RU2157381C1

RU2157381C1 - Method of preparing hyaluronic acid

Info

Publication number: RU2157381C1
Application number: RU99104197A
Authority: RU
Inventors: И.А. Федорищев; А.А. Чернышов; А.Е. Епифанов
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное предприятие "Тульская индустрия ЛТД"
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 1999-03-01
Publication date: 2000-10-10

Abstract

FIELD: chemical technology, more particularly production of hyaluronic acid for medical purposes. SUBSTANCE: well known method comprises multistage extraction of crushed cock's combs by deposition with acetic acid, fifth and subsequent extractions are used, and after treatment with alkali, enzymic hydrolysis of protein, ultrafiltration, alcohol deposition with ethanol and subsequent dissolution of precipitate in aqueous solution are successively carried out. The claimed method does not require considerable consumption of chemical reactants. EFFECT: method is more economical and preferable for use. 4 cl

Description

Изобретение относится к области химической технологии и может быть использовано при производстве гиалуроновой кислоты для медицинских целей. The invention relates to the field of chemical technology and can be used in the production of hyaluronic acid for medical purposes.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты путем обескровливания петушиных гребней, измельчения их, экстракции водой, термообработки экстракта при 90-100^oC, охлаждения экстракционной массы до 4-6^oC, отделения липидов, фильтрации массы, очистки фильтрата и выделения препарата путем введения активированного угля, перемешивания массы и фильтрования ее, а затем смешиванием полученного фильтрата с осадком сырья и двухстадийной экстракцией его водой в присутствии пенициллина с последующей сушкой экстракта /авт. св. СССР N1616926, C 08 B 37/08, БИ N 48, 1990 /.A known method of producing hyaluronic acid by bleeding cocks, grinding them, extraction with water, heat treatment of the extract at 90-100 ^o C, cooling the extraction mass to 4-6 ^o C, separating lipids, filtering the mass, purifying the filtrate and isolating the drug by introducing activated carbon mixing the mass and filtering it, and then mixing the obtained filtrate with a precipitate of the raw material and two-stage extraction with water in the presence of penicillin, followed by drying of the extract / ed. St. USSR N1616926, C 08 B 37/08, BI N 48, 1990 /.

Способ отличается сложностью при его реализации на производстве. Применение пенициллина может вызвать аллергическую реакцию организма на препарат. Выделение препарата путем введения активированного угля влечет за собой большие потери продукта, что весьма нетехнологично. The method is difficult when it is implemented in production. The use of penicillin can cause an allergic reaction of the body to the drug. Isolation of the drug by the introduction of activated carbon entails large losses of the product, which is very low-tech.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты, согласно которому сырье - гребни петухов и кур обескровливают, измельчают, многократно отмывают этанолом, содержащим хлороформ, дважды экстрагируют водой, объединенные экстракты подвергают депротеинизации путем многократной обработкой хлороформом, целевой продукт осаждают этанолом, обрабатывают ацетоном и сушат /Layton G. T., Stanwerth D.R. J. Immuol. Methods, 1984,42, p.329/. A known method of producing hyaluronic acid, according to which the raw materials - the crests of cocks and hens are bled, crushed, washed repeatedly with ethanol containing chloroform, extracted twice with water, the combined extracts are subjected to deproteinization by repeated treatment with chloroform, the target product is precipitated with ethanol, treated with acetone and dried / Layton GT , Stanwerth DR J. Immuol. Methods, 1984, 42, p. 329 /.

Полученный известным способом продукт используется преимущественно в офтальмологии, так как он содержит до 0,5% белковых веществ, однако использование ацетона при его производстве, помимо сохранения его неприятного запаха, может привести к неприятным последствиям в случае, когда в продукте (имеется в виду случайно) могут оказаться остатки опасной жидкости. The product obtained in a known manner is used mainly in ophthalmology, since it contains up to 0.5% protein substances, however, the use of acetone in its production, in addition to preserving its unpleasant odor, can lead to unpleasant consequences when in the product (meaning by chance ) may be leftover hazardous fluid.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты, включающий обескровливание и получение сырья - гребней петухов и кур, многократную промывку измельченного сырья этанолом и хлороформом, экстракцию промытого и измельченного сырья водой, подкисленной до pH 3-4, депротеинизацию профильтрованного экстракта активированным углем, а затем диэтиламиноэтилцеллюлозой, фильтрацию последовательным пропусканием депротеинизированного экстракта через разнообразные фильтры и сушку целевого продукта / патент РФ N 2074196, C 08 B 37/08, БИ N 6,1997 /. A known method of producing hyaluronic acid, including bleeding and obtaining raw materials - crests of cocks and chickens, repeated washing of crushed raw materials with ethanol and chloroform, extraction of washed and crushed raw materials with water, acidified to pH 3-4, deproteinization of the filtered extract with activated carbon, and then diethylaminoethyl cellulose, and then diethylaminoethyl cellulose sequentially passing the deproteinized extract through a variety of filters and drying the target product / RF patent N 2074196, C 08 B 37/08, BI N 6.1997 /.

