WO2009154502A1 - Method for producing a combined preparation exhibiting collagenase activity - Google Patents

Method for producing a combined preparation exhibiting collagenase activity Download PDF

Info

Publication number
WO2009154502A1
WO2009154502A1 PCT/RU2008/000426 RU2008000426W WO2009154502A1 WO 2009154502 A1 WO2009154502 A1 WO 2009154502A1 RU 2008000426 W RU2008000426 W RU 2008000426W WO 2009154502 A1 WO2009154502 A1 WO 2009154502A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
activity
sephadex
complex preparation
supernatant
carried out
Prior art date
Application number
PCT/RU2008/000426
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Александр Михайлович ШМОЙЛОВ
Андрей Ремуальдович ЧЕРНЯКОВ
Original Assignee
Shmoilov Alexandr Mikhailovich
Chernyakov Andrey Remualdovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shmoilov Alexandr Mikhailovich, Chernyakov Andrey Remualdovich filed Critical Shmoilov Alexandr Mikhailovich
Publication of WO2009154502A1 publication Critical patent/WO2009154502A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
    • C12N9/6405—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals not being snakes
    • C12N9/6408—Serine endopeptidases (3.4.21)

Definitions

  • the claimed invention relates to biotechnology, and more specifically relates to a method for producing an enzymatic complex preparation having collagenase activity.
  • a known method of producing a collagenase preparation from hepatopancreas of commercial crab species comprising the formation in OD M of ammonium acetate (pH 6.4) containing 0.1-1.0 mM calcium acetate, a homogenate of feedstock, separation of the supernatant by centrifugation and precipitation of the preparation with ammonium sulfate 60 -70% saturation.
  • the precipitate containing collagenase is separated by centrifugation, dissolved in 0.1 M ammonium acetate (pH 5.2-6.4) with the addition of 0.1-1.0 mm Ca 2+ , then ion-exchange chromatography on aminated silicate materials is carried out at pH 5.2-6.4, collagenase is eluted with a buffer solution containing 1 M NaCl in the presence of 15-25% isopropanol at pH 7.0-8.5.
  • collagenase is salted out from the eluting solution, saturating it with ammonium sulfate up to 60%.
  • the layer containing active collagenase is separated, dialyzed and freeze-dried (RF Patent 2008353, C 12 N 9/64, 02.28.94).
  • the yield of the target product is only 50%, purification of the drug is provided 40 times in comparison with the feedstock, which is insufficient for medical use of the drug.
  • the resulting preparation has a low activity due to the loss of valuable components, the isoelectric point of which is above 5, during centrifugation, ion-exchange chromatography on aminated silicate materials at pH 5.2-6.4, and due to the loss of a significant part enzymes in the process of desalination carried out dialysis for 2 days.
  • a long stay of enzymes in distilled water with a pH of 5.6 leads to partial inactivation of a number of proteolytic enzymes.
  • a known method of producing a proteolytic complex, including collagenase activity, from crushed pancreas-containing terrestrial or aquatic animals is extracted with 1 mM calcium chloride solution containing 0.2% detergent for 12 hours.
  • the precipitate is separated by separation and centrifugation of the supernatant to remove the lipid fraction.
  • Purification of fine particles is carried out by microfiltration on membranes with a pore diameter of 200 ⁇ m, the concentration of the resulting solution is carried out by ultrafiltration on a membrane with a permeability of 15 kDa.
  • the concentrated solution is sterilized by filtration and freeze-dried.
  • Collagenolytic activity for acid-soluble collagen - 672 units / mg (RF Patent W ° 2034028, C 12 N 9/64, 1995.04.30).
  • the product obtained in accordance with the specified method has a specific activity corresponding to the activity of technical preparations; in addition, the use of high concentrations of surfactants negatively affects the environment, requiring the development of special methods for the disposal of industrial waste.
  • a known method of producing an enzyme preparation having collagenolytic activity providing for the isolation of an enzyme from hepatopancreas of commercial crabs by tissue homogenization in a buffer solution with a pH of 6-9.5, containing a non-ionic detergent in an amount of 0.1-5% and 0.1-2.0 M alkali metal chloride solution.
  • the solution is purified by microfiltration on membranes with a pore diameter of 0.45 ⁇ m, the concentration of the resulting solution is carried out by ultrafiltration on a membrane with a pore permeability of 5 kDa.
  • the concentrated solution is freeze-dried.
  • the specific proteolytic activity is not lower than 10000 units / mg, and the specific activity of individual collagenases is significantly less than the specific activity of the total preparation (EP JV ° 0402321, class C 12 N 9/64, 1990.12.12).
  • the specified method does not provide a highly purified preparation - the final fraction includes a wide range of proteins with molecular
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) masses from 15-1200000 kDa, which includes not only collagenases (20-25.5 kDa), but also a large number of impurity proteins, including inhibitors.
  • Insoluble particles of the starting product are separated by sequential filtration through filters with pore sizes of 10, 0.5 and 0.1 mm.
  • the solution is purified by microfiltration on membranes with a pore diameter of 0.45 ⁇ m, passing proteins with molecular weights of 1200 kDa.
  • the concentration of the resulting solution is carried out by ultrafiltration on a membrane with a pore permeability of 10 kDa. The concentrated solution is freeze-dried.
  • the specific collagenolytic activity is at least 2000 units. Mandl / mg (RF patent .N ° 2096456, C 12 N 9/48, 1998.20.11).
  • the specified method provides a preparation with a high content of impurity proteins that are not related to collagenolytic enzymes, which leads to a small specific collagenase activity of the target product.
  • the disadvantages of this method include the low purification of the target product, which is associated with the loss of active collagenase occurring at the stage
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) addition of an acidic solution of chitosan (pH 2.5-5.0), which leads to partial inactivation of collagenolytic enzymes, as well as loss of collagenase when using a membrane with a permeability of pores of 30 kDa, by recent works on the isolation of genes of collagenolytic enzymes of hepatopancreas of the king crab, attracting crab shrimp, it was shown that their molecular weight is 21.5-25.0 kDa, therefore, with pore permeability of the membrane 30 kDa, collagenases largely pass through the membrane and the total activity of the final preparation that decreases.
  • the method of obtaining an enzymatic complex preparation with collagenase activity was selected, including homogenization of the larvae of the skin-beetle beetles of the genus Dertestes in a 3-4% solution of sodium chloride with the addition of 1-5 ⁇ M / L sodium azide at pH 6-7, at volume ratio of biomass and solution 1: 2-2.5.
  • the eluate is dialyzed in a 0.005 M sodium chloride solution at 2-6 ° C and concentrated by freeze drying of the preparation (RF patent Jfe 2236460, IPC: C 12 N 9/64, publ. 2004.09.20).
  • the enzymatic complex preparation has a small specific collagenase activity.
  • it must be subjected to complex and laborious treatments to isolate the required highly active proteins.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
  • the basis of the claimed invention is the task of reducing the loss of valuable proteins and reducing the amount of inactive proteins available in the original product, to create a method for producing an enzymatic complex preparation having a high specific collagenase activity with a high yield of the target product.
  • an enzymatic complex preparation is obtained in high yield, consisting of highly active proteins, which are able, among other things, to efficiently hydrolyze hypertrophic, keloid and hypertrophic keloid scars of various etiologies in vitro.
  • the peculiarity of the proposed method is that as the intestines and heads of the larvae of beetles of the genus Destests use the intestines and heads of the larvae of beetles of the type Destests necessarilyii or of the species Destestas tacilates.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Another feature of the proposed method is that Sephadex G-150 is used as gel filtration in the presence of dithiotriethol, and Sephadex G-25 is used as a Sephadex for each desalination.
  • a feature of the proposed method is that at each stage of the implementation of the method, the activity of the enzymatic complex preparation is determined by the Mandle method and by the hydrolysis of the synthetic chromogenic substrate of carbobenzoxyalanylalanylproline-i-nitroanilide.
  • the biomass homogenate of parts of larvae of beetles of the genus Destsestes is used, and more precisely, the homogenate of the biomass of separated intestines and heads of the larvae of beetles of the species Destests fesciiii and Destests tacylates, which provides a wider spectrum of the initial product.
  • the digestive tubes and heads of the larvae of beetles of the species Destests friiessehii and Dertestes tacilates i.e., the biomass is homogenized, according to the invention, in Ringer's solution containing sodium azide and dithiotriethol, with a volume ratio of biomass and solution of 1: (0.5-5.0), respectively providing solubilization of water-soluble proteins.
  • a volume ratio of biomass and solution below 1: 0.5 active proteins are practically absent in the solution - only trace amounts are observed; with a volume ratio of biomass and solution above 1: 5.0, the drug cannot be isolated, since chromatography does not make it possible to detect proteins.
  • the resulting homogenate is decanted for, for example, 3 hours to separate the supernatant, including the dissolved enzymatic complex preparation having activity. Separation of the supernatant by decantation allows you to save in the supernatant the amount of proteins that previously precipitated by centrifugation of the homogenate.
  • a feature of the claimed invention is that after each step of the proposed method, the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pro - /? NA hydrolysis, the hydrolysis progress is determined spectrophotometrically. Activity is measured by the change in absorption of A 4 I 0 .
  • Mandla unit is equivalent to activity releasing 1 ⁇ mol of amino acids in collagen, defined as leucine, when the enzyme with collagen is incubated for 5 hours at 37 ° C, pH 7.5.
  • collagen of the first type of rat tails was used according to the Mandle method with colorimetric measurement of the results according to the Moore ap Stein method.
  • the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined in this way.
  • the supernatant is filtered by Sephadex, including Sephadex G-150.
  • This stage of the proposed method is the first step in the purification of the enzymatic complex preparation. It is advisable to filter the supernatant on Sephadex in the presence of dithiotriethol.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) found the possibility of isolating active proteins by the values of molecular weights in the enzymatic complex preparation.
  • the yield of enzyme preparation in activity is about 70% when measuring enzymatic activity in terms of the efficiency of Z-Ala-Ala-Rro-pNA hydrolysis; about 85% - when measuring activity according to Mandl, the drug is transferred to the next stage of the proposed method.
  • the desalted enzyme complex preparation is then subjected to concentration by, according to the claimed method, ultrafiltration, for example, on membranes with permeability from 5 thousand to 50 thousand daltons, manufactured, for example, by Milliror, at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C .
