RU2036648C1

RU2036648C1 - Process for manufacture of peptides capable of producing antiproteasic, immunostimulating and hypotensive effects

Info

Publication number: RU2036648C1
Authority: RU
Inventors: Т.Н. Пивненко; Л.М. Эпштейн; В.И. Кравченко; Б.Г. Трофимович; Н.Н. Беседнова; Б.Я. Сыропятов
Original assignee: Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства
Priority date: 1992-03-20
Filing date: 1992-03-20
Publication date: 1995-06-09

Abstract

FIELD: biological engineering. SUBSTANCE: this process includes such steps as comminuting animal stock, extracting it in acidic aqueous medium, separation of ballast products and precipitation of peptides with acetone at extract-to-acetone ratio of (1:5) to (1:7) by volume at temperature of +5 to -5 C. Disclosed process prescribes using bird's stomach cuticle as starting stock. EFFECT: disclosed method allows substantially expand spectrum of physiological preparations and stock base for manufacture of such preparations.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения лекарственных препаратов из животного сырья. Препарат, получаемый по предлагаемому способу, может быть использован для регулирования пищеварения за счет действия на панкреатические протеазы, в качестве гипотензивного средства с мягким и продолжительным действием, а также для повышения иммунного статуса организма у людей и сельскохозяйственных животных. The invention relates to biotechnology, in particular to methods for producing drugs from animal raw materials. The drug obtained by the proposed method can be used to regulate digestion due to the action on pancreatic proteases, as a hypotensive agent with a mild and long-lasting effect, and also to increase the body's immune status in humans and farm animals.

Известны способы получения пептидных препаратов, обладающих антипротеазным действием, из поджелудочной железы, околоушной железы или печени, путем лизиса, когда животное сырье разлагают на пептиды с помощью протеолитических ферментов (папаина, фицина, бромалина) с последующим отделением конечного продукта. Known methods for producing peptide preparations having antiprotease action from the pancreas, parotid gland or liver, by lysis, when the animal is decomposed into peptides using proteolytic enzymes (papain, ficin, bromalin), followed by separation of the final product.

Известен способ получения ингибиторов протеаз из поджелудочной железы крупного рогатого скота (КРС), включающий гомогенизацию, экстракцию в 0,25 н. серной кислоте, отделение осадка, ступенчатое фракционирование сульфатом аммония, выдерживание в течение 2 сут, доведение рН до 3,0, ступенчатое фракционирование сульфатом аммония, отделение осадка, растворение его в боратном буфере рН 8,0 с добавлением сернокислого магния, обработка 2,5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, осаждение при рН 3,0 в насыщенном растворе сульфата магния, отделение надосадочной жидкости, осаждение примесей в ТХУ, отделение фильтрата, нагревание до 80^оС, кристаллизация в среде насыщенного сульфата магния. Выход составляет 0,008% по массе при активности около 40 ингибиторных единиц (ИЕ)/мл. Недостатком способа является многостадийность и малый выход.A known method of producing protease inhibitors from the pancreas of cattle (cattle), including homogenization, extraction of 0.25 N. sulfuric acid, separation of the precipitate, stepwise fractionation with ammonium sulfate, holding for 2 days, adjusting the pH to 3.0, stepwise fractionation with ammonium sulfate, separation of the precipitate, dissolving it in borate buffer pH 8.0 with the addition of magnesium sulfate, processing 2.5 % solution of trichloroacetic acid precipitation at pH 3.0 in a saturated solution of magnesium sulfate, separating the supernatant, the deposition of impurities in TCA, separating the filtrate, heating to 80 ° ^C, the crystallization in a medium of saturated magnesium sulphate. The yield is 0.008% by weight with an activity of about 40 inhibitor units (IE) / ml. The disadvantage of this method is multi-stage and low output.

