RU2055079C1

RU2055079C1 - Method for production of preparation of hyaluronic acid

Info

Publication number: RU2055079C1
Authority: RU
Inventors: Э.И. Мухтаров; Г.Б. Тулупова; И.Ю. Громов
Original assignee: Научно-производственное акционерное общество "Техкон"
Priority date: 1992-02-04
Filing date: 1992-02-04
Publication date: 1996-02-27

Abstract

FIELD: production of perfumery articles and cosmetics. SUBSTANCE: cock combs are ground and washed repeatedly by ethyl alcohol or by isopropyl alcohol, mass ratio of alcohol and combs being 1.5-3:1. Then pieces of combs are ground till stuffing is prepared. The process is followed by extraction with the help of water or 1-15 % solution of NaCl. Said process is carried out at temperature higher than 80 C. Thus prepared extract is isolated and desired preparation being separated from it. EFFECT: improves efficiency of method. 2 cl

Description

Изобретение относится к способу получения препарата гиалуроновой кислоты, относящейся к классу гликозаминогликанов, которая применяется при производстве парфюмерно-косметических изделий, а также может быть использована в качестве основы при получении высокоочищенного препарата для медицины и в качестве субстрата при количественном определении ферментов гиалуронидазного действия. The invention relates to a method for producing a preparation of hyaluronic acid belonging to the class of glycosaminoglycans, which is used in the manufacture of perfumes and cosmetics, and can also be used as a basis for obtaining a highly purified drug for medicine and as a substrate for the quantitative determination of enzymes with hyaluronidase action.

Известен способ получения препарата гиалуроновой кислоты высокой степени очистки для использования в глазной и суставной хирургии, при зарубцевании ран (1). A known method of obtaining a preparation of hyaluronic acid with a high degree of purification for use in ocular and articular surgery, with wound healing (1).

Технология получения этого препарата сложна и трудоемка, а сам препарат является очень дорогим в силу высокой стоимости его очистки. The technology for producing this drug is complex and time-consuming, and the drug itself is very expensive due to the high cost of its cleaning.

Кроме того, имеется ряд патентов на способы получения гиалуроновой кислоты, которая может быть применима в парфюмерно-косметических изделиях и которой не требуется высокая чистота. Однако эти способы также довольно сложны и включают ряд операций, связанных с очисткой препарата. In addition, there are a number of patents on methods for producing hyaluronic acid, which can be used in perfumes and cosmetics and which do not require high purity. However, these methods are also quite complex and include a number of operations related to the purification of the drug.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения препарата гиалуроновой кислоты путем обескровливания петушиных гребней, измельчения их, экстракции водой, термообработки экстракта при 90-100^оС в течение 1-2 мин, охлаждение экстракционной массы до 4-6^оС в течение 2-4 ч, отделения липидов, фильтрации массы и отделения осадка сырья. Очистку фильтрата и выделение препарата осуществляют введением активированного угля в количестве 1-2% от массы исходного сырья, перемешиванием массы 1-2 ч и фильтрованием ее, а затем смешиванием полученного фильтрата с осадком сырья и двухстадийной экстракцией его водой в течение 18-24 ч при 20-22^оС в присутствии пенициллина в количестве 0,05-0,07% от массы исходного сырья с последующей сушкой экстракта (2).The closest to the proposed method for producing a hyaluronic acid preparation by exsanguination cocks' combs, grinding them, extraction with water, the extract heat treatment at 90-100 ^{° C} for 1-2 min, cooling the mass before extraction 4-6 ^{° C} for 2-4 h, separation of lipids, filtration of the mass and separation of the sediment of raw materials. Purification of the filtrate and isolation of the drug is carried out by introducing activated carbon in an amount of 1-2% of the mass of the feedstock, mixing the mass for 1-2 hours and filtering it, and then mixing the obtained filtrate with a precipitate of the raw material and two-stage extraction with water for 18-24 hours at 20-22 ^{° C} in the presence of penicillin in an amount of 0.05-0.07% by weight of the feedstock, followed by drying the extract (2).

Многоступенчатость этого способа создаст сложности при его реализации на производстве. Кроме того, применение пенициллина может повлечь за собой аллергентное воздействие препарата. The multi-stage nature of this method will create difficulties in its implementation in production. In addition, the use of penicillin can lead to an allergenic effect of the drug.

Предлагаемый способ технологически проще и позволяет получить препарат, не обладающий аллергентными свойствами. The proposed method is technologically simpler and allows you to get a drug that does not have allergenic properties.