  • the second stage of purification of the enzymatic complex preparation is carried out, carrying out ion-exchange chromatography mainly on N'-1, 2-diethylaminoethyl-sephaprose in the presence of dithiotriethol.
  • the sorbed enzymatic complex preparation is eluted in a pH gradient with a change in the buffer system: O, IM ammonium acetate buffer, pH 6.4-0.05 M Tris-Hcl, pH 8.0, 2.5 mM CaCl 2, then double gradient of NaCl 0-1.5 M, ethanol 0-20%.
  • the yield of the enzyme complex preparation by activity is about 96% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of Z-Ala-Ala-Rro-pNA hydrolysis; about 134% - when measured
  • the desalted enzyme complex preparation is then subjected to concentration by, according to the claimed method, ultrafiltration, for example, on membranes with permeability from 5 thousand to 50 thousand daltons, manufactured, for example, by Millirog, at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C .
  • the claimed method allows to obtain in high yield an enzymatic complex preparation consisting only of highly active proteins, which provides wider possibilities for the use of this drug, including for effective action on hypertrophic, keloid and hypertrophic keloid scars of various etiologies.
  • the purified enzyme complex preparation has high collagenolytic activity — the activity yield (determined by the Mandl method) is PO%.
  • the specific activity of the enzyme complex preparation is 5 # 10 units of Mandl / mg protein.
  • Example 1 For a better understanding of the present invention, the following examples of its specific implementation. Example 1
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Ringer’s solution (containing sodium azide and dithiotriethol) at a volume ratio of biomass and solution of 1: 1 for 20 minutes at a temperature
  • the resulting homogenate is decanted at a temperature of +4 0 C for hours.
  • the supernatant is a 155 ml supernatant resulting from the deposition of solid particles, filtered through a filter with a pore diameter of 0.2 ⁇ m.
  • 150 ml of supernatant with an enzyme concentration of 9.2-9.5 mg / ml are obtained.
  • the activity of the dissolved enzymatic complex preparation in the resulting supernatant is determined.
  • the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis, the hydrolysis progress is determined spectrophotometrically. Activity is measured by the change in absorption of A 4I0 .
  • Mandla unit is equivalent to activity releasing 1 ⁇ l of amino acids in collagen, defined as leucine, when the enzyme with collagen is incubated for 5 hours at 37 ° C, pH 7.5.
  • collagen of the first type of rat tails was used according to the Mandle method with colorimetric measurement of the results according to the Moore ap Stein method.
  • the first stage of purification of the active enzymatic complex preparation in the obtained supernatant is carried out.
  • 10 ml of the obtained supernatant is applied to a 2x80 cm chromatographic column containing Sephadex G-150, equilibrated with 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4, containing trace amounts of dithiotriethol.
  • the yield of the enzyme preparation by activity is about 70% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis; about 85% - when measuring activity according to Mandl.
  • the active fractions of the eluate are combined, in total receiving 85-95 ml of the eluate containing an enzymatic complex preparation based on proteins with
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) specific molecular weights.
  • the concentration of proteins is 0.3-0.5 mg / ml.
  • the eluate containing the enzymatic complex preparation purified by gel filtration on Sephadex G-150 from products having an inappropriate molecular weight is then desalted portionwise using column chromatography using Sephadex G-25, then concentrated by ultrafiltration, for which the drug is passed through membranes Millirr company with a permeability of 10,000 daltons at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C.
  • the result is 135 ml of enzymatic complex preparation with an enzyme concentration of 3-5 mg / ml.
  • Chromatographic purification on the ion-exchange sorbent of the resulting solution containing the enzymatic complex preparation is carried out. For this, 10 ml of the resulting solution is applied to a 1.5 x 25 cm column containing N'-l, 2-diethylaminoethyl-cepharose balanced with 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4.
  • the elution is carried out in a pH gradient with a change in the buffer system: 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4 - 0.05 M Tris-Hcl, pH 8.0, 2.5 mm CaCl 2, then in a double gradient of NaCl 0- 1.5 M, ethanol 0-20% in the presence of dithiotriethol.
  • the yield of the enzyme complex preparation by activity is 96% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of the hydrolysis of Z-AIa-Ala-Pro-pNA; 134% - when measuring activity according to Mandl.
  • the removal of salts and alcohol from the dissolved enzymatic complex preparation is carried out.
  • the dissolved enzymatic complex preparation is desalted in portions using column chromatography, where Sephadex G-25 is used as a carrier. after which it is concentrated by ultrafiltration, for which purpose I pass the drug through a Milliror membrane with a permeability of 10,000 daltons at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The result is 10 ml of a complex enzyme preparation with a protein concentration of 0.5-1.0 mg / ml.
  • the yield of a complex enzyme preparation by activity is 70% when measuring enzymatic activity by the efficiency of Z-AIa-Ala-Pro hydrolysis - /? NA; 85% - when measuring activity according to Mandl.
  • the specific activity of the obtained complex enzyme preparation is 0.95 units. act./ mg protein when measuring enzymatic activity by the efficiency of the hydrolysis of Z-Ala-Ala-Pr-pNA, 450 xlO 3 units.
  • the resulting homogenate is decanted at a temperature of +4 C for 3 hours.
  • the supernatant is a supernatant with a volume of 230 ml, formed as a result of the deposition of solid particles, filtered through a filter with a pore diameter of 0.2 ⁇ m. 220 ml of supernatant are obtained with an enzyme concentration of 2.5-3.0 mg / ml.
  • the activity of the dissolved enzymatic complex preparation in the resulting supernatant is determined.
  • the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis, the hydrolysis progress is determined spectrophotometrically. Activity is measured by the change in absorption of A 4I0 .
  • Mandla unit is equivalent to activity releasing 1 ⁇ mol of amino acids in collagen, defined as leucine, when the enzyme with collagen is incubated for 5 hours at 37 ° C, pH 7.5.
  • collagen of the first type of rat tails is used according to the Mandle method with colorimetric measurement of the results according to the Moore apdStein ninhydrin method.
  • the yield of the enzyme preparation by activity is about 70% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis; about 85% - when measuring activity according to Mandl.
  • the active fractions of the eluate are combined, in total receiving 70-80 ml of the eluate containing the enzymatic complex preparation with proteins of certain molecular weights.
  • the concentration of proteins is 0.1-0.2 mg / ml.
  • the eluate containing the enzymatic complex preparation purified by gel filtration on Sephadex G-150 from products having an inappropriate molecular weight, is then desalted portionwise using column chromatography, where Sephadex G-25 is used as a carrier, and then concentrated by ultrafiltration, for which the drug is passed through to the Milliror membrane with a permeability of 10,000 daltons at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C.
  • the result is 150 ml of enzymatic complex preparation with a protein concentration of 1-2 mg / ml.
  • the second stage of purification is carried out - chromatographic purification is carried out on the ion-exchange sorbent of the resulting solution containing the enzymatic complex preparation.
  • 10 ml of the resulting solution is applied to a 1.5 x 25 cm column containing N'-1,2-diethylaminoethyl-sepharose, balanced with 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4.
  • the elution is carried out in a pH gradient with a change in the buffer system: 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4 - 0.05 M Tris-Hcl, pH 8.0, 2.5 mm CaCl 2, then in a double gradient of NaCl 0 -1.5 M, ethanol 0-20% in the presence of dithiotriethol.
  • the result is 15 ml of a complex enzyme preparation with a protein concentration of 0.3-0.5 mg / ml.
  • the yield of a complex enzyme preparation by activity is 60% when measuring enzymatic activity by the efficiency of Z-AIa-Ala-Progo-pNA hydrolysis; 75% - when measuring activity according to Mandl.
  • the specific activity of the obtained complex enzyme preparation is 0.15 units. act./mg of protein when measuring enzymatic activity by the efficiency of the hydrolysis of Z-Ala-Ala-Rro-pNA, 50 xlO 3 units.
  • the preparation of a complex enzyme preparation is carried out under conditions similar to those described in Example 1, however, the prepared biomass of the intestines and heads of the larvae of beetles of the species Destestwithii are homogenized in Ringer's solution (containing sodium azide and dithiotriethol) with a volume ratio of 1: 0.5 of the biomass and solution.
  • Ringer's solution containing sodium azide and dithiotriethol
  • the yield of the obtained complex enzyme preparation by activity is 70% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis; 85% - when measuring activity according to Mandl.
  • the specific activity of the obtained complex enzyme preparation is 0.95 units. act. / mg protein when measuring enzymatic activity according to
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) the efficiency of the hydrolysis of Z-Ala-Ala-Rro-pNA, 450 xlO 3 units Mandla / mg protein when measuring activity according to Mandla.
  • the preparation of a complex enzyme preparation is carried out under conditions similar to those described in Example 2, however, the prepared biomass of intestines and heads of beetle larvae of the species Destestas tacilates is homogenized in Ringer's solution (containing sodium azide and dithiotriethol) at a volume ratio of biomass and solution of 1: 5.0.
  • Ringer's solution containing sodium azide and dithiotriethol
  • the yield of the obtained complex enzyme preparation by activity is 60% when measuring the enzymatic activity by the hydrolysis efficiency of Z-Ala-Ala-Pro-pNA; 75% - when measuring activity according to Mandl.
  • the specific activity of the obtained complex enzyme preparation is 0.15 units. act./ mg protein when measuring enzymatic activity by the efficiency of the hydrolysis of Z-Ala-Ala-Pr-pNA, 50 xl units. Mandla / mg protein when measuring activity according to Mandla.
  • the invention will find application, in particular, in medicine, using an enzymatic complex preparation with collagenase activity for the treatment of burns, purulent-trophic ulcers, postoperative scars.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

The inventive method consists in forming the biomass homogenate of the intestines and heads of Dermestes larvae in a Ringer's solution containing sodium azide and dithiothreitol, subsequently separating a supernatant by decanting a homogenate and gel-filtering a supernatant on a sephadex with the sorption and elution of a combined fermentative preparation which is then desalinated and concentrated. The method also consists in carrying out ion chromatography accompanied with the sorption and elution of a combined fermentative preparation, subsequently desalinating the eluted combined fermentative preparation and concentrating the target product. Furthermore, each desalination is carried out with the aid of columnar chromatography on a sephadex and each concentration is carried out by ultrafiltering on membranes with penetrability ranging from 5 000 to 50 000 daltons.