Наиболее близким техническим решением является способ получения пептида, обладающего антипротеазной активностью, который включает следующие операции:
гомогенизация;
экстракция этиловым спиртом при кислом рН;
отделение балластных белков фильтрованием;
удаление экстракта перегонкой;
добавление 15%-ного хлористого натрия для удаления инсулина;
отделение фильтрата;
адсорбционное осаждение пептидов на Hylfo-Super-Gel в среде 31%-ного хлористого натрия;
отделение осадка фильтрованием;
экстракция пептидов из осадка водой;
высаливание белковых компонентов 60%-ным сернокислым аммонием;
отделение осадка центрифугированием;
растворение осадка в 0,01 н.уксусной кислоте;
обессолинование на колонке с сефадексом С-50;
лиофилизация;
растворение сухого вещества в 0,0005М уксусной кислоте;
хроматография на колонке с КМ-целлюлозой;
лиофилизация фракцией, элюированных 0,05 М уксусной кислотой.The closest technical solution is a method for producing a peptide having antiprotease activity, which includes the following operations:
homogenization;
extraction with ethyl alcohol at acidic pH;
separation of ballast proteins by filtration;
distillation of the extract;
adding 15% sodium chloride to remove insulin;
filtrate separation;
adsorption precipitation of peptides on Hylfo-Super-Gel in a medium of 31% sodium chloride;
separating the precipitate by filtration;
extraction of peptides from the precipitate with water;
salting out protein components with 60% ammonium sulfate;
sediment separation by centrifugation;
dissolution of the precipitate in 0.01 N. acetic acid;
desalination on a column with Sephadex C-50;
lyophilization;
dissolution of dry matter in 0.0005M acetic acid;
column chromatography with KM cellulose;
lyophilization fraction eluted with 0.05 M acetic acid.

Выход полипептидов, обладающих ингибиторной активностью 12 ИЕ из 1 кг исходного материала с удельной активностью 2,5-2,8 ИЕ/мг. The output of polypeptides with inhibitory activity of 12 IE from 1 kg of starting material with a specific activity of 2.5-2.8 IE / mg

Недостатком способа являются его многостадийность, низкий выход и малая ингибиторная активность, кроме того, препарат не обладает иммуностимулирующим и гипотензивным действиями. The disadvantage of this method is its multi-stage, low yield and low inhibitory activity, in addition, the drug does not have immunostimulating and hypotensive effects.

Задача, решаемая изобретением: получение полипептида, обладающего более широким спектром действия: антипротеазным, а также гипотензивным и иммуностимулирующим действиями; повышение ингибиторной активности; расширение сырьевой базы для получения физиологически активных веществ и упрощение способа получения. The problem solved by the invention: obtaining a polypeptide having a wider spectrum of action: antiprotease, as well as antihypertensive and immunostimulating actions; increase in inhibitory activity; the expansion of the raw material base to obtain physiologically active substances and the simplification of the production method.

В предлагаемом способе в качестве сырья используют кутикулу птичьего желудка, которую гомогенизируют, экстракцию проводят в водной среде при рН 3,5-4,5, выдерживают в течение 20-28 ч для прохождения полноты экстракции, отделяют надосадочную жидкость, которую обрабатывают ацетоном при соотношении надосадочной жидкости и ацетона (1:5) (1:7) (по объему) при температуре 5 (-5)^оС, отделяют осадок, высушивают его на воздухе, растворяют в воде, отделяют осадок во вторичном экстракте и высушивают надосадочную жидкость.In the proposed method, a cuticle of an avian stomach is used as a raw material, which is homogenized, extraction is carried out in an aqueous medium at a pH of 3.5-4.5, kept for 20-28 hours to complete the extraction, the supernatant is separated, which is treated with acetone at a ratio the supernatant and acetone (1: 5) (1: 7) (by volume) at a temperature of 5 (-5) ^о С, the precipitate is separated, dried in air, dissolved in water, the precipitate is separated in the secondary extract and the supernatant is dried.

Выход целевого продукта составляет 0,6-2% от массы исходного сырья. The yield of the target product is 0.6-2% by weight of the feedstock.

Антипротеазная активность составляет 14,7-16,4 ингибиторных единицы (ИЕ)/мг массы, индекс иммуностимуляции по тесту Ерне 2-2,4, имеет выраженное гипотензивное действие, вызывает снижение артериального давления на 30% от исходного. Antiprotease activity is 14.7-16.4 inhibitory units (IE) / mg mass, the immunostimulation index according to the Erne test 2-2.4, has a pronounced hypotensive effect, causes a decrease in blood pressure by 30% from the original.

