RU2236460C1 - Method for preparing collagenase - Google Patents
Method for preparing collagenase Download PDFInfo
- Publication number
- RU2236460C1 RU2236460C1 RU2003114709/13A RU2003114709A RU2236460C1 RU 2236460 C1 RU2236460 C1 RU 2236460C1 RU 2003114709/13 A RU2003114709/13 A RU 2003114709/13A RU 2003114709 A RU2003114709 A RU 2003114709A RU 2236460 C1 RU2236460 C1 RU 2236460C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagenase
- carried out
- addition
- solution
- sodium chloride
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области получения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, косметологии, дерматологии, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей.The invention relates to biotechnology, in particular to the field of obtaining highly purified and highly active enzyme preparations that can be used in medicine, cosmetology, dermatology, biochemistry and the food industry, as well as for research purposes.
В настоящее время особый интерес представляют ферменты, применяемые при “мягком” терапевтическом лечении ферментативными методами гипертрофических, келоидных и гипертрофических келоидных рубцов различной этиологии. Большинство медицинских препаратов, используемых для этой цели, не обладают лечебной активностью по отношению к застарелым рубцам. Крайне актуальным поэтому является поиск ферментативных препаратов, способных деградировать модифицированный коллаген застарелых плоских рубцов и рубцов различной этиологии. Не все известные коллагеназы способны эффективно гидролизовать рубцовую ткань человека. Поскольку ряд рубцов таких видов, как гипертрофический и келоидный имеют композитную структуру, в состав которой входит химически модифицированный коллаген, многие известные коллагеназы не оказывают заметного лечебного действия при их терапии.Currently, of particular interest are enzymes used in the “soft” therapeutic treatment with enzymatic methods of hypertrophic, keloid and hypertrophic keloid scars of various etiologies. Most medications used for this purpose do not have therapeutic activity against chronic scars. Therefore, it is extremely urgent to search for enzymatic preparations capable of degrading the modified collagen of old flat scars and scars of various etiologies. Not all known collagenases are able to effectively hydrolyze human scar tissue. Since a number of scars of such species as hypertrophic and keloid have a composite structure, which includes chemically modified collagen, many known collagenases do not have a noticeable therapeutic effect during their treatment.
Способность коллагеназ разрушать коллаген используется в медицине для лечения ожогов, гнойно-трофических язв, послеоперационных рубцов, остеохондрозов и др. В настоящее время известно довольно много ферментных препаратов с коллагенолитическим действием. Коллагеназы беспозвоночных обнаружены у пиявок, различных насекомых, у креветок, различных видов крабов. Однако далеко не все они являются источниками коллагеназ, применяемых в медицине. Это иногда связано с ограниченным количеством исходного материала, поэтому поиск новых, нетрадиционных источников коллагеназ имеет большое значение.The ability of collagenases to destroy collagen is used in medicine to treat burns, purulent-trophic ulcers, postoperative scars, osteochondrosis, etc. Currently, quite a lot of enzyme preparations with collagenolytic action are known. Invertebrate collagenases were found in leeches, various insects, shrimps, and various types of crabs. However, not all of them are sources of collagenases used in medicine. This is sometimes associated with a limited amount of source material, so the search for new, unconventional sources of collagenases is of great importance.
У беспозвоночных животных коллагеназы широко распространены и, в отличие от тканевых коллагеназ высших млекопитающих, используются в процессе пищеварения. Например, из морской звезды Pycnopodia helianthoides были выделены две протеиназы с коллагенолитическим действием. Одна из них отнесена к классу металлопротеиназ, а другая с меньшей молекулярной массой - химотрипсинового типа. Оба фермента разрушали меченый коллаген из шкуры гвинейской свиньи, но были практически неактивны по субстрату клостридиопептидазы PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg. M.E.Alexander, M.N.Dresden, Comp.Biochem.Physiol. 1980, V. 67B, p. 505-509.In invertebrate animals, collagenases are widespread and, unlike tissue collagenases of higher mammals, are used in the digestion process. For example, two proteases with a collagenolytic effect were isolated from the starfish Pycnopodia helianthoides. One of them is assigned to the class of metalloproteinases, and the other with a lower molecular weight is of the chymotrypsin type. Both enzymes destroyed labeled collagen from the skin of Guinea pigs, but were practically inactive on the substrate of clostridiopeptidase PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg. M.E. Alexander, M.N. Dresden, Comp. Biochem. Physiol. 1980, V. 67B, p. 505-509.