Description

Способ получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью A method of obtaining an enzymatic complex preparation having collagenase activity
Область техникиTechnical field
Заявляемое изобретение относится к биотехнологии, а точнее касается способа получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью.The claimed invention relates to biotechnology, and more specifically relates to a method for producing an enzymatic complex preparation having collagenase activity.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Известен способ получения препарата коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых видов краба, включающий образование в ОД M ацетате аммония (рН 6,4), содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, гомогената исходного сырья, отделение супернатанта центрифугированием и осаждение препарата сульфатом аммония 60-70% насыщения. Затем осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 M ацетате аммония (рН 5,2-6,4) с добавлением 0,1-1,0 мМ Ca2+, после этого проводят ионообменную хроматографию на аминированных силикатных материалах при рН 5,2-6,4, коллагеназу элюируют буферным раствором, содержащим 1 M NaCl, в присутствии 15-25% изопропанола при рН 7,0-8,5. Для дополнительной очистки и концентрации фермента коллагеназу высаливают из элюирующего раствора, насыщая его сульфатом аммония до 60%. Слой, содержащий активную коллагеназу, отделяют, диализируют и лиофильно высушивают (Патент РФ 2008353, С 12 N 9/64, 28.02.94 г.).A known method of producing a collagenase preparation from hepatopancreas of commercial crab species, comprising the formation in OD M of ammonium acetate (pH 6.4) containing 0.1-1.0 mM calcium acetate, a homogenate of feedstock, separation of the supernatant by centrifugation and precipitation of the preparation with ammonium sulfate 60 -70% saturation. Then the precipitate containing collagenase is separated by centrifugation, dissolved in 0.1 M ammonium acetate (pH 5.2-6.4) with the addition of 0.1-1.0 mm Ca 2+ , then ion-exchange chromatography on aminated silicate materials is carried out at pH 5.2-6.4, collagenase is eluted with a buffer solution containing 1 M NaCl in the presence of 15-25% isopropanol at pH 7.0-8.5. For additional purification and concentration of the enzyme, collagenase is salted out from the eluting solution, saturating it with ammonium sulfate up to 60%. The layer containing active collagenase is separated, dialyzed and freeze-dried (RF Patent 2008353, C 12 N 9/64, 02.28.94).
Выход целевого продукта составляет лишь 50%, обеспечена очистка препарата в 40 раз по сравнению с исходным сырьем, что недостаточно при медицинском применении препарата. Кроме того, полученный препарат имеет невысокую активность из-за потери ценных компонентов, изоэлектрическая точка которых выше 5, в процессе центрифугирования, ионообменной хроматографии, осуществляемой на аминированных силикатных материалах при рН 5,2-6,4, и из- за потери значительной части ферментов в процессе обессоливания, проводимого диализом в течение 2-х суток. Кроме того, длительное пребывание ферментов в дистиллированной воде с рН 5,6 приводит к частичной инактивации ряда протеолитических ферментов.The yield of the target product is only 50%, purification of the drug is provided 40 times in comparison with the feedstock, which is insufficient for medical use of the drug. In addition, the resulting preparation has a low activity due to the loss of valuable components, the isoelectric point of which is above 5, during centrifugation, ion-exchange chromatography on aminated silicate materials at pH 5.2-6.4, and due to the loss of a significant part enzymes in the process of desalination carried out dialysis for 2 days. In addition, a long stay of enzymes in distilled water with a pH of 5.6 leads to partial inactivation of a number of proteolytic enzymes.
Известен способ получения протеолитического комплекса, включающего коллагеназную активность, из измельченных панкреассодержащих наземных или водных животных. Экстракцию комплекса осуществляют 1 мМ раствором хлористого кальция, содержащим 0,2% детергента в течение 12 ч. Осадок отделяют сепарированием и центрифугированием надосадочной жидкости для удаления липидной фракции. Очистку от мелкодисперсных частиц ведут микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 200 мкм, концентрирование полученного раствора осуществляют ультрафильтрацией на мембране с проницаемостью 15 кДа. Концентрированный раствор стерилизуют фильтрацией и сушат сублимацией. Коллагенолитическая активность по кислоторастворимому коллагену - 672 ед/мг (Патент РФ W°2034028, С 12 N 9/64, 1995.04.30).A known method of producing a proteolytic complex, including collagenase activity, from crushed pancreas-containing terrestrial or aquatic animals. The complex is extracted with 1 mM calcium chloride solution containing 0.2% detergent for 12 hours. The precipitate is separated by separation and centrifugation of the supernatant to remove the lipid fraction. Purification of fine particles is carried out by microfiltration on membranes with a pore diameter of 200 μm, the concentration of the resulting solution is carried out by ultrafiltration on a membrane with a permeability of 15 kDa. The concentrated solution is sterilized by filtration and freeze-dried. Collagenolytic activity for acid-soluble collagen - 672 units / mg (RF Patent W ° 2034028, C 12 N 9/64, 1995.04.30).
Продукт, полученный в соответствии с указанным способом, имеет удельную активность, соответствующую активности технических препаратов, помимо этого использование высоких концентраций поверхностно-активных веществ отрицательно влияет на экологию, требуя разработки специальных способов утилизации отходов производства.The product obtained in accordance with the specified method has a specific activity corresponding to the activity of technical preparations; in addition, the use of high concentrations of surfactants negatively affects the environment, requiring the development of special methods for the disposal of industrial waste.
Известен способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, предусматривающий выделение фермента из гепатопанкреаса промысловых крабов гомогенизацией тканей в буферном растворе с рН 6-9,5, содержащем неионный детергент в количестве 0,1-5% и 0,1-2,0 M раствор хлорида щелочного металла. После отделения осадка и слоя липидов раствор очищают микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,45 мкм, концентрирование полученного раствора осуществляют ультрафильтрацией на мембране с проницаемостью пор 5 кДа. Концентрированный раствор лиофильно высушивают. Удельная протеолитическая активность не ниже 10000 ед/мг, а удельная активность индивидуальных коллагеназ существенно меньше удельной активности суммарного препарата (EP JV° 0402321, кл. С 12 N 9/64, 1990.12.12).A known method of producing an enzyme preparation having collagenolytic activity, providing for the isolation of an enzyme from hepatopancreas of commercial crabs by tissue homogenization in a buffer solution with a pH of 6-9.5, containing a non-ionic detergent in an amount of 0.1-5% and 0.1-2.0 M alkali metal chloride solution. After separating the precipitate and the lipid layer, the solution is purified by microfiltration on membranes with a pore diameter of 0.45 μm, the concentration of the resulting solution is carried out by ultrafiltration on a membrane with a pore permeability of 5 kDa. The concentrated solution is freeze-dried. The specific proteolytic activity is not lower than 10000 units / mg, and the specific activity of individual collagenases is significantly less than the specific activity of the total preparation (EP JV ° 0402321, class C 12 N 9/64, 1990.12.12).
Указанный способ не обеспечивает получение высокоочищенного препарата - финальная фракция включает широкий диапазон белков с молекулярнымиThe specified method does not provide a highly purified preparation - the final fraction includes a wide range of proteins with molecular
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) массами от 15-1200000 кДа, куда попадают не только коллагеназы ( 20-25,5 кДа), но и большое количество примесных белков, включая ингибиторы.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) masses from 15-1200000 kDa, which includes not only collagenases (20-25.5 kDa), but also a large number of impurity proteins, including inhibitors.
Известен способ получения протеолитического комплекса, включающего коллагеназную активность, из замороженного гепатопанкреаса камчатского краба, гомогенизированного перемешиванием в 0,1-1,0 M растворе хлорида щелочного металла при комнатной температуре. Нерастворимые частицы исходного продукта отделяют последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 10, 0,5 и 0,1 мм. После отделения осадка раствор очищают микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 0,45 мкм, пропускающих белки с молекулярными массами 1200 кДа. Для удаления эмульгированного жира, клеточных обломков и микроорганизмов концентрирование полученного раствора осуществляют ультрафильтрацией на мембране с проницаемостью пор 10 кДа. Концентрированный раствор лиофильно высушивают. Удельная коллагенолитическая активность составляет не менее 2000 ед. Мандл/мг (патент РФ .N°2096456, С 12 N 9/48, 1998.20.11). Указанный способ обеспечивает получение препарата с большим содержанием примесных белков, не относящихся к коллагенолитическим ферментам, что приводит к небольшой удельной коллагеназной активности целевого продукта.A known method of producing a proteolytic complex, including collagenase activity, from frozen hepatopancreas of king crab homogenized by stirring in a 0.1-1.0 M alkali metal chloride solution at room temperature. Insoluble particles of the starting product are separated by sequential filtration through filters with pore sizes of 10, 0.5 and 0.1 mm. After separation of the precipitate, the solution is purified by microfiltration on membranes with a pore diameter of 0.45 μm, passing proteins with molecular weights of 1200 kDa. To remove emulsified fat, cell debris and microorganisms, the concentration of the resulting solution is carried out by ultrafiltration on a membrane with a pore permeability of 10 kDa. The concentrated solution is freeze-dried. The specific collagenolytic activity is at least 2000 units. Mandl / mg (RF patent .N ° 2096456, C 12 N 9/48, 1998.20.11). The specified method provides a preparation with a high content of impurity proteins that are not related to collagenolytic enzymes, which leads to a small specific collagenase activity of the target product.
Известен также способ получения коллагеназы, описанный в патенте РФ N°2039819 (С 12 N 9/48, 1995.20.07). В качестве сырья для получения коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых крабов, выделение проводят при смешивании гомогената гепатопанкреаса крабов, полученного в результате автолитического гидролиза за счет эндопротеаз с раствором хитозана рН 2,5-6,5, а полученный раствор после отделения нерастворимого материала последовательно подвергают 2-х стадийной ультрафильтрации сначала на мембране, отсекающей примесные вещества с молекулярными массами 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с молекулярными массами 30 кДа, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизируют. Удельная активность коллагеназы 9800-11200 ед./мг белка.There is also a known method for producing collagenase described in RF patent N ° 2039819 (C 12 N 9/48, 1995.20.07). As a raw material for the production of collagenase, hepatopancreas of commercial crabs are used, isolation is carried out by mixing the crab hepatopancreas homogenate obtained as a result of autolytic hydrolysis by endoproteases with a solution of chitosan pH 2.5-6.5, and the resulting solution is subsequently subjected to 2- after separation of insoluble material x stage ultrafiltration first on a membrane that cuts off impurities with molecular masses of 100 kDa and more, collecting a solution passing through the membrane, and then on the membrane, jacent substances with molecular weights of 30 kDa, collecting the enzyme does not pass through the membrane. A solution containing enzymatic activity is lyophilized. The specific activity of collagenase is 9800-11200 units / mg protein.
