RU2669691C1 - Method for producing a complex of biologically active peptides having immunostimulating activity - Google Patents
Method for producing a complex of biologically active peptides having immunostimulating activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2669691C1 RU2669691C1 RU2017128861A RU2017128861A RU2669691C1 RU 2669691 C1 RU2669691 C1 RU 2669691C1 RU 2017128861 A RU2017128861 A RU 2017128861A RU 2017128861 A RU2017128861 A RU 2017128861A RU 2669691 C1 RU2669691 C1 RU 2669691C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptides
- extraction
- acetone
- biologically active
- solution
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/26—Lymph; Lymph nodes; Thymus; Spleen; Splenocytes; Thymocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
Abstract
Description
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается выделения биологически активных веществ из органов животных. Выделенный целевой продукт представляет комплекс биологически активных пептидов проявляющих иммуностимулирующую активность.The invention relates to the pharmaceutical industry and relates to the allocation of biologically active substances from animal organs. The selected target product is a complex of biologically active peptides exhibiting immunostimulating activity.
Биологически активные пептиды проявляющие иммуностимулирующее действие широко и успешно используется в медицине в качестве лекарственных препаратов для усиления неспецифической резистентности организма и в терапии иммунодефицитных состояний различного генеза у взрослых и детей.Biologically active peptides exhibiting an immunostimulating effect are widely and successfully used in medicine as drugs to enhance the nonspecific resistance of the body and in the treatment of immunodeficiency states of various origins in adults and children.
Изобретение может использоваться при получении пептидных препаратов из ткани вилочковой (зобной) железы в промышленных масштабах.The invention can be used to obtain peptide preparations from the tissue of the thymus (goiter) gland on an industrial scale.
Известно несколько способов получения биологически активного пептидов из ткани вилочковой железы копытных сельскохозяйственных животных. Все они предусматривают операции измельчения ткани, кислотную экстракцию, отделение осадка и выделение из него целевого продукта (см., например (Патент РФ №1522485, кл. А61К 35/30, 1994 г., Авторское свидетельство СССР №1112606, кл. А61К 37/24, 1982). Способы различаются условиями проведения технологических операций и веществами применяемые на данных стадиях. Известные способы не позволяют получать биологически активные пептиды из ткани вилочковой железы в достаточном количестве и высокого качества, а так же являются слишком сложными и длительными.Several methods are known for producing biologically active peptides from the thymus gland tissue of ungulate farm animals. All of them include operations of tissue grinding, acid extraction, sediment separation and isolation of the target product from it (see, for example, (RF Patent No. 1522485, class A61K 35/30, 1994, USSR Author's Certificate No. 1112606, class A61K 37 / 24, 1982). The methods differ in the conditions of the technological operations and the substances used at these stages. Known methods do not allow to obtain biologically active peptides from the thymus gland tissue in sufficient quantity and high quality, as well as are too complex and time consuming.
Наиболее близким решением к предлагаемому изобретению являются способ получения пептидов обладающих иммуностимулирующей активностью по авторскому свидетельству СССР №1112606. В соответствии с патентом исходное количество тимуса (вилочковой железы) молодняка крупного рогатого скота подвергают измельчению на волчке с диаметром отверстий решетки 2 мм. Проводят экстракцию 3%-ным раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк в концентрации 1,0 г/л при массовом соотношении измельченной массы и раствора уксусной кислоты 1:5 - 1:6. Экстракцию проводят в течение 48-72 ч с перемешиванием по 1 часу 3 раза в день. После окончания экстракции субстрат центрифугируют в течение 20 мин со скоростью 3000 об/мин. Осветленный экстракт обрабатывают охлажденным ацетоном при температуре -3 - -5°С и массовом соотношении экстракта и ацетона 1:5. Смесь перемешивают и оставляют на 20-24 часа для формирования осадка при температуре -3 - -5°С. Полученный осадок высушивают, измельчают и растворяют в дистиллированной воде при 20°С из расчета 20 г порошка в 1 л воды (2%) при рН 6,0-7,0. Водную экстракцию проводят 1-3 ч при непрерывном перемешивании и при комнатной температуре. Удаляют балластные вещества путем фильтрации. В отфильтрованный прозрачный слегка желтоватый раствор добавляют уксусной кислоты до рН 4,0. В раствор добавляют гликокол (на 1 г порошка 3 г гликокола), стерильно фильтруют через пластины EKS, разливают во флаконы и лиофилизируют.The closest solution to the proposed invention is a method for producing peptides with immunostimulating activity according to the author's certificate of the USSR No. 1112606. In accordance with the patent, the initial amount of thymus (thymus gland) of young cattle is subjected to grinding in a top with a diameter of the lattice holes 2 mm. Extraction is carried out with a 3% solution of acetic acid containing zinc chloride at a concentration of 1.0 g / l at a mass ratio of the crushed mass and the solution of acetic acid 1: 5 - 1: 6. The extraction is carried out for 48-72 hours with stirring for 1 hour 3 times a day. After extraction is complete, the substrate is centrifuged for 20 min at a speed of 3000 rpm. The clarified extract is treated with chilled acetone at a temperature of -3 - -5 ° C and a mass ratio of extract and acetone of 1: 5. The mixture is stirred and left for 20-24 hours to form a precipitate at a temperature of -3 - -5 ° C. The resulting precipitate is dried, crushed and dissolved in distilled water at 20 ° C at the rate of 20 g of powder in 1 l of water (2%) at pH 6.0-7.0. Water extraction is carried out for 1-3 hours with continuous stirring and at room temperature. Ballast substances are removed by filtration. Acetic acid is added to the filtered, clear, slightly yellowish solution to pH 4.0. Glycocol is added to the solution (3 g of glycocol per 1 g of powder), sterilely filtered through EKS plates, poured into vials and lyophilized.
