RU2128511C1

RU2128511C1 - Method of preparing drug used in sicknesses associated with central nervous system functional damages

Info

Publication number: RU2128511C1
Application number: RU97119997/14A
Authority: RU
Inventors: Александр Павлович Иванов (UA); Александр Павлович Иванов; Иван Иванович Кузьменко (UA); Иван Иванович Кузьменко; Александр Георгиевич Паничев (UA); Александр Георгиевич Паничев; Станислав Владимирович Губченко (UA); Станислав Владимирович Губченко; Владимир Яковлевич Найштетик (UA); Владимир Яковлевич Найштетик
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "НИР"
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1997-12-02
Publication date: 1999-04-10

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: method involves homogenization of an animal embryo brain tissue in physiological solution. Then homogeneity is kept up to termination of an extraction process, formed precipitate is removed and a preserving agent is added to solution. Solution is sterilized by filtration and kept its up to lipid layer formation termination. Then lipid layer is separated and solution is kept up to aggregation process ceasing. Then formed particles are separated and solution is subjected for an interaction with immobilized proteolytic enzyme. An agent can be used in medicine and pharmacology. EFFECT: higher efficiency. 1 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармакологии и медицине. The invention relates to biotechnology and can be used in pharmacology and medicine.

К заболеваниям, сопровождающимся нарушением функций центральной нервной системы, относятся различные формы неврологической и психиатрической патологии. Diseases accompanied by dysfunction of the central nervous system include various forms of neurological and psychiatric pathology.

Поскольку указанные заболевания значительно распространены, а арсенал средств для их лечения весьма ограничен, то поиски способов получения новых средств представляют собой существенный интерес. Since these diseases are significantly common, and the arsenal of funds for their treatment is very limited, the search for ways to obtain new drugs is of significant interest.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, заключающийся в использовании в качестве исходного сырья мозга животных (Рекламный проспект фирмы "Эбеве", Австрия, "Церебролизин"). Closest to the claimed is a method of obtaining a therapeutic agent for diseases accompanied by dysfunction of the central nervous system, which consists in using animal brain as a source of raw material (Promotional brochure of the company Ebeve, Austria, Cerebrolysin).

Сырье подвергают гомогенизации, после чего производят экстракцию, предназначенную для извлечения растворимых в воде компонентов, затем предусмотрено освобождение полученного экстракта от белка. Активная фракция церебролизина представляет собой низкомолекулярные и биологически активные нейропептиды, которые способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и непосредственно поступать к нервным клеткам. The raw material is subjected to homogenization, after which an extraction is carried out to extract water-soluble components, then the protein obtained is released from the extract. The active fraction of cerebrolysin is a low molecular weight and biologically active neuropeptides that are able to cross the blood-brain barrier and directly enter the nerve cells.

Известный способ позволяет получить лечебное средство необходимого действия, однако природа и сочетание входящих в него активных нейропептидов не обеспечивает достаточно высокой активности средства и, кроме того, спектр действия полученного средства несколько ограничен. The known method allows to obtain a therapeutic agent of the required action, however, the nature and combination of the active neuropeptides included in it does not provide a sufficiently high activity of the agent and, in addition, the spectrum of action of the obtained agent is somewhat limited.

Задачей настоящего изобретения является создание способа получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, в котором за счет выбранной совокупности действий и режимов, направленных на получение пренатальных нейропептидов и расщепления неактивных высокомолекулярных предшественников достигается высокая активность получаемого средства и значительно расширяется спектр его действия. The objective of the present invention is to provide a method for producing a therapeutic agent for diseases accompanied by dysfunction of the central nervous system, in which due to the selected set of actions and modes aimed at obtaining prenatal neuropeptides and splitting of inactive high molecular weight precursors, a high activity of the obtained agent is achieved and its spectrum of action is significantly expanded .

Поставленная задача решается тем, что в способе получения лечебного средства при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, заключающемся в гомогенизации ткани мозга животного, экстракции растворимых компонентов, согласно изобретению ткань мозга извлекают из эмбриона животного, а гомогенизированную массу разбавляют физиологическим раствором, после чего выдерживают ее до завершения процессов экстракции, а к раствору, полученному после удаления образовавшегося осадка, добавляют консервант в количестве не менее 0,05%, производят стерилизацию раствора фильтрованием и выдерживают его до завершения образования липидного слоя, а после его отделения оставшийся раствор выдерживают до прекращения процессов агрегации при температуре, не превышающей физиологическую, затем после отделения образовавшихся частиц раствор подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим взаимодействия устанавливают исходя из контрольной пробы получаемого средства и полученный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре не выше 10^oC.The problem is solved in that in the method of obtaining a therapeutic agent for diseases accompanied by dysfunction of the central nervous system, which consists in homogenizing the brain tissue of an animal, extracting soluble components, according to the invention, the brain tissue is removed from the animal’s embryo, and the homogenized mass is diluted with physiological saline, after which maintain it until the completion of the extraction processes, and to the solution obtained after removal of the precipitate formed, add a preservative in quantity At least 0.05%, sterilize the solution by filtration and maintain it until the formation of the lipid layer is complete, and after its separation, the remaining solution is maintained until the aggregation stops at a temperature not exceeding the physiological one, then after separation of the formed particles, the solution is reacted with an immobilized proteolytic enzyme, and the interaction mode is set based on a control sample of the obtained product and the resulting solution is incubated for 30 days at temperature not higher than 10 ^o C.