Полученный продукт содержит менее 0,05% белка. Однако это трудно согласуется с экстракцией сырья водой, подкисленной до pH 3-4 при 90-100^oC в течение 40-50 мин. При таких условиях в режиме экстракции протеогликановый агрегат (АПГ) - белково-гиалуроновый комплекс - коагулирует. Активированный уголь, используемый для первой стадии депротеинизации, адсорбирует на свою поверхность не только свободный белок, но и саму кислоту. При такой технологии выход продукта составляет лишь 0,09-0,12% от массы сырья, что не оправдано экономически.The resulting product contains less than 0.05% protein. However, this is difficult to agree with the extraction of raw materials with water, acidified to pH 3-4 at 90-100 ^o C for 40-50 minutes Under such conditions, in the extraction mode, the proteoglycan aggregate (APG) - the protein-hyaluronic complex - coagulates. Activated carbon, used for the first stage of deproteinization, adsorbs not only free protein, but also the acid itself on its surface. With this technology, the yield of the product is only 0.09-0.12% of the mass of raw materials, which is not economically justified.

Известен способ получения гиалуроновой кислоты, сходный с заявленным по наибольшему количеству существенных признаков / патент РФ N 2102400, C 08 B 37/08, БИ N 2,1998 /. A known method of producing hyaluronic acid, similar to the claimed for the most significant features / RF patent N 2102400, C 08 B 37/08, BI N 2,1998 /.

Способ включает двухстадийную экстракцию измельченных петушиных гребней, объединение экстрактов, осаждение гиалуроновой кислоты уксусной кислотой, растворение осадка в воде, обработку едким натром, окончательную очистку и получение концентрированного целевого продукта лиофилизацией. The method includes a two-stage extraction of crushed cocks, combining the extracts, precipitation of hyaluronic acid with acetic acid, dissolving the precipitate in water, treatment with sodium hydroxide, final purification and obtaining a concentrated target product by lyophilization.

Продукт, полученный известным способом, не нормируется по содержанию в нем белка. Это обосновано в случае его наружного применения, например в дерматологии и косметике. Повышение стабильности гиалуроновой кислоты при наличии в ее составе белка в то же время снижает ее биологическую совместимость с организмом потребителя (медицинская и ветеринарная практика). При этом необходимо отметить такие положительные качества известной технологии, как относительная простота, экономичность и стабильность целевого продукта по химическому составу. The product obtained in a known manner, is not standardized by its protein content. This is justified in case of its external use, for example, in dermatology and cosmetics. Increasing the stability of hyaluronic acid in the presence of protein in its composition at the same time reduces its biological compatibility with the consumer's body (medical and veterinary practice). At the same time, it is necessary to note such positive qualities of the known technology as relative simplicity, economy and stability of the target product in terms of chemical composition.

Задача, решаемая изобретением, заключается в разработке очередного способа получения гиалуроновой кислоты, который отличается относительной простотой и небольшим временем протекания технологического процесса, в результате чего появится продукт с минимальным содержанием белка, что позволит применять его в медицинских целях, например в гинекологии. The problem solved by the invention is to develop another method for producing hyaluronic acid, which is characterized by relative simplicity and a short process time, as a result of which a product with a minimum protein content will appear, which will allow its use for medical purposes, for example, in gynecology.

Для решения поставленной задачи в известном способе получения гиалуроновой кислоты, включающем многостадийную экстракцию измельченных петушиных гребней, объединение экстрактов, осаждение уксусной кислотой, растворение осадка в воде, обработку едким натром, окончательную очистку и получение концентрированного целевого продукта, для осаждения уксусной кислотой используют пятую и последующие вытяжки, а после обработки щелочью последовательно производят ферментный гидролиз белка, ультрафильтрацию, спиртоосаждение этанолом и последующее растворение осадка в водном растворе последнего. To solve the problem in a known method for the production of hyaluronic acid, including multi-stage extraction of crushed cock ridges, combining the extracts, precipitation with acetic acid, dissolving the precipitate in water, treatment with sodium hydroxide, final purification and obtaining a concentrated target product, use the fifth and subsequent ones to precipitate acetic acid extracts, and after treatment with alkali, enzymatic hydrolysis of the protein, ultrafiltration, alcohol deposition with ethanol and the subsequent dissolving the precipitate present in the aqueous solution of the latter.

