RU2034028C1

RU2034028C1 - Method of preparing of proteolytic complex

Info

Publication number: RU2034028C1
Authority: RU
Inventors: Т.Н. Пивненко; В.М. Жданюк; Л.М. Эпштейн
Original assignee: Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии
Priority date: 1992-02-07
Filing date: 1992-02-07
Publication date: 1995-04-30

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method involves milling of pancreas-containing organs of terrestrial and aqueous animals, extraction of proteolytic complex with 1 mM calcium chloride solution containing 0.2% detergent. Then extract is centrifuged, and supernatant is subjected for microfiltration. Proteolytic complex is isolated by ultrafiltration through diaphragms retaining capability of which is 15000-20000 Da. EFFECT: improved method of proteolytic complex preparing.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения протеолитических ферментов, и может быть применено для получения очищенных протеолитических ферментов для использования в микробиологической промышленности, в сельском хозяйстве, парфюмерии и медицине. The invention relates to biotechnology, and in particular to methods for producing proteolytic enzymes, and can be used to obtain purified proteolytic enzymes for use in the microbiological industry, in agriculture, perfumery and medicine.

Цель изобретения разработка новых способов получения протеолитических ферментов без использования растворителей и расширение сырьевой базы. The purpose of the invention is the development of new methods for producing proteolytic enzymes without the use of solvents and the expansion of the raw material base.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. The essence of the proposed method is as follows.

В качестве сырья используют панкреассодержащие органы рыб: пилорические придатки терпуга, камбалы, трески, сельди, скумбрии, ставриды, мойвы, палтуса, сайры, анчоуса, лососей, гепатопанкреас краба, криля, кальмара, поджелудочную железу морских ластоногих и китообразных, а также крупного и мелкого рогатого скота, свиней, оленей, кур. Pancreas-containing fish organs are used as raw materials: pyloric appendages of rasp, flounder, cod, herring, mackerel, horse mackerel, capelin, halibut, saury, anchovy, salmon, hepatopancreas crab, krill, squid, pancreas of marine pinnipeds and cetaceans, as well as large and small cattle, pigs, deer, hens.

Сырье измельчают (гомогенизируют), экстрагируют раствором 1 мМ хлористого кальция, добавляют 0,2% детергента, гомогенат очищают от крупно- и мелкодисперсных взвесей сапарированием, суперцентрифугированием и микрофильтрацией. The raw materials are crushed (homogenized), extracted with a solution of 1 mM calcium chloride, 0.2% detergent is added, the homogenate is purified from coarse and fine suspensions by saparization, supercentrifugation and microfiltration.

Ультрафильтрацию проводят на половолоконных или других мембранах с размером пор 15000-20000 Да. После этого раствор, содержащий протеолитический комплекс, сушат сублимационной или распылительной сушкой. Ultrafiltration is carried out on hollow fiber or other membranes with a pore size of 15,000-20000 Da. After that, the solution containing the proteolytic complex is freeze-dried or spray dried.

Полученный продукт (протеолитический комплекс) представляет собой аморфный порошок (от светлого до темно-коричневого цвета) растворимый в воде, содержащий щелочные, нейтральные и кислые протеазы: трипсин, химотрипсин, коллагеназу. The resulting product (proteolytic complex) is an amorphous powder (from light to dark brown) soluble in water, containing alkaline, neutral and acidic proteases: trypsin, chymotrypsin, collagenase.

П р и м е р 1. 1 кг пилорических придатков окуня-терпуга измельчают, экстрагируют добавлением 2 объемов 1 мМ раствора хлористого кальция и 2% додецилсульфата натрия, выдерживают 16 ч при 6^оС. Все последующие операции проводят при этой же температуре. Затем проводят сепарирование для отделения крупнодисперсных фракций соединительной ткани на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость направляют на осветление, проводимое на суперцентрифугах при 15000 об/мин, и на микрофильтрацию, проводимую на установках мембранной фильтрации с размерами пор в мембранах 200 мкм.PRI me R 1. 1 kg of pyloric appendages of perch rasp is crushed, extracted with 2 volumes of 1 mm solution of calcium chloride and 2% sodium dodecyl sulfate, incubated for 16 hours at 6 ^about C. All subsequent operations are carried out at the same temperature. Then carry out separation to separate coarse fractions of connective tissue in a horizontal sedimentation centrifuge at 3500 rpm The supernatant is sent to clarification carried out on supercentrifuges at 15,000 rpm, and to microfiltration carried out on membrane filtration units with pore sizes in the membranes of 200 μm.