Способ в соответствии с изобретением, включает измельчение куриных гребней, промывку их, экстрагирование гиалуроновой кислоты водой, отделение экстракта и выделение препарата, при этом промывку гребней осуществляют многократно этиловым или изопропиловым спиртом при массовом соотношении спирта и гребней 1:1,5-3,0, после чего кусочки гребней измельчают до состояния фарша, а экстрагирование проводят при температуре не выше 80^оС. Для экстрагирования может быть использована вода, содержащая 1-15 мас. хлорида натрия.The method in accordance with the invention, includes grinding chicken crests, washing them, extracting hyaluronic acid with water, separating the extract and isolating the preparation, while washing the crests is carried out repeatedly with ethyl or isopropyl alcohol at a mass ratio of alcohol and crests of 1: 1.5-3.0 after which the pieces ridges pulverized into forcemeat, and extraction was carried out at a temperature not exceeding 80 ° ^C. For the extraction may be used water containing 1-15 wt. sodium chloride.

Препарат получают следующим образом. The drug is prepared as follows.

Петушиные гребни с обрезанными окончаниями промывают холодной водой для удаления крови, в которой определяется различные белки и низкомолекулярные вещества. Кроме того, в крови содержится фермент гиалуронидаза, деполимеризующий гиалуроновую кислоту. Окончательное обескровливание, инактивация гиалуронидаза и удаление липидов осуществляется промывкой нарезанных на кусочки гребней этиловым или изопропиловым спиртом в соотношении к весу сырья 1: 1,5-3,0. Промывка может быть повторена несколько раз, но не менее двух. Обработка гребней спиртом позволяет исключить использование бактериостатического агента. После обработки спиртом гребни измельчают до состояния фарша, но не гомогенизируют, и проводят экстракцию гиалуроновой кислоты дистиллированной или деионизированной водой, или 1-15%-ным водным раствором хлорида натрия. При этом соотношение массы сырья воды должно составлять от 1:3 до 1: 5. Экстракцию проводят при помощи шейкера в течение 18 ч при температуре не выше 80^оС. При использовании различных видов мешалок время экстракции можно варьировать.Cocks with cut ends are washed with cold water to remove blood, which determines various proteins and low molecular weight substances. In addition, the blood contains the enzyme hyaluronidase, depolymerizing hyaluronic acid. The final bleeding, inactivation of hyaluronidase and removal of lipids is carried out by washing the ridges cut into pieces with ethyl or isopropyl alcohol in the ratio to the weight of the raw material 1: 1.5-3.0. Flushing can be repeated several times, but not less than two. The treatment of ridges with alcohol eliminates the use of a bacteriostatic agent. After treatment with alcohol, the ridges are ground to a state of mincemeat, but not homogenized, and hyaluronic acid is extracted with distilled or deionized water, or with a 1-15% aqueous solution of sodium chloride. The ratio of mass of raw water must be from 1: 3 to 1: 5. The extraction is carried out by means of a shaker for 18 hours at a temperature not higher than 80 ° ^C. When using various types of mixers extraction time can vary.

Препарат гиалуроновой кислоты из экстракта осаждают спиртом или ацетоном, или лиофильно сушат. A hyaluronic acid preparation from the extract is precipitated with alcohol or acetone, or freeze-dried.

Проведенное экспериментальное изучение препарата гиалуроновой кислоты показало, что препарат является безвредным и относится к VI классу токсичности по классификации К.К.Сидорова, ее ДЛ₅₀ более 3,1 г/кг массы белых беспородных мышей при внутрибрюшинном способе введения.An experimental study of the preparation of hyaluronic acid showed that the drug is harmless and belongs to the VI class of toxicity according to the classification of K.K. Sidorov, its DL _{50 is} more than 3.1 g / kg of the mass of white outbred mice with the intraperitoneal route of administration.

Водно-масляная эмульсия, содержащая 0,1% и 0,3% экстракта препарата, не оказывала общетоксического воздействия на организм крыс, о чем свидетельствовали результаты сравнительного анализа поведения, прибавки веса, состояния внутренних органов кожи опытных и контрольных групп. The water-in-oil emulsion containing 0.1% and 0.3% of the extract of the preparation did not exert a general toxic effect on the rat organism, as evidenced by the results of a comparative analysis of the behavior, weight gain, and condition of the internal organs of the skin of the experimental and control groups.

Препарат в изученных концентрациях не вызывал раздражающего и аллергизирующего действия при его накожном применении (30 аппликаций). The drug in the studied concentrations did not cause an irritant and allergenic effect with its skin application (30 applications).

