RU2049472C1

RU2049472C1 - Method of preparing brain tissue hydrolyzate "cerebrolyzate"

Info

Publication number: RU2049472C1
Application number: RU92012911A
Authority: RU
Inventors: А.В. Карякин; Г.С. Васильев; В.Г. Юсупов; В.Н. Мельников; В.Ф. Кулагин
Original assignee: Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат"
Priority date: 1992-12-21
Filing date: 1992-12-21
Publication date: 1995-12-10

Abstract

FIELD: drug production. SUBSTANCE: homogenate of brain cortex is subjected for enzymatic hydrolysis at pH 6.8-8.4 for 4-5 hr. Then proteins were separated by alcohol precipitation, prepared hydrolyzate is filtered successively through membrane filters at pore size 0.22-0.5 mcm at threshold retention of substances 5-15 kDa. Alcohol and water were distilled off, preserving agent is added 0.3% phenol followed by sterile filtration through membrane at pore size 0.2-0.32 mcm. EFFECT: simplified technology, high clinic effectiveness of preparation. 1 tbl

Description

Изобретение относится к способу получения отечественного препарата "Церебролизат", аналогичного по механизму биологического действия препарату "Церебролизин" фирмы Эбеве, получаемого путем ферментативного гидролиза головного мозга сельскохозяйственных животных. Описания технологии получения церебролизина в доступных источниках информации не обнаружено. The invention relates to a method for producing a domestic preparation “Cerebrolysate”, similar in biological mechanism to the preparation “Cerebrolysin" of Ebewe firm, obtained by enzymatic hydrolysis of the brain of farm animals. Descriptions of the technology for producing cerebrolysin in available sources of information were not found.

Способ является трудоемким за счет использования центрифугирования и проведения доочистки гидролизата активированным углем. Кроме того, получаемый продукт (гидролизат) не является лекарственной формой и не может быть применен в клинической практике, а его получение сопровождается накоплением большого количества неутилизируемых отходов в виде отработанного активированного угля. The method is time-consuming due to the use of centrifugation and post-treatment of the hydrolyzate with activated carbon. In addition, the resulting product (hydrolyzate) is not a dosage form and cannot be used in clinical practice, and its receipt is accompanied by the accumulation of a large amount of unused waste in the form of spent activated carbon.

Цель изобретения упрощение технологии получения за счет снижения трудоемкости способа и разработка лекарственной формы отечественного препарата "Церебролизат". The purpose of the invention is the simplification of production technology by reducing the complexity of the method and the development of the dosage form of the domestic drug "Cerebrolysate".

С этой целью получение препарата "Церебролизат" проводят путем ферментативного гидролиза гомогената коры мозга крупного рогатого скота при рН 6,8-8,4 и отделения белков путем осаждения этиловым спиртом, полученный гидролизат подвергают микрофильтрации на мембранах с диаметром пор 0,22-0,5 мкм и ультрафильтрации на мембранах с порогом задержания веществ 5-15 кД, а затем продукт концентрируют, фильтрацию проводят на мембранах 0,2-0,32 мкм. Выбранный размер пор (5-15 кД) обусловлен необходимостью удаления из препарата низкомолекулярных пептидов. To this end, the preparation of the preparation “Cerebrolyzate” is carried out by enzymatic hydrolysis of a homogenate of the cerebral cortex at pH 6.8-8.4 and separation of proteins by precipitation with ethyl alcohol, the obtained hydrolyzate is subjected to microfiltration on membranes with a pore diameter of 0.22-0, 5 microns and ultrafiltration on membranes with a retention threshold of 5-15 kD substances, and then the product is concentrated, filtration is carried out on membranes 0.2-0.32 microns. The selected pore size (5-15 kD) is due to the need to remove low molecular weight peptides from the preparation.