К недостаткам этого способа следует отнести невысокую очистку целевого продукта, что связано с потерями активной коллагеназы, возникающими на стадииThe disadvantages of this method include the low purification of the target product, which is associated with the loss of active collagenase occurring at the stage
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) прибавления кислого раствора хитозана (рН 2,5-5,0), который приводит к частичной инактивации коллагенолитических ферментов, а также потерями коллагеназы при применении мембраны с проницаемостью пор 30 кДа - работами последних лет по выделению генов коллагенолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба, манящего краба, креветок было показано, что их молекулярные массы составляет 21,5-25,0 кДа, поэтому при проницаемости пор мембраны 30 кДа коллагеназы в значительной мере проходят через мембрану и суммарная активность конечного препарата снижается.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) addition of an acidic solution of chitosan (pH 2.5-5.0), which leads to partial inactivation of collagenolytic enzymes, as well as loss of collagenase when using a membrane with a permeability of pores of 30 kDa, by recent works on the isolation of genes of collagenolytic enzymes of hepatopancreas of the king crab, attracting crab shrimp, it was shown that their molecular weight is 21.5-25.0 kDa, therefore, with pore permeability of the membrane 30 kDa, collagenases largely pass through the membrane and the total activity of the final preparation that decreases.
В качестве прототипа выбран способ получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, включающий, гомогенизацию личинок жуков-кожеедов рода Dеrтеstеs в 3-4%-нoм растворе хлорида натрия с добавлением 1-5 мкМ/л азида натрия при рН 6-7, при объемном соотношении биомассы и раствора 1 :2-2,5. Последующее отделение супернатанта, включающего растворенный ферментативный комплексный препарат, обладающий коллагеназной активностью, осуществляют центрифугированием, а очистку супернатанта ведут путем ионообменной хроматографии, при этом сорбцию проводят на ДЕАЕ-сефарозе, уравновешенной МЕS-буфером с добавлением 0,005M хлорида кальция, элюцию активных ферментов проводят трисовым буфером с добавлением хлорида натрия, хлорида кальция и этилового спирта. В заключении проводят диализ элюата в 0,005 M растворе хлорида натрия при 2-60C и концентририрование путем лиофильного высушивания препарата (патент РФ Jfe 2236460, МПК: С 12 N 9/64, опубл. 2004.09.20).As a prototype, the method of obtaining an enzymatic complex preparation with collagenase activity was selected, including homogenization of the larvae of the skin-beetle beetles of the genus Dertestes in a 3-4% solution of sodium chloride with the addition of 1-5 μM / L sodium azide at pH 6-7, at volume ratio of biomass and solution 1: 2-2.5. The subsequent separation of the supernatant, including the dissolved enzymatic complex preparation with collagenase activity, is carried out by centrifugation, and the supernatant is purified by ion exchange chromatography, while sorption is carried out on DEAE-Sepharose, equilibrated with MES buffer with the addition of 0.005 M calcium chloride, trice is eluted with active enzymes buffer with the addition of sodium chloride, calcium chloride and ethyl alcohol. In conclusion, the eluate is dialyzed in a 0.005 M sodium chloride solution at 2-6 ° C and concentrated by freeze drying of the preparation (RF patent Jfe 2236460, IPC: C 12 N 9/64, publ. 2004.09.20).
При выполнении указанного способа, в частности, в процессе центрифугирования часть активных белков исходного сырья утрачивается, кроме этого указанным способом получают конечный продукт, содержащий, помимо высокоактивных белков, большое количество примесных белков, не относящихся к коллагенолитическим ферментам. В результате ферментативный комплексный препарат имеет небольшую удельную коллагеназную активность. В связи с этим для практического использования получаемого препарата его необходимо подвергать сложным и трудоемким обработкам для выделения требуемых высокоактивных белков.When performing this method, in particular, in the centrifugation process, part of the active proteins of the feedstock is lost, in addition, the final product containing, in addition to highly active proteins, a large amount of impurity proteins not related to collagenolytic enzymes is obtained by the specified method. As a result, the enzymatic complex preparation has a small specific collagenase activity. In this regard, for the practical use of the resulting preparation, it must be subjected to complex and laborious treatments to isolate the required highly active proteins.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В основу заявляемого изобретения положена задача путем сокращения потерь ценных белков и сокращения количества неактивных белков, имеющихся в исходном продукте, создать способ получения ферментативного комплексного препарата, имеющего высокую удельную коллагеназную активность при высоком выходе целевого продукта.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The basis of the claimed invention is the task of reducing the loss of valuable proteins and reducing the amount of inactive proteins available in the original product, to create a method for producing an enzymatic complex preparation having a high specific collagenase activity with a high yield of the target product.
Эта задача решается при создании способа получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, включающего образование в водносолевом растворе гомогената биомассы частей личинок жуков рода Dеrтеstеs с последующим отделением супернатанта, включающего растворенный ферментативный комплексный препарат, обладающий активностью, очистку супернатанта путем ионообменной хроматографии с сорбцией и элюцией ферментативного комплексного препарата, последующее обессоливание элюированного ферментативного комплексного препарата и концентрирование целевого продукта, в котором, согласно изобретению, в качестве частей личинок жуков используют их кишечники и головы, образование гомогената биомассы кишечников и голов личинок жуков осуществляют в растворе Рингера, содержащем азид натрия и дитиотриэтол, отделение супернатанта ведут путем декантирования гомогената, а перед очисткой супернатанта осуществляют его гель-фильтрацию на сефадексе с сорбцией и элюцией ферментативного комплексного препарата, который затем подвергают обессоливанию и концентрированию, при этом каждое обессоливание проводят с помощью колоночной хроматографии на сефадексе, и каждое концентрирование ведут путем ультрафильтрации на мембранах с проницаемостью от 5 тысяч до 50 тысяч дальтон.This problem is solved when creating a method for producing an enzymatic complex preparation with collagenase activity, including the formation in a water-salt solution of a biomass homogenate of parts of the larvae of genus Destests, followed by separation of the supernatant, which includes dissolved enzymatic complex preparation, having activity, purification of the supernatant by ion exchange chromatography with sorption and enzymatic complex preparation, subsequent desalination of the eluted enzymatic a multiplex preparation and concentration of the target product, in which, according to the invention, their intestines and heads are used as parts of beetle larvae, the formation of intestinal biomass homogenate and beetle larvae heads is carried out in Ringer's solution containing sodium azide and dithiotriethol, the supernatant is separated by decantation of the homogenate, and before purification of the supernatant, it is gel-filtered on Sephadex with sorption and elution of the enzymatic complex preparation, which is then subjected to desalination and concentration, each desalination is carried out using column chromatography on Sephadex, and each concentration is carried out by ultrafiltration on membranes with permeability from 5 thousand to 50 thousand daltons.
Благодаря заявляемому изобретению с высоким выходом получают ферментативный комплексный препарат, состоящий из высокоактивных белков, способных, в том числе, эффективно гидролизовать гипертрофические, келоидные и гипертрофические келоидные рубцы различной этиологии iп vitrо.Thanks to the claimed invention, an enzymatic complex preparation is obtained in high yield, consisting of highly active proteins, which are able, among other things, to efficiently hydrolyze hypertrophic, keloid and hypertrophic keloid scars of various etiologies in vitro.
Особенность заявляемого способа состоит в том, что в качестве кишечников и голов личинок жуков рода Dеrтеstеs используют кишечники и головы личинок жуков вида Dеrтеstеs frisсhii или вида Dеrтеstеs тасиlаtеs.The peculiarity of the proposed method is that as the intestines and heads of the larvae of beetles of the genus Destests use the intestines and heads of the larvae of beetles of the type Destests frischii or of the species Destestas tacilates.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Другая особенность заявляемого способа состоит в том, что в качестве сефадекса при гель-фильтрации используют сефадекс G-150 в присутствии дитиотриэтола, а в качестве сефадекса при каждом обессоливании используют сефадекс G-25.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Another feature of the proposed method is that Sephadex G-150 is used as gel filtration in the presence of dithiotriethol, and Sephadex G-25 is used as a Sephadex for each desalination.
Согласно заявляемому изобретению, целесообразно образование гомогената биомассы осуществлять при объемном соотношении биомассы и раствора Рингера, равном 1 : (0,5- 5,0).According to the claimed invention, it is advisable to form a biomass homogenate with a volume ratio of biomass and Ringer's solution equal to 1: (0.5-5.0).
Особенность заявляемого способа состоит в том, что на каждой стадии осуществления способа определяют активность ферментативного комплексного препарата по методу Мандла и по гидролизу синтетического хромогенного субстрата карбобензоксиаланилаланилпролин-и-нитроанилида.A feature of the proposed method is that at each stage of the implementation of the method, the activity of the enzymatic complex preparation is determined by the Mandle method and by the hydrolysis of the synthetic chromogenic substrate of carbobenzoxyalanylalanylproline-i-nitroanilide.
Другие особенности и преимущества заявляемого изобретения станут ясны из последующего подробного описания способа получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, и примеров осуществления этого способа.Other features and advantages of the claimed invention will become apparent from the following detailed description of a method for producing an enzymatic complex preparation having collagenase activity, and examples of the implementation of this method.
Сущность заявляемого способа получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, заключается в следующем.The essence of the proposed method for producing an enzymatic complex preparation with collagenase activity is as follows.
Лучший вариант осуществления изобретенияThe best embodiment of the invention