Наиболее изучены и применяются для практических целей коллагеназы и комплексные ферментные препараты, полученные из представителей семейства Decapoda.Collagenases and complex enzyme preparations obtained from representatives of the Decapoda family are the most studied and used for practical purposes.
Препарат РНМ-101, содержащий протеиназы криля, был использован для лечения язв и эррозий, образовавшихся в результате ожога 4 н щелочью роговицы кроликов. Через 28 сут. лечения в 45% случаев наблюдали восстановление эпителия (без препарата - в 33% случаях), еще через 7 сут. лечения препаратом язвы роговицы уменьшились в размере, на основании чего делается вывод о целесообразности применения препарата из криля при лечении дефектов склеры глаза. Это один из немногих примеров применения коллагеназ членистоногих за рубежом. Sangwan V.S., Akpek E.K., Voo I., Zhao Т., Pinar V., Yang J., Christen W., Baltasar S., Wild R., Foster C.S //Cornea. 1999. V.I 8. P. 707-11.The PHM-101 preparation, containing krill proteinases, was used to treat ulcers and erosion resulting from a 4 n burn of alkali in the rabbit cornea. After 28 days. in 45% of cases, epithelium recovery was observed (without the drug in 33% of cases), after another 7 days. treatment with the drug, corneal ulcers decreased in size, on the basis of which it is concluded that it is advisable to use the drug from krill in the treatment of defects of the sclera of the eye. This is one of the few examples of the use of arthropod collagenases abroad. Sangwan V.S., Akpek E.K., Voo I., Zhao T., Pinar V., Yang J., Christen W., Baltasar S., Wild R., Foster C.S // Cornea. 1999. V.I. 8.P. 707-11.
Известен способ получения коллагеназы из головного отдела различных видов пиявок, приведенный в патенте WO 87/00860, опубл. 1987.02.12.A known method of producing collagenase from the head of various types of leeches is given in patent WO 87/00860, publ. 1987.02.12.
Согласно указанному патенту замороженный головной отдел пиявки гомогенизируют в дистиллированной воде 10 мин при 4°С. Суспензию далее центрифугируют 10 мин при 4°С и собирают супернатант. Осадок ресуспендируют и центрифугируют вновь. Супернатанты объединяют. Фермент высаливают сульфатом аммония 40% насыщения и центрифугируют 20 мин при 4°С. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 80% насыщения и центрифугируют в тех же условиях. Осадок ресуспендируют в 50% -ном сульфате аммония и диализуют против дистиллированной воды при 4°С.According to the said patent, the frozen head section of the leech is homogenized in distilled water for 10 minutes at 4 ° C. The suspension is then centrifuged for 10 min at 4 ° C and the supernatant is collected. The precipitate was resuspended and centrifuged again. Supernatants combine. The enzyme is salted out with
Активность во всех фракциях определяют, инкубируя 100 мкл каждой фракции в 100 мкл раствора коллагена 24 ч. После инкубации растворы помещают в лед на 30 мин и в надосадочной жидкости определяют коллагеназную активность. 2 мл образца из последнего осадка наносят на колонку с Сефадексом G-75 superfine и определяют активность в каждом белковом пике.The activity in all fractions is determined by incubating 100 μl of each fraction in 100 μl of collagen solution for 24 hours. After incubation, the solutions are placed in ice for 30 minutes and collagenase activity is determined in the supernatant. 2 ml of the sample from the last pellet was applied to a Sephadex G-75 superfine column and activity was determined at each protein peak.
Выходы по активности и степени очистки не приводятся. Для дальнейших исследований используют самые активные фракции. Кроме коллагеназы авторы выделяли ингибиторы 400000, 45000 и 600 дальтон.Yields on activity and degree of purification are not given. For further research, the most active fractions are used. In addition to collagenase, the authors isolated inhibitors of 400,000, 45,000, and 600 daltons.
Коллагеназы пиявок не дают побочных эффектов и действуют прямо на один из основных стимуляторов аггрегации тромбоцитов.Leech collagenases do not give side effects and act directly on one of the main stimulators of platelet aggregation.
