RU2610669C1 - Method for production of proteolytic preparation for medical use - Google Patents

Method for production of proteolytic preparation for medical use Download PDF

Info

Publication number
RU2610669C1
RU2610669C1 RU2015144538A RU2015144538A RU2610669C1 RU 2610669 C1 RU2610669 C1 RU 2610669C1 RU 2015144538 A RU2015144538 A RU 2015144538A RU 2015144538 A RU2015144538 A RU 2015144538A RU 2610669 C1 RU2610669 C1 RU 2610669C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
solution
extract
proteolytic enzymes
ml
complex
Prior art date
Application number
RU2015144538A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Сергей Федорович Антонов
Марина Павловна Зайчук
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Научно-исследовательский институт средств противоожоговой терапии"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Научно-исследовательский институт средств противоожоговой терапии" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Научно-исследовательский институт средств противоожоговой терапии"
Priority to RU2015144538A priority Critical patent/RU2610669C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2610669C1 publication Critical patent/RU2610669C1/en

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46Hydrolases (3)
    • A61K38/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue

Abstract

FIELD: medicine, pharmacy.
SUBSTANCE: invention refers to biotechnology. A method for extraction of proteolytic enzymes from the digestive organs of fish is proposed. The method includes tissue homogenizing in a buffer, selection of enzymes in the presence of ammonium sulfate, at that, nucleic acids and lipid-protein complexes are removed from the extract prior to protein precipitation in ammonium sulfate by treatment with a polyethyleneimine solution, added to a final concentration from 0.1 to 0.01 by weight %. Residual pyrogens are separated on a hydrophobic sorbent Sferotsell C-80 with further repeated desalination of the extract. The enzyme solution is sterilized by filtration through a membrane with pore size of 0.2 microns, followed by production of lyophilized formulation of the enzyme preparation.
EFFECT: invention allows to obtain proteolytic enzymes with increased collagenolytic activity.
6 cl, 1 dwg, 1 tbl, 7 ex

Description

Способ получения протеолитического препарата для медицинского применения A method for producing a proteolytic product for medical use

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению комплекса протеолитических ферментов, обладающих широким спектром протеолитической активности, способных гидролизовать белковые субстраты. The invention relates to biotechnology, namely to obtain a complex of proteolytic enzymes having a wide spectrum of proteolytic activity capable of hydrolysing protein substrates. Изобретение может найти применение в производстве медицинских препаратов. The invention may find application in the manufacture of medical preparations.

Известно использование в медицине для очищения ран препаратов на основе микробной коллагеназы, выделяемой штаммами-продуцентами Clostridium histolyticum. The use in medicine for wound cleansing preparations based on microbial collagenase secreted producing strain Clostridium histolyticum. Микробная коллагеназа обладает высокой специфичностью в отношении основного белка соединительной ткани коллагена. Microbial collagenase has high specificity for the main protein of connective tissue collagen. Однако, высокая специфичность, для целей очищения ран и лечения келоидных рубцов является недостатком. However, high specificity, for the purpose of wound cleansing and treatment of keloid scars is a disadvantage. Это связано с тем, что межклеточный матрикс и соединительная ткань содержит не только коллагеновые волокна, она представляет собой сложную сеть, включающую помимо коллагена эластин и адгезивные белки. This is due to the fact that extracellular matrix and connective tissue contain not only collagen fibers, it is a complex network of elastin in addition to collagen, and adhesion proteins. Другой важной составляющей межклеточного матрикса являются протеогликаны, осевой молекулой которых служит гиалуроновая кислота, к которой как щетинки к щетке присоединены белки, в свою очередь соединенные с множеством гликозаминогликанов. Another important component of the extracellular matrix proteoglycans are axial molecule which serves as hyaluronic acid, to which bristles are attached to the brush proteins, in turn connected to a plurality of glycosaminoglycans.

Омертвевшие ткани в ожоговой ране представлены, главным образом, коагулированными белками дермы (коллагена, эластина и др.), а также поврежденными компонентами внеклеточного матрикса. Necrotic tissue in a burn wound presented mainly coagulated proteins of the dermis (collagen, elastin etc.), As well as damage to components of the extracellular matrix. На поверхности ран может находиться фибринозный налет. On surface wounds can be fibrinous plaque. Видимые эффекты очищения ран под действием протеолитических ферментов чаще являются результатом расщепления фибрина, а не коллагена. Visible effects cleansing wounds by proteolytic enzymes are often the result of cleavage of fibrin instead of collagen. При лечении келоидных рубцов основной задачей ферментных препаратов является разрушение неправильно собранных коллагенновых фибрилл и протеогликанов до олигомеров и индивидуальных мономеров, которые частично используются для сборки новой более упорядоченной соединительной ткани. In the treatment of keloids primary goal is to destroy the enzyme preparations properly assembled the collagen fibrils and proteoglycans and individual oligomers to monomers which are partially used for the assembly of new connective tissue more ordered.

На основании этого можно полагать, что в медицинском применении могут оказаться более эффективными не препараты с узкоспецифичным действием (микробные коллагеназы), а комплексы протеолитических ферментов с более широким спектром субстратов. On this basis, it is believed that the medical use may be no more effective drugs with narrowly specific action (microbial collagenase), and the complexes of proteolytic enzymes with a broad spectrum of substrates.

Под комплексом протеолитических ферментов мы понимаем совокупность индивидуальных ферментов пищеварительной системы, обладающих протеолитическим действием, которые выделяются совместно в технологическом процессе. Under a complex of proteolytic enzymes, we mean a set of individual enzymes of the digestive system, having proteolytic activity, which stand together in the process.

К таким ферментным комплексам можно отнести сериновые протеазы, выделяемые из морских беспозвоночных (крабовая коллагеназа) и пищеварительные сериновые протеазы рыб. Such enzyme complexes include the serine proteases isolated from marine invertebrates (crab collagenase) and serine digestive protease fish.

В отличие от истинных коллагеназ сериновые протеазы беспозвоночных и рыб расщепляют все три полипептидных цепи тропоколлагена, причем образующиеся пептиды подвергаются дальнейшему гидролизу вплоть до индивидуальных аминокислот, которые либо включаются в процессы анаболизма, либо быстро выводятся из организма, не вызывая интоксикации. Unlike true collagenolytic serine protease digested fish and invertebrates all three polypeptide chain of tropocollagen, the produced peptides are further hydrolysis down to individual amino acids, which are either included in the anabolism processes or rapidly eliminated from the body without causing toxicity.

Наиболее широко разработаны и являются аналогами заявляемого способа методы получения крабовой коллагеназы из гепатопанкреаса крабов. The most widely developed and are analogous methods for the preparation of the claimed method collagenase crab hepatopancreas of crabs. Эффективность крабовой коллагеназы для очищения ран и лечения келоидных рубцов установлена и описана в патентной литературе (US 4801451, US 4963491, US 5945102 и US 6030612, а также RU 2008353, RU 2039819, RU 226505, RU 2365623). Efficacy crab collagenase for cleansing of wounds and the treatment of keloids established and described in the patent literature (US 4801451, US 4963491, US 5945102 and US 6030612 and RU 2008353, RU 2039819, RU 226505, RU 2365623).

Основной проблемой при промышленном получении препаратов на основе коллагеназы краба является нестабильность поставок сырья и длительный срок хранения сырья до доставки на перерабатывающее предприятие, что часто приводит обильному обсеменению сырья микроорганизмами и накоплению микробных эндотоксинов (по химической структуре представляющих собой липополисахариды), которые способны вызывать пирогенный эффект и аллергию. The main problem in the industrial production of drugs based on collagenase crab is a raw materials supply instability and long raw storage time before delivery to a processing plant which often results in abundant colonization raw microorganisms and accumulation of bacterial endotoxins (according to the chemical structure representing lipopolysaccharides) which can cause a pyrogenic effect and allergies. Это затрудняет промышленное выделение комплекса протеолитических ферментов и снижает его качество, а применение таких препаратов у пациентов сопровождается частыми аллергическими реакциями. This complicates the industrial isolation complex proteolytic enzymes and reduces its quality, and the use of such preparations in patients accompanied by frequent allergic reactions.

Как известно из уровня техники, комплексы протеолитических ферментов со сходными с крабовыми N-концевыми аминокислотными последовательностями можно выделить из пищеварительных органов рыб Изучение субстратной специфичности этих комплексов протеолитических ферментов показывает, что, в отличие от пищеварительных протеаз млекопитающих, они способны гидролизовать более широкий спектр субстратов, в том числе и коллагены различных типов, которые, вследствие особенностей аминокислотной последовательности и пространственной структуры, у As is known from the prior art, the complexes of proteolytic enzymes with similar with crab N-terminal amino acid sequences can be isolated from the digestive organs of fishes Study of substrate specificity of the complexes of proteolytic enzymes shows that, unlike the digestive proteases mammals, they are capable of hydrolysing a wide range of substrates, including collagens type which due to the nature of the amino acid sequence and spatial structure in стойчивы к действию большинства протеаз и доступны для гидролиза только специфическими ферментами - коллагеназами. Resistant to most proteases and hydrolysis only available for specific enzymes - collagenases. Источником комплекса протеолитических ферментов служат отходы пищевого производства рыбы - потроха (пищеварительные органы), которые обычно идут в отход и на утилизацию. The source of the complex of proteolytic enzymes are the waste of food fish production - giblets (digestive organs) that normally go to waste and recycling. По сравнению с крабовой коллагеназой этот источник гораздо более доступен и дешев (Zwilling R., et al., 1975 г, FEBS Lett. 60, 247-9; Gran GA, et al., 1981 г., Methods Enzymol 80, 722-734; Reeck GR and H. Neurath. 1972 г., Biochem. 11: 503-510, OA Klimova, et al., 1990 г., BBRC, v. 166, N3, 1411-1420). Compared with this source crab collagenase much more available and cheap (Zwilling R., et al, 1975, FEBS Lett 60, 247-9;.. Gran GA, et al, 1981 g., Methods Enzymol 80, 722-. 734; Reeck GR and H. Neurath g. 1972, Biochem 11:... 503-510, OA Klimova, et al, 1990 g., BBRC, v 166, N3, 1411-1420)..

Для медицинского использования наиболее предпочтительно использование комплексов протеолитических ферментов, выделяемых из пищеварительных органов рыб, так как они имеют сериновые протеазы, активные в отношении глубокого гидролиза коллагена и других белков соединительной ткани. For medical use, most preferably the use of the complexes of proteolytic enzymes secreted by the digestive organs of the fish, as they have a serine protease active against deep hydrolysis of collagen and other connective tissue proteins. Как показано в диссертационной работе «Соловьев М.М. As shown in the thesis "Soloviev MM Характеристика пищеварительных ферментов рыб озера Чаны на ранних этапов онтогенеза. Characteristics of digestive enzymes of fish Chany lake in the early stages of ontogeny. / Диссертация на соискание ученой степени к.б.н.: Новосибирск. / Thesis for the degree of k.b.n .: Novosibirsk. - 2011.» на всех этапах развития мирных и хищных рыб наибольший вклад в активность щелочных протеиназ вносит группа сериновых протеиназ (до 70-80%). - 2011 "at all stages of the development of peaceful and predatory fish the greatest contribution to the activity of alkaline protease makes a group of serine proteinase (70-80%). Доля цистеиновых протеиназ и металлопротеаз значительно меньше и не превышает 10-12%. The proportion of cysteine ​​proteases and metalloproteases considerably smaller and does not exceed 10-12%. У нехищных рыб выявлено 4-6 изоформ, у хищных 7-8 изоформ щелочных протеаз. In non-predatory fish found 4-6 isoforms in predatory 7-8 isoforms of alkaline proteases.

Известен «Способ выделения комплекса протеолитических ферментов из морепродуктов» путем гомогенизации сырья и осаждения ферментов, отличающийся тем, что, с целью расширения сырьевой базы и повышения выхода целевого продукта, в качестве сырья используют пилорические придатки камбалы, а осаждение ферментов ведут ацетоном при соотношении гомогенат:ацетон 1:2 (2,3). It is known "A method of isolating a complex of proteolytic enzymes seafood" by homogenization of raw materials and deposition of enzymes, characterized in that, in order to expand the resource base and increase the yield, as a raw material used pyloric appendages flounder, and deposition of enzymes are acetone at a ratio homogenate: acetone 1: 2 (2,3). При этом выделяемый комплекс представляет собой ценный набор ферментов, в частности щелочную, нейтральную и кислые протеиназы, аминопепсидазы и карбоксипептидазы. Thus secreted complex represents a valuable set of enzymes, in particular alkaline, neutral and acidic proteinase and carboxypeptidase aminopepsidazy. Способ выделения заключается в том, что выделенные из камбалы придатки гомогенизируют и быстро смешивают с двумя объемами, охлажденного до -15°С ацетона. allocation method is that isolated from flounder appendages homogenized and immediately mixed with two volumes, cooled to -15 ° C acetone. Через 20 мин материал отжимают от ацетона и высушивают при +20°С. After 20 minutes, the material is drained from acetone and dried at + 20 ° C. Удельная активность равна 0,76 по субстрату казеину. Specific activity is equal to 0.76 of the substrate casein. Протеолитическая активность выделенных ферментов в нейтральной и слабокислой области превосходит активность фермента, выделяемого из гепатопанкреаса краба (SU 1030409 C12N 9/64. «Способ выделения комплекса протеолитических ферментов из морепродуктов». М.В. Колодзейская, С.А. Кудинов, Л.М. Эпштейн, В.Н. Акулин. Заявл. 12.03.82, опубл. 23.07.83). Proteolytic activity of selected enzymes in neutral and weakly acidic region exceeds the activity of an enzyme released from crab hepatopancreas (SU 1030409 C12N 9/64. «A method of isolating a complex of proteolytic enzymes seafood." MV Kolodzeyskaya, SA Kudinov, LM . Epstein, VN Akulin. appl. 12/03/82, publ. 23.07.83).