Кроме этого:
- ферментный гидролиз белка ведут раствором папаина в течение 20-40 ч с восстановлением pH раствора до 6-7 через каждые 6-8 ч, а спиртоосаждение ведут 90-96% этанолом;
- окончательную очистку продукта ведут мембранной фильтрацией его раствора в 30-50% растворе этанола в воде;
- концентрированный целевой продукт получают удалением этанола из отфильтрованного раствора.Besides:
- enzymatic hydrolysis of the protein is carried out with a papain solution for 20-40 hours with the restoration of the pH of the solution to 6-7 every 6-8 hours, and alcohol precipitation is carried out with 90-96% ethanol;
- final purification of the product is carried out by membrane filtration of its solution in a 30-50% solution of ethanol in water;
- concentrated target product is obtained by removing ethanol from the filtered solution.

Гиалуроновую кислоту получают следующим образом. Петушиные гребни очищают от посторонних предметов, заливают холодной водой и выстаивают в течение некоторого времени с периодической сменой воды. Гребни извлекают, отжимая воду, и измельчают до получения фарша. Фарш заливают водой, доводят до кипения, экстракт отделяют. Процесс вытяжки повторяют еще три раза. Таким образом происходит удаление липидов и частично свободных белков. Полученные экстракты направляются на другие технологические нужды. Hyaluronic acid is prepared as follows. The cocks are cleaned of foreign objects, poured with cold water and stand for some time with a periodic change of water. The ridges are removed by squeezing water, and crushed to obtain minced meat. Stuffing is poured with water, brought to a boil, the extract is separated. The drawing process is repeated three more times. Thus, lipids and partially free proteins are removed. The obtained extracts are sent to other technological needs.

Начиная с пятой и последующих вытяжек экстракты объединяют и фильтруют для отделения твердых включений и больших белковых конгломератов. Starting from the fifth and subsequent extracts, the extracts are combined and filtered to separate solids and large protein conglomerates.

Для осаждения АПГ отфильтрованные экстракты обрабатывают уксусной кислотой. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок растворяют в дистиллированой воде и обрабатывают раствором щелочи для получения натриевой соли гиалуроновой кислоты (ГУК). To precipitate APG, the filtered extracts are treated with acetic acid. The supernatant is removed. The precipitate is dissolved in distilled water and treated with a solution of alkali to obtain the sodium salt of hyaluronic acid (HAC).

Далее производят ферментный гидролиз присоединенного белка, входящего в состав АПГ. Гидролизованный белок отделяют ультрафильтрацией. Next, enzymatic hydrolysis of the attached protein, which is part of the APG, is performed. The hydrolyzed protein is separated by ultrafiltration.

В концентрированном продукте производят спиртоосаждение ГУК этанолом. Одновременно осуществляется стерилизация вещества. Надосадочную жидкость удаляют. In the concentrated product, the precipitation of HUA with ethanol is carried out. At the same time, the substance is sterilized. The supernatant is removed.

Полученный коагулят растворяют в смеси этанола с водой, этот раствор фильтруют на мембранных фильтрах до получения совершенно прозрачного фильтрата. Такой способ фильтрации позволяет не только отфильтровывать споры бактерий, но и сохранять стерильность на протяжении всего процесса. Кроме этого, этанол способствует прохождению макромолекул ГУК через поры мембраны, что значительно увеличивает производительность (в сравнении с водным раствором ГУК). The resulting coagulate is dissolved in a mixture of ethanol with water, this solution is filtered on membrane filters to obtain a completely transparent filtrate. This method of filtration allows not only filtering out bacterial spores, but also maintaining sterility throughout the process. In addition, ethanol promotes the passage of HAC macromolecules through the pores of the membrane, which significantly increases productivity (compared with an aqueous solution of HEA).

В дальнейшем этанол выводится из раствора вакуумным выпариванием. После этой операции можно производить лиофильную сушку, так как выпаривание приводит к значительному увеличению концентрации раствора. Subsequently, ethanol is removed from the solution by vacuum evaporation. After this operation, freeze drying can be performed, since evaporation leads to a significant increase in the concentration of the solution.

Реализацию способа получения гиалуроновой кислоты проиллюстрируем на следующем примере. The implementation of the method of obtaining hyaluronic acid is illustrated by the following example.