Кроме того, в связи с тем, что коллагеназы пиявок разрушают коллаген только по одной связи, это дает возможность применять этот фермент вместе с другими активными факторами в микрохирургии при длительной остановке кровотечений или для сохранения циркуляции крови у застойных трансплантатов или лоскутов кожи и ткани (на ножке).In addition, due to the fact that collagenase of leeches destroy collagen only in one connection, this makes it possible to use this enzyme together with other active factors in microsurgery for prolonged arrest of bleeding or to maintain blood circulation in stagnant grafts or grafts of skin and tissue (on leg).
Недостатком известного способа является длительность и трудоемкость способа получения коллагеназы из этого вида сырья.The disadvantage of this method is the duration and complexity of the method of producing collagenase from this type of raw material.
Известны очищенные препараты коллагеназ, выпускаемые зарубежными фирмами Sigma, ICN. Эти ферментные препараты приготовлены из культуральной жидкости Clostridium hystolyticum, патогенного микроорганизма, являющегося возбудителем газовой гангрены, поэтому требуют тщательной очистки в специальных условиях.Known purified preparations of collagenases produced by foreign companies Sigma, ICN. These enzyme preparations are prepared from the culture fluid of Clostridium hystolyticum, a pathogenic microorganism that causes gas gangrene, and therefore require careful cleaning in special conditions.
В процессе выделения ферментов производят отделение пигментов, токсина, бактериальной ДНК и сопутствующих протеолитических ферментов.In the process of isolation of enzymes, pigments, toxin, bacterial DNA and associated proteolytic enzymes are separated.
Выделенный раствор суммарного препарата белков наносят на хроматографическую колонку с гидроксиапатитом, и в дальнейшем проводят очистку путем гель-фильтрации и повторной хроматографии на Reactive Red 120-агарозе при рН 7,5.The isolated solution of the total protein preparation is applied to a chromatographic column with hydroxyapatite, and then purification is carried out by gel filtration and repeated chromatography on Reactive Red 120-agarose at pH 7.5.
Способ дорогостоящий из-за применения Red-12-агарозы и многостадийный, что приводит к снижению выхода активных ферментов и повышения их стоимости. Полученные таким образом препараты дороги, их применение в пищевой и медицинской промышленности невозможно из-за опасности микробного заражения, а также наличия токсина.The method is expensive due to the use of Red-12-agarose and multi-stage, which leads to a decrease in the yield of active enzymes and increase their cost. The preparations obtained in this way are expensive, their use in the food and medical industry is impossible because of the danger of microbial infection, as well as the presence of toxin.
К недостаткам способа следует отнести также использование сырья, которое не содержит коллагеназ, способных оказывать заметное терапевтическое действие на застарелые рубцы различной этиологии (PCT/US 94/24272, C 12 N 9/52, 27.10.1994).The disadvantages of the method include the use of raw materials that do not contain collagenases that can have a noticeable therapeutic effect on chronic scars of various etiologies (PCT / US 94/24272, C 12 N 9/52, 10.27.1994).
Известен также способ получения коллагеназы из ультраконцентрата культуральной жидкости Streptomyces lavendulae ИНМИ-36-SV, приведенный в патенте РФ №2075219 (С 12 N 9/58, 27.03.1996 г.). Согласно указанному патенту культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрованием, из фильтраты получают ультраконцентрат, из которого высаживают белок добавлением сульфата аммония до 60% насыщения. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют и диализуют против трис-НСl буфера и пропускают через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой. Активные фракции концентрируют, подвергают гельфильтрации на сефадексе G-100, объединяют и лиофилизируют. Полученный препарат имеет более высокую коллагеназную активность, чем препарат из Clostridium histolyticum, однако способ имеет ряд недостатков, в частности его многостадийность, использование дорогостоящего сефадекса для обессоливания. Более того, в патенте не указывается конечный выход по активности, что не дает возможности оценить эффективность способа.There is also a method of producing collagenase from the ultra-concentrate of the culture fluid Streptomyces lavendulae INMI-36-SV, described in the patent of the Russian Federation No. 2075219 (C 12 N 9/58, 03/27/1996). According to this patent, the culture fluid is separated from the mycelium by filtration, an ultra-concentrate is obtained from the filtrates, from which the protein is precipitated by adding ammonium sulfate to 60% saturation. The precipitate was separated by centrifugation, dissolved and dialysed against Tris-Hcl buffer and passed through a DEAE cellulose column. The active fractions are concentrated, gel-filtered on Sephadex G-100, combined and lyophilized. The resulting preparation has a higher collagenase activity than the preparation from Clostridium histolyticum, however, the method has several disadvantages, in particular its multi-stage nature, the use of expensive Sephadex for desalination. Moreover, the patent does not indicate the final yield by activity, which makes it impossible to evaluate the effectiveness of the method.