Основным недостатком данного метода является использование больших количеств органического растворителя - ацетона, что требует соблюдения особых условий на производстве. The main disadvantage of this method is the use of large amounts of organic solvent - acetone, which requires special manufacturing conditions. Другим недостатком является присутствие в препарате балластных белков и липополисахаридов, что препятствует применению такого фермента в медицинских целях. Another disadvantage is the presence in the formulation of ballast proteins and lipopolysaccharides, which prevents the use of such an enzyme for medical purposes.

Известен ряд технических решений, в который описывается выделение протеолитических ферментов из рыб, но получаемый продукт также характеризуется наличием балластных белков и липополисахаридов, поэтому выделенные протеолитические ферменты пригодны только для использования в пищевой и кожевной промышленности. A number of technical solutions, which describes the isolation of proteolytic enzymes of the fish, but the resulting product is also characterized by the presence of ballast proteins and lipopolysaccharides so selected proteolytic enzymes are only suitable for use in the food industry and tanneries.

В частности, известен «Способ получения протеолитического ферментного препарата из внутренних органов». In particular, it is known "A method for producing a proteolytic enzyme preparation from the internal organs." Это изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментного препарата, и использовано в производстве пищевых продуктов из слабосозревающих объектов промысла Волго-Каспийского района. This invention relates to biotechnology, specifically to the production of the enzyme preparation, and used in food production from slabosozrevayuschih finfish Volga-Caspian area. Способ предусматривает измельчение сырья. The method comprises milling of raw material. Измельченное сырье подвергают автолизу в присутствии воды при гидромодуле 1:0,5 при рН 6,2±0,2 в течение 1-5 часов. Milled material was subjected to autolysis in the presence of water at a liquor ratio of 1: 0.5 at pH 6.2 ± 0.2 for 1-5 hours. После проведения автолиза жидкий автолизат, содержащий протеолитические ферменты, отделяют центрифугированием и подвергают очистке изопропиловым спиртом при гидромодуле 3:1 в течение 30-40 мин. Following autolysis liquid autolysate containing proteolytic enzymes is separated by centrifugation and purified with isopropyl alcohol at a liquor ratio 3: 1 for 30-40 min. Полученный в результате очистки жидкий ферментный препарат высушивают распылительно при температуре 150-180°С в течение 5-8 с. The resulting purification liquid enzyme preparation is spray dried at a temperature of 150-180 ° C for 5-8 seconds. Изобретение позволяет повысить выход протеолитического препарата и повысить его активность (RU №2288951 C12N 9/64 «Способ получения протеолитического ферментного препарата из внутренних органов рыб», опубл. 10.12.2006). The invention increases the yield of proteolytic drug and increase its activity (RU №2288951 C12N 9/64 «A method for producing a proteolytic enzyme preparation from the internal organs of fishes", publ. 10.12.2006).

Известен также способ получения ферментного препарата из рыбного сырья. Another known method of producing the enzyme preparation of the fish raw material. Это изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам извлечения протеолитических ферментов из рыбного сырья, и предназначено для использования в пищевой промышленности. This invention relates to biotechnology, specifically to methods for extraction of proteolytic enzymes of the fish raw material, and is intended for use in the food industry. Способ предусматривает измельчение сырья, выделение фермента экстракцией в присутствии раствора хлорида щелочного металла, отделение осадка, две стадии ультрафильтрации с добавлением в жидкую фракцию дробленого льда и лиофильную сушку концентрата. The method comprises milling of raw material, enzyme release by extraction in the presence of an alkali metal chloride, separating the precipitate, two ultrafiltration steps with the addition to the liquid fraction of crushed ice and freeze-drying the concentrate. На первой стадии ультрафильтрацию осуществляют на мембране с лимитом пропускания 50 кДа, а на второй стадии на мембране с лимитом пропускания 15 кДа. In the first ultrafiltration step is performed on a membrane with a 50 kDa transmission limit and the second step on a membrane with a transmission limit of 15 kDa. Изобретение позволяет повысить выход протеолитических ферментов и их активность в 3-5 раз по сравнению с известными аналогами (RU №2352634 C12N9/00 «Способ получения ферментного препарата из рыбного сырья», опубл. 20.04.2009). The invention increases the yield of proteolytic enzymes and their activity is 3-5 times as compared to known analogs (RU №2352634 C12N9 / 00 "Method of obtaining an enzyme preparation of raw fish", publ. 20.04.2009).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению является следующая последовательность действий для получения комплекса протеолитических ферментов из тканей рыб (Daboor SM, Budge SM, Chaly А.Е., et al. Extraction and Purification of Collagenase Enzymes: A Critical Review. // American Journal of Biochemistry and Biotechnology 6 (4): 239-263,2010.): The most close technical decision to the claimed invention is the following procedure for obtaining a complex of proteolytic enzymes from fish tissues (Daboor SM, Budge SM, Chaly AE, et al Extraction and Purification of Collagenase Enzymes:. A Critical Review // American Journal. of Biochemistry and Biotechnology 6 (4): 239-263,2010).:

- Гомогенизация сырья в 0,05 M Tris-HCl буфере с добавкой 0,005 М хлористого кальция при рН 7,4; - homogenization of raw material in 0,05 M Tris-HCl buffer with the addition of 0.005 M calcium chloride at pH 7.4;

- Центрифугирование гомогената при 25000×g в течение 30 мин при +4°С и сбор супернатанта; - centrifugation of the homogenate at 25,000 × g for 30 minutes at + 4 ° C and collecting the supernatant;

- Повторная экстракция осадка в 0,05 М Tris-HCl буфере с добавкой 0,005 М хлористого кальция при рН 7,4 с последующим центрифугированием гомогената при 25000×g в течение 30 мин и сбором супернатанта; - Re-extraction of the precipitate in 0.05 M Tris-HCl buffer with the addition of 0.005 M calcium chloride at pH 7.4 followed by centrifugation of the homogenate at 25,000 × g for 30 minutes and collecting the supernatant;

- Объединение супернатантов и центрифугирование при 40000×g в течение 30 мин при +4°С; - Combining supernatants and centrifugation at 40,000 × g for 30 minutes at + 4 ° C;

- Фильтрование полученного супернатанта через мембрану с порами 0,2 мкм; - Filtration of the resulting supernatant through a membrane with pores of 0.2 microns;

- Фракционирование белка переосаждением в растворе сульфата аммония при насыщении в пределах 40-80%; - fractionation by reprecipitation of the protein in solution during the ammonium sulfate saturation in the range of 40-80%;

- Выделение сульфатаммонийного осадка фракционированного фермента центрифугированием; - Isolation of the enzyme fractionated sulfatammoniynogo precipitate by centrifugation;

- Растворение осадка в буфере; - dissolving the precipitate in a buffer;

- Обессоливание путем пропускания раствора через полые волокна с размером пор 10 кДа; - Desalting by passing the solution through a hollow fiber having a pore size of 10 kDa;

- Вторичная очистка комплекса протеолитических ферментов с помощью ионообменной хроматографии. - Secondary Treatment complex of proteolytic enzymes by ion exchange chromatography.

Большая часть протеолитических ферментов находятся в клетках тканей либо в неактивной форме, либо в лизосомах, иначе бы они переваривали сами клетки. Most of the proteolytic enzymes found in the tissues or cells in an inactive form, or in the lysosomes, otherwise they would have digested the cells themselves. Поэтому, чтобы их экстрагировать необходимо разрушить клетки. Therefore, in order to extract their need to destroy the cells. Гомогенизация это процедура разрушения клеток и лизосом под действием механических, температурных или химических факторов. Homogenization is the process of destruction and lysosomes of cells under the influence of mechanical, thermal or chemical factors. От степени разрушения (измельчения клеток) зависит скорость и количество выхода ферментов в экстрагирующий раствор. The degree of destruction (crushing cells) depends on the speed and the amount of release of enzymes in the extraction solution. Обычно продолжительность экстракции составляет от нескольких часов до 2-3 суток. Typically, the extraction time is from several hours to 2-3 days. Другой процедурой извлечения протеолитических ферментов является автолиз, используемый в большинстве вышеприведенных патентов-аналогов. Another procedure for extraction of proteolytic enzymes, autolysis is used in most of the above patents-analogues. Автолиз тканей протекает при повышенных температурах. tissue autolysis takes place at elevated temperatures. В ходе него наблюдается ускоренный транспорт протеаз через лизосомальные барьеры с последующей их активацией и разрушением клеточных и лизосомальных барьеров под действием активных протеаз. During transportation has been accelerated through the lysosomal proteases barriers with subsequent activation and destruction of the cell and the lysosomal barriers under the action of active proteases. Также автолиз сопровождается побочными явлениями, к которым можно отнести автогидролиз самих ферментов и накопление в автолизированных тканях микробной биомассы, что приводит к резкому повышению содержания ЛПС и других микробных токсинов. Autolysis also accompanied by side effects, which include auto-hydrolysis enzymes themselves and accumulate in tissues Autolyzed microbial biomass, which leads to a sharp increase in the content of LPS and other microbial toxins.

Центрифугирование и мембранная фильтрация это технологические процедуры, направленные на удаление из гомогенизата нерастворимых частиц тканей, нерастворимых липидно-белковых комплексов и других нерастворимых частиц. Centrifugation and membrane filtration is technological procedures aimed at removing from the tissue homogenate of insoluble particles, insoluble lipid-protein complexes, and other insoluble particles.

Фракционирование белка в сульфате аммония это процедура первичной очистки при выделении белков. protein in the ammonium sulfate fractionation is primary purification procedure for allocating proteins. Высаливание белков идет по двум механизмам: сульфат-ионы делают молекулу белка более компактной, а следовательно, менее растворимой, сульфат-ионы связывают свободную воду. Salting out of proteins is by two mechanisms: sulphate ions protein molecule make more compact, and consequently, less soluble sulfate ions bind free water. Один ион SO 4 2- имеет 13-14 молекул H 2 O только в первом гидратном слое и, возможно, больше - во втором. One ion SO 4 2- is 13-14 molecules of H 2 O only in the first hydrated layer and, perhaps more - in the second. Считается, что при концентрации 5,4 Моля сульфат аммония связывает всю свободную воду - это 100% насыщение. It is believed that at a concentration of 5.4 Mol ammonium sulfate connects all the free water - is 100% saturation. Достоинствами сульфата аммония является то, что он имеет примерно одинаковую растворимость в диапазоне температур 0-+30 градусов Цельсия и то, что в концентрации выше 0,5 М он стабилизирует белки против денатурации. The advantages of the ammonium sulfate is that it has approximately the same solubility in the temperature range 0 to + 30 degrees Celsius and that at a concentration above 0.5M it stabilizes the proteins against denaturation. Обычно, индивидуальные белки теряют растворимость и выпадают в осадок при определенной степени насыщения раствора сульфатом аммония. Typically, individual proteins lose solubility and precipitate at a certain degree of saturation ammonium sulfate solution. При выделении сразу нескольких индивидуальных белков, как в нашем случае, происходит их осаждение в достаточно широком диапазоне насыщения сульфата аммония. When allocating multiple individual proteins, as in our case, it is their precipitation in a sufficiently broad range of ammonium sulfate saturation. Очищенный комплекс протеолитических ферментов, выделенный из рыб обычно высаждается в области насыщения сульфата аммония от 40 до 80%. The purified proteolytic enzyme isolated from fish usually precipitates in the ammonium sulfate saturation of 40 to 80%. Осадок отделяют от раствора сульфата аммония осаждением в центрифуге. The precipitate was separated from the solution by precipitation with ammonium sulfate in a centrifuge. Однако наличие в растворе нуклеиновых кислот и липидно-белковых комплексов ухудшает селективность фракционирования и приводит к соосаждению целевого комплекса протеолитических ферментов во всех фракциях сульфатаммонийного осадка. However, the presence in the solution of nucleic acids and lipid-protein complexes worsen the fractionation selectivity and results in the coprecipitation of the desired complex proteolytic enzymes in all fractions sulfatammoniynogo precipitate.

После растворения осадка фракции белков в буфере, раствор содержит значительное количество сульфата аммония, который будет мешать дальнейшей очистке комплекса протеолитических ферментов. After dissolving the protein fractions precipitate in a buffer solution contains a significant amount of ammonium sulfate, which will interfere with further purification of the complex of proteolytic enzymes. Раствор подвергают обессаливанию. The solution was subjected to desalting. Обычно, эту процедуру проводят путем ультрафильтрации через мембрану с определенным размером пор. Usually, this procedure is performed by ultrafiltration through a membrane with defined pore size. Однако, в нашем случае появление тонкодисперсного осадка липидно-белкового комплекса приводит к быстрой закупорке пор и резкому торможению процесса. However, in this case the appearance of fine particulate precipitate a lipid-protein complex leads to a rapid clogging of pores and a sharp braking process. Поэтому для обессаливания необходимо использовать тангенциальную фильтрацию. It is therefore necessary to use a tangential filtration for desalting. При тангенциальной фильтрации поток раствора направляют параллельно поверхности мембраны, что позволяет непрерывно смывать, забивающий поры осадок. In tangential filtration of the solution flow is directed parallel to the membrane surface, allowing continuous flush clogging pores precipitate. Разновидностью тангенциальной фильтрации являются аппараты с полыми волокнами и различные мембранные модули для тангенциальной фильтрации. A variety of devices are tangential filtration hollow fiber membrane and a variety of modules for tangential filtration.

Ионообменная хроматография эффективный способ разделения индивидуальных белков. Ion exchange chromatography method effective separation of individual proteins. Белки связываются с сорбентом и элюируются с него в соответствии со своим зарядом. Proteins bind to the sorbent and eluted with him according to his charge. Ионообменная хроматография позволяет отделить целевые белки от сопутствующих. Ion exchange chromatography separates proteins targeted by concomitant. Однако при выделении комплекса протеолитических ферментов из пищеварительных органов рыб ионообменная хроматография становится неэффективна, опять же из-за присутствия белково-липидного комплекса. However, the allocation of a complex of proteolytic enzymes of the digestive organs of fish becomes ineffective ion exchange chromatography, again due to the presence of protein-lipid complex. Белково-липидный комплекс необратимо садится на сорбент и связывает значительное количество белков комплекса протеолитических ферментов. Protein-lipid complex sits irreversibly binds to the sorbent and a significant amount of protein complex of proteolytic enzymes. В результате их выход с ионообменной хроматографии не превышает 10%. As a result of ion exchange chromatography with the yield does not exceed 10%.