В результате многочисленных экспериментов были выявлены следующие недостатки данного способа получения - низкий выход и качество целевого продуктаAs a result of numerous experiments, the following disadvantages of this production method were identified - low yield and quality of the target product
Таким образом, приведенные выше способ-прототип позволяет получать целевой продукт, содержащий пептиды обладающие иммуностимулирующей активностью, пригодные для производства фармацевтических препаратов, однако в технологическом отношении является менее предпочтительным.Thus, the above prototype method allows to obtain the target product containing peptides with immunostimulating activity, suitable for the manufacture of pharmaceutical preparations, however, in technological terms, is less preferred.
Задача настоящего изобретения состоит в способе получения целевого продукта, содержащий пептиды обладающие иммуностимулирующей активностью, обеспечивающий высокий процента выход и качества продукта, что делает его наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.The objective of the present invention is a method for producing the target product containing peptides having immunostimulating activity, providing a high percentage yield and product quality, which makes it most preferred when used on an industrial scale.
Техническим результатом настоящего изобретения является: увеличение выхода, активности и качества целевого продукта, оптимизация технологического процесса.The technical result of the present invention is: increasing the yield, activity and quality of the target product, optimization of the process.
Для достижения указанного технического результата предложен способ который включает в себя следующие стадии:To achieve the specified technical result, a method is proposed which includes the following stages:
Вилочковую железу убойных животных обрабатывают с удалением жировой ткани, сгустков крови и замораживают, замороженную ткань измельчают, гомогенизируют и проводят экстракцию 3% раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:5. Значение рН раствора должно быть рН 3.5. Для экстракции гомогенат выдерживают при температуре не выше +20°С при постоянном перемешивании в течение 48 часов. По окончании экстракции гомогенат сепарируют, отделяют твердую и жидкую фазы. К надосадочной жидкости добавляют охлажденный ацетон (температура не выше +5°С) в соотношении 1:5. Смесь перемешивают в течение 4 часов при температур +5°С. Образовавшийся осадок отделяют на центрифуге и несколько раз промывают охлажденным ацетоном. Полученный влажный осадок сушат в вакуум-сушильном шкафу. Получают ацетоновый порошок. Ацетоновый порошок растворяют в воде для инъекций и устанавливают рН 7,0. Добавляют фермент - сериновую эндопротеазу, выдерживают при постоянном перемешивании до +65°С в течение 3 часов. Для инактивации фермента температуру реакционной массы увеличивается до +90°С и выдерживают в течение 30 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры, сепарируют или фильтруют. Далее проводят стерилизующую фильтрацию путем пропускания раствора через мембрану с диаметром пор 0,22 мм. Раствор разливают в емкости, замораживают и лиофилизируют. Целевой продукт представляет лиофилизированный порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета и содержит комплекс биологически активных пептидов.The thymus gland of slaughtered animals is treated to remove adipose tissue, blood clots and frozen, the frozen tissue is crushed, homogenized and extracted with a 3% solution of acetic acid containing zinc chloride at a concentration of 1.2 g / l at a weight ratio of homogenate and acetic acid solution 1: 5. The pH of the solution should be pH 3.5. For extraction, the homogenate is maintained at a temperature not exceeding + 20 ° C with constant stirring for 48 hours. At the end of the extraction, the homogenate is separated, and the solid and liquid phases are separated. Chilled acetone (temperature no higher than + 5 ° C) is added to the supernatant in a ratio of 1: 5. The mixture is stirred for 4 hours at temperatures of + 5 ° C. The precipitate formed is centrifuged and washed several times with chilled acetone. The resulting wet cake is dried in a vacuum oven. Get acetone powder. Acetone powder is dissolved in water for injection and the pH is adjusted to 7.0. Add the enzyme - serine endoprotease, incubated with constant stirring up to + 65 ° C for 3 hours. To inactivate the enzyme, the temperature of the reaction mass is increased to + 90 ° C and maintained for 30 minutes. Then cooled to room temperature, separated or filtered. Sterilization filtration is then carried out by passing the solution through a membrane with a pore diameter of 0.22 mm. The solution is poured into containers, frozen and lyophilized. The target product is a lyophilized powder of white or white with a yellowish tint and contains a complex of biologically active peptides.