В России активно разрабатывались суммарные препараты протеиназ из гепатопанкреаса промысловых видов крабов. Интерес к этому объекту связан с утилизацией отходов краболовства. Кроме того, немаловажным преимуществом по сравнению с коллагеназой из С. histolyticum, бактерии - возбудителя газовой гангрены является относительная безвредность препаратов коллагеназ из краба для человека. Препараты, полученные разными способами из гепатопанкреаса, значительно различаются по степени чистоты и активности, а также по ферментному составу.In Russia, total preparations of proteinases from hepatopancreas of commercial crab species were actively developed. Interest in this facility is associated with the disposal of waste from crab fisheries. In addition, the relative safety of crab collagenase preparations for humans is an important advantage over collagenase from C. histolyticum, the causative agent of gas gangrene. Preparations obtained in different ways from hepatopancreas vary significantly in degree of purity and activity, as well as in enzyme composition.
На основе вышеуказанных препаратов ферментов создано большое количество лечебных форм в виде порошков, мазей и иммобилизованных на перевязочных материалах ферментов для лечения гнойных ран, язв, рубцов.Based on the above enzyme preparations, a large number of therapeutic forms have been created in the form of powders, ointments and enzymes immobilized on dressings for the treatment of purulent wounds, ulcers, scars.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения препарата коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых видов краба Paralithodes Camtschatica, включающий гомогенизацию его в 0,1М ацетате аммония, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, рН 6,4, отделение супернатанта центрифугированием и осаждение препарата сульфатом аммония 60-70% насыщения. Осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1М ацетате аммония рН 5,2-6,4 с добавлением 0,1-1,0 мМ Са2+. Затем проводят ионообменную хроматографию на аминированных силикатных материалах при рН 5,2-6,4, коллагеназу элюируют буферным раствором, содержащим 1 М Nad в присутствии 15-25% изопропанола, при рН 7,0-8,5. Для дополнительной очистки и концентрации фермента коллагеназу высаливают из элюирующего раствора, насыщая его сульфатом аммония до 60%. Слой, содержащий активную коллагеназу, отделяют, диализируют и лиофильно высушивают.Closest to the claimed is a method for producing a collagenase preparation from hepatopancreas of commercial species of crab Paralithodes Camtschatica, including its homogenization in 0.1 M ammonium acetate containing 0.1-1.0 mm calcium acetate, pH 6.4, separation of the supernatant by centrifugation and sedimentation of the drug ammonium sulfate 60-70% saturation. The precipitate containing collagenase is separated by centrifugation, dissolved in 0.1 M ammonium acetate pH 5.2-6.4 with the addition of 0.1-1.0 mm Ca 2+ . Then, ion-exchange chromatography is carried out on aminated silicate materials at a pH of 5.2-6.4, collagenase is eluted with a buffer solution containing 1 M Nad in the presence of 15-25% isopropanol at a pH of 7.0-8.5. For additional purification and concentration of the enzyme, collagenase is salted out from the eluting solution, saturating it with ammonium sulfate up to 60%. The layer containing active collagenase is separated, dialyzed and freeze-dried.