В качестве исходного продукта, содержащего комплекс белков с коллагеназной активностью, используют гомогенат биомассы частей личинок жуков рода Dеrтеstеs, а точнее гомогенат биомассы отделённых кишечников и голов личинок жуков видов Dеrтеstеs fήsсhii и Dеrтеstеs тасиlаtеs, что обеспечивает исходный продукт более широким спектром ферментов.As the initial product containing a complex of proteins with collagenase activity, the biomass homogenate of parts of larvae of beetles of the genus Destsestes is used, and more precisely, the homogenate of the biomass of separated intestines and heads of the larvae of beetles of the species Destests fesciiii and Destests tacylates, which provides a wider spectrum of the initial product.
Пищеварительные трубки и головы личинок жуков видов Dеrтеstеs frisсhii и Dеrтеstеs тасиlаtеs, то есть биомассу гомогенизируют, согласно изобретению, в растворе Рингера, содержащем азид натрия и дитиотриэтол, при объёмном соотношении биомассы и раствора 1 : (0,5-5,0), соответственно, обеспечивая солюбилизацию водорастворимых белков. При объёмном соотношении биомассы и раствора ниже 1 : 0,5 активные белки в растворе практически отсутствуют - наблюдают только следовые количества, при объёмном соотношении биомассы и раствора выше 1 : 5,0 препарат невозможно выделить, так как при хроматографии детектировать белки не представляется возможным.The digestive tubes and heads of the larvae of beetles of the species Destests friiсhii and Dertestes tacilates, i.e., the biomass is homogenized, according to the invention, in Ringer's solution containing sodium azide and dithiotriethol, with a volume ratio of biomass and solution of 1: (0.5-5.0), respectively providing solubilization of water-soluble proteins. With a volume ratio of biomass and solution below 1: 0.5, active proteins are practically absent in the solution - only trace amounts are observed; with a volume ratio of biomass and solution above 1: 5.0, the drug cannot be isolated, since chromatography does not make it possible to detect proteins.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Исследования показали, что гомогенизирование в растворе Рингера в присутствии дитиотриэтола обеспечивает повышение активности белков, содержащихся в биомассе.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Studies have shown that homogenization in Ringer's solution in the presence of dithiotriethol provides an increase in the activity of proteins contained in biomass.
Полученный гомогенат декантируют в течение, например, 3 часов для отделения супернатанта, включающего растворенный ферментативный комплексный препарат, обладающий активностью. Отделение супернатанта путем декантирования позволяет сохранить в супернатанте то количество белков, которое ранее при центрифугировании гомогената выпадало в осадок.The resulting homogenate is decanted for, for example, 3 hours to separate the supernatant, including the dissolved enzymatic complex preparation having activity. Separation of the supernatant by decantation allows you to save in the supernatant the amount of proteins that previously precipitated by centrifugation of the homogenate.
Особенность заявляемого изобретения состоит в том, что после каждого этапа заявляемого способа определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-/?NA, ход гидролиза определяют спектрофотометрически. Активность измеряют по изменению поглощения A4I0.A feature of the claimed invention is that after each step of the proposed method, the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pro - /? NA hydrolysis, the hydrolysis progress is determined spectrophotometrically. Activity is measured by the change in absorption of A 4 I 0 .
Коллагеназная активность в единицах мандла: 1 единица Мандла эквивалентна активности, освобождающей 1 μmоl аминокислот в коллагене, определяющихся как лейцин, при инкубации фермента с коллагеном 5 часов при 37 0C, рН 7.5.Collagenase activity in units of mandla: 1 Mandla unit is equivalent to activity releasing 1 μmol of amino acids in collagen, defined as leucine, when the enzyme with collagen is incubated for 5 hours at 37 ° C, pH 7.5.
Для исследования используют коллаген первого типа хвостов крыс по методике Мандла с колориметрическим измерением результатов по нингидриновому методу Мооrе апd Stеiп.For the study, collagen of the first type of rat tails was used according to the Mandle method with colorimetric measurement of the results according to the Moore ap Stein method.
Таким образом, согласно изобретению, после отделения супернатанта указанным образом определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.Thus, according to the invention, after separation of the supernatant, the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined in this way.
При получении положительных результатов активности ферментативного комплексного препарата, находящегося в растворе, согласно изобретению, осуществляют rельфильтрацию супернатанта на сефадексе, в том числе на сефадексе G- 150. Эта стадия заявляемого способа является первым этапом очистки ферментативного комплексного препарата. Целесообразно rельфильтрацию супернатанта на сефадексе осуществлять в присутствии дитиотриэтола.Upon receipt of the positive results of the activity of the enzymatic complex preparation in solution according to the invention, the supernatant is filtered by Sephadex, including Sephadex G-150. This stage of the proposed method is the first step in the purification of the enzymatic complex preparation. It is advisable to filter the supernatant on Sephadex in the presence of dithiotriethol.
Исследования показали, что благодаря указанному приему обеспечено отделение от ферментативного комплексного препарата веществ, имеющих молекулярную массу, не соответствующую активным ферментам. Таким образомStudies have shown that, thanks to this technique, substances having a molecular weight not corresponding to the active enzymes are separated from the enzymatic complex preparation. In this way
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) найдена возможность выделить по значениям молекулярных масс в ферментативном комплексном препарате активные белки.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) found the possibility of isolating active proteins by the values of molecular weights in the enzymatic complex preparation.
Как указано выше, по завершению гельфильтрации супернатанта определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.As indicated above, upon completion of gel filtration of the supernatant, the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined.
На данном этапе заявляемого способа выход ферментного препарата по активности составляет порядка 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА; порядка 85% - при измерении активности по Мандлу, препарат переносят на следующую стадию заявляемого способа.At this stage of the proposed method, the yield of enzyme preparation in activity is about 70% when measuring enzymatic activity in terms of the efficiency of Z-Ala-Ala-Rro-pNA hydrolysis; about 85% - when measuring activity according to Mandl, the drug is transferred to the next stage of the proposed method.
Для удаления из очищенного ферментного комплексного препарата солей осуществляют, согласно заявляемому способу, обессоливание с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс, преимущественно сефадекс G-25. Указанный прием обеспечивает получение в более короткие сроки ферментного комплексного препарата более высокого качества.To remove salts from the purified enzyme complex preparation of the salts, according to the claimed method, desalination is carried out using column chromatography, where Sephadex, mainly Sephadex G-25, is used as a carrier. The specified method ensures the receipt of a shorter time enzyme complex preparation of higher quality.
Обессоленный ферментный комплексный препарат далее подвергают концентрированию путем, согласно заявляемому способу, ультрафильтрации, например, на мембранах с проницаемостью от 5 тысяч до 50 тысяч дальтон, выпускаемых, например, фирмой "Мilliроr", при давлении не более 3 атм и температуре +40C.The desalted enzyme complex preparation is then subjected to concentration by, according to the claimed method, ultrafiltration, for example, on membranes with permeability from 5 thousand to 50 thousand daltons, manufactured, for example, by Milliror, at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C .
Далее проводят второй этап очистки ферментативного комплексного препарата, осуществляя ионообменную хроматографию преимущественно на N'- 1 ,2-диэтилaминoэтил-ceфapoзe в присутствии дитиотриэтола.Next, the second stage of purification of the enzymatic complex preparation is carried out, carrying out ion-exchange chromatography mainly on N'-1, 2-diethylaminoethyl-sephaprose in the presence of dithiotriethol.
Элюцию сорбированного ферментативного комплексного препарата производят в градиенте рН со сменой буферной системы: О, IM аммоний-ацетатный буфер, рН 6,4 - 0,05 M трис-НСl, рН 8,0, 2,5 мМ CaCl2, затем в двойном градиенте NaCl 0-1,5 M , этанол 0- 20%.The sorbed enzymatic complex preparation is eluted in a pH gradient with a change in the buffer system: O, IM ammonium acetate buffer, pH 6.4-0.05 M Tris-Hcl, pH 8.0, 2.5 mM CaCl 2, then double gradient of NaCl 0-1.5 M, ethanol 0-20%.
Как указано выше, по завершению ионообменной хроматографии и элюции определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.As indicated above, upon completion of ion exchange chromatography and elution, the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined.
На данном этапе способа выход ферментного комплексного препарата по активности составляет порядка 96 % при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА; порядка 134% - при измеренииAt this stage of the method, the yield of the enzyme complex preparation by activity is about 96% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of Z-Ala-Ala-Rro-pNA hydrolysis; about 134% - when measured
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) активности по Мандлу, препарат переносят на следующую стадию заявляемого способа.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) activity according to Mandl, the drug is transferred to the next stage of the proposed method.
Для удаления из очищенного ферментного комплексного препарата солей и спирта осуществляют, согласно заявляемому способу, обессоливание с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс, преимущественно сефадекс G-25. Указанный прием обеспечивает в более короткие сроки получение более высокого качества ферментного комплексного препарата.To remove salts and alcohol from the purified enzyme complex preparation, according to the claimed method, desalination is carried out using column chromatography, where Sephadex, mainly Sephadex G-25, is used as a carrier. The specified method provides in a shorter time obtaining a higher quality enzyme complex preparation.
Обессоленный ферментный комплексный препарат далее подвергают концентрированию путем, согласно заявляемому способу, ультрафильтрации, например, на мембранах с проницаемостью от 5 тысяч до 50 тысяч дальтон, выпускаемых, например, фирмой "Мilliрог", при давлении не более 3 атм и температуре +40C.The desalted enzyme complex preparation is then subjected to concentration by, according to the claimed method, ultrafiltration, for example, on membranes with permeability from 5 thousand to 50 thousand daltons, manufactured, for example, by Millirog, at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C .
При использовании ультрафильрации для концентрирования отсутствуют используемые стадии замораживания и лиофилизации, при которых коллагеназная активность целевого продукта значительно снижается.When using ultrafiltration for concentration, there are no used stages of freezing and lyophilization, in which the collagenase activity of the target product is significantly reduced.