Для производства используют вилочковую железу телят и молодняка крупного рогатого скота. Замороженную вилочковую железу используют не позднее чем через 8-10 месяцев.For production, the thymus gland of calves and young cattle is used. Frozen thymus is used no later than after 8-10 months.
Использование повышенной концентрации хлористого цинка (1,2 г/л) способствует более полному извлечению активных фракций из гомогенизированной ткани вилочковой железы. Применение протеолитического фермента сериновой эндопротеазы, обладающей широкой субстрат - специфичностью, при высокой ионной силе, способствует более полному высвобождению и накоплению биологически активных пептидов из ацетонового порошка. Конечная концентрация фермента при ферментативном гидролизе составляет 0,3%. Проведенными нами исследованиями, по кинетики высвобождения пептидов из ацетонового порошка при ферментативном гидролизе, установлено, что максимальное количество пептидов накапливается в гидролизате в течение 3 часов. В течение данного времени интенсивно протекает протеолиз и происходит максимальное накопление продуктов промежуточного гидролиза белково-пептидных субстратов. Применение ограниченного ферментативного гидролиза способствует полному удалению высокомолекулярных белковых примесей из целевого продукта, которые могут вызывать негативные последствия, такие как аллергические реакции и прионные заболевания. В данном случае ферментативный гидролиз можно рассматривать, как альтернативный вариант методу ультрафильтрации с целью удаления белковых веществ проявляющие побочные свойства. Отсутствие белковых примесей в целевом продукте подтверждено методами ВЭЖХ и электрофореза по Леммли (Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклемновых кислот Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот М.: Наука, 1985. 536 с, Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.).The use of an increased concentration of zinc chloride (1.2 g / l) contributes to a more complete extraction of active fractions from the homogenized tissue of the thymus gland. The use of the proteolytic enzyme of serine endoprotease, which has a wide substrate - specificity, with high ionic strength, contributes to a more complete release and accumulation of biologically active peptides from acetone powder. The final concentration of the enzyme during enzymatic hydrolysis is 0.3%. Our studies on the kinetics of the release of peptides from acetone powder during enzymatic hydrolysis, it was found that the maximum number of peptides accumulates in the hydrolyzate within 3 hours. During this time, proteolysis proceeds intensively and the maximum accumulation of products of intermediate hydrolysis of protein-peptide substrates occurs. The use of limited enzymatic hydrolysis promotes the complete removal of high molecular weight protein impurities from the target product, which can cause negative consequences, such as allergic reactions and prion diseases. In this case, enzymatic hydrolysis can be considered as an alternative to the ultrafiltration method in order to remove protein substances that exhibit side properties. The absence of protein impurities in the target product was confirmed by the methods of HPLC and electrophoresis according to Lemmli (Osterman L.A. Chromatography of proteins and nucleic acids Osterman L.A. Methods for the study of proteins and nucleic acids M .: Nauka, 1985.536 s, Electrophoresis and ultracentrifugation (practical allowance), Moscow: Nauka, 1981.288 p.).