В качестве аминированных силикатных материалов используют аминосилохром, аминоаэросил, аминосиликагель. Выход коллагеназы составляет 50%, очистка в 40 раз.Aminosilochrome, aminoaerosil, aminosilica gel are used as aminated silicate materials. Collagenase yield is 50%,
К недостаткам способа следует отнести невысокий выход и недостаточную очистку целевого продукта. Последнее особенно важно при медицинском применении препарата. Кроме того, применение анионообменной хроматографии приводит к потере ценных компонентов, изоэлектрическая точка которых выше 5. Обессоливание препарата коллагеназ диализом приводит к потере ферментов, т.к. коллагеназа за время диализа (2 суток) частично гидролизует диализные мешки. Длительное пребывание ферментов в дистиллированной воде с рН 5,6 приводит к частичной инактивации ряда протеолитических ферментов. Более того, полученные препараты не оказывают заметное терапевтическое действие на застарелые рубцы различной этимологии. Патент РФ №2008353, C 12 N 9/64, 28.02.94 г.The disadvantages of the method include a low yield and insufficient purification of the target product. The latter is especially important for medical use of the drug. In addition, the use of anion exchange chromatography leads to the loss of valuable components, the isoelectric point of which is higher than 5. The desalination of the collagenase preparation by dialysis leads to the loss of enzymes, because collagenase during dialysis (2 days) partially hydrolyzes dialysis bags. A prolonged stay of enzymes in distilled water with a pH of 5.6 leads to partial inactivation of a number of proteolytic enzymes. Moreover, the preparations obtained do not have a noticeable therapeutic effect on chronic scars of various etymologies. RF patent No. 2008353, C 12 N 9/64, 02/28/94
Задачей изобретения является создание способа получения новой формы препарата коллагеназы, обладающей большой удельной активностью по отношению к рубцовой ткани человека различной этиологии.The objective of the invention is to provide a method for producing a new form of collagenase preparation with high specific activity in relation to human scar tissue of various etiologies.
Другой задачей изобретения является повышение выхода препарата и сокращение времени проведения процесса.Another objective of the invention is to increase the yield of the drug and reduce the time of the process.
Поставленные задачи решаются тем, что в способе получения препарата коллагеназы, включающем гомогенизацию исходного коллагенсодержащего сырья, отделение экстракта центрифугированием, хроматографическую очистку на ионообменном сорбенте и последующие элюцию активных ферментов, диализ элюата и лиофильную сушку препарата, в качестве исходного коллагенсодержащего сырья используют личинки жуков-кожеедов рода Dermestes, гомогенизацию проводят в растворе хлорида натрия с добавлением азида натрия при объемном соотношении биомассы и раствора 1:2-2,5, при этом хроматографическую очистку ведут на ДЕАЕ-сефарозе, уравновешенной MES-буфером с добавлением 0,005М хлорида кальция, а элюцию - трисовым буфером с добавлением хлорида натрия, хлорида кальция и этилового спирта.The tasks are solved in that in a method for producing a collagenase preparation, including homogenization of the initial collagen-containing raw material, separation of the extract by centrifugation, chromatographic purification on an ion-exchange sorbent and subsequent elution of active enzymes, dialysis of the eluate and freeze-drying of the preparation, larvae of beetle-skin beetles are used as initial collagen-containing raw materials genus Dermestes, homogenization is carried out in a solution of sodium chloride with the addition of sodium azide at a volume ratio of biomass and solution 1 : 2-2.5, while chromatographic purification was carried out on DEAE-Sepharose, equilibrated with MES buffer with the addition of 0.005 M calcium chloride, and elution with Tris buffer with the addition of sodium chloride, calcium chloride and ethyl alcohol.
Обычно, гомогенизацию проводят в 3-4%-ном растворе хлорида натрия с добавлением 1-5 мкМ/л азида натрия при рН 6-7.Typically, homogenization is carried out in a 3-4% sodium chloride solution with 1-5 μM / L sodium azide added at pH 6-7.
Предпочтительно проводить элюцию буферным раствором, содержащим 1,5 М хлорида натрия, 0,005 М хлорида кальция, и 20%-ного этилового спирта, а диализ - в 0,005 М растворе хлорида натрия при 2-6°С.It is preferable to carry out the elution with a buffer solution containing 1.5 M sodium chloride, 0.005 M calcium chloride, and 20% ethyl alcohol, and dialysis in a 0.005 M sodium chloride solution at 2-6 ° C.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем. В качестве источника коллагеназы используют личинки жуков-кожеедов рода Dermestes, способных в качестве пищевого субстрата использовать мумифицированные трупы крупных животных. Личинки кожеедов используются на той стадии развития, когда активность коллагеназы максимальная.The essence of the proposed method is as follows. As a source of collagenase, larvae of the skin-eating beetles of the genus Dermestes are used, capable of using mummified corpses of large animals as a food substrate. Skin-eater's larvae are used at the developmental stage when collagenase activity is maximal.