Таким образом, заявляемый способ позволяет с высоким выходом получать ферментативный комплексный препарат, состоящий только из высокоактивных белков, что обеспечивает более широкие возможности применения этого препарата, в том числе, для эффективного воздействия на гипертрофические, келоидные и гипертрофические келоидные рубцы различной этиологии. Получаемый, согласно заявляемому способу, очищенный ферментный комплексный препарат обладает высокой коллагенолитической активностью - выход по активности (определенный методом Мандла) составляет ПО %. Удельная активность ферментного комплексного препарата составляет 5#10 единиц Мандл/мг белка.Thus, the claimed method allows to obtain in high yield an enzymatic complex preparation consisting only of highly active proteins, which provides wider possibilities for the use of this drug, including for effective action on hypertrophic, keloid and hypertrophic keloid scars of various etiologies. Obtained, according to the claimed method, the purified enzyme complex preparation has high collagenolytic activity — the activity yield (determined by the Mandl method) is PO%. The specific activity of the enzyme complex preparation is 5 # 10 units of Mandl / mg protein.
Для лучшего понимания данного изобретения приводятся следующие примеры его конкретного выполнения. Пример 1.For a better understanding of the present invention, the following examples of its specific implementation. Example 1
Отделённые кишечники и головы 1000 личинок жуков вида Dеrтеstеs frisсhii растирают в фарфоровой ступке фарфоровым пестиком с целью солюбилизации водорастворимых белков, полученную биомассу гомогенизируют вSeparate intestines and heads of 1000 larvae of Destest frischii beetles are ground in a porcelain mortar with a porcelain pestle in order to solubilize water-soluble proteins, the resulting biomass is homogenized in
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) растворе Рингера (содержащем азид натрия и дитиотриэтол) при объёмном соотношении биомассы и раствора 1 : 1 в течение 20 мин при температуреSUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Ringer’s solution (containing sodium azide and dithiotriethol) at a volume ratio of biomass and solution of 1: 1 for 20 minutes at a temperature
+40C.+4 0 C.
Полученный гомогенат декантируют при температуре +4 0C в течение часов. Надосадочную жидкость - супернатант объёмом 155 мл, образовавшийся в результате осаждения твёрдых частиц, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Получают 150 мл супернатанта с концентрацией ферментов, составляющей 9,2-9,5 мг/мл.The resulting homogenate is decanted at a temperature of +4 0 C for hours. The supernatant is a 155 ml supernatant resulting from the deposition of solid particles, filtered through a filter with a pore diameter of 0.2 μm. 150 ml of supernatant with an enzyme concentration of 9.2-9.5 mg / ml are obtained.
Определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата в полученном супернатанте. Для этого определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА, ход гидролиза определяют спектрофотометрически. Активность измеряют по изменению поглощения A4I0.The activity of the dissolved enzymatic complex preparation in the resulting supernatant is determined. For this, the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis, the hydrolysis progress is determined spectrophotometrically. Activity is measured by the change in absorption of A 4I0 .
Коллагеназная активность в единицах мандла: 1 единица Мандла эквивалентна активности, освобождающей 1 μтоl аминокислот в коллагене, определяющихся как лейцин, при инкубации фермента с коллагеном 5 часов при 37 °C, pH 7.5.Collagenase activity in units of mandla: 1 Mandla unit is equivalent to activity releasing 1 μl of amino acids in collagen, defined as leucine, when the enzyme with collagen is incubated for 5 hours at 37 ° C, pH 7.5.
Для исследования используют коллаген первого типа хвостов крыс по методике Мандла с колориметрическим измерением результатов по нингидриновому методу Мооrе апd Stеiп.For the study, collagen of the first type of rat tails was used according to the Mandle method with colorimetric measurement of the results according to the Moore ap Stein method.
Далее путем гельфильтрации осуществляют первый этап очистки активного ферментативного комплексного препарата в полученном супернатанте. Для этого по 10 мл полученного супернатанта наносят на хроматографическую колонку размером 2x80 см, содержащую сефадекс G- 150, уравновешенный 0,1 M аммоний- ацетатным буфером, рН 6,4, содержащим дитиотриэтол в следовых количествах.Then, by gel filtration, the first stage of purification of the active enzymatic complex preparation in the obtained supernatant is carried out. For this, 10 ml of the obtained supernatant is applied to a 2x80 cm chromatographic column containing Sephadex G-150, equilibrated with 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4, containing trace amounts of dithiotriethol.
В результате осуществленной очистки выход ферментного препарата по активности составляет порядка 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА; порядка 85% - при измерении активности по Мандлу.As a result of the purification, the yield of the enzyme preparation by activity is about 70% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis; about 85% - when measuring activity according to Mandl.
Активные фракции элюата объединяют, суммарно получая 85-95 мл элюата, содержащего ферментативный комплексный препарат на основе белков сThe active fractions of the eluate are combined, in total receiving 85-95 ml of the eluate containing an enzymatic complex preparation based on proteins with
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) определенными молекулярными массами. Концентрация белков составляет 0,3-0,5 мг/мл.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) specific molecular weights. The concentration of proteins is 0.3-0.5 mg / ml.
Элюат, содержащий ферментативный комплексный препарат, очищенный путем гель-фильрации на сефадексе G- 150 от продуктов, имеющих несоответствующую молекулярную массу, далее порционно обессоливают с помощью колоночной хроматографии, где используют сефадекс G-25, затем концентрируют ультрафильтрацией, для чего препарат пропускают через мембраны фирмы "Мilliроr" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 3 атм и температуре +40C.The eluate containing the enzymatic complex preparation purified by gel filtration on Sephadex G-150 from products having an inappropriate molecular weight is then desalted portionwise using column chromatography using Sephadex G-25, then concentrated by ultrafiltration, for which the drug is passed through membranes Millirr company with a permeability of 10,000 daltons at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C.
В результате получают 135 мл ферментативного комплексного препарата с концентрацией фермента 3-5 мг/мл.The result is 135 ml of enzymatic complex preparation with an enzyme concentration of 3-5 mg / ml.
Осуществляют хроматографическую очистку на ионообменном сорбенте полученного раствора, содержащего ферментативный комплексный препарат. Для этого по 10 мл полученного раствора наносят на колонку размером 1,5 x25 см, содержащей N'-l,2-диэтилaминoэтил-ceфapoзy, уравновешенную 0,1 M аммоний- ацетатным буфером, рН 6,4.Chromatographic purification on the ion-exchange sorbent of the resulting solution containing the enzymatic complex preparation is carried out. For this, 10 ml of the resulting solution is applied to a 1.5 x 25 cm column containing N'-l, 2-diethylaminoethyl-cepharose balanced with 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4.
Элюцию проводят в градиенте рН со сменой буферной системы: 0,1M аммоний-ацетатный буфер, рН 6,4 - 0,05 M трис-НСl, рН 8,0, 2,5 мМ CaCl2, затем в двойном градиенте NaCl 0-1,5 M , этанол 0- 20% в присутствии дитиотриэтола.The elution is carried out in a pH gradient with a change in the buffer system: 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4 - 0.05 M Tris-Hcl, pH 8.0, 2.5 mm CaCl 2, then in a double gradient of NaCl 0- 1.5 M, ethanol 0-20% in the presence of dithiotriethol.
По завершению ионообменной хроматографии и элюции определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.Upon completion of ion exchange chromatography and elution, the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined.
Выход ферментного комплексного препарата по активности составляет 96 % при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-AIa- Аlа-Рrо-рNА; 134% - при измерении активности по Мандлу. После этого осуществляют удаление из растворенного ферментативного комплексного препарата солей и спирта. Для этого растворенный ферментативный комплексный препарат порционно обессоливают с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс G-25. после чего концентрируют ультрафильтрацией, для чего препарат пропускаю через мембраны фирмы "Мilliроr" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 3 атм и температуре +40C.The yield of the enzyme complex preparation by activity is 96% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of the hydrolysis of Z-AIa-Ala-Pro-pNA; 134% - when measuring activity according to Mandl. After that, the removal of salts and alcohol from the dissolved enzymatic complex preparation is carried out. For this, the dissolved enzymatic complex preparation is desalted in portions using column chromatography, where Sephadex G-25 is used as a carrier. after which it is concentrated by ultrafiltration, for which purpose I pass the drug through a Milliror membrane with a permeability of 10,000 daltons at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В результате получают 10 мл комплексного ферментного препарата с концентрацией белка 0,5-1,0 мг/мл.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The result is 10 ml of a complex enzyme preparation with a protein concentration of 0.5-1.0 mg / ml.
Выход комплексного ферментного препарата по активности составляет 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-AIa- Ala-Pro-/?NA; 85% - при измерении активности по Мандлу.The yield of a complex enzyme preparation by activity is 70% when measuring enzymatic activity by the efficiency of Z-AIa-Ala-Pro hydrolysis - /? NA; 85% - when measuring activity according to Mandl.
Удельная активность полученного комплексного ферментного препарата составляет 0,95 ед. акт./мг белка при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА, 450 хlО3 ед. Мандла/ мг белка при измерении активности по Мандлу.The specific activity of the obtained complex enzyme preparation is 0.95 units. act./ mg protein when measuring enzymatic activity by the efficiency of the hydrolysis of Z-Ala-Ala-Pr-pNA, 450 xlO 3 units. Mandla / mg protein when measuring activity according to Mandla.
Пример 2.Example 2
Отделённые кишечники и головы 1500 личинок жуков вида Dеrтеstеs тасиlаtеs растирают в фарфоровой ступке фарфоровым пестиком с целью солюбилизации водорастворимых белков, полученную биомассу гомогенизируют в растворе Рингера (содержащем азид натрия и дитиотриэтол) при объёмном соотношении биомассы и раствора 1 : 1 в течение 20 мин при температуре +40C.Separated intestines and heads of 1,500 larvae of Destestas tacilates beetles are ground in a porcelain mortar with a porcelain pestle in order to solubilize water-soluble proteins, the resulting biomass is homogenized in Ringer's solution (containing sodium azide and dithiotriethol) at a volume ratio of biomass of 1 min at a temperature of 20 min for 1 min: 1 for 1 min: 1 solution: +4 0 C.
Полученный гомогенат декантируют при температуре +4 С в течение 3 часов. Надосадочную жидкость - супернатант объёмом 230 мл, образовавшийся в результате осаждения твёрдых частиц, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Получают 220 мл супернатанта с концентрацией ферментов, составляющей 2,5-3,0 мг/мл.The resulting homogenate is decanted at a temperature of +4 C for 3 hours. The supernatant is a supernatant with a volume of 230 ml, formed as a result of the deposition of solid particles, filtered through a filter with a pore diameter of 0.2 μm. 220 ml of supernatant are obtained with an enzyme concentration of 2.5-3.0 mg / ml.
Определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата в полученном супернатанте. Для этого определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА, ход гидролиза определяют спектрофотометрически. Активность измеряют по изменению поглощения A4I0.The activity of the dissolved enzymatic complex preparation in the resulting supernatant is determined. For this, the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis, the hydrolysis progress is determined spectrophotometrically. Activity is measured by the change in absorption of A 4I0 .
Коллагеназная активность в единицах мандла: 1 единица Мандла эквивалентна активности, освобождающей 1 μmоl аминокислот в коллагене, определяющихся как лейцин, при инкубации фермента с коллагеном 5 часов при 37 °C, рН 7.5.Collagenase activity in units of mandla: 1 Mandla unit is equivalent to activity releasing 1 μmol of amino acids in collagen, defined as leucine, when the enzyme with collagen is incubated for 5 hours at 37 ° C, pH 7.5.
Для исследования используют коллаген первого типа хвостов крыс по методике Мандла с колориметрическим измерением результатов по нингидриновому методу Мооrе апdStеiп.For the study, collagen of the first type of rat tails is used according to the Mandle method with colorimetric measurement of the results according to the Moore apdStein ninhydrin method.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Далее путем гельфильтрации осуществляют первый этап очистки активного ферментативного комплексного препарата в полученном супернатанте. Для этого по 10 мл полученного супернатанта наносят на хроматографическую колонку размером 2x80 см, содержащую сефадекс G- 150, уравновешенный 0,1 M аммоний-ацетатным буфером, рН 6,4, содержащий дитиотриэтол в следовых количествах.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Then, by gel filtration, the first stage of purification of the active enzymatic complex preparation in the obtained supernatant is carried out. For this, 10 ml of the obtained supernatant is applied to a 2x80 cm chromatographic column containing Sephadex G-150, equilibrated with 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4, containing trace amounts of dithiotriethol.
В результате осуществленной очистки выход ферментного препарата по активности составляет порядка 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА; порядка 85% - при измерении активности по Мандлу.As a result of the purification, the yield of the enzyme preparation by activity is about 70% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis; about 85% - when measuring activity according to Mandl.
Активные фракции элюата объединяют, суммарно получая 70-80 мл элюата, содержащего ферментативный комплексный препарат с белками определённых молекулярных масс. Концентрация белков составляет 0,1-0,2 мг/мл.The active fractions of the eluate are combined, in total receiving 70-80 ml of the eluate containing the enzymatic complex preparation with proteins of certain molecular weights. The concentration of proteins is 0.1-0.2 mg / ml.
Элюат, содержащий ферментативный комплексный препарат, очищенный путем гель-фильрации на сефадексе G- 150 от продуктов, имеющих несоответствующую молекулярную массу, далее порционно обессоливают с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс G-25, после чего концентрируют ультрафильтрацией, для чего препарат пропускают через на мембраны фирмы "Мilliроr" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 3 атм и температуре +40C.The eluate containing the enzymatic complex preparation, purified by gel filtration on Sephadex G-150 from products having an inappropriate molecular weight, is then desalted portionwise using column chromatography, where Sephadex G-25 is used as a carrier, and then concentrated by ultrafiltration, for which the drug is passed through to the Milliror membrane with a permeability of 10,000 daltons at a pressure of not more than 3 atm and a temperature of +4 0 C.
В результате получают 150 мл ферментативного комплексного препарата с концентрацией белка 1-2 мг/мл.The result is 150 ml of enzymatic complex preparation with a protein concentration of 1-2 mg / ml.
Осуществляют второй этап очистки - проводят хроматографическую очистку на ионообменном сорбенте полученного раствора, содержащего ферментативный комплексный препарат. Для этого по 10 мл полученного раствора наносят на колонку размером 1,5 x25 см, содержащей N'- 1,2- диэтиламиноэтил- сефарозу, уравновешенную 0,1 M аммоний-ацетатным буфером, рН 6,4.The second stage of purification is carried out - chromatographic purification is carried out on the ion-exchange sorbent of the resulting solution containing the enzymatic complex preparation. For this, 10 ml of the resulting solution is applied to a 1.5 x 25 cm column containing N'-1,2-diethylaminoethyl-sepharose, balanced with 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4.
Элюцию проводят в градиенте рН со сменой буферной системы: 0,1 M аммоний-ацетатный буфер, рН 6,4 - 0,05 M трис-НСl, рН 8,0, 2,5 мМ CaCl2, затем в двойном градиенте NaCl 0-1,5 M , этанол 0- 20% в присутствии дитиотриэтола.The elution is carried out in a pH gradient with a change in the buffer system: 0.1 M ammonium acetate buffer, pH 6.4 - 0.05 M Tris-Hcl, pH 8.0, 2.5 mm CaCl 2, then in a double gradient of NaCl 0 -1.5 M, ethanol 0-20% in the presence of dithiotriethol.
По завершению ионообменной хроматографии и элюции определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.Upon completion of ion exchange chromatography and elution, the activity of the dissolved enzymatic complex preparation is determined.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) На этом этапе выход ферментного комплексного препарата по активности составляет 96 % при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-AIa- Аlа-Рrо-рNА; 134% - при измерении активности по Мандлу. Далее осуществляют удаление из растворенного ферментативного комплексного препарата солей и спирта. Для этого растворенный ферментативный комплексный препарат порционно обессоливают с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс G-25., после чего концентрируют ультрафильтрацией, для чего препарат пропускают через мембраны фирмы "Мilliроr" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 3 атм и температуре +40C.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) At this stage, the yield of the enzyme complex preparation by activity is 96% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of the hydrolysis of Z-AIa- Ala-Pro-pNA; 134% - when measuring activity according to Mandl. Then, salts and alcohol are removed from the dissolved enzymatic complex preparation. To do this, the dissolved enzymatic complex preparation is desalted in portions using column chromatography, where Sephadex G-25 is used as a carrier, and then concentrated by ultrafiltration, for which the preparation is passed through Milliror membranes with a permeability of 10,000 daltons at a pressure of not more than 3 atm and temperature +4 0 C.
В результате получают 15 мл комплексного ферментного препарата с концентрацией белка 0,3- 0,5 мг/мл.The result is 15 ml of a complex enzyme preparation with a protein concentration of 0.3-0.5 mg / ml.
Выход комплексного ферментного препарата по активности составляет 60% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-AIa- Аlа-Рго-рNА; 75% - при измерении активности по Мандлу. Удельная активность полученного комплексного ферментного препарата составляет 0,15 ед. акт./мг белка при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z- Аlа-Аlа-Рrо-рNА, 50 хlО3 ед. Мандла/ мг белка при измерении активности по Мандлу.The yield of a complex enzyme preparation by activity is 60% when measuring enzymatic activity by the efficiency of Z-AIa-Ala-Progo-pNA hydrolysis; 75% - when measuring activity according to Mandl. The specific activity of the obtained complex enzyme preparation is 0.15 units. act./mg of protein when measuring enzymatic activity by the efficiency of the hydrolysis of Z-Ala-Ala-Rro-pNA, 50 xlO 3 units. Mandla / mg protein when measuring activity according to Mandla.
Пример 3.Example 3
Получение комплексного ферментного препарата осуществляют в условиях, аналогичных уазанным в примере 1, однако подготовленную биомассу кишечников и голов личинок жуков вида Dеrтеstеs frisсhii гомогенизируют в растворе Рингера (содержащем азид натрия и дитиотриэтол) при объёмном соотношении биомассы и раствора 1: 0,5.The preparation of a complex enzyme preparation is carried out under conditions similar to those described in Example 1, however, the prepared biomass of the intestines and heads of the larvae of beetles of the species Destest frischii are homogenized in Ringer's solution (containing sodium azide and dithiotriethol) with a volume ratio of 1: 0.5 of the biomass and solution.
Выход полученного комплексного ферментного препарата по активности составляет 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА; 85% - при измерении активности по Мандлу.The yield of the obtained complex enzyme preparation by activity is 70% when measuring the enzymatic activity by the efficiency of Z-Ala-Ala-Pr-pNA hydrolysis; 85% - when measuring activity according to Mandl.
Удельная активность полученного комплексного ферментного препарата составляет 0,95 ед. акт./мг белка при измерении ферментативной активности поThe specific activity of the obtained complex enzyme preparation is 0.95 units. act. / mg protein when measuring enzymatic activity according to
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА, 450 хlО3 ед. Мандла/ мг белка при измерении активности по Мандлу.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) the efficiency of the hydrolysis of Z-Ala-Ala-Rro-pNA, 450 xlO 3 units Mandla / mg protein when measuring activity according to Mandla.
Пример 4Example 4
Получение комплексного ферментного препарата осуществляют в условиях, аналогичных указанным в примере 2, однако подготовленную биомассу кишечников и голов личинок жуков вида Dеrтеstеs тасиlаtеs гомогенизируют в растворе Рингера (содержащем азид натрия и дитиотриэтол) при объёмном соотношении биомассы и раствора 1: 5,0.The preparation of a complex enzyme preparation is carried out under conditions similar to those described in Example 2, however, the prepared biomass of intestines and heads of beetle larvae of the species Destestas tacilates is homogenized in Ringer's solution (containing sodium azide and dithiotriethol) at a volume ratio of biomass and solution of 1: 5.0.
Выход полученного комплексного ферментного препарата по активности составляет 60% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рго-рNА; 75% - при измерении активности по Мандлу.The yield of the obtained complex enzyme preparation by activity is 60% when measuring the enzymatic activity by the hydrolysis efficiency of Z-Ala-Ala-Pro-pNA; 75% - when measuring activity according to Mandl.
Удельная активность полученного комплексного ферментного препарата составляет 0,15 ед. акт./мг белка при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Аlа-Аlа-Рrо-рNА, 50 хlО ед. Мандла/ мг белка при измерении активности по Мандлу.The specific activity of the obtained complex enzyme preparation is 0.15 units. act./ mg protein when measuring enzymatic activity by the efficiency of the hydrolysis of Z-Ala-Ala-Pr-pNA, 50 xl units. Mandla / mg protein when measuring activity according to Mandla.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Изобретение найдет применение, в частности, в медицине при использовании ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, для лечения ожогов, гнойно-трофических язв, послеоперационных рубцов.The invention will find application, in particular, in medicine, using an enzymatic complex preparation with collagenase activity for the treatment of burns, purulent-trophic ulcers, postoperative scars.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