Недостатком данного известного способа является то, что предложенная в нем методика не учитывает особенностей тканей рыб. A disadvantage of this known method is that the methodology proposed therein does not take into account features of fish tissues. В них присутствует большое количество липидов, балластных и гидрофобных белков, а также нуклеиновых кислот и других полианионных молекул, которые склонны к образованию липидно-белковых комплексов, препятствующих выделению ферментов высокой степени очистки. They present a large amount of lipid and hydrophobic proteins ballast, as well as nucleic acids and other polyanionic molecules which tend to form a lipid-protein complexes hindering the release of enzymes of high purity. Липиды и нуклеиновые кислоты способны соосаждаться с ферментами. Lipids and nucleic acids can be coprecipitated with enzymes. Образование липидно-белковых и полиэлектролитных комплексов затрудняет ультрафильтрацию и мембранную фильтрацию, а также приводит к неспецифическому необратимому связыванию больших количеств целевых ферментов с сорбентом на технологических стадиях ионообменной хроматографии. The formation of lipid-protein and polyelectrolyte complexes complicates ultrafiltration and membrane filtration, and leads to irreversible unspecific binding of large amounts of target enzyme from the sorbent processing steps of ion exchange chromatography. В результате существенными недостатками взятой в качестве прототипа схемы являются низкий выход конечной продукции - (менее 10% от содержания в сырье) и низкая коллагенолитическая активность. As a result, significant disadvantages taken as a prototype circuit are low yield of the final product - (less than 10% of the content in the raw material) and low collagenolytic activity.

Под липидно-белковым комплексом понимаются комплексы, образующиеся в экстракте в результате связывания фосфолипидов с белками за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, которые в процессе выделения целевых ферментов теряют растворимость и выпадают в виде нерастворимых комплексов и мицелл. Under the lipid-protein complex refers to complexes formed in the extract resulting from the binding of phospholipids to proteins due to ionic and hydrophobic interactions that in the process of isolating target enzymes lose solubility and drop as insoluble complexes and micelles.

Они способны захватывать и осаждать целевые ферменты, что приводит к снижению выхода целевого продукта. They are able to capture and precipitate the target enzymes, which leads to a decrease in the yield.

Технической задачей изобретения является создание эффективного способа получения очищенного комплекса протеолитических ферментов медицинского применения и расширение арсенала способов получения очищенного комплекса протеолитических ферментов. An object of the invention is to provide an efficient method for producing a purified complex of proteolytic enzymes for medical application and expansion of the arsenal of ways to obtain a purified complex of proteolytic enzymes.

Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи, состоит в получении комплекса протеолитических ферментов, содержащего щелочные, нейтральные и кислые протеиназы, с повышенной коллагенолитической активностью за счет повышения специфической активности в отношении глубокого гидролиза коллагена и желатины, а также расщепления гемоглобина, казеина, снижении пирогенности (способность вещества вызывать повышение температуры тела), одновременно с повышением количественного выхода целевого продукты. The technical result providing solution of the problem, consists in obtaining a complex of proteolytic enzymes, containing the alkaline, neutral and acid proteases with increased collagenolytic activity by increasing the specific activity against deep collagen hydrolysis and gelatin, as well as hemoglobin cleavage casein reducing pyrogenicity ( ability of a substance to cause an increase in body temperature), simultaneously with an increase in the quantitative yield of the desired products. Обнаружено, что помимо вышеназванных субстратов комплекс протеолитических ферментов способен в меньшей степени расщеплять хитозан, аналог гликозоаминогликанов соединительной ткани. It was found that besides the above substrates complex of proteolytic enzymes capable of cleaving a lesser degree chitosan, analog glikozoaminoglikanov connective tissue.

Указанный технический результат достигается за счет включения в процесс получения комплекса протеолитических ферментов на оптимальных стадиях операций отделения нуклеиновых кислот и липидно-белковых комплексов путем обработки экстракта полиэтиленимином, а также операции хроматографической очистки на гидрофобном сорбенте, что позволяет своевременно удалить из выделяемого фермента липополисахариды, ответственные за пирогенность. Said technical result is achieved by the inclusion in the process of preparation of a complex of proteolytic enzymes at optimal stages operations separation of nucleic acids and lipid-protein complexes by treating the extract with polyethyleneimine, and also operations chromatographic purification on the hydrophobic sorbent that removes timely of emitted enzyme lipopolysaccharides responsible for pyrogenicity. Отсутствие пирогености значительно повышает качество препарата по сравнению с аналогами при медицинском применении. Absence of pyrogens significantly improves the quality of the drug compared with analogues in medical applications.

Сущность изобретения состоит в том, что способ выделения комплекса протеолитических ферментов из пищеварительных органов рыб включает … последовательно выполняемые гомогенизацию тканей в буфере, отделение измельченных тканей центрифугированием, фильтрование супернатанта через мембрану, высаливание белков в сульфате аммония, выделение сульфатаммонийного осадка центрифугированием, растворение осадка в буфере, обессоливание экстракта диафильтрацией, очистку ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе, отличающийся тем, что до осаж Summary of the invention consists in the fact that a method of separating a complex of proteolytic enzymes of the digestive organs of fish comprises ... sequentially performed homogenizing the tissue in a buffer, separation by centrifugation of crushed tissue, filtering the supernatant through a membrane, salting out of proteins in the ammonium sulfate, isolation sulfatammoniynogo centrifugation precipitate precipitate dissolving buffer , desalting by diafiltration extract, purification by ion exchange chromatography on DEAE-cellulose, characterized in that before the upset дения белков в сульфате аммония нуклеиновые кислоты и липидно-белковые комплексы удаляют из экстракта обработкой раствором полиэтиленимина, который добавляют до конечной концентрации полиэтиленимина в экстракте от 0,1 до 0,01 вес. Denia proteins in ammonium sulphate nucleic acid and lipid-protein complexes was removed from the extract by treatment with a solution of polyethyleneimine, which was added to a final concentration of polyethyleneimine in the extract is from 0.1 to 0.01 wt. %, а после ионообменной хроматографии осуществляют отделение остаточных пирогенов на гидрофобном сорбенте Сфероцелл С-80, стерилизующую фильтрацию через мембрану с размером пор 0,2 мкм и повторное обессоливание экстракта диафильтрацией с последующим приготовлением готовой формы лиофилизацией. %, And after ion exchange chromatography separation is carried out on the residual pyrogens hydrophobic sorbent Sferotsell C-80, a sterilizing filtration through a membrane with a pore size of 0.2 microns and re-extract desalting by diafiltration, followed by preparation of the formulation by lyophilization.

Предпочтительно, для получения готовой дозированной формы после отделения остаточных пирогенов вводят криопротектор, например, физиологически приемлемый буфер, моно- или дисахарид, в количестве от 1 до 10% вес. Preferably, to obtain a finished dosage form after separation of residual pyrogens administered cryoprotectant, e.g., a physiologically acceptable buffer, a mono- or disaccharide in an amount of from 1 to 10% by weight. %, и/или медицинский биополимер, в количестве от 0,1 до 10% вес. %, And / or medical biopolymer in an amount of from 0.1 to 10% by weight. %. %.

Предпочтительно, гомогенизацию производят постепенно добавляя 0,05 М Трис-буфер с добавкой 0,005М хлористого кальция CaCl 2 рН 7,4. Preferably, homogenization produce gradually adding 0.05 M Tris buffer supplemented with 0.005 M calcium chloride CaCl 2 pH 7.4. с последующей экстракцией на холоду. followed by extraction of the cold.

В одних частных случаях реализации способа обессоливание экстракта диафильтрацией осуществляют путем пропускания раствора через полые волокна с размером пор 10 кДа, в иных случаях обессоливание экстракта диафильтрацией осуществляют на модуле тангенциальной ультрафильтрации. In some special cases of the method of desalting by diafiltration of the extract is carried out by passing the solution through a hollow fiber having a pore size of 10 kDa, in some cases desalting by diafiltration is performed to extract a tangential ultrafiltration module.

Предпочтительно, моно- или дисахарид, выбирают из группы: маннитол, лактоза или трегалоза, а медицинский биополимер - из группы декстранов, поливинилпирралидонов, поливиниловых спиртов. Preferably, the mono- or disaccharide is selected from the group of mannitol, lactose or trehalose and medical biopolymer - from the group of dextrans, polivinilpirralidonov, polyvinyl alcohols.

На чертеже представлен рисунок электрофореза. The drawing shows the electrophoresis pattern.

ПРИМЕРЫ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ EXAMPLES Preparation of the complex of proteolytic enzymes

Пример 1. Example 1.

В качестве исходного сырья использовали 400 г пищеварительных органов африканского сома. As a raw material was used 400 g of digestive organs African catfish. Органы отмыли от крови водой и провели гомогенизацию тканей в буфере, для чего дезинтегрировали в гомогенизаторе (10 мин), постепенно добавляя 0,05 М Трис-буфер с добавкой 0,005М хлористого кальция CaCl 2 рН 7,4 (800 мл). Organs were washed by water, blood and tissue homogenization held in the buffer, which disintegrated in a homogenizer (10 min), gradually adding 0.05 M Tris buffer supplemented with 0.005 M calcium chloride CaCl 2 pH 7.4 (800 ml). Для отделения измельченных тканей (гомогената) центрифугированием предварительно провели экстракцию на холоду в течение суток. For separating the crushed tissue (homogenate) pre-centrifugation, extraction was carried out in the cold for one day. Общий объем экстракта составил 1200 мл. The total amount of extract amounted 1200 ml. Гомогенат центрифугировали при 25000 об/мин, +4°С 30 мин. The homogenate is centrifuged at 25,000 rev / min, + 4 ° C for 30 minutes. Верхний слой липидов откинули. The upper lipid layer was pulled back.

Осадок повторно гомогенизировали в 0,05 М Трис-буфере с добавкой 0,005М хлористого кальция CaCl 2 рН 7,4 (200 мл), провели повторную экстракцию на холоду в течение суток. The pellet was re-homogenized in 0.05 M Tris buffer supplemented with 0.005 M calcium chloride CaCl 2 pH 7.4 (200 ml), extraction was conducted repeated in the cold for one day. Общий объем экстракта составил 300 мл. The total amount of extract was 300 ml. Экстракт (Гомогенат) для отделение измельченных тканей центрифугировали при 25000 об/мин, +4°С 30 мин. Extract (homogenate) for the separation of shredded tissue was centrifuged at 25,000 rev / min, + 4 ° C for 30 minutes. Верхний слой липидов и осадок откинули. The top layer lipids, and the precipitate was pulled back.

Оба супернатанта объединили и получили 1200 мл раствора. Both the supernatant were combined and received 1200 ml solution. Полученный раствор профильтровали через мембрану с размерами пор 0,2 мкм. The resulting solution was filtered through a membrane with a pore size of 0.2 microns.

Раствор подтитровали 0,1 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. Podtitrovali solution of 0.1 M sodium hydroxide to pH 8.0. Отдельно приготовили раствор, содержащий 5 вес. Separately prepared solution containing 5 wt. % полиэтиленимина. % PEI. При перемешивании в 1200 мл раствора супернатанта добавили 24 мл раствора полиэтиленимина (ПЭИ) до конечной концентрации полиэтиленимина в растворе 0,1 вес. With stirring, 1200 ml of the supernatant was added 24 ml of a solution of polyethyleneimine (PEI) to a final concentration of polyethyleneimine in a 0.1 wt. %. %. Конечную концентрацию полиэтиленимина в растворе (С ПЭИ кон ) рассчитываем по формуле 1: The final concentration of polyethyleneimine in the solution (C PEI con) is calculated by formula 1:

Figure 00000001

где V ПЭИ - объем добавляемого раствора полиэтиленимина в миллилитрах, PEI where V - volume of solution added polyethyleneimine in milliliters,

С ПЭИ - концентрация взятого раствора ПЭИ в весовых процентах, With PEI - PEI solution concentration is taken in weight percent,

V p-pa - объем раствора супернатанта в миллилитрах. V p-pa - supernatant solution volume in milliliters.

Конечная концентрация полиэтиленимина составит (24*5)/1224≈0,1 (весовой процент полиэтиленимина в экстракте). The final concentration of polyethyleneimine is (24 * 5) / 1224≈0,1 (weight percent of polyethylenimine in the extract).

Образовался осадок нуклеиновых кислот с ПЭИ. A precipitate was formed nucleic acids with PEI. Раствор перемешивали еще 40 минут при комнатной температуре для укрупнения осадка. The solution was stirred for another 40 minutes at room temperature to precipitate coarsening.

Осадок (нуклеиновые кислоты) выделили на центрифуге 12000 об/мин в течение 25 мин. The precipitate (nucleic acid) gave the centrifuge 12,000 rpm / min for 25 min. Осадок ПЭИ и нуклеиновых кислот практически не имел протеолитической активности. The precipitate PEI and nucleic acids had virtually no proteolytic activity. Его отбросили. His discarded.

В раствор, собранный после обработки ПЭИ, ввели сульфат аммония до 80% насыщения. The solution collected after PEI treatment, ammonium sulfate is introduced to 80% saturation. Осадок формировали в холодильнике в течение суток. The precipitate formed in the refrigerator for one day. Осадок выделили центрифугированием при 12000 об/мин, +4°С 20 мин. The precipitate was isolated by centrifugation at 12,000 rev / min, + 4 ° C for 20 minutes. Осадок белков растворили в 0,05М Трис-буфере. The precipitate protein was dissolved in 0.05 M Tris buffer. Раствор обессолили диафильтрацией на полых волокнах с размерами пор 10 кДа. The solution was desalted by diafiltration hollow fiber having a pore size of 10 kDa.