Личинки обезглавливают микроножницами, из тела личинки вынимают пищеварительную трубку и гомогенизацию проводят в 3-4%-ном растворе хлористого натрия с добавлением следовых количеств азида натрия, не более 1-5 мкМ/л для уничтожения микрофлоры раствора.Larvae are decapitated with microscissors, the digestive tube is removed from the body and homogenization is carried out in a 3-4% sodium chloride solution with the addition of trace amounts of sodium azide, not more than 1-5 μM / L to destroy the microflora of the solution.
Очистку супернатанта ведут ионообменной хроматографией, при этом сорбцию коллагеназы осуществляют на ДЭАЭ-сефарозе в присутствии 50 мМ MES-буфера, (рН=6,4), с 0,005М хлоридом кальция, а элюцию - трисовым буфером рН=8-8,5 с 1,5 М хлоридом натрия и 20% этиловым спиртом, содержащим 0,005 М хлорид кальция.Purification of the supernatant is carried out by ion exchange chromatography, while collagenase is sorbed on DEAE-Sepharose in the presence of 50 mM MES buffer (pH = 6.4), with 0.005 M calcium chloride, and elution with Tris buffer pH = 8-8.5 s 1.5 M sodium chloride and 20% ethyl alcohol containing 0.005 M calcium chloride.
Обессоливание и концентрирование целевого препарата осуществляют диализом с последующим лиофильным высушиванием.Desalting and concentration of the target drug is carried out by dialysis, followed by freeze drying.
Суммарный выход активного продукта составляет - 50-75% в зависимости от гетерогенности используемого сырья.The total yield of the active product is - 50-75%, depending on the heterogeneity of the raw materials used.
Удельная активность коллагеназы по рубцам различной этиологии повышается в 5-10 раз.The specific activity of collagenase in scars of various etiologies increases 5-10 times.
Пример 1.Example 1
Пищеварительные тракты из 1000 личинок гомогенизируют в 3%-ном растворе хлорида натрия с добавлением азида натрия в количестве 3 мкМ/л, рН-6-7, в стеклянном механическом гомогенизаторе при объемном соотношении биомассы и раствора, равном 1:2 в течение 15 мин при комнатной температуре.The digestive tracts of 1000 larvae are homogenized in a 3% sodium chloride solution with the addition of sodium azide in an amount of 3 μM / L, pH-6-7, in a glass mechanical homogenizer with a volume ratio of biomass and solution of 1: 2 for 15 min at room temperature.
Полученный гомогенат подвергают центрифугированию при 10000 об/мин. Получают 100 мл суммарного препарата белков пищеварительного тракта личинок кожеедов.The resulting homogenate is subjected to centrifugation at 10,000 rpm. Get 100 ml of the total preparation of proteins of the digestive tract of skin larvae larvae.
Из полученного раствора 10 мл наносят на колонку (1,5х20 см) с ДЭАЭ-сефарозой, уравновешенной MES-буфером, рН=6,4, с 0,005 М хлорида кальция.From the resulting solution, 10 ml is applied to a column (1.5 x 20 cm) with DEAE-Sepharose, equilibrated with MES buffer, pH = 6.4, with 0.005 M calcium chloride.
Элюцию активных ферментов проводят 0,05М трисовым буфером при рН=8, с 1,5 М хлорида натрия, 0,005М хлорида кальция и 20% по объему этилового спирта.Elution of active enzymes is carried out with 0.05 M Tris buffer at pH = 8, with 1.5 M sodium chloride, 0.005 M calcium chloride and 20% by volume of ethyl alcohol.
Элюат подвергают диализу против 0,005М раствора хлорида кальция в течение суток при +4°С, затем лиофильно высушивают. Выход ферментного препарата составляет 60%. Удельная активность полученного ферментного препарата 25 мг рубцовой ткани /сутки на 0,1 мг препарата.The eluate is dialyzed against a 0.005M calcium chloride solution overnight at + 4 ° C, then freeze-dried. The yield of the enzyme preparation is 60%. The specific activity of the obtained enzyme preparation is 25 mg of scar tissue / day per 0.1 mg of the preparation.