П р и м е р 1. 0,6 кг высушенной кутикулы куриного желудка измельчают, добавляют 3,1 л воды, подкисляют уксусной кислотой до рН 3,5, оставляют при периодическом перемешивании на 28 ч. Затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирают и заливают 6 ч. ацетона при температуре 5^оС, выдерживают 18 ч и отделяют осадок декантацией и центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин, собирают осадок, растворяют его в дистиллированной воде, отделяют осадок во вторичном экстракте и высушивают надосадочную жидкость. Выход препарата 0,013 кг (2%).PRI me R 1. 0.6 kg of a dried cuticle of a chicken stomach is crushed, add 3.1 l of water, acidified with acetic acid to pH 3.5, left with periodic stirring for 28 hours, Then the suspension is centrifuged at 5000 rpm within 30 minutes The supernatant was collected and poured 6 hours. The acetone at ^{5 °} C, held for 18 hours and separated by decantation of the precipitate and centrifugation at 3000 rev / min for 10 min, the precipitate was collected, dissolved in distilled water, the precipitate is separated in the secondary extract and dried supernatant. The yield of the drug is 0.013 kg (2%).

Конечный продукт представляет собой белый кристаллический порошок, растворимый в воде при кислом рН. Ингибиторная активность 14,7 ИЕ/мг. Индекс иммуностимуляции 2,4. Снижение артериального давления на 50 мм рт.ст. The final product is a white crystalline powder, soluble in water at acidic pH. Inhibitory activity of 14.7 IE / mg. Immunostimulation Index 2.4. Decrease in blood pressure by 50 mm Hg

П р и м е р 2. 0,25 кг замороженной кутикулы утиного желудка измельчают, выдерживают в 1,25 л воды, подкисленной уксусной кислотой (рН 3,5), при периодическом перемешивании 22 ч. Затем гомогенат центрифугируют в течение 30 мин при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость собирают и заливают 6 ч. охлажденного до 3^оС ацетона. Выдерживают смесь 16 ч и отделяют осадок частичной декандацией и центрифугированием в течение 5 мин при 2000 об/мин. Осадок собирают и высушивают на фильтре. Растворяют осадок в дистиллированной воде (0,25 л), непрерывно перемешивают в течение 3 ч. Отделяют осадок центрифугированием. Лиофилизируют во флаконах или кюветах.PRI me R 2. 0.25 kg of a frozen duck stomach cuticle is crushed, kept in 1.25 l of water, acidified with acetic acid (pH 3.5), with periodic stirring for 22 hours. Then, the homogenate is centrifuged for 30 minutes at 5000 rpm The supernatant was collected and poured 6 hours. Cooled to 3 ° ^C acetone. The mixture is aged for 16 hours and the precipitate is separated by partial decantation and centrifugation for 5 minutes at 2000 rpm. The precipitate was collected and dried on a filter. Dissolve the precipitate in distilled water (0.25 L), mix continuously for 3 hours. Separate the precipitate by centrifugation. Lyophilized in vials or cuvettes.

Выход препарата 0,0015 кг (0,6%). Ингибиторная активность 16,4 ИЕ/мг массы. Снижение артериального давления на 46 мм рт.ст. Индекс иммуностимуляции 1,8. The yield of the drug is 0.0015 kg (0.6%). Inhibitory activity of 16.4 IE / mg mass. Lowering blood pressure by 46 mmHg Immunostimulation Index 1.8.

П р и м е р 3. Выделение пептидов проводили как и в примере 1, но в качестве сырья используют кутикулу гусиного желудка. PRI me R 3. The selection of peptides was carried out as in example 1, but as a raw material using a cuticle of a goose stomach.

Выход конечного продукта 1,2% Ингибиторная активность 14,7 ИЕ/мг. Индекс иммуностимуляции 2,0. Снижение артериального давления на 46 мм рт.ст. The yield of the final product is 1.2%. Inhibitory activity is 14.7 IE / mg. Immunostimulation Index 2.0. Lowering blood pressure by 46 mmHg

Изучение физико-химического состава проводили с помощью гель-фильтрации и аминокислотного анализа. В состав препарата входят пептиды мол. м. от 13.000 Да до 1.000 Да. The study of the physico-chemical composition was carried out using gel filtration and amino acid analysis. The composition of the drug includes peptides mol. m. from 13.000 Yes to 1.000 Yes.