Провели ионообменную хроматографией на DEAE-целлюлозе. We spent ion exchange chromatography on DEAE-cellulose. Колонку, содержащую 80 мл суспензии сорбента DEAE-целлюлозы, предварительно уравновесили 0,01 М Трис-буфером. The column containing 80 ml of sorbent suspension DEAE-cellulose previously equilibrated with 0.01 M Tris buffer. Обезсоленый раствор белков нанесли на колонку. Obezsoleny protein solution was applied to the column. Элюцию сорбированных белков провели градиентом натрия хлористого 0,05-1,0 М NaCl в 0,01 М Трис буфере, рН 8,0. Elution of adsorbed proteins had a sodium chloride gradient of 0.05-1.0 M NaCl in 0.01 M Tris buffer, pH 8.0. Скорость элюции 20-40 мл/час. elution rate of 20-40 ml / hour. Контроль содержания белка провели с помощью УФ-детектора при длине волны 280 нм. Control protein content held by a UV detector at a wavelength of 280 nm. При элюции собрали три фракции белка, имеющего активность. When the elution fractions collected three proteins having the activity. Все активные фракции объединили. All active fractions were pooled. Объединенный раствор обессолили диафильтрацией на установке для тангенциальной ультрафильтрации. The combined solution was desalted by diafiltration on an installation for tangential ultrafiltration.

Провели хроматографию полученного раствора на гидрофобном сорбенте для отделения остаточных пирогенов. We conducted chromatography of the resulting solution onto a hydrophobic sorbent for separating residual pyrogens. В колонку поместили 50 мл гидрофобного сорбента Сфероцелл С-80, содержащего гидрофобные лиганды С8-С10 (сорбент на основе макропористой целлюлозной матрицы, модифицированной октил/децилглицидиловым эфиром). The column was placed 50 ml of a hydrophobic sorbent Sferotsell C-80 containing hydrophobic ligands C8-C10 (sorbent based on macroporous cellulose matrix modified octyl / detsilglitsidilovym ether). Колонку уравновесили 0,01 М фосфатным буфером с добавкой 0,05М NaCl, рН 8,0. The column was equilibrated with 0.01 M phosphate buffer supplemented with 0.05 M NaCl, pH 8.0. Раствор пропускали через колонку с сорбентом со скоростью 20-40 мл/час. The solution was passed through a column of adsorbent at a rate of 20-40 ml / hour. Выход фермента контролировали УФ-детектором по оптической плотности раствора. The yield of enzyme was monitored by a UV detector for the optical density of the solution. Собранный раствор обессолили с помощью диафильтрации на установке для тангенциальной ультрафильтрации и сконцентрировали до содержания белка 4 мг/мл (по Лоури). The collected solution is desalted via diafiltration in a plant for tangential ultrafiltration and concentrated to a protein content of 4 mg / ml (according to Lowry). Довели рН полученного раствора до 7,4. The pH of the resulting solution was adjusted to 7.4. Далее провели стерилизующую фильтрацию через мембрану 0,2 мкм. Further spent sterilizing filtration through a 0.2 .mu.m membrane.

В полученный раствор ввели моносахарид маннитол до концентрации 3,2% и полимер полиглюкин (декстран) до концентрации 0,1%. The resulting solution was introduced monosaccharide mannitol to a concentration of 3.2% and polyglukin polymer (dextran) to a concentration of 0.1%. Раствор стерилизовали фильтрацией через мембрану с порами 0,2 мкм. The solution was sterilized by filtration through a membrane with pores of 0.2 microns. Раствор разлили по стерильным флаконам по 1,25 мл/флакон. The solution was poured into sterile vials at 1.25 mL / vial.

Флаконы заморозили до -40°С в течение 2-10 часов и лиофилизовали в течение суток по стандартной программе. The vials were frozen to -40 ° C for 2-10 hours and lyophilized for one day under the standard program. После лиофилизации флаконы герметично укупорили. After lyophilization the vials were hermetically capped.

Получили очищенный комплекс протеолитических ферментов с активностью по коллагену 1500-2500 мкг субстрата/мин×мг фермента, который может быть использован для медицинских целей. A purified complex of proteolytic enzymes with activity on collagen substrate 1500-2500 mcg / min × mg enzyme which can be used for medical purposes. В 1 флаконе 5 мг очищенного комплекса протеолитических ферментов. In one vial of 5 mg of purified complex of proteolytic enzymes. Всего получили 120 флаконов. Total received 120 vials.

Выполнен электрофорез выделенного комплекса протеолитических ферментов в полиакриламидном геле. Completed electrophoresis isolated complex of proteolytic enzymes in polyacrylamide gel. После окрашивания пластины геля красителем кумасси синим виден большой набор полос белков с различными массами. After staining the gel with Coomassie blue visible plate a large set of proteins with bands of different masses. Наиболее интенсивно окрашены полосы соответствующие массам 25±2 и 36±3 кДа и мене интенсивно в области 45 кДа. The most intensely colored band corresponding to the masses 25, ± 2 and 36 ± 3 kDa and Me vigorously in 45 kDa.

Специфическую коллагенолитическую активность выделенного в примерах комплекса протеолитических ферментов определялась по скорости ферментативного гидролиза коллагена методом окрашивания освобождающихся аминогрупп тринитробензолсульфокислотой (ТНБС). Specific collagenolytic activity of the isolated complex in the Examples of proteolytic enzymes was determined from the rate of enzymatic hydrolysis of collagen by staining liberated amino trinitrobenzolsulfokislotoy (TNBS). Активность определяли в микрограммах гидролизованного субстрата 1 миллиграммом фермента в минуту. Activity was determined in micrograms of hydrolyzed substrate 1 milligram of enzyme per minute.

Метод ТНБС известен из технической литературы: Практическая химия белка: Пер. TNBS method known from the technical literature: Practical Protein Chemistry: Trans. с англ. from English. / Под ред. / Ed. А. Дарбре. A. Darbre. - М.: Мир, 1989. - 623 с. - M .: Mir, 1989. - 623 p.

Пример 2. Example 2.

В качестве исходного сырья использовали 400 г пищеварительных органов щук. As a raw material was used 400 g of digestive organs pike. Органы отмыли от крови водой и провели гомогенизацию тканей в буфере, для чего дезинтегрировали в гомогенизаторе (10 мин), постепенно добавляя 0,05 М Трис-буфер включающий 1 М хлористого натрия NaCl и 0,005М хлористого кальция CaCl 2 рН 7,4 (800 мл). Organs were washed with water from the blood and carried out homogenization of the tissue in a buffer, which disintegrated in a homogenizer (10 min), gradually adding 0.05 M Tris-buffer comprising 1 M NaCl and 0.005 M calcium chloride, sodium chloride CaCl 2 pH 7.4 (800 mL). Для отделения измельченных тканей (гомогената) центрифугированием предварительно провели экстракцию на холоду в течение суток. For separating the crushed tissue (homogenate) pre-centrifugation, extraction was carried out in the cold for one day. Общий объем экстракта составил 1200 мл. The total amount of extract amounted 1200 ml. Гомогенат центрифугировали при 25000 об/мин, +4°С 30 мин. The homogenate is centrifuged at 25,000 rev / min, + 4 ° C for 30 minutes. Верхний слой липидов откинули. The upper lipid layer was pulled back.

Осадок повторно гомогенизировали в 0,05 М Трис-буфере с добавкой 0,005М хлористого кальция CaCl 2 рН 7,4 (200 мл). The pellet was re-homogenized in 0.05 M Tris buffer supplemented with 0.005 M calcium chloride CaCl 2 pH 7.4 (200 ml). провели повторную Экстракцию провели на холоду в течение суток. conducted repeated extractions carried out in the cold for days. Общий объем экстракта составил 300 мл. The total amount of extract was 300 ml. Экстракт (Гомогенат) для отделение измельченных тканей центрифугировали при 25000 об/мин, +4°С 30 мин. Extract (homogenate) for the separation of shredded tissue was centrifuged at 25,000 rev / min, + 4 ° C for 30 minutes. Верхний слой липидов и осадок откинули. The top layer lipids, and the precipitate was pulled back.

Оба супернатанта объединили и получили 1200 мл раствора. Both the supernatant were combined and received 1200 ml solution. Полученный раствор профильтровали через мембрану с размерами пор 0,2 мкм. The resulting solution was filtered through a membrane with a pore size of 0.2 microns.

Раствор подтитровали 0,1 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. Podtitrovali solution of 0.1 M sodium hydroxide to pH 8.0. При перемешивании в 1200 мл раствора супернатанта добавили 6 мл раствора полиэтиленимина (ПЭИ) до конечной концентрации полиэтиленимина в растворе 0,025 вес. With stirring, 1200 ml of the supernatant solution was added 6 ml of a solution of polyethyleneimine (PEI) to a final concentration of polyethyleneimine in the solution of 0.025 wt. %. %.

Конечная концентрация полиэтиленимина составила (6*5)/1206≈0,025 (весовой процент полиэтиленимина в экстракте). The final concentration of polyethyleneimine amounted to (6 * 5) / 1206≈0,025 (weight percent of polyethylenimine in the extract).

Образовался осадок нуклеиновых кислот с ПЭИ. A precipitate was formed nucleic acids with PEI. Раствор перемешивали еще 40 минут при комнатной температуре для укрупнения осадка. The solution was stirred for another 40 minutes at room temperature to precipitate coarsening.

Осадок (нуклеиновые кислоты) выделили на центрифуге 12000 об/мин в течение 25 мин. The precipitate (nucleic acid) gave the centrifuge 12,000 rpm / min for 25 min. Осадок ПЭИ и нуклеиновых кислот практически не имел протеолитической активности. The precipitate PEI and nucleic acids had virtually no proteolytic activity. Его отбросили. His discarded.

В раствор, собранный обработки ПЭИ, ввели сульфат аммония до 80% насыщения. The solution was collected PEI treatment, ammonium sulfate is introduced to 80% saturation. Осадок формировали в холодильнике в течение суток. The precipitate formed in the refrigerator for one day. Осадок выделили центрифугированием при 12000 об/мин, +4°С 20 мин. The precipitate was isolated by centrifugation at 12,000 rev / min, + 4 ° C for 20 minutes. Осадок белков растворили в 0,05М Трис-буфере. The precipitate protein was dissolved in 0.05 M Tris buffer. Раствор обессолили диафильтрацией на полых волокнах с размерами пор 10 кДа. The solution was desalted by diafiltration hollow fiber having a pore size of 10 kDa.

Провели ионообменную хроматографией на DEAE-целлюлозе. We spent ion exchange chromatography on DEAE-cellulose. Колонку, содержащую 80 мл суспензии сорбента DEAE-целлюлозы, предварительно уравновесили 0,01 М Трис-буфером. The column containing 80 ml of sorbent suspension DEAE-cellulose previously equilibrated with 0.01 M Tris buffer. Обезсоленый раствор белков нанесли на колонку. Obezsoleny protein solution was applied to the column. Элюцию сорбированных белков провели градиентом натрия хлористого 0,05-1,0 М NaCl в 0,01 М Трис буфере, рН 8,0. Elution of adsorbed proteins had a sodium chloride gradient of 0.05-1.0 M NaCl in 0.01 M Tris buffer, pH 8.0. Скорость элюции 20-40 мл/час. elution rate of 20-40 ml / hour. Контроль содержания белка провели с помощью УФ-детектора при длине волны 280 нм. Control protein content held by a UV detector at a wavelength of 280 nm. При элюции собрали три фракции белка, имеющего активность. When the elution fractions collected three proteins having the activity. Все активные фракции объединили. All active fractions were pooled. Объединенный раствор обессолили диафильтрацией на установке для тангенциальной ультрафильтрации. The combined solution was desalted by diafiltration on an installation for tangential ultrafiltration.

Провели хроматографию полученного раствора на гидрофобном сорбенте для отделения остаточных пирогенов. We conducted chromatography of the resulting solution onto a hydrophobic sorbent for separating residual pyrogens. В колонку поместили 50 мл гидрофобного сорбента Сфероцелл С-80, содержащего гидрофобные лиганды С8-С10. The column was placed 50 ml of a hydrophobic sorbent Sferotsell C-80 containing hydrophobic ligands C8-C10. Колонку уравновесили 0,01 М фосфатным буфером с добавкой 0,05М NaCl, рН 8,0. The column was equilibrated with 0.01 M phosphate buffer supplemented with 0.05 M NaCl, pH 8.0. Раствор пропускали через колонку с сорбентом со скоростью 20-40 мл/час. The solution was passed through a column of adsorbent at a rate of 20-40 ml / hour. Выход фермента контролировали УФ-детектором по оптической плотности раствора. The yield of enzyme was monitored by a UV detector for the optical density of the solution. Собранный раствор обессолили с помощью диафильтрации на установке для тангенциальной ультрафильтрации и сконцентрировали до содержания белка 2 мг/мл (по Лоури). The collected solution is desalted via diafiltration in a plant for tangential ultrafiltration and concentrated to protein content 2 mg / ml (according to Lowry). Довели рН полученного раствора до 7,4. The pH of the resulting solution was adjusted to 7.4. Далее провели стерилизующую фильтрацию через мембрану 0,2 мкм. Further spent sterilizing filtration through a 0.2 .mu.m membrane.

В полученный раствор ввели дисахарид лактозу до концентрации 10% и г полимер поливинилпирралидон (марки коллидон 17 PF) до концентрации 2,5%. The resulting solution was introduced disaccharide lactose to a concentration of 10% and g polivinilpirralidon polymer (brand Kollidon 17 PF) to a concentration of 2.5%. Раствор стерилизовали фильтрацией через мембрану с порами 0,2 мкм. The solution was sterilized by filtration through a membrane with pores of 0.2 microns. Раствор разлили по стерильным флаконам по 2 мл/флакон. The solution was poured into sterile vials by 2 ml / vial.

Флаконы заморозили до -40°С в течение 2-10 часов и лиофилизовали в течение суток по стандартной программе. The vials were frozen to -40 ° C for 2-10 hours and lyophilized for one day under the standard program. После лиофилизации флаконы герметично укупорили. After lyophilization the vials were hermetically capped.