Пример 2.Example 2
Исследование влияния препарата белков пищеварительного тракта личинок кожеедов на гипертрофические келоидные рубцы человека проводят in vitro по нижеприведенной методике.The study of the effect of the preparation of the digestive tract proteins of the skin larvae larvae on human hypertrophic keloid scars is carried out in vitro according to the following procedure.
Для исследования берут образцы рубцов трех пациентов:For research take samples of scars of three patients:
1 - 2-летний гипертрофический рубец1 - 2 year hypertrophic scar
2 - 2-х летний гипертрофический келоидный рубец2 - 2 year old hypertrophic keloid scar
3 - 2,5 летний келоидный рубец.3 - 2.5 year old keloid scar.
Для каждого образца рубца делают 4 навески ткани массой 50 мг каждая. Навески помещают в буфер для коллагенолиза.For each scar sample, 4 tissue samples weighing 50 mg each are made. Samples are placed in a collagenolysis buffer.
Готовят растворы трипсина (отрицательный контроль) и клостридиальной коллагеназы (положительный контроль) с концентрацией, равной и рассчитанной для коллагеназы в исследуемом препарате. Определение концентрации всех белков производят по методу Бредфорд.Solutions of trypsin (negative control) and clostridial collagenase (positive control) are prepared with a concentration equal to and calculated for collagenase in the study drug. The concentration of all proteins is determined by the Bradford method.
Трипсин используют для проверки интактности рубцовой ткани, клостридиальную коллагеназу - в качестве эталона коллагеназной активности.Trypsin is used to test the intactness of scar tissue, clostridial collagenase as a standard for collagenase activity.
Коллагенолиз проводят в закрытых стеклянных бюксах на качалке при 36°С, 96 час.Collagenolysis is carried out in closed glass bottles on a rocking chair at 36 ° C, 96 hours.
Результаты коллагенолиза приведены на чертежах.The results of collagenolysis are shown in the drawings.
На фиг.1 показана динамика расщепления 2-х летнего гипертрофического рубца.Figure 1 shows the dynamics of the splitting of a 2-year hypertrophic scar.
На фиг 2 показана динамика расщепления 2-х летнего гипертрофического келоидного рубца.Figure 2 shows the dynamics of cleavage of a 2-year-old hypertrophic keloid scar.
На фиг.3 показана динамика расщепления 2,5 летнего келоидного рубца.Figure 3 shows the dynamics of the cleavage of 2.5 year old keloid scar.
На всех чертежах номера бюксов соответствуют:In all the drawings, the numbers of the boxes correspond to:
№1 - буфер для коллагенолизаNo. 1 - collagenolysis buffer
№2 - трипсинNo. 2 - trypsin
№3 - клостридиальная коллагеназаNo. 3 - clostridial collagenase
№4 -препарат коллагеназы личинок кожеедовNo. 4 - the preparation of collagenase of skin larvae larvae
Как видно из рисунков, исследуемый препарат эффективнее клостридиальной коллагеназы во всех случаях: навески 1 и 3 рубцов полностью растворились за 48 часов.As can be seen from the figures, the studied drug is more effective than clostridial collagenase in all cases: weights of 1 and 3 scars completely dissolved in 48 hours.
На фиг.4 приведены данные сравнения активности препаратов при расщеплении застарелого гипертрофического келоидного рубца (2,5 года) в процентном соотношении.Figure 4 shows data comparing the activity of drugs in the cleavage of an old hypertrophic keloid scar (2.5 years) in a percentage ratio.
Столбиками показана остаточная масса навески рубца в процентах после расщепления.The bars show the residual mass of a portion of the rumen in percent after splitting.