Морфологические исследования не показали патологических изменений в структуре кожи и печени экспериментальных животных под влиянием применения препарата. Morphological studies did not show pathological changes in the structure of the skin and liver of experimental animals under the influence of the use of the drug.

Биохимические исследования показали, что препарат в 0,3% концентрации увеличивал содержание суммарных липидов на 11% уровень общих растворимых белков на 8%
Гистологическая экспертиза опытных биоптатов кожи (0,3%-ная концентрация препарата) свидетельствовала об его увлажняющем действии.Biochemical studies showed that the drug in 0.3% concentration increased the content of total lipids by 11%; the level of total soluble proteins by 8%
Histological examination of experimental skin biopsy samples (0.3% concentration of the drug) indicated its moisturizing effect.

Предлагаемый препарат гиалуроновой кислоты рекомендуется для введения в косметические средства для ухода за сухой и увядающей кожей. Благодаря меньшему содержанию белка он также может найти более широкое применение в косметической промышленности, в частности его можно вводить в лосьоны, губные помады и т.д. The proposed preparation of hyaluronic acid is recommended for administration in cosmetics for the care of dry and aging skin. Due to its lower protein content, it can also find wider application in the cosmetic industry, in particular, it can be introduced into lotions, lipsticks, etc.

Количество используемого при промывке спирта не может быть менее чем 1,5 объема по отношению к весу сырья, так как в противном случае гребешки не будут полностью закрыты жидкостью. Использование свыше 3-х объемов спирта нецелесообразно из-за большого расхода спирта при незначительном улучшении качества. The amount of alcohol used during washing can not be less than 1.5 volumes relative to the weight of the raw material, since otherwise the scallops will not be completely covered by the liquid. The use of more than 3 volumes of alcohol is impractical due to the large consumption of alcohol with a slight improvement in quality.

При водной экстракции использование менее 3-х объемов воды по отношению к весу сырья приведет к получению очень вязкого раствора и вследствие этого к высоким потерям экстракта при отделении экстракта и низкому выходу конечного продукта. Использование свыше 5-ти объемов воды при экстрагировании приводит к большим энергозатратам при лиофилизации экстракта или требует большого объема спирта при переосаждении при незначительном увеличении выхода. In aqueous extraction, the use of less than 3 volumes of water relative to the weight of the feed will result in a very viscous solution and, as a result, high losses of the extract during separation of the extract and low yield of the final product. The use of more than 5 volumes of water during extraction leads to high energy consumption during lyophilization of the extract or requires a large amount of alcohol during reprecipitation with a slight increase in yield.

При повышении температуры экстракционной смеси выше 80^оС может происходить частичная деполимеризация гиалуроновой кислоты и уменьшение вязкости получаемых растворов.With increasing temperature of the extraction mixture above ⁸⁰ ° C may be partial depolymerization of hyaluronic acid and a decrease in viscosity obtained solutions.

П р и м е р 1. У петухов в возрасте 15 месяцев после обескровливания и шпарки срезают гребни, промывают холодной водопроводной водой до исчезновения красной окраски и разрезают на кусочки размером не более 10 мм. PRI me R 1. In roosters at the age of 15 months after bleeding and scalding, ridges are cut off, washed with cold tap water until the red color disappears and cut into pieces of no more than 10 mm in size.

250 г нарезанных гребней заливают 375 мл 96%-ного этилового спирта и перемешивают в течение 6 ч. Спирт сливают и повторяют промывку с новой порцией спирта в течение 18 ч. После перемешивания спирт сливают гребни измельчают до состояния фарша, но не гомогенизируют. К измельченному сырью добавляют 750 мл дистиллированной воды (соотношение 1:3) и проводят экстракцию при постоянном перемешивании в течение 18 ч при 60^оС. Экстракт препарата центрифугируют и центрифугат лиофилизируют. Получают 4,75 г препарата гиалуроновой кислоты (выход 1,92% к массе исходного сырья). Препарат представляет собой волокнистое вещество белого цвета, содержание белка 9% кинематическая вязкость 0,1%-ного водного раствора 6,3 сСт, оптическая плотность при λ 540 мм 0,10.250 g of chopped ridges are poured into 375 ml of 96% ethanol and stirred for 6 hours. The alcohol is drained and the washing is repeated with a new portion of alcohol for 18 hours. After stirring, the alcohol is drained and the combs are ground to the state of minced meat, but not homogenized. To the comminuted raw material is added to 750 ml distilled water (ratio 1: 3) and extracted under constant stirring for 18 hours at 60 ^C. The extract was centrifuged and the pellet preparation is lyophilized. Get 4.75 g of the preparation of hyaluronic acid (yield 1.92% by weight of the feedstock). The preparation is a white fibrous substance, the protein content is 9%, the kinematic viscosity of a 0.1% aqueous solution of 6.3 cSt, and the optical density at λ 540 mm is 0.10.