Сравнение предлагаемого способа с известным показывает, что общими существенными признаками для них являются: ферментативный гидролиз гемогената мозга животных, спиртовое осаждение белков с последующим отделением жмыха и удалением полипептидов, а также концентрирование. Однако, в отличие от прототипа, заявляемый способ предусматривает использование в качестве сырья коры головного мозга крупного рогатого скота, проведение ферментативного гидролиза в более щелочных условиях, отделение жмыха микрофильтрацией вместо центрифугирования, использование ультрафильтрации вместо обработки активированным углем для доочистки и осветления гидролизата, получение лекарственной формы путем добавления консерванта и проведения стерилизующей фильтрации. Comparison of the proposed method with the known one shows that the common essential features for them are: enzymatic hydrolysis of animal brain hemogenate, alcohol precipitation of proteins, followed by separation of oilcake and removal of polypeptides, as well as concentration. However, unlike the prototype, the inventive method involves the use of cattle cerebral cortex as a raw material, enzymatic hydrolysis in more alkaline conditions, separation of the meal by microfiltration instead of centrifugation, the use of ultrafiltration instead of activated carbon treatment for the purification and clarification of the hydrolyzate, and the preparation of the dosage form by adding a preservative and sterilizing filtration.

Использование в качестве сырья коры головного мозга позволяет получить препарат, обладающий более направленным действием, поскольку не используются такие части мозга, как гипофиз, мозжечок и стволовая часть мозга. Проведение ферментативного гидролиза в нейтральной или слабо-щелочной среде обеспечивает оптимальные условия для работы сериновых эндопротеаз. Кроме того, при использовании в способе-прототипе более кислых значений рН увеличивается сухой остаток препарата за счет образования солей при подведении рН до нейтральных значений, что отрицательно сказывается на качестве препарата при доведении его до лекарственной формы. Использование микро- и ультрафильтрации позволяет повысить технологичность способа за счет замены трудоемких операций, а проведение заключительной стерилизующей фильтрации также направлено на получение лекарственной формы препарата "Церебролизат". Дополнительный эффект от применения предлагаемого способа проявляется и в повышении экологической чистоты производства за счет исключения их технологии активированного угля. The use of the cerebral cortex as a raw material makes it possible to obtain a drug with a more directed effect, since such parts of the brain as the pituitary, cerebellum, and brain stem are not used. Enzymatic hydrolysis in a neutral or slightly alkaline environment provides optimal conditions for the operation of serine endoproteases. In addition, when using more acidic pH values in the prototype method, the dry residue of the drug increases due to the formation of salts when pH is adjusted to neutral values, which negatively affects the quality of the drug when it is brought to the dosage form. The use of micro- and ultrafiltration can improve the manufacturability of the method by replacing time-consuming operations, and the final sterilizing filtration is also aimed at obtaining a dosage form of the drug "Cerebrolyzate". An additional effect of the application of the proposed method is manifested in increasing the environmental cleanliness of production by eliminating their activated carbon technology.

Приведенная совокупность отличительных признаков заявляемого способа в литературе не описана и создает новый положительный эффект, следовательно, разработанный способ удовлетворяет критериям "Новизна" и "Изобретательский уровень". The above set of distinctive features of the proposed method is not described in the literature and creates a new positive effect, therefore, the developed method meets the criteria of "Novelty" and "Inventive step".

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Дефростированный или свежий головной мозг без стволовой части и мозжечок измельчают и гомогенизируют в воде с нейтральным или слабо щелочным значением рН (6,8-8,4) и подвергают гидролизу сериновой эндопептидазой грибкового происхождения при температуре от 40 до 50^оС в течение 4-5 ч. По окончании гидролиза реакционную массу при перемешивании нагревают до 90-95^оС и выдерживают при этой температуре в течение 50 мин. После охлаждения до комнатной температуры в раствор добавляют 2,5 объема спирта и через 2 ч инкубации смесь последовательно фильтруют через мембранные фильтры с размерами пор 0,22-0,5 мкм и с молекулярным весом отсечения 5-15 кД. Спирт и воду отгоняют. Для приготовления лекарственной формы препарата, после добавления консерванта, проводят стерильную фильтрацию на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,22-0,32 мкм.The proposed method is as follows. Fresh or defrosted brain without cerebellum and brain stem was ground and homogenised in water with a neutral or weakly alkaline pH (6.8-8.4) and hydrolyzed serine endopeptidase fungal origin at a temperature of from 40 ^to 50 ° C for 4 5 hours. at the end of the hydrolysis, the reaction mass was heated under stirring to 90-95 ^{° C} and kept at this temperature for 50 min. After cooling to room temperature, 2.5 volumes of alcohol are added to the solution, and after 2 hours of incubation, the mixture is successively filtered through membrane filters with pore sizes of 0.22-0.5 μm and with a molecular weight cut-off of 5-15 kD. Alcohol and water are distilled off. To prepare the dosage form of the drug, after adding a preservative, sterile filtration is carried out on membrane filters with a pore diameter of 0.22-0.32 microns.