Получили очищенный комплекс протеолитических ферментов с активностью по коллагену 1200-2000 мкг субстрата/мин×мг фермента, который может быть использован для медицинских целей. A purified complex of proteolytic enzymes with activity on collagen substrate 1200-2000 mcg / min × mg enzyme which can be used for medical purposes. В 1 флаконе 4 мг очищенного комплекса протеолитических ферментов. In one vial of 4 mg of purified complex of proteolytic enzymes. Всего получили 125 флаконов. Total received 125 vials.

Выполнен электрофорез выделенного комплекса протеолитических ферментов в полиакриламидном геле. Completed electrophoresis isolated complex of proteolytic enzymes in polyacrylamide gel. После окрашивания пластины геля красителем кумасси синим виден большой набор полос белков с различными массами. After staining the gel with Coomassie blue visible plate a large set of proteins with bands of different masses. Наиболее интенсивно окрашены полосы соответствующие массам 25±2 и 36±3 кДа и мене интенсивно в области 45 кДа. The most intensely colored band corresponding to the masses 25, ± 2 and 36 ± 3 kDa and Me vigorously in 45 kDa.

Пример 3 EXAMPLE 3

400 г пищеварительных органов камбалы отмыли от крови водой. 400 g of the digestive organs from blood flounder washed with water. Провели гомогенизацию тканей в буфере, для чего ткани дезинтегрировали в гомогенизаторе (10 мин за 5 раз), постепенно добавляя 0,05 М Трис буфер, включающий 3М хлористого натрия NaCl, 0,005М хлористого кальция CaCl 2 , рН 7,4, 0,02% азида натрия NaN 3 . Spent tissue homogenization in a buffer, which disintegrated tissue homogenizer (10 min 5 times), gradually adding 0.05 M Tris buffer comprising sodium chloride 3M NaCl, 0.005 M calcium chloride CaCl 2, pH 7.4, 0.02 % of sodium azide NaN 3. (800 мл). (800 mL). Экстракцию провели в холодильнике в течение трех суток. The extraction is carried out in the refrigerator for three days. Общий объем экстракта около 1200 мл. The total amount of extract is about 1200 ml. Провели отделение измельченных тканей центрифугированием. Department spent particulate tissue centrifugation. Экстракт центрифугировали при 14000 Об/мин, +4°С 20 мин. The extract was centrifuged at 14,000 rev / min, + 4 ° C for 20 minutes. Верхний слой липидов и осадок откинули. The top layer lipids, and the precipitate was pulled back.

Получили 800 мл раствора. We received 800 ml of solution. Полученный раствор профильтровали через мембрану с размерами пор 0,2 мкм. The resulting solution was filtered through a membrane with a pore size of 0.2 microns.

Раствор подтитровали 0,1 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. Podtitrovali solution of 0.1 M sodium hydroxide to pH 8.0. При перемешивании в 800 мл раствора супернатанта добавили 1,6 мл раствора полиэтиленимина (ПЭИ) до конечной концентрации полиэтиленимина в растворе 0,01 вес. With stirring, 800 ml of the supernatant solution were added 1.6 ml of a solution of polyethyleneimine (PEI) to a final concentration of polyethyleneimine in the solution is 0.01 wt. %. %.

Конечная концентрация полиэтиленимина составила (1,6*5)/801,6≈0,01 (весовой процент полиэтиленимина в экстракте). The final concentration of polyethyleneimine amounted to (1.6 * 5) / 801,6≈0,01 (weight percent of polyethylenimine in the extract).

Образовался осадок нуклеиновых кислот с ПЭИ. A precipitate was formed nucleic acids with PEI. Раствор перемешивали еще 25 минут при комнатной температуре для укрупнения осадка. The solution was stirred for another 25 minutes at room temperature to precipitate coarsening.

Осадок (нуклеиновые кислоты) выделили на центрифуге 12000 об/мин в течение 25 мин. The precipitate (nucleic acid) gave the centrifuge 12,000 rpm / min for 25 min. Осадок ПЭИ и нуклеиновых кислот практически не имел протеолитической активности. The precipitate PEI and nucleic acids had virtually no proteolytic activity. Его отбросили. His discarded.

В раствор, собранный обработки ПЭИ, ввели сульфат аммония до 80% насыщения. The solution was collected PEI treatment, ammonium sulfate is introduced to 80% saturation. Осадок формировали в холодильнике в течение суток. The precipitate formed in the refrigerator for one day. Осадок выделили центрифугированием при 12000 об/мин, +4°С 20 мин. The precipitate was isolated by centrifugation at 12,000 rev / min, + 4 ° C for 20 minutes. Осадок белков растворили в 0,05М Трис-буфере. The precipitate protein was dissolved in 0.05 M Tris buffer. Раствор обессолили диафильтрацией на полых волокнах с размерами пор 10 кДа. The solution was desalted by diafiltration hollow fiber having a pore size of 10 kDa.

Провели ионообменную хроматографией на DEAE-целлюлозе. We spent ion exchange chromatography on DEAE-cellulose. Колонку, содержащую 80 мл суспензии сорбента DEAE-целлюлозы, предварительно уравновесили 0,01 М Трис-буфером. The column containing 80 ml of sorbent suspension DEAE-cellulose previously equilibrated with 0.01 M Tris buffer. Обезсоленый раствор белков нанесли на колонку. Obezsoleny protein solution was applied to the column. Элюцию сорбированных белков провели градиентом натрия хлористого 0,05-1,0 М NaCl в 0,01 М Трис буфере, рН 8,0. Elution of adsorbed proteins had a sodium chloride gradient of 0.05-1.0 M NaCl in 0.01 M Tris buffer, pH 8.0. Скорость элюции 20-40 мл/час. elution rate of 20-40 ml / hour. Контроль содержания белка провели с помощью УФ-детектора при длине волны 280 нм. Control protein content held by a UV detector at a wavelength of 280 nm. При элюции собрали три фракции белка, имеющего активность. When the elution fractions collected three proteins having the activity. Все активные фракции объединили. All active fractions were pooled. Объединенный раствор обессолили диафильтрацией на установке для тангенциальной ультрафильтрации. The combined solution was desalted by diafiltration on an installation for tangential ultrafiltration.

Провели хроматографию полученного раствора на гидрофобном сорбенте для отделения остаточных пирогенов. We conducted chromatography of the resulting solution onto a hydrophobic sorbent for separating residual pyrogens. В колонку поместили 50 мл гидрофобного сорбента Сфероцелл С-80, содержащего гидрофобные лиганды С8-С10. The column was placed 50 ml of a hydrophobic sorbent Sferotsell C-80 containing hydrophobic ligands C8-C10. Колонку уравновесили 0,01 М фосфатным буфером с добавкой 0,05М NaCl, рН 8,0. The column was equilibrated with 0.01 M phosphate buffer supplemented with 0.05 M NaCl, pH 8.0. Раствор пропускали через колонку с сорбентом со скоростью 20-40 мл/час. The solution was passed through a column of adsorbent at a rate of 20-40 ml / hour. Выход фермента контролировали УФ-детектором по оптической плотности раствора. The yield of enzyme was monitored by a UV detector for the optical density of the solution. Собранный раствор обессолили с помощью диафильтрации на установке для тангенциальной ультрафильтрации и сконцентрировали до содержания белка 2 мг/мл (по Лоури). The collected solution is desalted via diafiltration in a plant for tangential ultrafiltration and concentrated to protein content 2 mg / ml (according to Lowry). Довели рН полученного раствора до 7,4. The pH of the resulting solution was adjusted to 7.4. Далее провели стерилизующую фильтрацию через мембрану 0,2 мкм. Further spent sterilizing filtration through a 0.2 .mu.m membrane.

В полученный раствор ввели фосфатный буфер до 0,1 М и полимер поливинилпирралидон (марки коллидон 17 PF) до концентрации 10%. The resulting solution was introduced phosphate buffer to 0.1 M and polivinilpirralidon polymer (brand Kollidon 17 PF) to a concentration of 10%. Раствор стерилизовали фильтрацией через мембрану с порами 0,2 мкм. The solution was sterilized by filtration through a membrane with pores of 0.2 microns. Раствор разлили по стерильным флаконам по 2 мл/флакон. The solution was poured into sterile vials by 2 ml / vial.

Флаконы заморозили до -40°С в течение 2-10 часов и лиофилизовали в течение суток по стандартной программе. The vials were frozen to -40 ° C for 2-10 hours and lyophilized for one day under the standard program. После лиофилизации флаконы герметично укупорили. After lyophilization the vials were hermetically capped.

Получили очищенный комплекс протеолитических ферментов с активностью по коллагену 1500-2000 мкг субстрата/мин×мг фермента, который может быть использован для медицинских целей. A purified complex of proteolytic enzymes with activity on collagen substrate 1500-2000 mcg / min × mg enzyme which can be used for medical purposes. В 1 флаконе 4 мг очищенного комплекса протеолитических ферментов. In one vial of 4 mg of purified complex of proteolytic enzymes. Всего получили 150 флаконов. Total received 150 vials.

Выполнен электрофорез в полиакриламидном геле выделенного комплекса протеолитических ферментов. Completed polyacrylamide gel electrophoresis, isolated complex of proteolytic enzymes. После окрашивания пластины геля красителем кумасси синим наиболее интенсивно окрашены полосы соответствующие массам 25 и 36 кДа и мене интенсивно в области 45 кДа (фиг. 1). After staining the gel with Coomassie blue plate most intensely colored band corresponding to the masses 25 and 36 kDa and Me vigorously in 45 kDa (FIG. 1).

Пример 4. Example 4.

400 г внутренних органов пираньи отмыли от крови водой. 400 g of internal organs from blood piranha washed with water. Провели гомогенизацию тканей в буфере. Homogenizing the tissue held in the buffer. Ткани дезинтегрировали в гомогенизаторе, постепенно добавляя 0,05 М Трис буфер, 0,005М CaCl 2 , рН 7,4 с 0,02% Азидом натрия NaN 3 . Disintegrated tissue homogenizer, gradually adding 0.05 M Tris buffer, 0.005 M CaCl 2, pH 7.4 with 0.02% sodium azide NaN 3. (800 мл). (800 mL). Экстракцию провели в холодильнике в течение суток. The extraction is carried out in the refrigerator for days. Общий объем экстракта около 1200 мл. The total amount of extract is about 1200 ml. Отделение измельченных тканей центрифугированием Экстракт центрифугировали при 14000 Об/мин, +4°С 20 мин. Branch centrifugation crushed tissue extract was centrifuged at 14,000 rev / min, + 4 ° C for 20 minutes. Верхний слой липидов и осадок откинули. The top layer lipids, and the precipitate was pulled back.

Получили 600 мл раствора. We received 600 ml of solution. Полученный раствор профильтровали через мембрану с размерами пор 0,2 мкм. The resulting solution was filtered through a membrane with a pore size of 0.2 microns.

Раствор подтитровали 0,1 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. Podtitrovali solution of 0.1 M sodium hydroxide to pH 8.0. При перемешивании в 600 мл раствора супернатанта добавили 3 мл раствора полиэтиленимина (ПЭИ) до конечной концентрации полиэтиленимина в растворе 0,025 вес. With stirring, 600 ml of the supernatant solution were added 3 ml of a solution of polyethyleneimine (PEI) to a final concentration of polyethyleneimine in the solution of 0.025 wt. %. %.

Конечная концентрация полиэтиленимина составила (3*5)/603≈0,025 (весовой процент полиэтиленимина в экстракте). The final concentration of polyethyleneimine amounted (3 * 5) / 603≈0,025 (weight percent of polyethylenimine in the extract).

Образовался осадок нуклеиновых кислот с ПЭИ. A precipitate was formed nucleic acids with PEI. Раствор перемешивали еще 30 минут при комнатной температуре для укрупнения осадка. The solution was stirred for another 30 minutes at room temperature to precipitate coarsening.

Осадок (нуклеиновые кислоты) выделили на центрифуге 12000 об/мин в течение 25 мин. The precipitate (nucleic acid) gave the centrifuge 12,000 rpm / min for 25 min. Осадок ПЭИ и нуклеиновых кислот практически не имел протеолитической активности. The precipitate PEI and nucleic acids had virtually no proteolytic activity. Его отбросили. His discarded.

В раствор, собранный обработки ПЭИ, ввели сульфат аммония до 80% насыщения. The solution was collected PEI treatment, ammonium sulfate is introduced to 80% saturation. Осадок формировали в холодильнике в течение суток. The precipitate formed in the refrigerator for one day. Осадок выделили центрифугированием при 12000 об/мин, +4°С 20 мин. The precipitate was isolated by centrifugation at 12,000 rev / min, + 4 ° C for 20 minutes. Осадок белков растворили в 0,05М Трис-буфере. The precipitate protein was dissolved in 0.05 M Tris buffer. Раствор обессолили диафильтрацией на полых волокнах с размерами пор 10 кДа. The solution was desalted by diafiltration hollow fiber having a pore size of 10 kDa.

Провели ионообменную хроматографией на DEAE-целлюлозе. We spent ion exchange chromatography on DEAE-cellulose. Колонку, содержащую 80 мл суспензии сорбента DEAE-целлюлозы, предварительно уравновесили 0,01 М Трис-буфером. The column containing 80 ml of sorbent suspension DEAE-cellulose previously equilibrated with 0.01 M Tris buffer. Обезсоленый раствор белков нанесли на колонку. Obezsoleny protein solution was applied to the column. Элюцию сорбированных белков провели градиентом натрия хлористого 0,05-1,0 М NaCl в 0,01 М Трис буфере, рН 8,0. Elution of adsorbed proteins had a sodium chloride gradient of 0.05-1.0 M NaCl in 0.01 M Tris buffer, pH 8.0. Скорость элюции 20-40 мл/час. elution rate of 20-40 ml / hour. Контроль содержания белка провели с помощью УФ-детектора при длине волны 280 нм. Control protein content held by a UV detector at a wavelength of 280 nm. При элюции собрали три фракции белка, имеющего активность. When the elution fractions collected three proteins having the activity. Все активные фракции объединили. All active fractions were pooled. Объединенный раствор обессолили диафильтрацией на установке для тангенциальной ультрафильтрации. The combined solution was desalted by diafiltration on an installation for tangential ultrafiltration.