Использование в заявляемом способе в качестве исходного сырья мозговой ткани эмбриона животных, например крупного рогатого скота, связано с наличием в ней регуляторных пептидов пренатального периода, что определяет основные свойства получаемого средства. The use of the inventive method as an initial raw material of the brain tissue of an animal embryo, for example cattle, is associated with the presence of prenatal regulatory peptides in it, which determines the main properties of the obtained agent.

После процесса гомогенизации полученную массу разбавляют физиологическим раствором и выдерживают до полной экстракции растворимых белков пептида. Условия указанной операции контролируют посредством определения полноты экстракции. В процессе экстракции образуется осадок нерастворимых частиц: белки, липиды, мембраны и др., осадок подлежит удалению. After the homogenization process, the resulting mass is diluted with physiological saline and kept until complete extraction of soluble peptide proteins. The conditions of this operation are controlled by determining the completeness of the extraction. In the process of extraction, a precipitate of insoluble particles is formed: proteins, lipids, membranes, etc., the precipitate must be removed.

Полученный после удаления осадка раствор содержит в себе белки, аминокислоты, липиды и представляет собой основу для получения целевого продукта. The solution obtained after removal of the precipitate contains proteins, amino acids, lipids and is the basis for obtaining the target product.

Добавление к такому раствору консерванта в количестве не менее 0,05% обусловлено необходимостью противовирусного, противогрибкового и т.п. обеззараживания получаемого средства. The addition of a preservative to such a solution in an amount of at least 0.05% is due to the need for an antiviral, antifungal, etc. disinfection of the product.

Образовавшуюся взвесь отделяют, поскольку она будет отрицательно влиять на последующие процессы способа. Отделение взвеси можно осуществлять, например, фильтрованием. The resulting suspension is separated, because it will adversely affect the subsequent processes of the method. Suspension may be carried out, for example, by filtration.

Стерилизованный раствор выдерживают при комнатной температуре до завершения образования липидного слоя (время выдержки обычно составляет 5 суток), липидный слой затем отделяют. Оставшийся раствор выдерживают при температуре, не превышающей физиологическую, поскольку при более высокой температуре термолабильные белки будут подвергаться денатурации. Время выдержки зависит от завершения процессов агрегации частиц, о чем можно судить по изменению прозрачности раствора. The sterilized solution is kept at room temperature until the formation of the lipid layer (completion time is usually 5 days), the lipid layer is then separated. The remaining solution is maintained at a temperature not exceeding physiological, since at a higher temperature the thermolabile proteins will undergo denaturation. The exposure time depends on the completion of the particle aggregation processes, which can be judged by the change in the transparency of the solution.

Образовавшийся осадок отделяют, а раствор подвергают процессу протеолиза на колонне с иммобилизованным ферментом. Указанный процесс обеспечивает необходимую специфичность действия образовавшихся в результате расщепления пептидов. The precipitate formed is separated, and the solution is subjected to a proteolysis process on a column with an immobilized enzyme. The specified process provides the necessary specificity of the action resulting from the cleavage of peptides.

Окончательным завершающимся этапом заявляемого способа является выдерживание полученного элюента обычно в течение 30 суток при температуре 10^oC до его стабилизации, другими словами, выдерживание элюата при данных условиях препятствует процессам агрегации неактивных частиц.The final stage of the proposed method is the aging of the obtained eluent, usually for 30 days at a temperature of 10 ^o C until it stabilizes, in other words, the aging of the eluate under these conditions prevents the aggregation of inactive particles.

Изобретение поясняется примерами конкретного выполнения. The invention is illustrated by examples of specific performance.

Пример
Для получения заявляемого лечебного средства берут 100 г ткани головного мозга эмбриона свиньи, затем производят измельчение и гомогенизацию при температуре 8^oC. К полученной массе добавляют 400 мл физраствора, охлажденного до температуры 10^oC, массу выдерживают при перемешивании при температуре 8^oC до завершения процессов экстракции растворимых белков в течение 36 часов. Образовавшийся осадок отделяют после центрифугирования при 3000 g в течение 1 часа при температуре 24^oC.Example
To obtain the claimed therapeutic agent, take 100 g of brain tissue of a pig embryo, then grind and homogenize at a temperature of 8 ^o C. To the resulting mass add 400 ml of saline, cooled to a temperature of 10 ^o C, the mass is kept under stirring at a temperature of 8 ^o C to completion of soluble protein extraction processes within 36 hours. The precipitate formed is separated after centrifugation at 3000 g for 1 hour at a temperature of 24 ^o C.

