RU2096456C1 - Method of preparing enzyme preparation showing collagenolytic activity - Google Patents
Method of preparing enzyme preparation showing collagenolytic activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2096456C1 RU2096456C1 RU96121409A RU96121409A RU2096456C1 RU 2096456 C1 RU2096456 C1 RU 2096456C1 RU 96121409 A RU96121409 A RU 96121409A RU 96121409 A RU96121409 A RU 96121409A RU 2096456 C1 RU2096456 C1 RU 2096456C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- preparation
- metal chloride
- enzyme
- filters
- activity
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, медико-фармакологической промышленности, касается способа получения препарата, обладающего коллагенолитической активностью из гепатопанкреаса камчатского краба Paralihodes camtschatica (комплекса трипсино и химотрипсино-подобных протеаз) и может быть использовано в меховой и кожевенной промышленности, ветеринарии и медицине. The invention relates to biotechnology, food, medical and pharmacological industries, relates to a method for producing a preparation having collagenolytic activity from hepatopancreas of king crab Paralihodes camtschatica (a complex of trypsino and chymotrypsin-like proteases) and can be used in the fur and leather industry, veterinary medicine and medicine.
Установлено, что коллагенолитическая протеза A (КП-A) из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschatisa относится к сериновым протеазам, обладающим ярко выраженной коллагенолитической активностью и отличающихся от истинных коллагеназ в первую очередь строением активного центра. It was established that the collagenolytic prosthesis A (KP-A) from the hepatopancreas of the king crab Paralithodes camtschatisa belongs to serine proteases, which have pronounced collagenolytic activity and differ from true collagenases primarily in the structure of the active center.
Известен способ получения коллагеназы из гепатопанкреаса крабов, согласно которому выделение фермента проводят при смешивании гомогената гепатопанкреса крабов, полученного в результате автолитического гидролиза за счет эндопротеаз при температуре 0 30oC в течение 2 8 ч, с раствором хитозана, pH 2,0 6,5 с его конечной концентрацией 0,01 0,4 мас. Полученный раствор после отделения нерастворимого материала подвергается ультрафильтрации на мембране, отсекающей примесные вещества с молекулярной массой 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, и на мембране, отсекающей вещества с молекулярной массой 30 кДа и ниже, собирая фермент, непроходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы 10800 11200 ед/мг белка. Липиды в препарате отсутствуют [1]
Способ, при его небольших затратах материалов, технологического времени и сырья, практически лишен недостатков, за исключением использования хитозана, который может инактивировать фермент.A known method of producing collagenase from crab hepatopancreas, according to which the enzyme is isolated by mixing the crab hepatopancres homogenate obtained by autolytic hydrolysis by endoproteases at a temperature of 0 30 o C for 2 8 hours, with a solution of chitosan, pH 2.0 6.5 with its final concentration of 0.01 to 0.4 wt. After separation of the insoluble material, the resulting solution is ultrafiltered on a membrane cutting off impurities with a molecular mass of 100 kDa and more, collecting a solution passing through the membrane, and on a membrane cutting off substances with a molecular mass of 30 kDa and below, collecting an enzyme that does not pass through the membrane. A solution containing enzymatic activity is lyophilized. The specific activity of collagenase is 10800 11200 u / mg protein. There are no lipids in the preparation [1]
The method, at its low cost of materials, technological time and raw materials, is practically devoid of drawbacks, with the exception of the use of chitosan, which can inactivate the enzyme.
Известен способ получения протеолитического комплекса, включающего коллагеназную активность из измельченных панкреассодержащих наземных или водных животных. Экстракцию комплекса осуществляют из гомогепата 1 мМ раствором хлористого кальция, содержащим 0,2% детергента в течение 12 ч. Осадок отделяют сепарированием и центрифугированием надосадочной жидкости для удаления липидной фракции. Очистку от мелкодисперсных частиц ведут микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 200 мкм, концентрирование полученного раствора осуществляют на половолоконных ультрафильтрах с мембранами, имеющими диаметр 15000 Да. Концентрированный раствор стерилизуют фильтрацией и сушат сублимацией. A known method of producing a proteolytic complex, including collagenase activity from ground pancreatic terrestrial or aquatic animals. The complex is extracted from homogepate with a 1 mM calcium chloride solution containing 0.2% detergent for 12 hours. The precipitate is separated by separation and centrifugation of the supernatant to remove the lipid fraction. Purification from fine particles is carried out by microfiltration on membranes with a pore diameter of 200 μm, the concentration of the resulting solution is carried out on hollow fiber ultrafilters with membranes having a diameter of 15,000 Da. The concentrated solution is sterilized by filtration and freeze-dried.
Коллагенолитическая активность по кислоторастворимому коллагену 672 Е/мг [2]
Недостатком способа является использование высоких концентраций поверхностно-активных веществ, способных влиять на экологию.Collagenolytic activity of acid-soluble collagen 672 U / mg [2]
The disadvantage of this method is the use of high concentrations of surfactants that can affect the environment.