Согласно литературным данным при ограниченном протеолизе белков происходит высвобождение низкомолекулярных пептидов, которые обладают выраженными биологически активными свойствами. Например, при протеолизе казеина (белок содержащийся в молоке) высвобождаются пептиды, которые обладают анальгетическими свойствами - казоморфины, при протеолизе иммуноглобулинов, в частности иммуноглобулинов G, образуются иммуномодулируюшие пептиды - тафцин, ригин, пептиды коллагена и фибронектина участвующие в тканевом и клеточном гомеостазе (Структурные основы действия пептидных и белковых иммунорегуляторовлод ред. Чипенса Г.И. Рига: Зинатне, 1990. 324 с, Jinsmaa Y, Yoshikawa М, 1999; «Enzymatic release of neocasomorphin and beta-casomorphhinfrom bovine beta-casein»; Peptides 20:957-962.,).According to published data, with limited proteolysis of proteins, low molecular weight peptides are released that have pronounced biologically active properties. For example, during the proteolysis of casein (the protein contained in milk) peptides are released that have analgesic properties - casomorphins; during the proteolysis of immunoglobulins, in particular immunoglobulins G, immunomodulating peptides are formed - tuftsin, rigin, collagen and fibronectin peptides involved in tissue and cell tissue homeostasis the basics of the action of peptide and protein immunoregulators under the editorship of Chipens GI Riga: Zinatne, 1990. 324 s, Jinsmaa Y, Yoshikawa M, 1999; “Enzymatic release of neocasomorphin and beta-casomorphhinfrom bovine beta-casein”; Peptides 20: 957- 962.,).
Использование ацетона на одной из стадий технологического процесса позволяет не только удалить липиды, пигменты и полисахариды, но и значительно сократить содержание уксусной кислоты и цинка хлористого в готовом продукте. Необходимо подчеркнуть, что из ацетонового порошка в основном извлекаются водорастворимые полипептиды и белки, что особенно важно при учете их фармакокинетики и биодоступности.The use of acetone at one of the stages of the technological process allows not only to remove lipids, pigments and polysaccharides, but also significantly reduce the content of acetic acid and zinc chloride in the finished product. It should be emphasized that water-soluble polypeptides and proteins are mainly extracted from acetone powder, which is especially important when considering their pharmacokinetics and bioavailability.
Сопоставимый анализ предлагаемого способа показал, что определяющим отличием заявляемого технического решения от прототипа является то, что биологически активные водорастворимые пептиды выделяют на стадии экстракции из ацетонового порошка при ферментативном гидролизе, при этом значительно повышается выход и качество целевого продукта (таблица 1).A comparable analysis of the proposed method showed that the defining difference of the claimed technical solution from the prototype is that biologically active water-soluble peptides are isolated at the stage of extraction from acetone powder by enzymatic hydrolysis, while the yield and quality of the target product are significantly increased (table 1).
Изобретение иллюстрируется примером конкретного выполнения способа: Предварительно размороженное сырье в количестве 20 кг подвергают измельчению с помощью волчка с диаметром отверстий решетки 3 мм. Далее проводят экстракцию 3% раствором кислоты уксусной при рН 3,5, содержащий цинк хлористый в концентрации 1,2 г/л при массовом соотношении измельченной массы и экстракционного раствора 1:5. В начале процесса экстракции смесь гомогенизируют погружным диспергатором при частоте вращения ротора 3000 об/мин в течение 20 минут и далее экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течении 48 часов при температуре не более +20°С. По окончании процесса экстракции проводят отделение жидкой и твердой части экстракционной смеси при помощи сепаратора. Режим сепарации 2000-3000 об/мин.The invention is illustrated by an example of a specific implementation of the method: Pre-thawed raw materials in the amount of 20 kg are subjected to grinding using a spinning top with a diameter of the holes of the lattice 3 mm Next, extraction is carried out with a 3% solution of acetic acid at pH 3.5, containing zinc chloride at a concentration of 1.2 g / l at a mass ratio of the ground mass and the extraction solution of 1: 5. At the beginning of the extraction process, the mixture is homogenized with an immersion dispersant at a rotor speed of 3000 rpm for 20 minutes and then the extraction is carried out with constant stirring for 48 hours at a temperature of no more than + 20 ° С. At the end of the extraction process, the liquid and solid parts of the extraction mixture are separated using a separator. Separation mode 2000-3000 rpm.
