RU2169915C1

RU2169915C1 - Method of determining collagen

Info

Publication number: RU2169915C1
Application number: RU99123641A
Authority: RU
Inventors: В.К. Шорманов; Л.С. Новикова; М.К. Елизарова; М.В. Полонская; Г.В. Беляева; Е.В. Харламова; А.А. Прокошев
Original assignee: Шорманов Владимир Камбулатович
Priority date: 1999-11-09
Filing date: 1999-11-09
Publication date: 2001-06-27

Abstract

FIELD: analytical methods. SUBSTANCE: sample to be analyzed is dissolved in water under conditions of heating at 42-44 C for 2 h. Resulting solution is treated with acetone solution of tetrachloro-p-quinone in presence of 1,4-dioxane and colored solution obtained is photometered. EFFECT: increased accuracy and accelerated procedure. 2 tbl

Description

Изобретение относится к аналитической химии и биологической химии, а именно к способам определения коллагена, и может быть использовано в практике контрольно-аналитических лабораторий химических и химико-фармацевтических предприятий, биохимических лабораторий. Способ относится к числу массовых. The invention relates to analytical chemistry and biological chemistry, and in particular to methods for determining collagen, and can be used in the practice of control and analytical laboratories of chemical and chemical-pharmaceutical enterprises, biochemical laboratories. The method belongs to the mass.

Известен способ определения белков, в том числе и коллагена, по общему азоту путем обработки анализируемой пробы концентрированной серной кислотой в присутствии сульфата калия и красного оксида ртути (II), подщелачивания реакционной смеси гидроксидом натрия в присутствии тиосульфата натрия, отгонки выделяющегося аммиака, поглощения аммиака раствором серной кислоты с последующим титрованием раствором гидроксида натрия в присутствии смеси индикаторов метилового красного и метиленового синего до появления зеленого окрашивания [Полюдек-Фабини P. , Бейрих Т. Органический анализ.- Л.: Химия, 1981, с. 529-531; 253-255]. A known method for the determination of proteins, including collagen, by total nitrogen by treating the analyzed sample with concentrated sulfuric acid in the presence of potassium sulfate and red mercury (II) oxide, alkalizing the reaction mixture with sodium hydroxide in the presence of sodium thiosulfate, distilling off the ammonia, absorbing ammonia with a solution sulfuric acid, followed by titration with a solution of sodium hydroxide in the presence of a mixture of indicators of methyl red and methylene blue until a green color appears [Polydek -Fabini P., Beirich T. Organic analysis.- L .: Chemistry, 1981, p. 529-531; 253-255].

Способ малоселективен, трудоемок, характеризуется значительными затратами времени на его осуществление. The method is poorly selective, time-consuming, characterized by a significant investment of time for its implementation.

Известен способ определения коллагена по аминокислотным фрагментам, заключающийся в обработке анализируемой пробы раствором трихлоруксусной кислоты в условиях нагревания при 90^oC в течение 30 минут, разбавлении реакционной смеси водой, обработке сульфатом меди (II) в щелочной среде с последующей обработкой реактивом Фолина-Чиокальте, выдерживанием реакционной смеси в течение 30 минут и фотометрированием образующегося окрашенного раствора [Слуцкий Л.И., Шелекетина И.И. Количественное определение коллагена в легочной ткани //Вопросы медицинской химии. -1959. -Т. 5.- Вып. 6. -С. 466-468].A known method for determining collagen by amino acid fragments, which consists in processing the analyzed sample with a solution of trichloroacetic acid under heating at 90 ^° C for 30 minutes, diluting the reaction mixture with water, treating with copper (II) sulfate in an alkaline medium, followed by treatment with Folin-Ciocalt reagent, keeping the reaction mixture for 30 minutes and photometry of the resulting colored solution [Slutsky LI, Sheleketina II Quantitative determination of collagen in the lung tissue // Questions of medical chemistry. -1959. -T. 5.- Iss. 6.-C. 466-468].