Провели хроматографию полученного раствора на гидрофобном сорбенте для отделения остаточных пирогенов. We conducted chromatography of the resulting solution onto a hydrophobic sorbent for separating residual pyrogens. В колонку поместили 50 мл гидрофобного сорбента Сфероцелл С-80, содержащего гидрофобные лиганды С8-С10. The column was placed 50 ml of a hydrophobic sorbent Sferotsell C-80 containing hydrophobic ligands C8-C10. Колонку уравновесили 0,01 М фосфатным буфером с добавкой 0,05М NaCl, рН 8,0. The column was equilibrated with 0.01 M phosphate buffer supplemented with 0.05 M NaCl, pH 8.0. Раствор пропускали через колонку с сорбентом со скоростью 20-40 мл/час. The solution was passed through a column of adsorbent at a rate of 20-40 ml / hour. Выход фермента контролировали УФ-детектором по оптической плотности раствора. The yield of enzyme was monitored by a UV detector for the optical density of the solution. Собранный раствор обессолили с помощью диафильтрации на установке для тангенциальной ультрафильтрации и сконцентрировали до содержания белка 2 мг/мл (по Лоури). The collected solution is desalted via diafiltration in a plant for tangential ultrafiltration and concentrated to protein content 2 mg / ml (according to Lowry). Довели рН полученного раствора до 7,4. The pH of the resulting solution was adjusted to 7.4. Далее провели стерилизующую фильтрацию через мембрану 0,2 мкм. Further spent sterilizing filtration through a 0.2 .mu.m membrane.

В полученный раствор ввели Трис-буфер до 0,025 М и полимер поливиниловый спирт до концентрации 0,1%, и дисахарид трегалозу до концентрации 4%. The resulting solution was introduced to a Tris buffer 0.025 M and the polymer polyvinyl alcohol to a concentration of 0.1%, and the disaccharide trehalose to a concentration of 4%. Раствор стерилизовали фильтрацией через мембрану с порами 0,2 мкм. The solution was sterilized by filtration through a membrane with pores of 0.2 microns. Раствор разлили по стерильным флаконам по 2 мл/флакон. The solution was poured into sterile vials by 2 ml / vial.

Флаконы заморозили до -40°С в течение 2-10 часов и лиофилизовали в течение суток по стандартной программе. The vials were frozen to -40 ° C for 2-10 hours and lyophilized for one day under the standard program. После лиофилизации флаконы герметично укупорили. After lyophilization the vials were hermetically capped.

Получили очищенный комплекс протеолитических ферментов с активностью по коллагену 1500-2200 мкг субстрата/мин×мг фермента, который может быть использован для медицинских целей. A purified complex of proteolytic enzymes with activity on collagen substrate 1500-2200 mcg / min × mg enzyme which can be used for medical purposes. В 1 флаконе 4 мг очищенного комплекса протеолитических ферментов. In one vial of 4 mg of purified complex of proteolytic enzymes. Всего получили 100 флаконов. Total received 100 vials.

Выполнен электрофорез в полиакриламидном геле выделенного комплекса протеолитических ферментов. Completed polyacrylamide gel electrophoresis, isolated complex of proteolytic enzymes. После окрашивания пластины геля красителем кумасси синим наиболее интенсивно окрашены полосы соответствующие массам 25 и 36 кДа и мене интенсивно в области 45 кДа. After staining the gel with Coomassie blue plate most intensely colored band corresponding to the masses 25 and 36 kDa and Me vigorously in 45 kDa.

Пример 5 EXAMPLE 5

В качестве исходного сырья использовали 500 г пищеварительных органов катрановой акулы (Squalus acanthias). The use of 500 g of the digestive organs squalidae (Squalus acanthias) feedstock. Органы отмыли от крови очищенной водой и дезинтегрировали в гомогенизаторе (10 мин), постепенно добавляя 0,05 М Трис-буфер с добавкой 1М NaCl и 0,005М хлористого кальция CaCl 2 рН 7,4 (1000 мл). Organs were washed from the blood of purified water and disintegrated in a homogenizer (10 min), gradually adding 0.05 M Tris buffer supplemented with 1M NaCl and 0.005 M calcium chloride CaCl 2 pH 7.4 (1000 ml). Экстракцию провели на холоду. The extraction is carried out in the cold. Общий объем экстракта составил 1500 мл. The total amount of extract amounted 1500 ml. Гомогенат центрифугировали при 25000 об/мин, +4°С 30 мин. The homogenate is centrifuged at 25,000 rev / min, + 4 ° C for 30 minutes. Верхний слой липидов откинули. The upper lipid layer was pulled back.

Получили 1200 мл раствора. Received 1200 ml solution. Полученный раствор профильтровали через мембрану с размерами пор 0,2 мкм. The resulting solution was filtered through a membrane with a pore size of 0.2 microns.

Раствор подтитровали 0,1 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. Podtitrovali solution of 0.1 M sodium hydroxide to pH 8.0. При перемешивании в 1200 мл раствора супернатанта добавили 12 мл раствора полиэтиленимина (ПЭИ) до конечной концентрации полиэтиленимина в растворе 0,05 вес. With stirring, 1200 ml of the supernatant solution was added 12 ml of a solution of polyethyleneimine (PEI) to a final concentration of polyethyleneimine in the solution 0.05 wt. %. %.

Конечная концентрация полиэтиленимина составила (12*5)/1212≈0,05 (весовой процент полиэтиленимина в экстракте). The final concentration of polyethyleneimine was (12 * 5) / 1212≈0,05 (weight percent of polyethylenimine in the extract).

Образовался осадок нуклеиновых кислот с ПЭИ. A precipitate was formed nucleic acids with PEI. Раствор перемешивали еще 30 минут при комнатной температуре для укрупнения осадка. The solution was stirred for another 30 minutes at room temperature to precipitate coarsening.

Осадок (нуклеиновые кислоты) выделили на центрифуге 12000 об/мин в течение 25 мин. The precipitate (nucleic acid) gave the centrifuge 12,000 rpm / min for 25 min. Осадок ПЭИ и нуклеиновых кислот практически не имел протеолитической активности. The precipitate PEI and nucleic acids had virtually no proteolytic activity. Его отбросили. His discarded.

В раствор, собранный обработки ПЭИ, ввели сульфат аммония до 80% насыщения. The solution was collected PEI treatment, ammonium sulfate is introduced to 80% saturation. Осадок формировали в холодильнике в течение суток. The precipitate formed in the refrigerator for one day. Осадок выделили центрифугированием при 12000 об/мин, +4°С 20 мин. The precipitate was isolated by centrifugation at 12,000 rev / min, + 4 ° C for 20 minutes. Осадок белков растворили в 0,05М Трис-буфере. The precipitate protein was dissolved in 0.05 M Tris buffer. Раствор обессолили диафильтрацией на полых волокнах с размерами пор 10 кДа. The solution was desalted by diafiltration hollow fiber having a pore size of 10 kDa.

Провели ионообменную хроматографией на DEAE-целлюлозе. We spent ion exchange chromatography on DEAE-cellulose. Колонку, содержащую 80 мл суспензии сорбента DEAE-целлюлозы, предварительно уравновесили 0,01 М Трис-буфером. The column containing 80 ml of sorbent suspension DEAE-cellulose previously equilibrated with 0.01 M Tris buffer. Обезсоленый раствор белков нанесли на колонку. Obezsoleny protein solution was applied to the column. Элюцию сорбированных белков провели градиентом натрия хлористого 0,05-1,0 М NaCl в 0,01 М Трис буфере, рН 8,0. Elution of adsorbed proteins had a sodium chloride gradient of 0.05-1.0 M NaCl in 0.01 M Tris buffer, pH 8.0. Скорость элюции 20-40 мл/час. elution rate of 20-40 ml / hour. Контроль содержания белка провели с помощью УФ-детектора при длине волны 280 нм. Control protein content held by a UV detector at a wavelength of 280 nm. При элюции собрали три фракции белка, имеющего активность. When the elution fractions collected three proteins having the activity. Все активные фракции объединили. All active fractions were pooled. Объединенный раствор обессолили диафильтрацией на установке для тангенциальной ультрафильтрации. The combined solution was desalted by diafiltration on an installation for tangential ultrafiltration.

Провели хроматографию полученного раствора на гидрофобном сорбенте для отделения остаточных пирогенов. We conducted chromatography of the resulting solution onto a hydrophobic sorbent for separating residual pyrogens. В колонку поместили 50 мл гидрофобного сорбента Сфероцелл С-80, содержащего гидрофобные лиганды С8-С10. The column was placed 50 ml of a hydrophobic sorbent Sferotsell C-80 containing hydrophobic ligands C8-C10. Колонку уравновесили 0,01 М фосфатным буфером с добавкой 0,05М NaCl, рН 8,0. The column was equilibrated with 0.01 M phosphate buffer supplemented with 0.05 M NaCl, pH 8.0. Раствор пропускали через колонку с сорбентом со скоростью 20-40 мл/час. The solution was passed through a column of adsorbent at a rate of 20-40 ml / hour. Выход фермента контролировали УФ-детектором по оптической плотности раствора. The yield of enzyme was monitored by a UV detector for the optical density of the solution. Собранный раствор обессолили с помощью диафильтрации на установке для тангенциальной ультрафильтрации и сконцентрировали до содержания белка 2,5 мг/мл (по Лоури). The collected solution is desalted via diafiltration in a plant for tangential ultrafiltration and concentrated to a protein content of 2.5 mg / ml (according to Lowry). Довели рН полученного раствора до 7,4. The pH of the resulting solution was adjusted to 7.4. Далее провели стерилизующую фильтрацию через мембрану 0,2 мкм. Further spent sterilizing filtration through a 0.2 .mu.m membrane.

В полученный раствор ввели Трис-буфер до 0,025 М моносахарид маннитол до концентрации 4%. The resulting solution was introduced to a Tris buffer 0.025 M mannitol monosaccharide to a concentration of 4%. Раствор простерилизовали фильтрацией через мембрану с порами 0,2 мкм. The solution was sterilized by filtration through a membrane with pores of 0.2 microns. Раствор разлили по стерильным флаконам по 2 мл/флакон. The solution was poured into sterile vials by 2 ml / vial.

Флаконы заморозили до -40°С в течение 2-10 часов и лиофилизовали в течение суток по стандартной программе. The vials were frozen to -40 ° C for 2-10 hours and lyophilized for one day under the standard program. После лиофилизации флаконы герметично укупорили. After lyophilization the vials were hermetically capped.

Получили очищенный комплекс протеолитических ферментов с активностью по коллагену 1800-2600 мкг субстрата/мин×мг фермента, который может быть использован для медицинских целей. A purified complex of proteolytic enzymes with activity on collagen substrate 1800-2600 mcg / min × mg enzyme which can be used for medical purposes. В 1 флаконе 5 мг очищенного комплекса протеолитических ферментов. In one vial of 5 mg of purified complex of proteolytic enzymes. Всего получили 130 флаконов. Total received 130 vials.

Выполнен электрофорез в полиакриламидном геле выделенного комплекса протеолитических ферментов. Completed polyacrylamide gel electrophoresis, isolated complex of proteolytic enzymes. После окрашивания пластины геля красителем кумасси синим наиболее интенсивно окрашены полосы соответствующие массам 25 и 36 кДа и мене интенсивно в области 45 кДа. After staining the gel with Coomassie blue plate most intensely colored band corresponding to the masses 25 and 36 kDa and Me vigorously in 45 kDa.

Пример 6 EXAMPLE 6

В качестве исходного сырья использовали 500 г пищеварительных органов ската морская лисица (Raja clavata). As a raw material was used 500 g of digestive organs slope sea fox (Raja clavata). Органы отмыли от крови очищенной водой и дезинтегрировали в гомогенизаторе (10 мин), постепенно добавляя 1М NaCl и 0,005М хлористого кальция CaCl 2 , рН 7,4 (1000 мл). Organs were washed from the blood of purified water and disintegrated in a homogenizer (10 min), gradually adding 1M NaCl and 0.005 M calcium chloride CaCl 2, pH 7.4 (1000 ml). Экстракцию провели на холоду. The extraction is carried out in the cold. Общий объем экстракта составил 1500 мл. The total amount of extract amounted 1500 ml. Гомогенат центрифугировали при 25000 об/мин, +4°С 30 мин. The homogenate is centrifuged at 25,000 rev / min, + 4 ° C for 30 minutes. Верхний слой липидов откинули. The upper lipid layer was pulled back.

Получили 1200 мл раствора. Received 1200 ml solution. Полученный раствор профильтровали через мембрану с размерами пор 0,2 мкм. The resulting solution was filtered through a membrane with a pore size of 0.2 microns.

Раствор подтитровали 0,1 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. Podtitrovali solution of 0.1 M sodium hydroxide to pH 8.0. При перемешивании в 1200 мл раствора супернатанта добавили 4 мл раствора полиэтиленимина (ПЭИ) до конечной концентрации полиэтиленимина в растворе 0,017 вес. With stirring, 1200 ml of the supernatant was added 4 ml solution of polyethyleneimine (PEI) to a final concentration of polyethyleneimine in the solution of 0.017 wt. %. %.

Конечная концентрация полиэтиленимина составила (4*5)/1204≈0,017 (весовой процент полиэтиленимина в экстракте). The final concentration of polyethyleneimine amounted to (4 * 5) / 1204≈0,017 (weight percent of polyethylenimine in the extract).

Образовался осадок нуклеиновых кислот с ПЭИ. A precipitate was formed nucleic acids with PEI. Раствор перемешивали еще 40 минут при комнатной температуре для укрупнения осадка. The solution was stirred for another 40 minutes at room temperature to precipitate coarsening.

Осадок (нуклеиновые кислоты) выделили на центрифуге 12000 об/мин в течение 25 мин. The precipitate (nucleic acid) gave the centrifuge 12,000 rpm / min for 25 min. Осадок ПЭИ и нуклеиновых кислот практически не имел протеолитической активности. The precipitate PEI and nucleic acids had virtually no proteolytic activity. Его отбросили. His discarded.