Claims

Формула изобретения Claim
1. Способ получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, включающий образование в водносолевом растворе гомогената биомассы частей личинок жуков рода Dеrтеstеs с последующим отделением супернатанта, включающего растворенный ферментативный комплексный препарат, обладающий активностью, очистку супернатанта путем ионообменной хроматографии с сорбцией и элюцией ферментативного комплексного препарата, последующее обессоливание элюированного ферментативного комплексного препарата и концентрирование целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве частей личинок жуков используют их кишечники и головы, образование гомогената биомассы кишечников и голов личинок жуков осуществляют в растворе Рингера, содержащем азид натрия и дитиотриэтол, отделение супернатанта ведут путем декантирования гомогената, а перед очисткой супернатанта осуществляют его гель-фильтрацию на сефадексе с сорбцией и элюцией ферментативного комплексного препарата, который затем подвергают обессоливанию и концентрированию, при этом каждое обессоливание проводят с помощью колоночной хроматографии на сефадексе, и каждое концентрирование ведут путем ультрафильтрации на мембранах с проницаемостью от 5 тысяч до 50 тысяч дальтон.1. A method for producing an enzymatic complex preparation with collagenase activity, comprising the formation in a water-salt solution of a biomass homogenate of parts of larvae of genus Dertestes beetles, followed by separation of a supernatant comprising a dissolved enzymatic complex preparation with activity, purification of the supernatant by ion-exchange chromatography with sorption and elution of the enzyme , subsequent desalination of the eluted enzymatic complex preparation and concentrate The target product is treated with the fact that their intestines and heads are used as parts of beetle larvae, formation of intestinal biomass homogenate and heads of beetle larvae is carried out in Ringer's solution containing sodium azide and dithiotriethol, separation supernatant is carried out by decanting the homogenate, and before purification of the supernatant, it is gel-filtered on Sephadex with sorption and elution of an enzymatic complex preparation, which is then subjected to desalination and concentration, each Seeding is carried out using column chromatography on Sephadex, and each concentration is carried out by ultrafiltration on membranes with permeability from 5 thousand to 50 thousand daltons.
2. Способ по п.l, отличающийся тем, что в качестве кишечников и голов личинок жуков рода Dеrтеstеs используют кишечники и головы личинок жуков вида Dеrтеstеs frisсhii или вида Dеrтеstеs тасиlаtеs.2. The method according to claim 1, characterized in that the intestines and heads of the larvae of beetles of the species Dertests frischii or the species Dertestes tacilates are used as the intestines and heads of the larvae of beetles of the genus Dertests.
3. Способ по п.l, отличающийся тем, что в качестве сефадекса при гель- фильтрации используют сефадекс G- 150 в присутствии дитиотриэтола^ 3. The method according to claim 1, characterized in that Sephadex G-150 is used as a Sephadex in gel filtration in the presence of dithiotriethol ^
4. Способ по п.l, отличающийся тем, что в качестве сефадекса при каждом обессоливании используют сефадекс G-25.4. The method according to claim 1, characterized in that Sephadex G-25 is used as a Sephadex at each desalination.
5. Способ по п.l, отличающийся тем, что образование гомогената осуществляют при объемном соотношении биомассы и раствора Рингера, равном 1 : (0,5- 5,0).5. The method according to claim 1, characterized in that the formation of homogenate is carried out at a volume ratio of biomass and Ringer's solution equal to 1: (0.5-5.0).
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
6. Способ по п.l, отличающийся тем, что на каждой стадии осуществления способа определяют активность ферментативного комплексного препарата по методу Мандла и по гидролизу синтетического хромагенного субстрата карбобензоксиаланилаланилпропил-пара-нитроанилида.6. The method according to p. 1, characterized in that at each stage of the method, the activity of the enzymatic complex preparation is determined by the method of Mandle and by hydrolysis of a synthetic chromogenic substrate of carbobenzoxyalanylalylpropyl-para-nitroanilide.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
PCT/RU2008/000426 2008-06-09 2008-07-01 Method for producing a combined preparation exhibiting collagenase activity WO2009154502A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008122834 2008-06-09
RU2008122834/13A RU2412997C2 (en) 2008-06-09 2008-06-09 Method of producing enzymatic complex preparation having collagenase activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009154502A1 true WO2009154502A1 (en) 2009-12-23

Family

ID=41434265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2008/000426 WO2009154502A1 (en) 2008-06-09 2008-07-01 Method for producing a combined preparation exhibiting collagenase activity

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2412997C2 (en)
WO (1) WO2009154502A1 (en)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2008353C1 (en) * 1991-08-05 1994-02-28 Научно-производственное предприятие "Тринита" Method of collagenase preparation producing
RU2039819C1 (en) * 1990-03-29 1995-07-20 Александр Алексеевич Артюков Method for production of collagenase
RU2096456C1 (en) * 1996-11-10 1997-11-20 Вадим Леонидович Стадников Method of preparing enzyme preparation showing collagenolytic activity
RU2236460C1 (en) * 2003-05-20 2004-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-производственное предприятие "Тринита" Method for preparing collagenase

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2039819C1 (en) * 1990-03-29 1995-07-20 Александр Алексеевич Артюков Method for production of collagenase
RU2008353C1 (en) * 1991-08-05 1994-02-28 Научно-производственное предприятие "Тринита" Method of collagenase preparation producing
RU2096456C1 (en) * 1996-11-10 1997-11-20 Вадим Леонидович Стадников Method of preparing enzyme preparation showing collagenolytic activity
RU2236460C1 (en) * 2003-05-20 2004-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-производственное предприятие "Тринита" Method for preparing collagenase

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
I.M. GRACHEVA ET AL., TEKHNOLOGIYA FERMENTNYKH PREPARATOV., 2000, MOSCOW, pages 137, 149 - 151, 184-186 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2008122834A (en) 2009-12-20
RU2412997C2 (en) 2011-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0695350B1 (en) Process for purifying collagenase
JP2002526057A (en) Endofucanases, and methods of using endofucanases for preparing fuco-oligosaccharides from fucan, use of fuco-oligosaccharides for protection of bacteria producing endofucanase and plants
CN101182495B (en) Joint production process for producing alkaline phosphatase and heparin sodium with pig small intestine as raw material
JPH02504465A (en) Improvements in the isolation of active enzymes from krill tissue
KR101853463B1 (en) Method for purifying botulinum toxin
CN102864200A (en) Method for preparing ACE (Angiotensin Converting Enzyme) inhibitory peptide by hydrolyzing rice protein isolate with complex enzyme
WO2009154502A1 (en) Method for producing a combined preparation exhibiting collagenase activity
CA1221046A (en) Method for separating lysozyme from egg-white
DE2509482C2 (en) Process for the preparation of the kallikrein trypsin inhibitor from bovine lung
RU2280076C1 (en) Enzyme preparation from hepatopancreas of commercial crab species and method for production of the same
RU2584601C1 (en) Method of extracting proteolytic terrilytin enzyme
CN101215553B (en) Extraction method for ferulic acid esterase
RU2225441C1 (en) Method for preparing collagenase preparation
RU2236460C1 (en) Method for preparing collagenase
US20220204922A1 (en) Purified fish proteases with high specific activities and its process of production
CN104892723B (en) Preparation method of hairtail liver antibacterial peptide
RU2096456C1 (en) Method of preparing enzyme preparation showing collagenolytic activity
RU2265052C2 (en) Method for preparing collagenase preparation
CN114032270B (en) Blood clam polypeptide and polypeptide powder with whitening effect, and preparation method and application thereof
FR2616800A1 (en) PRODUCTION OF BGLUCURONIDASE ENZYME, GLYCYRRHIZINE HYDROLYSIS AND 18-B-GLYCYRRHETINIC ACID PRODUCTION
JP4280390B2 (en) Alginate-degrading enzyme
CN102212513A (en) Proteolytic enzyme separated from cordyceps sinensis and purification method thereof
JP4224313B2 (en) Method for preparing amylase inhibitor
RU2412995C1 (en) Method of obtaining collagenase inhibitor with anti-tumour action from hepatopancreas of red king crab
RU2088241C1 (en) Method of preparing the protease basic inhibitor from the cattle lung and pancreas

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08874729

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 08874729

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1