Отфильтрованный раствор экстракта охлаждается при перемешивании в течение 24 часов, после чего начинается процесс осаждения. К охлажденному экстракту добавляют в соотношении 1:5 охлажденный ацетон при температура не выше +5°С. Далее смесь перемешивают и выдерживают в течение 4 часов для формирования осадка. Осадок отделяется от жидкой фазы при помощи центрифуги. Твердая фаза несколько раз (2-3 раза) промывается охлажденным ацетоном до тех пор, пока осадок не приобретет светлосерый или белый цвет. Полученный влажный осадок ацетонового порошка направляют в вакуумно-сушильный шкаф для сушки при температуре не выше +20°С. Время высушивания составляет 2,5-3,0 часа. Получают ацетоновый порошок в количестве 1,26 кг. Водно-ацетоновая смесь направляют на регенерацию ацетона.The filtered extract solution is cooled with stirring for 24 hours, after which the precipitation process begins. Chilled acetone is added to the chilled extract in a ratio of 1: 5 at a temperature not exceeding + 5 ° C. Next, the mixture is stirred and incubated for 4 hours to form a precipitate. The precipitate is separated from the liquid phase using a centrifuge. The solid phase is washed several times (2-3 times) with chilled acetone until the precipitate acquires a light gray or white color. The obtained wet cake of acetone powder is sent to a vacuum drying oven for drying at a temperature not exceeding + 20 ° C. Drying time is 2.5-3.0 hours. 1.26 kg of acetone powder is obtained. The water-acetone mixture is directed to the regeneration of acetone.
К ацетоновому порошку добавляют расчетное количество воды для инъекций при рН 7,0. Затем вносят сериновую эндопротеазу (0,3% от общего объема раствора полупродукта). После внесения фермента раствор полупродукта нагревают при постоянном перемешивании до +65°С. Нагрев осуществляют в течение 3 часов. Затем температуру реакционной массы увеличивают до +90°С и выдерживается в течение 30 минут для инактивации фермента.The calculated amount of water for injection at pH 7.0 is added to the acetone powder. Then make a serine endoprotease (0.3% of the total volume of the intermediate solution). After making the enzyme, the intermediate product is heated with constant stirring to + 65 ° C. Heating is carried out for 3 hours. Then the temperature of the reaction mass is increased to + 90 ° C and maintained for 30 minutes to inactivate the enzyme.
После окончания ферментативного гидролиза реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и подают на сепаратор для удаления твердой фазы. Режим сепарирования при 2000-3000 об/мин. Полученный фильтрат собирают и передают на стадию стерилизующей фильтрации.After enzymatic hydrolysis is complete, the reaction mixture is cooled to room temperature and fed to a separator to remove the solid phase. Separation mode at 2000-3000 rpm. The obtained filtrate is collected and transferred to the stage of sterilizing filtration.
Процессы стадии стерилизующей фильтрации осуществляют в помещении класса чистоты В. Полученный стерильный раствор разливают в предварительно подготовленные стерильные поддоны и передают на стадию лиофильной сушки.The processes of the sterilizing filtration stage are carried out in a room of purity class B. The resulting sterile solution is poured into previously prepared sterile trays and transferred to the freeze-drying stage.
Процессы стадии осуществляются в помещении класса чистоты В с локальной зоной А в зоне загрузки/выгрузки сушки. Процесс производства осуществляют на лиофильной сушке в автоматическом режиме.The stage processes are carried out in a room of cleanliness class B with a local zone A in the drying loading / unloading zone. The production process is carried out on freeze drying in automatic mode.
Высушенный готовый продукт представляет собой хорошо сформированный порошок белого или желтовато-белого цвета, потери в массе при высушивании не должны превышать 10%. Выход готового продукта составляет 0,380 кг сухого порошка. Высушенный готовый продукт упаковывается в первичную упаковку и передается в помещение для хранения, где маркируется и временно хранится в холодильнике.The dried finished product is a well-formed powder of white or yellowish white color, the mass loss during drying should not exceed 10%. The yield is 0.380 kg of dry powder. The dried finished product is packed in primary packaging and transferred to the storage room, where it is marked and temporarily stored in the refrigerator.
Далее проводят контроль параметров полученного продукта (таблица 2 и таблица 3): Полученный заявляемым способом целевой продукт был проверен на биологическую активность. Биологическую активность оценивают по иммунологической активности выделенных лимфоцитов крови с использованием метода розеткообразования (РО). Тест розеткообразования основан на различиях рецепторной структуры лейкоцитов (лимфоцитов, гранулоцитов, моноцитов), которые при взаимодействии с эритроцитами могут спонтанно присоединять последние к своей поверхности. При этом образуются фигуры, напоминающие розетки, в центре которых находится лейкоцит, а вокруг него располагаются не менее 3-5 эритроцитов. В формировании розеток участвуют антигены самих эритроцитов, которые образуют спонтанные и иммунные розетки: спонтанные розетки - между лимфоцитами животных и эритроцитами кролика.Next, they control the parameters of the obtained product (table 2 and table 3): Obtained by the claimed method, the target product was tested for biological activity. Biological activity is assessed by the immunological activity of the isolated blood lymphocytes using the method of rosette formation (PO). The test of rosette formation is based on differences in the receptor structure of leukocytes (lymphocytes, granulocytes, monocytes), which, when interacting with red blood cells, can spontaneously attach the latter to their surface. In this case, figures resembling sockets are formed, in the center of which there is a white blood cell, and at least 3-5 red blood cells are located around it. The formation of rosettes involves antigens of the red blood cells themselves, which form spontaneous and immune rosettes: spontaneous rosettes - between animal lymphocytes and rabbit erythrocytes.
