RU2049471C1

RU2049471C1 - Method of preparing brain tissue hydrolyzate "cerebrolyzate"

Info

Publication number: RU2049471C1
Application number: RU92012910A
Authority: RU
Inventors: А.В. Карякин; Г.С. Васильев; В.Г. Юсупов; В.Н. Мельников
Original assignee: Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат"
Priority date: 1992-12-21
Filing date: 1992-12-21
Publication date: 1995-12-10

Abstract

FIELD: drug production. SUBSTANCE: homogenate of brain cortex is subjected for enzymatic hydrolysis at pH 6.8-8.4 for 4-5 hr. Then mill cake is separated by filtration through membrane filter at pore size 0.22-0.5 mcm, and proteins and peptides were separated by two-stage ultrafiltration through membrane at threshold retention of substances 30-50 kDa and 5-15 kDa. Mixture is evaporated under vacuum (concentration), preserving agent is added 0.3% phenol followed by sterile filtration through membrane at pore size 0.2-0.32 mcm. EFFECT: simplified technology, high clinic activity of preparation. 1 tbl

Description

Изобретение относится к способу получения отечественного препарата "Церебролизат", аналогичного по механизму биологического действия препарату "Церебролизин" фирмы Эбеве, получаемого путем ферментативного гидролиза головного мозга сельскохозяйственных животных. Описания технологии получения Церебролизина в доступных источниках информации не обнаружено. The invention relates to a method for producing a domestic preparation “Cerebrolysate”, similar in biological mechanism to the preparation “Cerebrolysin" of Ebewe firm, obtained by enzymatic hydrolysis of the brain of farm animals. Descriptions of the technology for producing Cerebrolysin in available sources of information were not found.

Известный способ является трудоемким за счет использования центрифугирования и проведения доочистки гидролизата активированным углем. Кроме того, получаемый продукт (гидролизат) не является лекарственной формой и не может быть применен в клинической практике, а его получение сопровождается накоплением большого количества неутилизируемых отходов в виде отработанного активиpованного угля. Использование спирта делает производство взрывоопасным, дорогим и требует его отгонки на заключительных стадиях. The known method is time-consuming due to the use of centrifugation and post-treatment of the hydrolyzate with activated carbon. In addition, the resulting product (hydrolyzate) is not a dosage form and cannot be used in clinical practice, and its production is accompanied by the accumulation of a large amount of unused waste in the form of activated activated carbon. The use of alcohol makes the production explosive, expensive and requires distillation at the final stages.

Цель изобретения упрощение технологии получения за счет снижения трудоемкости способа и разработка лекарственной формы отечественного препарата "Церебролизат". The purpose of the invention is the simplification of production technology by reducing the complexity of the method and the development of the dosage form of the domestic drug "Cerebrolysate".

С этой целью получение препарата "Церебролизат" проводят путем ферментативного гидролиза гомогената коры мозга крупного рогатого скота при рН 6,8-8,4, отделение жмыха проводят микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,2-0,5 мкм, а отделение белков и пептидов осуществляют двумя последовательными ультрафильтрациями на мембранах с порогом задержания веществ 30-50 кД и 5-15 кД, затем продукт концентрируют, а стерильную фильтрацию проводят на мембранах 0,2-0,32 мкм. Выбранный размер пор обусловлен необходимостью удаления из препарата белков (на мембранах 30-50 Кд) и низкомолекулярных пептидов (на мембранах 5-15 кД). To this end, the preparation of the preparation “Cerebrolyzate” is carried out by enzymatic hydrolysis of the homogenate of the cerebral cortex at pH 6.8-8.4, separation of the cake is carried out by microfiltration on membranes with pore size 0.2-0.5 microns, and the separation of proteins and Peptides are carried out by two successive ultrafiltrations on membranes with a retention threshold of 30-50 kD and 5-15 kD, then the product is concentrated and sterile filtration is carried out on 0.2-0.32 microns membranes. The selected pore size is due to the need to remove proteins (on membranes 30-50 Kd) and low molecular weight peptides (on membranes 5-15 kDa) from the preparation.