Столбик 1 - контроль - без ферментаColumn 1 - control - without enzyme
Столбик 2 - добавлялась клостридиопептидазаColumn 2 - Clostridiopeptidase was added
Столбик 3 - с препаратом коллагеназы из личинок DermestesColumn 3 - with the preparation of collagenase from Dermestes larvae
Столбик 4 -с препаратом Морикраза.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать коллагеназу из личинок жуков кожеедов с выходом до 75%, повысить удельную активность в 5-10 раз, сократить время процесса за счет сокращения общего числа стадий выделения препарата и сделать способ достаточно экономным за счет применения более дешевого сорбента для хроматографической очистки.Thus, the proposed method allows to obtain collagenase from the larvae of beetle beetles with a yield of up to 75%, increase the specific activity by 5-10 times, reduce the process time by reducing the total number of stages of drug isolation and make the method quite economical by using a cheaper sorbent for chromatographic purification.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003114709/13A RU2236460C1 (en) | 2003-05-20 | 2003-05-20 | Method for preparing collagenase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003114709/13A RU2236460C1 (en) | 2003-05-20 | 2003-05-20 | Method for preparing collagenase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2236460C1 true RU2236460C1 (en) | 2004-09-20 |
| RU2003114709A RU2003114709A (en) | 2005-02-10 |
Family
ID=33433905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003114709/13A RU2236460C1 (en) | 2003-05-20 | 2003-05-20 | Method for preparing collagenase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2236460C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009154502A1 (en) * | 2008-06-09 | 2009-12-23 | Shmoilov Alexandr Mikhailovich | Method for producing a combined preparation exhibiting collagenase activity |
| RU2750382C1 (en) * | 2020-07-27 | 2021-06-28 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Method for producing immobilized enzyme preparation based on collagenase, hyaluronic acid and polysaccharides modified with vinyl monomers |
-
2003
- 2003-05-20 RU RU2003114709/13A patent/RU2236460C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009154502A1 (en) * | 2008-06-09 | 2009-12-23 | Shmoilov Alexandr Mikhailovich | Method for producing a combined preparation exhibiting collagenase activity |
| RU2750382C1 (en) * | 2020-07-27 | 2021-06-28 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Method for producing immobilized enzyme preparation based on collagenase, hyaluronic acid and polysaccharides modified with vinyl monomers |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003114709A (en) | 2005-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210040468A1 (en) | Compositions and methods for producing clostridial collagenases | |
| US8540983B2 (en) | Debriding composition from bromelain and methods of production thereof | |
| US10597632B2 (en) | Animal product-free culture medium for bacteria of the genus Clostridium and a process for producing supernatant comprising one or more collagenolytic and gelatinolytic proteases | |
| JP3253108B2 (en) | Compositions containing proteases produced by Vibrio and methods for use in debridement and wound healing | |
| US4329430A (en) | Enzyme mixture | |
| US6902548B1 (en) | Use of Streptomyces hyalurolyticus enzyme in ophthalmic treatments | |
| US5145681A (en) | Compositions containing protease produced by vibrio and method of use in debridement and wound healing | |
| Hidayat et al. | Antibacterial activity test of the partially purified bromelain from pineapple core extract (Ananas comosus [L.] Merr) by fractionation using ammonium sulfate acetone | |
| RU2236460C1 (en) | Method for preparing collagenase | |
| KR101853463B1 (en) | Method for purifying botulinum toxin | |
| CA2318356A1 (en) | Pharmaceutical formulation containing a hyaluronic acid-splitting enzyme of microbial origin | |
| Pappenheimer Jr | Proteins of pathogenic bacteria | |
| RU2346983C1 (en) | Method of production of plasminogen activator | |
| RU2781289C1 (en) | Method for production of highly purified concentrated preparation with collagenase activity | |
| US4066503A (en) | Enzyme of hydrolytic action, enzymatic preparation, method for preparing both and their uses | |
| RU2412997C2 (en) | Method of producing enzymatic complex preparation having collagenase activity | |
| JPH09182583A (en) | Enzyme activating prourokinase and collection of the same | |
| Salih | Production, Purification and Characterization of Collagenase produced from locally isolated Staphylococcus aureus HN77 | |
| WO2010070746A1 (en) | Canine angiostatin-like polypeptide | |
| US4075322A (en) | Enzyme composition | |
| EVANGELISTA et al. | STUDIES ON THE CYTOTOXIC POTENTIAL OF THE CRUDE VENOM AND | |
| JPH042600B2 (en) | ||
| JPS60500413A (en) | Pharmaceutical composition with high collagenolytic activity | |
| JP2003088397A (en) | Plasminogen fragment having neovascularization- inhibiting activity and method for searching compound which induce production of the plasminogen fragment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090521 |