Полученный раствор пропускают через установку с половолоконными мембранами, имеющими размер пор 20000 Да. Концентрирование проводят до уменьшения объема исходного раствора в 10 раз. Раствор сушат на распылительной установке при температуре в зоне распыления 75^оС.The resulting solution was passed through an installation with hollow fiber membranes having a pore size of 20,000 Da. Concentration is carried out to reduce the volume of the initial solution by 10 times. The solution is dried in a spray unit at a temperature in the spray zone of 75 ^about C.

Выход сухого продукта 12 г. Активность ферментов: щелочные протеазы (рН 8,0; субстрат казеин) 82 Е/г, нейтральные протеазы (рН 6,0; субстрат-гемоглобин) 7 Е/г, кислые протеазы (субстрат-гемоглобин) 5 Е/г. The yield of dry product is 12 g. Enzyme activity: alkaline proteases (pH 8.0; casein substrate) 82 U / g, neutral proteases (pH 6.0; hemoglobin substrate) 7 U / g, acidic proteases (hemoglobin substrate) 5 E / g

П р и м е р 2. 1 кг пилорических придатков камбалы измельчают, экстрагируют в 2 объемах 1 мМ раствора хлористого кальция, добавляют 0,2% додецилсульфата натрия для разрушения межмолекулярных комплексов. Выдерживают 24 ч при 4^оС. Проводят разделение сепарированием на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин, надосадочную жидкость направляют на дальнейшее разделение от липидной фракции и мелкодисперсных частиц последовательно на суперцентрифуге при 13000 об/мин и установке мембранной фильтрации с размером пор в мембране 200 мкм.PRI me R 2. 1 kg of pyloric appendages of flounder is crushed, extracted in 2 volumes of 1 mm solution of calcium chloride, add 0.2% sodium dodecyl sulfate to break the intermolecular complexes. Incubated for 24 hours at 4 ° ^C. The separation was carried out by separation in a horizontal decanter centrifuge at 3500 rev / min, and the supernatant liquid is sent for further separation of the lipid fraction and fine particles successively to supercentrifuge at 13000 rev / min and the installation of membrane filtration having a pore size in the membrane 200 microns.

Полученный раствор направляют на ультрафильтрацию, проводимую на половолоконных фильтрах с размером пор 15000 Да. Концентрирование проводят до уменьшения объема исходного раствора в 12 раз. The resulting solution is sent to ultrafiltration carried out on hollow fiber filters with a pore size of 15,000 Da. Concentration is carried out to reduce the volume of the initial solution by 12 times.

Очищенный раствор сушат на распылительной установке. Выход сухого продукта 14 г активностью, Е/г: Щелочные протеазы 48 Нейтральные протеазы 12 Кислые протеазы 4
П р и м е р 3. 1 кг пилорических придатков лососей гомогенизируют, добавляют 2 л 1 мМ раствора хлористого кальция и 6 г додецилсульфата натрия, оставляют при перемешивании на 24 ч. Затем проводят сепарирование для отделения крупных фракций соединительной ткани на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость направляют на осветвление, его проводят на суперцентрифугах при 13000-15000 об/мин. Затем проводят очистку от мелкодисперсных частиц на установках мембранной фильтрации с размерами пор в мембранах 200 мкм.The purified solution is dried in a spray plant. The yield of dry product is 14 g of activity, E / g: Alkaline proteases 48 Neutral proteases 12 Acidic proteases 4
PRI me R 3. 1 kg of pyloric salmon appendages are homogenized, 2 l of 1 mM calcium chloride solution and 6 g of sodium dodecyl sulfate are added, left stirring for 24 hours. Separation is then carried out to separate large fractions of connective tissue in a horizontal sedimentation centrifuge at 3500 rpm The supernatant is sent to clarification, it is carried out in supercentrifuges at 13000-15000 rpm Then, fine particles are cleaned at membrane filtration units with pore sizes in the membranes of 200 μm.