Способ малоселективен, характеризуется трудоемкостью, недостаточно высокой точностью. The method is poorly selective, characterized by complexity, insufficiently high accuracy.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемым результатам является способ определения коллагена по его аминокислотному фрагменту оксипролину путем обработки анализируемой пробы раствором хлорной кислоты в течение 4 часов в условиях нагревания (на водяной бане) при 100^oC, нейтрализации реакционной смеси гидроксидом натрия, прибавления пропанола-2 и раствора хлорамина Т в ацетат-цитратном буфере с последующей обработкой раствором парадиметиламинобензальдегида в смеси 57% раствора хлорной кислоты и пропанола-2, нагреванием в течение 25 минут при 60^oC и фотометрированием образующегося окрашенного раствора [Прошина Л.Я., Приваленко М.Н. Исследование фракционного состава коллагена в ткани печени // Вопросы медицинской химии. -1982. -Т. 28. -Вып. 1. -С. 115-119].The closest technical solution and the achieved results is a method for determining collagen from its amino acid fragment oxyproline by treating the analyzed sample with a solution of perchloric acid for 4 hours under heating conditions (in a water bath) at 100 ^o C, neutralizing the reaction mixture with sodium hydroxide, adding propanol - 2 and a solution of chloramine T in acetate-citrate buffer, followed by treatment with a solution of paradimethylaminobenzaldehyde in a mixture of 57% solution of perchloric acid and propanol-2, heating for 25 minutes at 60 ^o C and photometry of the resulting colored solution [Proshina L.Ya., Privalenko MN The study of the fractional composition of collagen in the liver tissue // Questions of medical chemistry. -1982. -T. 28. -Vyp. 1. -C. 115-119].

Способ характеризуется длительностью выполнения, трудоемкостью, недостаточной селективностью, относительно невысокой точностью. The method is characterized by the duration of the work, the complexity, lack of selectivity, relatively low accuracy.

Задачей настоящего изобретения является упрощение способа, повышение точности, селективности, сокращение продолжительности процесса определения. The objective of the present invention is to simplify the method, improve accuracy, selectivity, reduce the duration of the determination process.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что анализируемую пробу растворяют в воде в условиях нагревания при 42-44^oC в течение 2 часов, обрабатывают ацетоновым раствором тетрахлорпарахинона в присутствии 1,4-диоксана с последующим фотометрированием образующегося окрашенного раствора.The problem is achieved using the proposed method, which consists in the fact that the analyzed sample is dissolved in water under heating at 42-44 ^o C for 2 hours, treated with an acetone solution of tetrachloroparaquinone in the presence of 1,4-dioxane, followed by photometry of the resulting colored solution .

Способ осуществляется следующим образом: анализируемую пробу растворяют в воде в условиях нагревания при 42-44^oC в течение 2 часов, обрабатывают ацетоновым раствором тетрахлорпарахинона в присутствии 1,4-диоксана и образующийся окрашенный раствор фотометрируют.The method is as follows: the analyzed sample is dissolved in water under heating at 42-44 ^o C for 2 hours, treated with an acetone solution of tetrachloroparaquinone in the presence of 1,4-dioxane and the resulting colored solution is photometric.

Способ иллюстрируется следующими примерами. The method is illustrated by the following examples.

Пример 1
Качественное определение коллагена
Около 5 мг коллагена растворяют в 5 мл воды в условиях нагревания при 42-44^oC в течение 2 часов. К 1 мл полученного раствора прибавляют 0,5 мл 0,4% раствора тетрахлорпарахинона в ацетоне и 3,5 мл 1,4-диоксана. В присутствии коллагена появляется фиолетовое окрашивание. Чувствительность реакции - 2,6 мкг/мл.Example 1
Qualitative determination of collagen
About 5 mg of collagen is dissolved in 5 ml of water under heating at 42-44 ^o C for 2 hours. 0.5 ml of a 0.4% solution of tetrachloroparaquinone in acetone and 3.5 ml of 1,4-dioxane are added to 1 ml of the resulting solution. In the presence of collagen, a purple color appears. The sensitivity of the reaction is 2.6 μg / ml.