К полученному экстракту по каплям добавляют, избегая вспенивания и перемешивая 50 мл 1%-ного раствора хинозола в физрастворе. Затем раствор стерилизуют фильтрованием, а образовавшийся раствор выдерживают в течение 5 суток при 20 - 25^oC, после чего продолжают выдерживать раствор еще 1 час при температуре 50^oC.To the obtained extract is added dropwise, avoiding foaming and stirring with 50 ml of a 1% solution of quinosol in saline. Then the solution is sterilized by filtration, and the resulting solution is kept for 5 days at 20 - 25 ^o C, after which they continue to withstand the solution for another 1 hour at a temperature of 50 ^o C.

При таких условиях образуется липидный слой, который после охлаждения отделяют, а раствор подвергают фильтрации через фильтр 45 мкм. Under such conditions, a lipid layer is formed, which is separated after cooling, and the solution is filtered through a 45 μm filter.

Полученный фильтрат пропускают через колонку, заполненную носителем (например, сефарозой B) с иммобилизованным ферментом. The filtrate obtained is passed through a column filled with a vehicle (e.g., Sepharose B) with an immobilized enzyme.

Скорость элюции устанавливают исходя из полноты расщепления высокомолекулярных компонентов. Содержание белка в полученном продукте составляет 12 мг/мл. Элюат стерилизуют в асептических условиях фильтрацией через фильтр 0,22 мкм. The elution rate is set based on the completeness of the splitting of high molecular weight components. The protein content in the resulting product is 12 mg / ml. The eluate is sterilized under aseptic conditions by filtration through a 0.22 μm filter.

Затем стерилизованный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре 10^oC. После стерилизации путем последовательной фильтрации через фильтры 0,45 мкм и 0,22 мкм раствор ампулируют.Then the sterilized solution is kept for 30 days at a temperature of 10 ^o C. After sterilization by successive filtration through filters of 0.45 μm and 0.22 μm, the solution is amplified.

Полученное лечебное средство "Цереброкурин" представляет собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета со слабым специфическим запахом. Заявляемое лечебное средство идентифицируют посредством снятия электрофорограммы. The obtained medicinal product "Cerebrocurin" is a clear liquid of light yellow color with a faint specific odor. The inventive therapeutic agent is identified by taking electrophoretograms.

Способ получения лечебного средства "Цереброкурин" достаточно прост в выполнении. Однако особенности совокупности всех его действий и режимов отделяют его высокую терапевтическую активность и специфичность, что подтверждено клиническими испытаниями. A method of obtaining a therapeutic agent "Cerebrocurin" is quite simple to perform. However, the features of the totality of all its actions and modes separate its high therapeutic activity and specificity, which is confirmed by clinical trials.

Высокие фармацевтические свойства полученного препарата, заключающиеся в положительном влиянии на высшую нервную деятельность, в основе которых лежит активация энергопродуцирующей и белоксинтезирующей функции нервных клеток, повышение активности синаптического аппарата нейронов и др., определяют расширение диапазона заболеваний, на которые направлено получаемое предлагаемым решением средство. The high pharmaceutical properties of the resulting preparation, which have a positive effect on higher nervous activity, which are based on the activation of the energy-producing and protein-synthesizing functions of nerve cells, increased activity of the synaptic apparatus of neurons, etc., determine the expansion of the range of diseases that the remedy obtained by the proposed solution is aimed at.

Заявляемый способ позволил получить препарат "Цереброкурин", который имеет широкий диапазон действия, что положительно отличает его от известных препаратов такого же назначения. The inventive method allowed to obtain the drug "Cerebrocurin", which has a wide range of effects, which positively distinguishes it from known drugs of the same purpose.

"Цереброкурин" назначают при различных формах вегетососудистой дистонии и астеноневротического синдрома, хронических дициркуляторных и посттравматических энцефалопатиях, при явлениях острого нарушения мозгового кровообращения, старческом слабоумии сосудистого гнезда, при умственной отсталости различной этиологии, при ишемической болезни сердца и др. "Cerebrocurin" is prescribed for various forms of vegetative-vascular dystonia and asthenoneurotic syndrome, chronic dicirculatory and post-traumatic encephalopathies, for symptoms of acute cerebrovascular accident, senile dementia of the vascular nest, for mental retardation of various etiologies, for coronary heart disease, etc.

Claims

A method of obtaining a therapeutic agent for diseases accompanied by dysfunction of the central nervous system, which consists in homogenizing the brain tissue of an animal, an extract of soluble components, characterized in that the brain tissue is removed from the animal’s embryo, and the homogenized mass is diluted with physiological saline, after which it is kept until the processes are completed extraction, and to the solution obtained after removing the precipitate formed, add a preservative in an amount of at least 0.5%, sterilize the solution by filtration and maintain it until the formation of the lipid layer is completed, and after its separation, the remaining solution is maintained until the aggregation stops at a temperature not exceeding the physiological temperature, then after separation of the formed particles, the solution is reacted with an immobilized proteolytic enzyme, and the interaction mode is set based on the control samples of the obtained product, and the resulting solution is incubated for 30 days at a temperature not exceeding 10 ^o C.