Испытание проводят в реакции «активного» розеткообразования (РОК) обработанных трипсином тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика. Время проведения опыта на одном животном от момента его умерщвления и извлечения тимуса до подсчета процентного содержания розеткообразующих клеток (РОК) не должно превышать 2 часа.The test is carried out in the reaction of "active" rosette formation (ROCK) of trypsin-treated guinea pig thymocytes with rabbit erythrocytes. The time for conducting an experiment on one animal from the time of its killing and extraction of the thymus to the calculation of the percentage of rosetting cells (ROCK) should not exceed 2 hours.
В опыт берут последовательно 5 морских свинок с массой тела 150-250 г. От каждого животного, умервщленного в камере для эфтаназии, отбирали тимус. Одну долю тимуса помещают в 5 мл среды 199, затем в стеклянный гомогенизатор, тщательно гомогенизируют. Затем гомогенат фильтруют через 4 слоя марли, предварительно смоченной средой 199, в центрифужную пробирку. Пробирку с суспензией клеток центрифугируют при 1500 об/мин (400 g) в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют и к осадку прибавляют 1 мл среды 199, суспензируют. В сухую центрифужную пробирку вносят 0,33 мл 3% раствора кислоты уксусной и 0,02 мл взвеси тимоцитов, тщательно перемешивают. В камере Горяева подсчитывают количество клеток в 100 больших квадратах, полученное число умножают на 5*104 и получают количество клеток в 1 мл. Если количество клеток в 1 мл окажется менее 100*106. животное исключают из опыта и заменяют другим. Полученную суспензию клеток разбавляют средой 199 до концентрации 20*106 клеток/мл. Одновременно готовят концентрацию суспензии 2*106 клеток/мл (норма).Five guinea pigs with a body weight of 150-250 g were taken sequentially into the experiment. Thymus was selected from each animal killed in the chamber for ephtanasia. One portion of the thymus is placed in 5 ml of medium 199, then in a glass homogenizer, thoroughly homogenized. Then the homogenate is filtered through 4 layers of gauze, pre-moistened with medium 199, in a centrifuge tube. The cell suspension tube is centrifuged at 1500 rpm (400 g) for 10 minutes. The supernatant is removed and 1 ml of medium 199 is added to the precipitate and suspended. 0.33 ml of a 3% solution of acetic acid and 0.02 ml of a suspension of thymocytes are added to a dry centrifuge tube, mixed thoroughly. In the Goryaev’s chamber, the number of cells in 100 large squares is calculated, the resulting number is multiplied by 5 * 10 4 and the number of cells in 1 ml is obtained. If the number of cells in 1 ml is less than 100 * 10 6 . the animal is excluded from the experiment and replaced with another. The resulting cell suspension is diluted with medium 199 to a concentration of 20 * 10 6 cells / ml. At the same time, a suspension concentration of 2 * 10 6 cells / ml was prepared (normal).