При гель-фильтрации на сорбенте "Toya-PerL-55" (Япония) установлено значительное преобладание пептидного компонента мол.м. 5900 Да. Остальные компоненты представлены следовыми количествами. Молекулярная масса полученного ингибитора близка известным для низкомолекулярных белковых ингибиторов из животных тюленей, а также прототипу (6500 Да). When gel filtration on the Toya-PerL-55 sorbent (Japan), a significant predominance of the peptide component of mol.m was found. 5900 Yes. The remaining components are represented by trace amounts. The molecular weight of the obtained inhibitor is close to that known for low molecular weight protein inhibitors from animal seals, as well as to the prototype (6500 Da).

Ингибиторную способность препарата оценивали по способности тормозить активность трипсина из поджелудочной железы КРС производства "Sigma" США, определяемой на сорбенте ВАЕЕ (Nα -бензоил-L-аргинин этиловый эфир). The inhibitory ability of the drug was evaluated by the ability to inhibit trypsin activity from cattle pancreas manufactured by Sigma USA, determined on the sorbent BAEE (Nα-benzoyl-L-arginine ethyl ether).

1 единица (Е) активности трипсина равна увеличению оптической плотности при λ=253 нм 0,001 в мин при гидролизе ВАЕЕ при рН 8,0 и 25^оС. За 1 единицу ингибиторной активности (ИЕ) принимали такое его количество, которое способно подавлять активность 1 Е трипсина.1 unit (E) is an increase in trypsin activity in absorbance at λ = 253 nm, 0.001 min at VAEE hydrolysis at pH 8.0 and 25 ^° C for 1 unit of inhibitory activity (IU) take such amount thereof which is capable of suppressing the activity of 1 E trypsin.

Гипотензивное действие препарата, т.е. способность снижать артериальное давление (АД), определяли на домашних кошках. При внутривенном введении препарата в дозе 10 мг/кг (0,04 от АД₅₀). Максимальная степень снижения АD составляет 46-50 мм рт.ст. или около 30% достигается на 15-й мин после введения, затем возвращается в норму через 6 ч и более.Antihypertensive effect of the drug, i.e. the ability to lower blood pressure (BP) was determined on domestic cats. With intravenous administration of the drug at a dose of 10 mg / kg (0.04 from blood pressure ₅₀ ). The maximum degree of reduction in AD is 46-50 mm Hg. or about 30% is reached at the 15th minute after administration, then returns to normal after 6 hours or more.

Иммуностимулирующее действие препарата оценивали на мышах линии СВА, вводя им подкожно препарат в дозе 1 мкг на 1 мышь за сутки до иммунизации их эритроцитами барана. Животным контрольной группы вводили 0,1 мл 0,85%-ного раствора хлористого натрия. Тестируемые препараты увеличивали число антителообразующих клеток в селезенке мышей (тест Ерне) в 1,8-2,4 раза. The immunostimulating effect of the drug was evaluated on CBA mice, injecting them subcutaneously with a dose of 1 μg per 1 mouse one day before immunization with ram red blood cells. The animals of the control group were injected with 0.1 ml of a 0.85% sodium chloride solution. The tested drugs increased the number of antibody-forming cells in the spleen of mice (Erne test) by 1.8-2.4 times.

Кутикула птичьего желудка составляет около 0,4% от массы птицы и около 3% от массы внутренностей. При заготовке и обработке субпродуктов, в частности желудков, кутикула может быть заготовлена в промышленных масштабах. Одна работница за смену заготавливает 5-10 кг кутикулы. The cuticle of the avian stomach is about 0.4% by weight of the bird and about 3% by weight of the viscera. When harvesting and processing offal, in particular the stomachs, the cuticle can be harvested on an industrial scale. One shift worker harvests 5-10 kg of cuticle.

Использование предлагаемого способа получения пептидов позволяет существенно расширить спектр физиологического действия препаратов и сырьевой базы для их получения. Using the proposed method for producing peptides can significantly expand the spectrum of the physiological action of drugs and raw materials for their production.

Claims

METHOD FOR PRODUCING PEPTIDES HAVING ANTIPROTEASIC, IMMUNTABLE AND HYPOTENSIVE ACTION, including homogenization of raw materials, treatment with an extractant in an acidic environment, separation of ballast substances, precipitation of peptides, separation of the precipitate, extraction with water and drying , as an extractant, water, and the precipitation of peptides is carried out with acetone at a volume ratio of acetone extract of 1 5 7 at 5 -5 ^o C.