П р и м е р 2. Получение препарата проводят аналогично примеру 1, используя в качестве экстрагирующей жидкости 10%-ный водный раствор хлорида натрия, а выделение продукта из раствора осуществляли переосаждением 4 мл объемами этилового спирта. PRI me R 2. The preparation is carried out analogously to example 1, using a 10% aqueous solution of sodium chloride as extracting liquid, and the product was isolated from the solution by reprecipitation of 4 ml with volumes of ethyl alcohol.

Получен порошок белого цвета, выход 1,88% содержание белка 8% кинематическая вязкость 0,1%-ного водного раствора 5,9 сСт, оптическая плотность при λ 540 мм 0,09. A white powder was obtained, yield 1.88% protein content 8%, kinematic viscosity of 0.1% aqueous solution of 5.9 cSt, optical density at λ 540 mm 0.09.

П р и м е р 3. Выделение препарата проводят как в примере 1, используя при экстрагировании 4 объема дистиллированной воды по отношению к исходному весу сырья. PRI me R 3. The selection of the drug is carried out as in example 1, using when extracting 4 volumes of distilled water in relation to the initial weight of the raw material.

Получено белое волокнистое вещество с выходом 2,11% содержание белка 14% кинематическая вязкость 0,1%-ного водного раствора 6,0 сСт, оптическая плотность при λ 540 мм 0,10. A white fibrous substance was obtained with a yield of 2.11% protein content of 14%, kinematic viscosity of a 0.1% aqueous solution of 6.0 cSt, optical density at 0 540 λ.

П р и м е р 4. Выделение препарата проводят как в примере 1, используя при экстрагировании 5 объемов дистиллированной воды по отношению к весу сырья. PRI me R 4. The selection of the drug is carried out as in example 1, using when extracting 5 volumes of distilled water relative to the weight of the raw material.

Получено белое волокнистое вещество с выходом 2,15% содержание белка 18% кинематическая вязкость 0,1-ного водного раствора 6,2 сСт, оптическая плотность при λ 540 мм 0,11. A white fibrous substance was obtained with a yield of 2.15% protein content of 18%, kinematic viscosity of a 0.1% aqueous solution of 6.2 cSt, optical density at λ 540 mm 0.11.

П р и м е р 5. Выделение препарата проводят как в примере 3, используя для промывки 3 объема изопропилового спирта по отношению к исходному весу сырья. PRI me R 5. The selection of the drug is carried out as in example 3, using for washing 3 volumes of isopropyl alcohol in relation to the initial weight of the raw material.

Получено волокнистое вещество белого цвета со слабым кремоватым оттенком, выход 1,94% содержание белка 15% кинематическая вязкость 0,1%-ного водного раствора 6,2 сСт, оптическая плотность при λ 540 мм 0,13. A white fibrous substance with a faint creamy tint was obtained, yield 1.94% protein content 15% kinematic viscosity of a 0.1% aqueous solution of 6.2 cSt, optical density at λ 540 mm 0.13.

П р и м е р 6. Выделение препарата проводят как в примере 3, при этом температура экстрагирования 80^оС.PRI me R 6. The selection of the drug is carried out as in example 3, while the extraction temperature of 80 ^about C.

Получено белое волокнистое вещество с выходом 2,12% содержание белка 24% кинематическая вязкость 0,1% -ного водного раствора 5,7 сСт, оптическая плотность при λ 540 мм равна 0,14. A white fibrous substance was obtained with a yield of 2.12% protein content 24%; kinematic viscosity of a 0.1% aqueous solution of 5.7 cSt; optical density at λ 540 mm was 0.14.

Claims

1. METHOD FOR PRODUCING A HYALURONIC ACID PRODUCT, including crushing cocks, washing them, extracting hyaluronic acid with water, separating the extract and isolating the preparation, characterized in that the cords are washed repeatedly with ethyl or isopropyl alcohol in a mass ratio of 1.5 to alcohol of alcohol and crests 3.0): 1, after which the pieces of the crests are crushed to the state of forcemeat, and the extraction is carried out at a temperature not exceeding 80 ^o C.

2. The method according to p. 1, characterized in that for extraction using water containing 1 to 15 wt.% Sodium chloride.