В раствор, собранный обработки ПЭИ, ввели сульфат аммония до 80% насыщения. The solution was collected PEI treatment, ammonium sulfate is introduced to 80% saturation. Осадок формировали в холодильнике в течение суток. The precipitate formed in the refrigerator for one day. Осадок выделили центрифугированием при 12000 об/мин, +4°С 20 мин. The precipitate was isolated by centrifugation at 12,000 rev / min, + 4 ° C for 20 minutes. Осадок белков растворили в 0,05М Трис-буфере. The precipitate protein was dissolved in 0.05 M Tris buffer. Раствор обессолили диафильтрацией на полых волокнах с размерами пор 10 кДа. The solution was desalted by diafiltration hollow fiber having a pore size of 10 kDa.

Провели ионообменную хроматографией на DEAE-целлюлозе. We spent ion exchange chromatography on DEAE-cellulose. Колонку, содержащую 80 мл суспензии сорбента DEAE-целлюлозы, предварительно уравновесили 0,01 М Трис-буфером. The column containing 80 ml of sorbent suspension DEAE-cellulose previously equilibrated with 0.01 M Tris buffer. Обезсоленый раствор белков нанесли на колонку. Obezsoleny protein solution was applied to the column. Элюцию сорбированных белков провели градиентом натрия хлористого 0,05-1,0 М NaCl в 0,01 М Трис буфере, рН 8,0. Elution of adsorbed proteins had a sodium chloride gradient of 0.05-1.0 M NaCl in 0.01 M Tris buffer, pH 8.0. Скорость элюции 20-40 мл/час. elution rate of 20-40 ml / hour. Контроль содержания белка провели с помощью УФ-детектора при длине волны 280 нм. Control protein content held by a UV detector at a wavelength of 280 nm. При элюции собрали три фракции белка, имеющего активность. When the elution fractions collected three proteins having the activity. Все активные фракции объединили. All active fractions were pooled. Объединенный раствор обессолили диафильтрацией на установке для тангенциальной ультрафильтрации. The combined solution was desalted by diafiltration on an installation for tangential ultrafiltration.

Провели хроматографию полученного раствора на гидрофобном сорбенте для отделения остаточных пирогенов. We conducted chromatography of the resulting solution onto a hydrophobic sorbent for separating residual pyrogens. В колонку поместили 50 мл гидрофобного сорбента Сфероцелл С-80, содержащего гидрофобные лиганды С 810 . The column was placed 50 ml of a hydrophobic sorbent Sferotsell C-80 hydrophobic ligands containing C 8 -C 10. Колонку уравновесили 0,01 М фосфатным буфером с добавкой 0,05М NaCl, рН 8,0. The column was equilibrated with 0.01 M phosphate buffer supplemented with 0.05 M NaCl, pH 8.0. Раствор пропускали через колонку с сорбентом со скоростью 20-40 мл/час. The solution was passed through a column of adsorbent at a rate of 20-40 ml / hour. Выход фермента контролировали УФ-детектором по оптической плотности раствора. The yield of enzyme was monitored by a UV detector for the optical density of the solution. Собранный раствор обессолили с помощью диафильтрации на установке для тангенциальной ультрафильтрации и сконцентрировали до содержания белка 2,5 мг/мл (по Лоури). The collected solution is desalted via diafiltration in a plant for tangential ultrafiltration and concentrated to a protein content of 2.5 mg / ml (according to Lowry). Довели рН полученного раствора до 8,0. The pH of the resulting solution was adjusted to 8.0. Далее провели стерилизующую фильтрацию через мембрану 0,2 мкм. Further spent sterilizing filtration through a 0.2 .mu.m membrane.

В полученный раствор ввели Трис-буфер до 0,025 М моносахарид маннитол до концентрации 4%. The resulting solution was introduced to a Tris buffer 0.025 M mannitol monosaccharide to a concentration of 4%. Раствор простерилизовали фильтрацией через мембрану с порами 0,2 мкм. The solution was sterilized by filtration through a membrane with pores of 0.2 microns. Раствор разлили по стерильным флаконам по 2 мл/флакон. The solution was poured into sterile vials by 2 ml / vial.

Флаконы заморозили до -40°С в течение 2-10 часов и лиофилизовали в течение суток по стандартной программе. The vials were frozen to -40 ° C for 2-10 hours and lyophilized for one day under the standard program. После лиофилизации флаконы герметично укупорили. After lyophilization the vials were hermetically capped.

Получили очищенный комплекс протеолитических ферментов с активностью по коллагену 1800-2600 мкг субстрата/мин×мг фермента, который может быть использован для медицинских целей. A purified complex of proteolytic enzymes with activity on collagen substrate 1800-2600 mcg / min × mg enzyme which can be used for medical purposes. В 1 флаконе 5 мг очищенного комплекса протеолитических ферментов. In one vial of 5 mg of purified complex of proteolytic enzymes. Всего получили 120 флаконов. Total received 120 vials.

Выполнен электрофорез в полиакриламидном геле выделенного комплекса протеолитических ферментов. Completed polyacrylamide gel electrophoresis, isolated complex of proteolytic enzymes. После окрашивания пластины геля красителем кумасси синим наиболее интенсивно окрашены полосы соответствующие массам 25 и 36 кДа и мене интенсивно в области 45 кДа. After staining the gel with Coomassie blue plate most intensely colored band corresponding to the masses 25 and 36 kDa and Me vigorously in 45 kDa.

СРАВНЕНИЕ ПОЛУЧЕННОГО КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ С ИЗВЕСТНЫМИ АНАЛОГАМИ Comparison of the resulting complex proteolytic enzymes having known analogues

Сравнительную специфическую активность определяли для полученного комплекса протеолитических ферментов в сравнении с коммерческим препаратом коллагеназы краба и коммерческой сериновой протеазой химотрипсин. The comparative specific activity was determined for the obtained complex proteolytic enzymes in comparison with the commercial preparation and commercial collagenase crab serine protease chymotrypsin. В качестве субстрата использовали высокомолекулярный фотожелатин. As a substrate was used a high fotozhelatin. Реакцию ферментативного гидролиза провели при +37°С. Enzymatic hydrolysis reaction is carried out at + 37 ° C. Для получения сравнимых результатов испытуемые препараты растворили в одинаковой концентрации по белку. For obtaining comparable results the test drugs dissolved in the same concentration of protein. Концентрацию белка нормировали по калибровочным кривым по оптической плотности при 280 нм. The protein concentration was normalized to the calibration curves by optical density at 280 nm. Для определения активности использовали концентрации ферментов 0,25, 0,1, 0,05, 0,025 мг/мл. To determine the activity of enzymes used concentration of 0.25, 0.1, 0.05, 0.025 mg / ml. Активность фермента зависит от ионной силы, природы присутствующих солей и рН среды. The enzyme activity is dependent on ionic strength, the nature of salts present and the pH of the medium. В деионизированной воде протеолитические ферменты мало активны. In deionized water proteolytic enzymes are active enough. Для создания различного кислотно-основного баланса среды использовали 0,2 М фосфатно-лимоннокислый буфер. To create various acid-base balance of the medium was used a 0.2 M phosphate-citrate buffer.

Полученные результаты представлены в таблице. The results are shown in the table. Специфическая активность выделенного комплекса протеолитических ферментов в области рН 7,0-9,2 практически совпадает со специфической активностью комплекса ферментов, выделенных из гепатопанкреаса краба. The specific activity of the isolated complex of proteolytic enzymes at pH 7.0-9.2 practically coincides with a specific activity enzyme complex isolated from crab hepatopancreas. Химотрипсин показал низкую активность в отношении к субстрату. Chymotrypsin showed low activity in respect to the substrate.

В таблице приведена специфическая активность протеолитических ферментов в мкг субстрата*мин/мг фермента. The table shows the specific activity of proteolytic enzymes in substrate mcg * min / mg enzyme.

Известно, что для каждого фермента существует оптимальная область рН, при котором его ферментативная активность максимальна. It is known that for each enzyme there is an optimal pH range at which its enzyme activity is maximal. Для установления рН-оптимума действия обычно используют универсальные буферы, эффективные в широком диапазоне рН. To establish the pH optimum of action of commonly used universal buffers effective over a wide pH range. Мы использовали фосфатно-лимоннокислый буфер. We used a phosphate-citrate buffer. К сожалению, оказалось, что анион лимонной кислоты (цитрат), снижает активность протеолитических ферментов. Unfortunately, it appears that the anion of citric acid (citrate), reduces the activity of proteolytic enzymes. Тем не менее, во-первых удалось установить, что рН-оптимум для комплекса протеолитических ферментов лежит в области рН 7,0-9,0, во вторых комплекс протеолитических ферментов, выделенных из пищеварительных органов рыб имеет близкую специфическую активность и рН-оптимум к характеристикам крабовой коллагеназы However, first it was found that the optimum pH for the proteolytic enzymes of the complex is in the range pH 7.0-9.0, in the second set of proteolytic enzymes isolated from the digestive organs of fish has close specific activity and pH optimum for characteristics crab collagenase

Таблица Table

Figure 00000002

ПРИМЕР ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛУЧЕННОГО КОМПЛЕКСА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ APPLICATION EXAMPLE Preparation of a complex of proteolytic enzymes

Терапевтическое действие препарата - эффект очищения ран и отторжение струпа исследовали на модели термического ожога на крысах самцах. The therapeutic effect of the drug - the effect of cleansing wounds and tested for rejection of scab thermal burn models in male rats. Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах, самцах - 60 штук. The experiments were performed on white rats, male - 60 pieces. Животные были распределены на группы с помощью метода рандомизации с использованием в качестве основного критерия массы тела. Animals were divided into groups using randomization method using as the main criterion of body weight. При сравнительном изучении влияния комплекса на динамику отторжения некротического струпа было использовано по 5 особей крыс. In a comparative study the influence of the dynamics of rejection necrotic eschar were used for 5 rats. При изучении специфической активности опытные и контрольные группы состояли из 10 крыс (ожоги). When studying the specific activity of the experimental and control groups consisted of 10 rats (burns). В группе изучения местно-раздражающего действия комплекса использовали группы по 5 крыс. In the study group of locally-irritant complex using groups of 5 rats.

Животных из контрольной и опытных групп наркотизировали диэтиловым эфиром и наносили на депилированную кожу спины в грудино-поясничной области термический ожог раскаленной до 200°С металлической пластиной площадью 2 см 2 с экспозицией 10 секунд. The animals of control and experimental groups were anesthetized with diethyl ether and applied to the depilated back skin in the lumbar region sterno-thermal burn glow to 200 ° C metal plate area of 2 cm 2 exposure 10 seconds. Экспериментальную терапию проводили комплексом протеолитических ферментов, полученным по примерам 1-6 и препаратом сравнения крабовой коллагеназой при разведении их водой. Experimental therapy was a complex of proteolytic enzymes obtained in Examples 1-6 and comparison crab collagenase drug upon dilution with water.

На модели термических ожогов у крыс были установлены более ранние клинически значимые признаки коллагенолитических свойств исследуемого комплекса - краевое, неполное и полное отторжение некротического струпа, сопоставимое с таковыми показателями при терапии ожоговых ран кожи крыс крабовой коллагеназой. In the model of thermal burns in rats were installed earlier clinically significant signs collagenolytic properties analyte complex - boundary, incomplete and complete rejection of necrotic eschar comparable with those indices in the treatment of burn wounds of skin collagenase rat crab. Положительное действие комплекса протеолитических ферментов отражалось в активной эпителизации поверхности раневого дефекта с менее выраженными реактивными изменениями многослойного плоского эпителия в краях раны по сравнению с контрольной группой, в которой отмечались менее выраженные процессы регенерации с тенденцией к псевдоэпителиоматозной гиперплазии в краях раны. The positive effect of a complex of proteolytic enzymes reflected in epithelization of the active surface of the wound defect with less pronounced reactive changes stratified squamous epithelium in the wound edges as compared to the control group which were observed in less severe regeneration processes with a tendency to psevdoepiteliomatoznoy hyperplasia in the wound edges.

Комплекс протеолитических ферментов, полученный в соответствии с заявляемым способом, в частности, по примерам 1-6, не обладает местно-раздражающим действием на кожу крыс при 21-дневном нанесении. The complex of proteolytic enzymes prepared according to the claimed method, in particular, in Examples 1-6, it has no local irritant effect on the skin at rat 21-day application.

Одновременно он обладает регенерирующим, анальгетическим и дезодорирующим действием. Simultaneously it possesses regenerative, analgesic and deodorizing effect.

Определение подлинности и чистоты комплекса протеолитических ферментов методом электрофореза Determining the identity and purity of the complex proteolytic enzymes by electrophoresis

Для определения подлинности (соответствия молекулярной массе) и чистоты (отсутствие посторонних примесей) используют метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в нативных и редуцирующих условиях с последующей визуализацией окрашивающим раствором Кумасси. To determine the authenticity (corresponding to the molecular weight) and purity (absence of impurities) was used method of vertical polyacrylamide gel electrophoresis in native and reducing conditions, followed by visualization with Coomassie staining solution. Использовали систему для электрофореза "Mini-PROTEAN 3". System was used for electrophoresis "Mini-PROTEAN 3". Электрофорез проводили при следующих условиях: концентрация разделяющего геля 4-20%, концентрация концентрирующего геля 4%, сила тока 25 мА, напряжение при разделении белков 240 В, продолжительность 50 мин, температура среды +7 град. Electrophoresis was carried out under the following conditions: the concentration of 4-20% separating gel, the concentration of 4% stacking gel, the current strength of 25 mA, the voltage in the separation of proteins of 240 V, duration 50 minutes, ambient temperature +7 deg. Цельсия. Celsius. В лунки дорожек вносили исследуемый раствор препарата в 0,5 М трис-HCl буфере ((гидроксиметил)аминометан) рН 6,8 в количестве 2-7 мкл, из расчета чтобы нагрузка вещества на дорожку геля составляла около 2,5 мкг. Tracks were added to the wells of the drug in the test solution 0.5 M tris-HCl buffer ((hydroxymethyl) aminomethane) pH 6.8 in an amount of 2-7 l of the substance to calculate the load on the gel lane was about 2.5 g.