Сравнение предлагаемого способа с известным показывает, что общими существенными признаками у них являются: ферментативный гидролиз гомогената головного мозга животных, отделение жмыха и белковых фрагментов, концентрирование. Однако, в отличие от прототипа заявляемый способ предусматривает использование в качестве сырья коры головного мозга крупного рогатого скота, проведение ферментативного гидролизата в более щелочных условиях, отделение жмыха и белковых фрагментов микрофильтрацией с последующей двухстадийной ультрафильтрацией вместо спиртового осаждения, центрифугирования и обработки активированным углем, получение лекарственной формы путем добавления консерванта и проведения стерилизующей фильтрации. Comparison of the proposed method with the known one shows that the common essential features of them are: enzymatic hydrolysis of the homogenate of the animal brain, separation of oil cake and protein fragments, concentration. However, unlike the prototype, the inventive method involves the use of cattle cerebral cortex as a raw material, carrying out an enzymatic hydrolyzate in more alkaline conditions, separating the cake and protein fragments by microfiltration, followed by two-stage ultrafiltration instead of alcohol precipitation, centrifugation and treatment with activated carbon, obtaining medicinal form by adding a preservative and sterilizing filtration.

Использование в качестве сырья коры головного мозга позволяет получить препарат, обладающий более направленным действием, поскольку не используются такие части мозга, как гипофиз, мозжечок и стволовая часть мозга. Проведение ферментативного гидролиза в нейтральной или слабо-щелочной среде обеспечивает оптимальные условия для работы сериновых эндопротеаз. Кроме того, при использовании в способе-прототипе более кислых значений рН увеличивается сухой остаток препарата за счет образования солей при подведении рН до нейтральных значений, что отрицательно сказывается на качестве препарата при доведении его до лекарственной формы. Замена спиртового осаждения на двухстадийную ультрафильтрацию позволяет избежать, указанных выше недостатков применения спирта, а совместно с микрофильтрацией повысить технологичность процесса за счет замены трудоемких операций. Проведение заключительной стерилизующей фильтрации также направлено на получение лекарственной формы препарата "Церебролизат". Дополнительный эффект от применения предлагаемого способа проявляется и в повышении экологической чистоты производства за счет исключения из технологии активированного угля. The use of the cerebral cortex as a raw material makes it possible to obtain a drug with a more directed effect, since such parts of the brain as the pituitary, cerebellum, and brain stem are not used. Enzymatic hydrolysis in a neutral or slightly alkaline environment provides optimal conditions for the operation of serine endoproteases. In addition, when using more acidic pH values in the prototype method, the dry residue of the drug increases due to the formation of salts when pH is adjusted to neutral values, which negatively affects the quality of the drug when it is brought to the dosage form. Replacing alcohol deposition with two-stage ultrafiltration avoids the above disadvantages of using alcohol, and together with microfiltration, improves the processability by replacing labor-intensive operations. The final sterilizing filtration is also aimed at obtaining the dosage form of the drug "Cerebrolysate". An additional effect of the application of the proposed method is manifested in increasing the environmental cleanliness of production due to the exclusion of activated carbon from the technology.

Приведенная совокупность отличительных признаков заявляемого способа в литературе не описана и создает новый положительный эффект, следовательно, разработанный способ удовлетворяет критериям "Новизна" и "Изобретательский уровень". The above set of distinctive features of the proposed method is not described in the literature and creates a new positive effect, therefore, the developed method meets the criteria of "Novelty" and "Inventive step".

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Дефростированный или свежий головной мозг без стволовой части и мозжечка измельчают и гомогенизируют в воде с нейтральным или слабо щелочным значением рН (6,8-8,4) и подвергают гидролизу сериновой эндопептидазой грибкового происхождения при температуре от 40 до 50^оС в течение 4-5 ч. По окончании гидролиза реакционную массу при перемешивании нагревают до 90-95^оС и выдерживают при этой температуре в течение 40 мин. После охлаждения до комнатной температуры проводят микрофильтрацию через мембранные фильтры с размерами пор 0,22-0,5 мкм и две последовательные ультрафильтрации через мембраны с порогом задержания веществ 30-50 и 5-15 кД. Смесь упаривают под вакуумом (концентрирование), добавляют консервант и проводят стерильную фильтрацию.The proposed method is as follows. Fresh or defrosted brain without cerebellum and brain stem was ground and homogenised in water with a neutral or weakly alkaline pH (6.8-8.4) and hydrolyzed serine endopeptidase fungal origin at a temperature of from 40 ^to 50 ° C for 4 5 hours. at the end of the hydrolysis, the reaction mass was heated under stirring to 90-95 ^{° C} and kept at this temperature for 40 min. After cooling to room temperature, microfiltration is carried out through membrane filters with pore sizes of 0.22-0.5 microns and two consecutive ultrafiltration through membranes with a retention threshold of 30-50 and 5-15 kD substances. The mixture was evaporated in vacuo (concentration), a preservative was added and sterile filtration was carried out.