В сухую центрифужную пробирку вносят в соотношении 6:1 суспензию тимоцитов в концентрации 20*106 клеток/мл и 0,5% раствор трипсина в среде 199, приготовленный непосредственно перед использованием. После прибавления раствора трипсина образовавшийся сгусток удаляют отсасыванием пипеткой. Суспензию клеток центрифугируют при 1500 об/мин (400 g) в течение 10 мин. Надосадочную жидкость аккуратно сливают, прибавляют 3 мл среды 199, тщательно ресуспендируют. Затем отмывают тимоциты от трипсина в этом же режиме. К осадку прибавляют 1 мл среды, тщательно ресуспендируют. Затем готовят рабочую суспензию с концентрацией 2*106 клеток/мл (контроль), как указано ранее. Определение биологической активности субстанции экстракта вилочковой железы с использованием тимоцитов от одной морской свинки проводят следующим образом. В первую центрифужную пробирку вносят 0,1 мл контрольной суспензии тимоцитов в концентрации 2*106 клеток/мл (норма). Во вторую (контроль) и третью (опыт) центрифужные пробирки вносят по 0,1 мл рабочей суспензии тимоцитов, обработанных трипсином, в той же концентрации. В третью пробирку прибавляют 0,02 мл испытуемого раствора. Затем во все пробирки прибавляют по 0,1 мл % суспензии свежих отмытых раствором натрия хлорида изотонического 0,9% эритроцитов кролика, разведенных в среде 199. Взвесь клеток перемешивают и центрифугируют в течение 5 минут при 800-1000 об/мин (200g). Клетки ресуспендируют и в камере Горячева подсчитывают процентное содержание РОК в каждой из трех пробирок. За РОК принимают тимоцит, присоединивший 3 и более эритроцитов. В случае определения числа РОК в субстанции в норме (без обработки трипсином) менее 40% или процентного содержания РОК в опыте менее чем в контроле, животное исключают из опыта и заменяют другим. Определяют средние арифметические показатели процентного содержания РОК у 5 животных. Субстанцию считают биологически активной, если при снижении среднеарифметического числа РОК при воздействии трипсина по сравнению с нормой, она восстанавливает количество РОК не менее чем на 40% по сравнению с контролем.A 6: 1 suspension of thymocytes at a concentration of 20 * 10 6 cells / ml and a 0.5% trypsin solution in medium 199, prepared immediately before use, are introduced into a dry centrifuge tube at a ratio of 6: 1. After the trypsin solution was added, the resulting clot was removed by aspiration with a pipette. The cell suspension is centrifuged at 1500 rpm (400 g) for 10 minutes. The supernatant is carefully drained, 3 ml of medium 199 are added, and they are carefully resuspended. Then thymocytes are washed from trypsin in the same mode. 1 ml of medium is added to the precipitate, carefully resuspended. Then prepare a working suspension with a concentration of 2 * 10 6 cells / ml (control), as indicated previously. The determination of the biological activity of the substance of the thymus extract using thymocytes from one guinea pig is carried out as follows. 0.1 ml of a control suspension of thymocytes at a concentration of 2 * 10 6 cells / ml (normal) is added to the first centrifuge tube. In the second (control) and third (experiment) centrifuge tubes add 0.1 ml of a working suspension of thymocytes treated with trypsin in the same concentration. 0.02 ml of the test solution is added to the third tube. Then, 0.1 ml% suspension of fresh isotonic 0.9% rabbit erythrocytes diluted in 199 medium, washed with sodium chloride solution diluted in 199 medium, is added to all test tubes. The suspension of cells is mixed and centrifuged for 5 minutes at 800-1000 rpm (200g). Cells are resuspended and the percentage of ROCK in each of the three tubes is counted in the Goryachev chamber. For ROCK take thymocyte, attached 3 or more red blood cells. In the case of determining the number of ROCK in the substance in the norm (without trypsin treatment) less than 40% or the percentage of ROCK in the experiment less than in the control, the animal is excluded from the experiment and replaced with another. Determine the arithmetic mean of the percentage of ROCK in 5 animals. A substance is considered biologically active if, with a decrease in the arithmetic mean number of ROC under the influence of trypsin compared to the norm, it restores the amount of ROC by at least 40% compared to the control.
Выявлено, что продукт полученный заявленным способом обладает выраженной биологической активностью - процент восстановления РОК (розеткообразующих клеток) достоверно превышали 40% относительно контрольных значений (таблица 2).It was revealed that the product obtained by the claimed method has a pronounced biological activity - the percentage recovery of ROCK (rosette-forming cells) significantly exceeded 40% relative to the control values (table 2).
Проведенные испытания представлены в таблице 3.The tests are presented in table 3.
Представленные в таблице 3 данные демонстрируют, что полученный заявленным способом целевой продукт имеет аналогичные качественные и количественные характеристики, а по некоторым параметрам заявленный продукт превосходит известный.The data presented in table 3 demonstrate that the target product obtained by the claimed method has similar qualitative and quantitative characteristics, and in some parameters the claimed product exceeds the known one.