Полученный раствор пропускают через установку с поволоконными мембранами, имеющими размер пор 20000 Да. The resulting solution was passed through an installation with fiber membranes having a pore size of 20,000 Da.

Концентрирование проводят до 10-кратного уменьшения исходного объема. Concentration is carried out up to a 10-fold decrease in the initial volume.

Так как препарат предназначается для лечебных целей, то полученный раствор направляют на стерильную фильтрацию, разливают во флаконы и сушат сублимационным способом. Выход конечного продукта 36 г с активностью протеаз, Е/г: Щелочные 390 Нейтральные 31 Кислые 12 и эстеразной активностью: трипсина (субстрат ТАМЭ-N-тозил-L-аргинин метиловый эфир) 627 Е/мг, химотрипсин (субстрат БТЭЭ-N-бензоил-L-тирозин этиловый эфир) 2090 Е/мг
П р и м е р 4. 1 кг гепатопанкреаса краба гомогенизируют до однородного состояния, добавляют 2 л 1 мМ раствора хлористого кальция и 6 г додецилсульфата натрия, выдерживают 12 ч. Проводят сепарирование на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин. Полученный осадок выбрасывают, а 2,4 л надосадочной жидкости центрифугируют на проточной суперцентрифуге при 13000-15000 об/мин, при этом удаляется часть липидной фракции. Очистку от мелкодисперсных частиц осуществляют методом микрофильтрации на мембранах с диаметром пор 200 мкм. Концентрирование 1,9 л полученного раствора проводят на половолоконных ультрафильтрационных аппаратах с мембранами, имеющими диметр пор 15000 Да. Концентрирование проводят до сокращения объема исходного раствора в 10 раз 0,190 л. Полученный концентрированный раствор после стерильной фильтрации разливают во флаконы и сушат сублимационно.Since the drug is intended for medicinal purposes, the resulting solution is sent to sterile filtration, poured into vials and dried by freeze-drying. The yield of the final product is 36 g with protease activity, E / g: Alkaline 390 Neutral 31 Acid 12 and esterase activity: trypsin (TAME-N-tosyl-L-arginine methyl ether substrate) 627 U / mg, chymotrypsin (BTEE-N- substrate benzoyl-L-tyrosine ethyl ester) 2090 U / mg
Example 4. 1 kg of crab hepatopancreas is homogenized, add 2 l of 1 mm solution of calcium chloride and 6 g of sodium dodecyl sulfate, incubated for 12 hours. Separation is carried out on a horizontal precipitation centrifuge at 3500 rpm. The resulting precipitate is discarded, and 2.4 L of the supernatant is centrifuged in a flow supercentrifuge at 13000-15000 rpm, while part of the lipid fraction is removed. Purification from fine particles is carried out by microfiltration on membranes with a pore diameter of 200 μm. Concentration of 1.9 L of the resulting solution is carried out on hollow fiber ultrafiltration apparatus with membranes having a pore diameter of 15,000 Da. Concentration is carried out until the volume of the initial solution is reduced by 10 times 0.190 L. The resulting concentrated solution after sterile filtration is poured into vials and freeze-dried.

Выход сухого продукта 98 г с активностью протеаз, Е/г: Щелочные 288 Нейтральные 265 Кислые 72 эстеразной активностью: трипсиноподобных ферментов (по субстрату ТАМЭ -N-тозил-L-аргинин метиловому эфиру) 1640 Е/мг; химотрипсиноподобных ферментов (по субстрату БТЭЭ N-бензоил-L-тирозин этиловому эфиру) 714 Е/мг; коллагеназная активность по кислоторастворимому коллагену 672 E/мг. The yield of dry product is 98 g with protease activity, E / g: Alkaline 288 Neutral 265 Acidic 72 esterase activity: trypsin-like enzymes (TAME-N-tosyl-L-arginine methyl ester substrate) 1640 U / mg; chemotrypsin-like enzymes (based on BTEE substrate N-benzoyl-L-tyrosine ethyl ether) 714 U / mg; collagenase activity for acid-soluble collagen 672 E / mg

П р и м е р 5. В качестве сырья используют поджелудочную железу моржа в количестве 500 г. PRI me R 5. As a raw material use the pancreas of walrus in the amount of 500 g

Получение протеолитического комплекса проводят как в примере 4. Obtaining a proteolytic complex is carried out as in example 4.