П р и м е р 1. 1 кг мозга без основания мозга и мозжечка пропускают через мясорубку. Гомогенат готовят в воде в соотношении 1:1 (мас./об) в размельчителе ткани с вращающимся ножом. рН гомогената доводят щелочью до 7,4. Гомогенат нагревают до 40^оС и при перемешивании добавляют 50 г сериновой эндопротеазы. Инкубацию проводят в течение 5 ч при постоянном перемешивании и температуре 40±1^оС. По окончании протеолиза температуру реакционной смеси доводят до 95^оС и выдерживают при этой температуре в течение 40 мин. После охлаждения до 20^оС к раствору добавляют 5 л спирта, инкубируют 2 ч, затем проводят микрофильтрацию через мембранные фильтры с размерами пор 0,32 мкм. Осветленный, стерильный продукт подвергают ультрафильтрации через мембранные фильтры с молекулярным весом отсечения веществ 10 кД. Спирт и воду отгоняют. Конечный объем смеси составлял 200 мл. К продукту добавляют консервант 0,3% фенола. Лекарственную форму Церебролизата получают путем повторной стерильной фильтрации смеси и последующим разливом препарата в ампулы объемом 1-20 мл. Аминокислотный состав препарата указан в таблице.PRI me R 1. 1 kg of the brain without the base of the brain and cerebellum are passed through a meat grinder. The homogenate is prepared in water in a ratio of 1: 1 (w / v) in a fabric shredder with a rotating knife. The pH of the homogenate is adjusted with alkali to 7.4. The homogenate was heated ^to 40 ° C and added with stirring 50 g of serine endoprotease. Incubation was carried out for 5 hours at continuous stirring and temperature of 40 ± 1 ° ^C. After proteolysis reaction mixture temperature was adjusted to 95 ^C and kept at this temperature for 40 min. After cooling to 20 ^° C, 5 L of alcohol is added to the solution, incubated for 2 hours, then microfiltration through membrane filters with pore sizes of 0.32 μm is carried out. The clarified, sterile product is ultrafiltered through membrane filters with a molecular weight cut-off of 10 kD. Alcohol and water are distilled off. The final volume of the mixture was 200 ml. A 0.3% phenol preservative is added to the product. The dosage form of Cerebrolysate is obtained by repeated sterile filtration of the mixture and subsequent pouring of the drug into ampoules of 1-20 ml. The amino acid composition of the drug is shown in the table.

П р и м е р 2. Получение препарата проводят согласно примеру 1, но с использованием микрофильтрационных мембран с размером пор 0,22 мкм, а ультрафильтрацию проводят на мембранах с порогом задержания веществ 15 кД. Аминокислотный состав полученного препарата идентичен полученному по примеру 1. PRI me R 2. The preparation is carried out according to example 1, but using microfiltration membranes with a pore size of 0.22 μm, and ultrafiltration is carried out on membranes with a retention threshold of substances of 15 kD. The amino acid composition of the resulting preparation is identical to that obtained in example 1.

Препарат прошел клиническое изучение в ведущих неврологических центрах РСФСР и показал свою высокую эффективность для лечения травм и заболеваний центральной нервной системы: инсультов, нарушений мозгового кровообращения, энцефалопатий, детского церебрального паралича. Рекомендован для использования в медицинской практике. The drug underwent a clinical study in the leading neurological centers of the RSFSR and showed its high effectiveness for the treatment of injuries and diseases of the central nervous system: strokes, cerebrovascular accidents, encephalopathies, cerebral palsy. Recommended for use in medical practice.

Claims

A method of obtaining a brain tissue hydrolyzate, including enzymatic hydrolysis of cattle brain homogenate with subsequent isolation of the target product by separation of protein fragments and concentration, characterized in that the cerebral cortex is used as a raw material, enzymatic hydrolysis is carried out in a pH range of 6.8, 8.4, the hydrolyzate obtained after alcohol deposition is subjected to microfiltration on membranes with a pore size of 0.22 0.5 μm and ultrafiltration on membranes with a threshold for retention of substances 5 15 kD, and the sterilizing fil tration is carried out on membranes having a pore size of 0.2 - 0.32 microns after concentrating the product.