Таким образом, целевой продукт, полученный предлагаемым способом, соответствует всем параметрам фармацевтического продукта - субстанции.Thus, the target product obtained by the proposed method meets all the parameters of a pharmaceutical product - substance.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128861A RU2669691C1 (en) | 2017-08-14 | 2017-08-14 | Method for producing a complex of biologically active peptides having immunostimulating activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128861A RU2669691C1 (en) | 2017-08-14 | 2017-08-14 | Method for producing a complex of biologically active peptides having immunostimulating activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2669691C1 true RU2669691C1 (en) | 2018-10-15 |
Family
ID=63862365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017128861A RU2669691C1 (en) | 2017-08-14 | 2017-08-14 | Method for producing a complex of biologically active peptides having immunostimulating activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2669691C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2049472C1 (en) * | 1992-12-21 | 1995-12-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Method of preparing brain tissue hydrolyzate "cerebrolyzate" |
| SU1112606A1 (en) * | 1982-04-27 | 1996-08-20 | Ленинградское производственное объединение мясной промышленности им. С.М.Кирова | Method of preparing immunostimulating agent from thymus gland |
| RU2090194C1 (en) * | 1994-09-30 | 1997-09-20 | Игорь Арнольдович Скворцов | Method for producing preparation for treating coordination disturbances in cerebellum and brain stem region |
-
2017
- 2017-08-14 RU RU2017128861A patent/RU2669691C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1112606A1 (en) * | 1982-04-27 | 1996-08-20 | Ленинградское производственное объединение мясной промышленности им. С.М.Кирова | Method of preparing immunostimulating agent from thymus gland |
| RU2049472C1 (en) * | 1992-12-21 | 1995-12-10 | Научно-производственное объединение "Иммунопрепарат" | Method of preparing brain tissue hydrolyzate "cerebrolyzate" |
| RU2090194C1 (en) * | 1994-09-30 | 1997-09-20 | Игорь Арнольдович Скворцов | Method for producing preparation for treating coordination disturbances in cerebellum and brain stem region |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Выделение регуляторных пептидов из тимусамина - нуклеопротеинового комплекса тимуса/А.Ю. Соловьев, Д.В. Жилинский, И.А. Чернова, Б.Я. Басин, Л.К. Шатаева, В.Х. Хавинсон // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2011. - Т.11. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR910009342B1 (en) | Process for preparing biologically active extract | |
| CN102933595A (en) | Atelocollagen separation method, method for preparing modified atelocollagen, and atelocollagen- and collagen-based matrix prepared by the methods | |
| JPH08501688A (en) | Method for manufacturing beta-casein fortified products | |
| WO2012002837A1 (en) | Method for producing a biologically active complex. biologically active protein/polypeptide complex | |
| RU2409291C1 (en) | Method for production of water-soluble polypeptide complex of salmon fishes liver | |
| RU2669691C1 (en) | Method for producing a complex of biologically active peptides having immunostimulating activity | |
| RU2669693C1 (en) | Method for obtaining a complex of biologically active peptides that restore the prostate gland function | |
| RU2669692C1 (en) | Method for producing complex of biologically active peptides with neurotropic activity | |
| RU2287959C2 (en) | Method for producing of natural structurizers from fish wastes | |
| RU2560845C1 (en) | Method for producing low-molecular activated embryonic complex (nika-em) | |
| RU2563816C1 (en) | Method for producing immune stimulant | |
| RU2488634C1 (en) | Method to produce dna from salmon roe | |
| RU2481113C2 (en) | Method for preparing substances having effect on proliferation of a431 human epidermoid carcinoma cells | |
| RU2625497C1 (en) | Method for manufacturing food additive from wild plant of lupin | |
| RU2128511C1 (en) | Method of preparing drug used in sicknesses associated with central nervous system functional damages | |
| RU2338375C2 (en) | Method of plasma or blood serum storage for obtaining of immunoglobulene and albuminous biological preparations | |
| RU2737730C2 (en) | Method for fractionation of leukocyte proteins | |
| RU1417244C (en) | Method of preparing of substance recovering prostate gland function | |
| RU2782347C1 (en) | Processing method for poultry bursa of fabricius | |
| RU2736645C1 (en) | Method for producing a bacteriologically pure protein product with high content of minor proteins | |
| RU2332423C2 (en) | Method of preparation of thymic peptide | |
| RU2483565C2 (en) | Method for production of modified protein isolate of sunflower press cake | |
| JP2010018575A (en) | Jellyfish extracted fraction exhibiting cell adhesion-inhibiting activity | |
| RU2671537C2 (en) | Hyaluronidase preparation and method of its preparation | |
| RU2677042C1 (en) | Method of complex processing of red deer bones |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200815 |