Выход 16% Активность протеаз, Е/г: Щелочные 540 Нейтральные 108 Кислые 21
П р и м е р 6. 1,4 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота измельчают, гомогенизируют до однородного состояния, добавляют 2,8 л мМ раствора хлористого кальция и добавляют 0,2% детергента "Бридж 35" (полиоксиэтилен лауриловый эфир), выдерживают 16 ч. Затем проводят сепарирование на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин. Осадок выбрасывают, а надосадочную жидкость разделяют на проточной суперцентрифуге при 13000-15000 об/мин, при этом удаляется и отбрасывается липидная фракция. Очистку от мелкодисперсных частиц проводят методом микрофильтрации на мембранах с размером пор 200 мкм. Затем раствор подается на ультрафильтрацию, проводимую на кассетных установках. Задерживающая способность мембран распространяется на молекулы массой 20000 Да.Yield 16% Protease activity, E / g: Alkaline 540 Neutral 108 Acidic 21
PRI me R 6. 1.4 kg of cattle pancreas are crushed, homogenized to a homogeneous state, 2.8 l mm solution of calcium chloride are added and 0.2% Bridge 35 detergent (polyoxyethylene lauryl ether) is added, stand for 16 hours. Then carry out the separation in a horizontal precipitation centrifuge at 3500 rpm The precipitate is discarded, and the supernatant is separated in a flow supercentrifuge at 13000-15000 rpm, while the lipid fraction is removed and discarded. Purification from fine particles is carried out by microfiltration on membranes with a pore size of 200 μm. Then the solution is fed to ultrafiltration carried out on cassette installations. The retention capacity of membranes extends to molecules weighing 20,000 Da.

Сушку очищаемого раствора проводили методом сублимации. The purified solution was dried by sublimation.

Выход сухого продукта 53 г с активностью: Щелочные протеазы, Е/г 440 Нейтральные протеазы, Е/г 156 Кислые протеазы следовое
количество Трипсин (субстрат ТАМЭ), Е/мг 7625 Химотрипсин (субстрат АТЭЭ ацетил-тирозин этиловый эфир), Е/мг 5059
П р и м е р 7. В качестве сырья используют поджелудочную железу кур в количестве 300 г. Получение проводят как в примере 6.The yield of dry product 53 g with activity: Alkaline proteases, E / g 440 Neutral proteases, E / g 156 Acidic proteases trace
amount of trypsin (TAME substrate), E / mg 7625 Chymotrypsin (ATEE substrate acetyl-tyrosine ethyl ether), E / mg 5059
PRI me R 7. As a raw material use the pancreas of chickens in an amount of 300 g. The preparation is carried out as in example 6.

Выход конечного продукта 12 г с активностью: Щелочные протеазы, Е/г 204 Нейтральные протеазы, Е/г 14 Кислые протеазы, Е/г 9 Трипсин (субстрат ТАМЭ), Е/мг 1680 Химотрипсин (субстрат АТЭЭ), Е/мг 1025 The yield of the final product is 12 g with activity: Alkaline proteases, E / g 204 Neutral proteases, E / g 14 Acidic proteases, E / g 9 Trypsin (TAME substrate), E / mg 1680 Chymotrypsin (ATEE substrate), E / mg 1025

Claims

METHOD FOR PRODUCING A PROTEOLYTIC COMPLEX, which provides for the homogenization of the feedstock, its purification by separation of impurities, isolation and drying, characterized in that the pancreas-containing organs of terrestrial and marine animals are used as feedstock, the proteolytic complex is extracted from the homogenate with a 1 mM calcium chloride solution containing 0 , 2% of detergent, while purification from impurities is carried out by step centrifugation and microfiltration, and the complex is isolated by ultrafiltration through membranes with the delaying ability on a pier. m. 15,000 20,000.