Пример 2
Количественное определение коллагена
Построение калибровочного графика
В ряд пробирок вносят 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 мл 0,1% раствора коллагена и соответственно 0,8, 0,6, 0,4, 0,2 и 0 мл воды. В каждую пробирку прибавляют по 0,5 мл 0,4% раствора тетрахлорпарахинона в ацетоне и по 3,5 мл 1,4-диоксана. Содержимое пробирок перемешивают и через 10 минут фотометрируют образующиеся окрашенные растворы на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 547 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерение оптической плотности проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По результатам измерений строят калибровочный график и рассчитывают его уравнение, которое в данном случае имеет вид:
Д = 0,00441•С - 0,02405,
где Д - оптическая плотность, С - концентрация коллагена в фотометрируемом растворе, мкг/мл.Example 2
Collagen Quantification
Calibration plotting
0.2, 0.4, 0.6, 0.8, and 1.0 ml of a 0.1% collagen solution and, respectively, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, and 0 ml are added to a number of tubes water. 0.5 ml of a 0.4% solution of tetrachloroparaquinone in acetone and 3.5 ml of 1,4-dioxane are added to each tube. The contents of the tubes are mixed and, after 10 minutes, the resulting colored solutions are photographed on an SF-26 spectrophotometer at a wavelength of 547 nm in a cuvette with a working layer thickness of 10 mm. The measurement of optical density is carried out against the background of the solution obtained in the control experiment. Based on the measurement results build a calibration graph and calculate its equation, which in this case has the form:
D = 0.00441 • C - 0.02405,
where D is the optical density, C is the concentration of collagen in the photometric solution, μg / ml.

Методика определения
Около 0,025 г коллагена, предварительно высушенного до постоянной массы в присутствии водоотнимающего средства (кристаллический гидроксид натрия) в эксикаторе при 20-22^oC (точная навеска), растворяют в 20 мл воды в мерной колбе вместимостью 25 мл в условиях нагревания при 42-44^oC в течение 2 часов. Полученный раствор охлаждают и доводят водой до глотки. 0,6 мл полученного раствора вносят в пробирку, прибавляют 0,4 мл воды и дальнейшие операции осуществляют в соответствии со схемой, описанной для построения калибровочного графика.Determination method
About 0.025 g of collagen, pre-dried to constant weight in the presence of a dewatering agent (crystalline sodium hydroxide) in a desiccator at 20-22 ^o C (accurately weighed), is dissolved in 20 ml of water in a 25 ml volumetric flask under heating at 42-44 ^o C for 2 hours. The resulting solution was cooled and made up to the throat with water. 0.6 ml of the resulting solution is added to the test tube, 0.4 ml of water is added and further operations are carried out in accordance with the scheme described for constructing the calibration graph.

Количественное содержание коллагена определяют, исходя из величины оптической плотности, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску. The quantitative content of collagen is determined on the basis of the optical density, according to the equation of the calibration graph and converted to a sample.

Результаты количественного определения коллагена представлены в таблице 1. The results of the quantitative determination of collagen are presented in table 1.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом значительно упрощает процесс определения, более чем в два раза сокращает его продолжительность (с 4 часов 45 минут до 2 часов 15 минут), характеризуется более высокой точностью (относительная ошибка среднего результата снижается в 5 раз) и селективностью (в отличие от прототипа позволяет избирательно проводить определение коллагена в присутствии ряда белков и аминокислот). The proposed method in comparison with the prototype significantly simplifies the determination process, more than halves its duration (from 4 hours 45 minutes to 2 hours 15 minutes), is characterized by higher accuracy (the relative error of the average result is reduced by 5 times) and selectivity (in unlike the prototype allows the selective determination of collagen in the presence of a number of proteins and amino acids).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 2.0 Comparative characteristics of the proposed and known methods are presented in table 2.0

Claims

A method for determining collagen by dissolving an analyzed sample in water when heated, followed by treatment with a color reagent in the presence of an organic solvent and photometricizing the resulting colored solution, characterized in that the analyzed sample is dissolved in water at 42-44 ° C for 2 hours, using a color reagent a solution of tetrachloroparaquinone in acetone, and 1,4-dioxane as an organic solvent.