23 кг петушиных гребней очищают от посторонних предметов и тщательно промывают холодной водой. Полученное сырье измельчают до получения фарша вязкости 2,1. Фарш заливают водой в пропорции 1: 2,5, доводят до кипения, экстракт отделяют. Процесс вытяжки повторяют еще три раза. Экстракты первых четырех вытяжек не участвуют в дальнейшем технологическом процессе. 23 kg of cocks are cleaned of foreign objects and thoroughly washed with cold water. The resulting raw material is ground to obtain a meat viscosity of 2.1. Stuffing is poured with water in a ratio of 1: 2.5, brought to a boil, the extract is separated. The drawing process is repeated three more times. The extracts of the first four extracts do not participate in the further technological process.

Начиная с пятой и последующих вытяжек экстракты объединяют и фильтруют на тканях для отделения твердой фазы. Starting from the fifth and subsequent extracts, the extracts are combined and filtered on tissues to separate the solid phase.

Отфильтрованные экстракты обрабатывают уксусной кислотой при pH 5 в течение 18,5 ч. Формируется осадок. Надосадочную жидкость сливают. Осадок смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:3 и обрабатывают раствором едкого натра при pH 8. Добавляют 0,1% раствор папаина в количестве 5 литров. Периодически в течение 26 ч с интервалом в 6,5 ч pH раствора восстанавливают до 7. Полученный продукт очищают ультрафильтрацией и производят его обработку 96% этанолом. Надосадочную жидкость сливают. Осадок смешивают с 40% раствором этанола в воде. Производят окончательную очистку методом мембранной фильтрации. Путем выпаривания этанола в течение 0,5 ч концентрацию продукта доводят с 1,5 до 3% ГУК. После этого производят лиофильную сушку. The filtered extracts are treated with acetic acid at pH 5 for 18.5 hours. A precipitate forms. The supernatant is drained. The precipitate is mixed with distilled water in a ratio of 1: 3 and treated with sodium hydroxide solution at pH 8. A 0.1% solution of papain in an amount of 5 liters is added. Periodically for 26 hours with an interval of 6.5 hours, the pH of the solution was restored to 7. The resulting product was purified by ultrafiltration and treated with 96% ethanol. The supernatant is drained. The precipitate is mixed with a 40% solution of ethanol in water. Final purification by membrane filtration is carried out. By evaporation of ethanol for 0.5 h, the concentration of the product was adjusted from 1.5 to 3% HAC. After that produce freeze drying.

Полученный препарат представляет собой натриевую соль гиалуроновой кислоты - так называемое "сухое вещество" с минимальным содержанием белка. The resulting preparation is a sodium salt of hyaluronic acid - the so-called "dry substance" with a minimum protein content.

Как показала практика, предпочтительными для осаждения гиалуроновой кислоты уксусной кислотой являются пятая и шестая вытяжки. Объем осадка в них сопоставим с первыми четырьмя вытяжками, количество липидов - практически равно нулю, содержание белка - минимально, а количество "сухого вещества" - выгодно отличается в большую сторону. As practice has shown, the fifth and sixth extracts are preferred for the precipitation of hyaluronic acid with acetic acid. The sediment volume in them is comparable with the first four extracts, the amount of lipids is almost zero, the protein content is minimal, and the amount of “dry matter” compares favorably.

Заявленный способ не требует значительных расходов химических реактивов, а этанол легко перегоняется и возвращается в техпроцесс. Это характеризует данный способ как экономичный и предпочтительный для использования и тиражирования. The claimed method does not require significant chemical reagents, and ethanol is easily distilled and returned to the process. This characterizes this method as economical and preferred for use and replication.

Claims

1. A method of obtaining hyaluronic acid, including multi-stage extraction of rooster crowns minced to minced meat, combining extracts, precipitating hyaluronic acid with acetic acid, dissolving the precipitate in water, treating with sodium hydroxide, final purification and obtaining a concentrated target product, characterized in that the extraction process includes bringing the minced meat to a boil, and the fifth and subsequent extracts are used for precipitation with acetic acid, and after treatment with alkali, produce no enzymatic protein hydrolysis, ultrafiltration, spirtoosazhdenie ethanol and redissolving the precipitate in an aqueous solution of the latter.

2. The method according to claim 1, characterized in that the enzymatic hydrolysis of the protein is carried out with a solution of papain for 20 to 40 hours with the restoration of the pH of the solution to 6 to 7 every 6 to 8 hours, and the precipitation is carried out with 90 - 96% ethanol.

3. The method according to p. 1 or 2, characterized in that the final purification of the product is carried out by membrane filtration of its solution in a 30-50% solution of ethanol in water.

4. The method according to claim 3, characterized in that the concentrated target product is obtained by removing ethanol from the filtered solution.