П р и м е р 1. 1 кг мозга без основания и мозжечка пропускают через мясорубку. Гомогенат ткани мозга готовят в дистиллированной воде рН 8,4 в соотношении 1: 1 вес мозга/объем воды. Гомогенат нагревают до 48±2^оС и при перемешивании добавляют 40 г сериновой эндопротеазы. Инкубацию проводят в течение 4 ч при перемешивании и постоянной температуре. Далее смесь нагревают до 98^оС, инбкубируют 40 минут и после охлаждения последовательно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (микрофильтрация для обесцвечивания раствора и стерилизации) и через ультрафильтрационную установку с молекулярным весом отсечения веществ 50 кД и ультрафильтрационную установку с молекулярным весом отсечения веществ 10 кД. Смесь упаривают под вакуумом до 200 мл (концентрирование), добавляют консервант (0,3% фенола) и перед разливом проводят стерильную фильтрацию на фильтрах 0,22 мкм.PRI me R 1. 1 kg of brain without a base and cerebellum are passed through a meat grinder. A homogenate of brain tissue is prepared in distilled water, pH 8.4 in a ratio of 1: 1 brain weight / volume of water. The homogenate was heated to 48 ± 2 ^{° C} and with stirring was added 40 g of serine endoprotease. Incubation is carried out for 4 hours with stirring at a constant temperature. The mixture was heated to 98 ^{° C,} inbkubiruyut 40 minutes and after cooling is subsequently filtered through a filter having a pore diameter of 0.22 microns (microfiltration for bleaching and sterilizing solution) and through an ultrafiltration unit having a molecular weight cut-off of 50 kD substances and an ultrafiltration unit having a molecular weight cut-off substances 10 kD. The mixture was evaporated in vacuo to 200 ml (concentration), a preservative (0.3% phenol) was added and sterile filtration was performed on 0.22 μm filters before bottling.

П р и м е р 2. Получение препарата проводят согласно примеру 1, но с использованием микрофильтрационных мембран с размером пор 0,32 мкм, а ультрафильтрацию проводят на мембранах с порогом отсечения веществ 30 кД, а затем 15 кД. Аминокислотный состав полученных по примерам 1 и 2 препаратов был идентичен и представлен в таблице. PRI me R 2. The preparation is carried out according to example 1, but using microfiltration membranes with a pore size of 0.32 μm, and ultrafiltration is carried out on membranes with a cutoff threshold of substances of 30 kD, and then 15 kD. The amino acid composition obtained in examples 1 and 2 of the preparations was identical and presented in the table.

Препарат прошел клиническое изучение в ведущих неврологических центрах РСФСР и показал свою высокую эффективность для лечения травм и заболеваний центральной нервной системы: инсультов, нарушений мозгового кровообращения, энцефалопатий, детского церебрального паралича. Рекомендован для использования в медицинской практике. The drug underwent a clinical study in the leading neurological centers of the RSFSR and showed its high effectiveness for the treatment of injuries and diseases of the central nervous system: strokes, cerebrovascular accidents, encephalopathies, cerebral palsy. Recommended for use in medical practice.

Claims

A method of obtaining a brain tissue hydrolyzate, including enzymatic hydrolysis of cattle brain homogenate with subsequent isolation of the target product by separation of protein fragments and concentration, characterized in that the cerebral cortex is used as a raw material, enzymatic hydrolysis is carried out in the pH range of 6.8 to 8.4, separation of the cake is carried out by microfiltration on membranes with a pore size of 0.2 0.5 μm, and the separation of proteins and peptides is carried out by two-stage sequential ultrafiltration on membranes with a threshold threshold substances 30 30 kDa and 5 15 kDa, after concentration, sterilizing filtration is carried out on membranes with a pore size of 0.2 0.32 μm.