По окончании электрофореза гель фиксировали в спиртовом растворе уксусной кислоты, далее окрашивали коллоидным красителем Кумасси в течение 40-60 мин на шейкере, далее краситель сливали и отмывали гель водой до исчезновения фона. Upon completion of electrophoresis, the gel was fixed in an alcohol solution of acetic acid, then stained with Colloidal Coomassie for 40-60 min on a shaker, more dye was drained and washed with water until the gel background. Для оценки результатов при выполнении электрофореза в одну из дорожек вносят смесь калибровочных белков с молекулярными массами 18 кДа, 25 кДа, 35 кДа, 45 кДа, 66 кДа, 116 кДа. To evaluate the results when performing the electrophoresis in one of the tracks making calibration mixture of proteins with molecular weights of 18 kDa, 25 kDa, 35 kDa, 45 kDa, 66 kDa, 116 kDa.

На чертеже дорожка 1 рисунка электрофореза содержит калибровочные белки. In the figure, lane 1 contains the electrophoresis pattern gauge proteins. Дорожки 2 и 3 содержат характерные полосы белков комплекса протеолитических ферментов в редуцирующих условиях. Lanes 2 and 3 contain the specific protein bands complex proteolytic enzymes under reducing conditions. Нагрузка на дорожку 2 составляла 3 мкл раствора, нагрузка на дорожку 3 5 мкл раствора. The load on track 2 was 3 l of a solution, the load on track 3 5 .mu.l solution.

Комплекс протеолитических ферментов дает специфические окрашенные полосы в области 23-28 кДа, соответствующие эластазам, в области 32-37 кДа, соответствующие трипсиноподобным ферментам, в области 40-50 кДа, соответствующие химотрипсиноподобным ферментам. The complex gives specific proteolytic enzymes stained bands at 23-28 kDa, the corresponding elastase in 32-37 kD region, corresponding to the enzymes trypsin, in the 40-50 kDa corresponding to the chymotrypsin-like enzymes. В зависимости от процедуры исполнения и степени автолиза окрашенные полосы в этих регионах могут быть как одинарными, так и расщепляться на дублеты и триплеты изоферментов. Depending on the design procedure and the degree of autolysis stained bands in these regions can be both single and split into doublets and triplets isoenzymes.

Характерная для комплекса протеолитических ферментов получаемая в электрофорезе последовательность полос отлична от последовательности полос при электрофорезе крабовой коллагеназе и индивидуальных препаратов протеолитических ферментов, таких как трипсин, химотрипсин и др. Для комплекса протеолитических ферментов не наблюдается различий в картине электрофореза в нередуцирующих и редуцирующих условиях. Characteristic for the complex of proteolytic enzymes obtained in electrophoresis bands sequence differs from the sequence of bands during electrophoresis crab collagenase and individual preparations of proteolytic enzymes such as trypsin, chymotrypsin, and others. For a complex of proteolytic enzymes is observed differences in the film nonreducing electrophoresis and reducing conditions.

Нативные ферменты и белки очень часто находятся в виде димеров, тетрамеров и октамеров. Native enzymes and proteins often are in the form of dimers, tetramers and octamers. Для того чтобы их разделить в процедуре электрофореза до индивидуальных белков создают специальные условия, обычно, путем добавления восстановителя - меркаптоэтанола, который разрывает дисульфидные связи между белками. In order to separate them in the electrophoresis procedure individual proteins to create special conditions, typically by adding a reducing agent - mercaptoethanol, which breaks the disulfide bonds between proteins.

Таким образом реализуется получение комплекса протеолитических ферментов, содержащего щелочные, нейтральные и кислые протеиназы, с повышенной коллагенолитической активностью за счет повышения специфической активности в отношении глубокого гидролиза коллагена и желатины, а также расщепления гемоглобина, казеина, снижении пирогенности (способность вещества вызывать повышение температуры тела), одновременно с повышением количественного выхода целевого продукты. Thus realized preparation of a complex of proteolytic enzymes, containing the alkaline, neutral and acid proteases with increased collagenolytic activity by increasing the specific activity against deep hydrolysis of collagen and gelatins, as well as splitting hemoglobin, casein, reducing pyrogenicity (substance ability to induce fever) simultaneously with the increase in quantitative yield of the desired products. Помимо вышеназванных субстратов комплекс протеолитических ферментов способен в меньшей степени расщеплять хитозан. In addition to the above substrates complex of proteolytic enzymes capable of cleaving a lesser degree of chitosan.

Преимущества заявляемого способа обусловлены включением в процесс получения комплекса протеолитических ферментов на оптимальных стадиях операций отделения нуклеиновых кислот и липидно-белковых комплексов путем обработки экстракта полиэтиленимином, а также операции хроматографической очистки на гидрофобном сорбенте, что позволяет своевременно удалить из выделяемого фермента липополисахариды, ответственные за пирогенность. Advantages of the inventive method due to the inclusion in the process of obtaining the complex of proteolytic enzymes at optimal stages operations separation of nucleic acids and lipid-protein complexes by treating the extract with polyethyleneimine, and also operations chromatographic purification on the hydrophobic sorbent, that allows to remove from the evolved enzyme lipopolysaccharides responsible for pyrogenicity. Отсутствие пирогености значительно повышает качество препарата по сравнению с аналогами при медицинском применении Absence of pyrogens significantly improves the quality of the drug compared with analogues in medical application

Изобретение позволяет получить протеолитический препарат, который может быть использован в медицине, в косметике и в биотехнологии, в медицине при очистке инфицированных ран от некротических тканей, ожоговых ран, отморожений, для ускорения отторжения струпов и некротических язв, при терапии грыжи интервертебрального диска позвоночника, для лечения келоидных рубцов, для лечения послеоперационных спаек в органах брюшной полости; The invention provides a proteolytic preparation which can be used in medicine, cosmetics and biotechnology, medicine for the cleaning of infected wounds from necrotic tissue, burn wounds, frostbite, to accelerate the rejection eschar and necrotic ulcers, in the treatment of hernias intervertebralnogo spinal disc for treatment of keloid scars, for the treatment of post-surgical adhesions in abdominal cavity; в косметике для очистки проблемной кожи; in cosmetics for cleaning oily skin; в биотехнологии для получения и выделения клеточных культур человеческих и животных тканей. in biotechnology for the production and isolation of cell cultures of human and animal tissues.

Claims (6)

1. Способ выделения комплекса протеолитических ферментов из пищеварительных органов рыб, включающий последовательно выполняемые гомогенизацию тканей в буфере, отделение измельченных тканей центрифугированием, фильтрование супернатанта через мембрану, высаливание белков в сульфате аммония, выделение сульфатаммонийного осадка центрифугированием, растворение осадка в буфере, обессоливание экстракта диафильтрацией, очистку ионообменной хроматографией на DEAE-целлюлозе, отличающийся тем, что до осаждения белков в сульфате аммония нукле 1. A method for isolating from a complex of proteolytic enzymes of the digestive organs of fishes comprising sequentially performed in tissue homogenization buffer, separation by centrifugation of crushed tissue, filtering the supernatant through a membrane, salting out of proteins in the ammonium sulfate, isolation sulfatammoniynogo centrifugation pellet, dissolving the precipitate in a buffer extract desalting by diafiltration, purification by ion exchange chromatography on DEAE-cellulose, characterized in that prior to deposition of proteins in the ammonium sulfate nucl иновые кислоты и липидно-белковые комплексы удаляют из экстракта обработкой раствором полиэтиленимина, который добавляют до конечной концентрации полиэтиленимина в экстракте от 0,1 до 0,01 вес.%, а после ионообменной хроматографии осуществляют отделение остаточных пирогенов на гидрофобном сорбенте Сфероцелл С-80, стерилизующую фильтрацию через мембрану с размером пор 0,2 мкм и повторное обессоливание экстракта диафильтрацией с последующим приготовлением готовой формы лиофилизацией. ynoic acid and lipid-protein complexes was removed from the extract by treatment with a solution of polyethyleneimine, which was added to a final polyethyleneimine concentration of the extract from 0.1 to 0.01 wt.%, and after ion exchange chromatography separation is carried out on the residual pyrogens hydrophobic sorbent Sferotsell C-80 sterilizing filtration through a membrane with a pore size of 0.2 microns and re-extract desalting by diafiltration, followed by preparation of the formulation by lyophilization.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для получения готовой дозированной формы после отделения остаточных пирогенов вводят криопротектор, например физиологически приемлемый буфер, моно- или дисахарид, в количестве от 1 до 10 вес.%, и/или медицинский биополимер, в количестве от 0,1 до 10 вес.%. 2. The method of claim. 1, characterized in that to produce the finished dosage form after separation of residual pyrogens administered cryoprotectant, for example a physiologically acceptable buffer, a mono- or disaccharide in an amount of from 1 to 10 wt.%, And / or medical biopolymer in an amount of from 0.1 to 10 wt.%.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что гомогенизацию производят с медленным добавлением 0,05 М Трис-буфер с добавкой 0,005М хлористого кальция CaCl 2 рН 7,4. 3. The method of claim. 2, characterized in that the homogenization is carried out with slow addition of 0.05 M Tris buffer supplemented with 0.005 M calcium chloride CaCl 2 pH 7.4. с последующей экстракцией на холоду. followed by extraction of the cold.
4. Способ по любому из пп. 4. A method according to any one of claims. 1-3, отличающийся тем, что обессоливание экстракта диафильтрацией осуществляют путем пропускания раствора через полые волокна с размером пор 10 кДа. 1-3, characterized in that the extract is desalting by diafiltration is carried out by passing the solution through a hollow fiber having a pore size of 10 kDa.
5. Способ по любому из пп. 5. A method according to any one of claims. 1-3, отличающийся тем, что обессоливание экстракта диафильтрацией осуществляют на модуле тангенциальной ультрафильтрации. 1-3, characterized in that the extract is desalting by diafiltration is performed on a tangential ultrafiltration module.
6. Способ по любому из пп. 6. A method according to any one of claims. 1-3, отличающийся тем, что моно- или дисахарид выбирают из группы: маннитол, лактоза или трегалоза, а медицинский биополимер - из группы декстранов, поливинилпирралидонов, поливиниловых спиртов. 1-3, characterized in that the mono- or disaccharide is selected from the group of mannitol, lactose or trehalose and medical biopolymer - from the group of dextrans, polivinilpirralidonov, polyvinyl alcohols.
RU2015144538A 2015-10-16 2015-10-16 Method for production of proteolytic preparation for medical use RU2610669C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015144538A RU2610669C1 (en) 2015-10-16 2015-10-16 Method for production of proteolytic preparation for medical use

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015144538A RU2610669C1 (en) 2015-10-16 2015-10-16 Method for production of proteolytic preparation for medical use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2610669C1 true RU2610669C1 (en) 2017-02-14

Family

ID=58458706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015144538A RU2610669C1 (en) 2015-10-16 2015-10-16 Method for production of proteolytic preparation for medical use

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2610669C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2034028C1 (en) * 1992-02-07 1995-04-30 Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии Method of preparing of proteolytic complex
RU2264824C2 (en) * 1999-06-18 2005-11-27 Йон Браги БЬЯРНАСОН Fish serine proteinases and their pharmaceutical and cosmetic application

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2034028C1 (en) * 1992-02-07 1995-04-30 Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии Method of preparing of proteolytic complex
RU2264824C2 (en) * 1999-06-18 2005-11-27 Йон Браги БЬЯРНАСОН Fish serine proteinases and their pharmaceutical and cosmetic application

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TERUEL S.R.L., SIMPSON B.K. Characterization of the collagenolytic enzyme fraction from winter flouder (Pseudopleuronectes americanus).// Comp. Biochem. Physiol., 1995, v.112B, 131-136. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI80598B (en) Foerfarande Foer framstaellning of a enzymberedning.
JP4101309B2 (en) Preparation of human thrombin concentrate for therapeutic use
BuRNETT et al. The chemistry and toxicology of some venomous pelagic coelenterates
US5420248A (en) Unpigmented fish skin, particularly from flat fish, as a novel industrial source of collagen, extraction method, collagen and biomaterial thereby obtained
Rao et al. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential
US4588587A (en) Method of treatment to inhibit metastasis
KR100977744B1 (en) Collagen and method for producing same
Lamboni et al. Silk sericin: a versatile material for tissue engineering and drug delivery
Rucavado et al. Local tissue damage induced by BaP1, a metalloproteinase isolated from Bothrops asper (terciopelo) snake venom
CN1190445C (en) Process for producing functional silk fibroin and utilization of the same
JP4025897B2 (en) Preparation of collagen
EP0081440B1 (en) Process for preparing forms of native or non-crosslinked collagen with a preserved helicoidal structure, in association with mucopolysaccharides, and their use in the cosmetic, pharmaceutical, analytical and other fields
RU2241489C2 (en) Matrix protein compositions for healing wound
AU705719B2 (en) Method for preparation of type II collagen
DE69434414T2 (en) Phosphatase or a corresponding derivative pharmaceutical composition contained
EP0115974B1 (en) Highly active collagenolytic preparation and pharmaceutical compositions containing it
US3357894A (en) Proteolytic enzymes of pig pancreas
CA1179263A (en) Chymopapain and method for its use
JP2003246740A (en) Shark cartilage extract
JPH11503338A (en) Resorbable extracellular matrix for cartilage tissue reconstruction
LU85582A1 (en) Fractions of hyaluronic acid having pharmaceutical activity, processes for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5714582A (en) Invertebrate type V telopeptide collagen, methods of making, and use thereof
RU2157695C2 (en) Shark cartilage extracts, methods of their preparing and using
US4271070A (en) Chemically-modified fiber collagen hemostatic agents
JP2003505156A (en) How to improve the treatment of wounds and compositions

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20171017