Наиболее близким к предложенному по технологической сущности и достигаемому техническому результату является способ получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, предусматривающий выделение фермента из гепатопанкреаса промысловых крабов гомогенизацией ткани в буферном растворе с pH 6 9,5 содержащем неионный детергент в количестве 0,1 5% и 0,1 2,0 М раствор хлорида щелочного металла. После отделения осадка и слоя липидов раствор обрабатывают на комплексе мембранного оборудования (Миллипор) с использованием мембранных кассет с размером пор 0,45 мкн микрофильтрация и последующая ультрафильтрация через мембраны с лимитом пропускания 5000 Да. Концентрат лиофильно высушивают. Удельная протеолитическая активность препарата не ниже 10000 Е/мг белка. Удельная активность индивидуальных коллагеназ существенно меньше удельной активности суммарного препарата [3]
Недостатком способа также является использование высоких концентраций детергента и буферных растворов, продолжительность ультрафильтрации.Closest to the proposed technological essence and the technical result achieved is a method for producing an enzyme preparation having collagenolytic activity, which involves the isolation of an enzyme from hepatopancreas of commercial crabs by tissue homogenization in a buffer solution with a pH of 6.9.5 containing a nonionic detergent in an amount of 0.1-5% and 0.1 2.0 M alkali metal chloride solution. After separation of the precipitate and the lipid layer, the solution is processed on a membrane equipment complex (Millipore) using membrane cassettes with a pore size of 0.45 microns microfiltration and subsequent ultrafiltration through membranes with a transmission limit of 5000 Da. The concentrate is freeze-dried. The specific proteolytic activity of the drug is not lower than 10,000 U / mg protein. The specific activity of individual collagenases is significantly less than the specific activity of the total drug [3]
The disadvantage of this method is the use of high concentrations of detergent and buffer solutions, the duration of ultrafiltration.
Задачей предлагаемого изобретения является усовершенствование способа получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, который мог бы быть реализован более простой технологией, а полученный комплексный ферментный препарат обладал высокой коллагенолитической активностью, протеолитической, эстеразной, пептидазной, эластазной, ДНКазной, липазной, амидазной и хитиназной активностью. The objective of the invention is to improve the method for producing an enzyme preparation having collagenolytic activity, which could be implemented by a simpler technology, and the resulting complex enzyme preparation has a high collagenolytic activity, proteolytic, esterase, peptidase, elastase, DNase, lipase, amidase and chitinase activity.
Полученный комплексный ферментный препарат назван Коллалитин. Удельная коллагенолитическая активность препарата, составляет не менее 500 3000 ед Мандл/мг (субстрат адоказеин, 14-C-коллаген 1 типа).The resulting complex enzyme preparation is called Collalitin. The specific collagenolytic activity of the drug is at least 500 3000 units Mandl / mg (substrate adocasein, type 14 14 -C-collagen).
Коллалитин не содержит ионов тяжелых металлов, примесей, вредных и токсичных веществ. Collalitin does not contain heavy metal ions, impurities, harmful and toxic substances.
Коллагеназа в коллалитине представлена тремя изоферментами с молекулярной массой в пределах от 18 до 27 кДа. Содержание белка в препарате не менее 97%
Препарат стабилен при температуре до 60oC и в области pH 5,0 9,0. оптимум коллагенолитической активности при pH 7,9 и температуре 37oC.Collagenase in collallitin is represented by three isoenzymes with a molecular weight ranging from 18 to 27 kDa. The protein content in the drug is not less than 97%
The drug is stable at temperatures up to 60 o C and in the pH range of 5.0 to 9.0. the optimum collagenolytic activity at pH 7.9 and a temperature of 37 o C.
Коллалитин не обладает токсичным и аллергизирующим действием, не вызывает патологических изменений ультраструктуры кожи. Collalitin has no toxic and allergenic effect, does not cause pathological changes in the ultrastructure of the skin.
Указанная задача решается тем, что в способе получения ферментного препарата, обладающего коллагенолитической активностью, включающем выделение фермента из гепатопанкреаса камчатского краба экстракцией в присутствии раствора хлорида щелочного металла, отделение осадка и липидов, и очистку последовательной микрофильтрацией на мембранах с номинальным размером пор 0,45 мкн и ультрафильтрацией концентрата с последующей лиофильной сушкой, согласно изобретению выделение фермента экстракцией ведут непосредственно из замороженного гепатопанкреаса краба выдержкой в 0,1 1 М растворе хлорида щелочного металла в соотношении 1 2,1 2,3 при периодическом перемешивании в течении 14 16 ч, отделение осадка ведут последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 10,0 мм, 0,5 мм и 0,1 мм, обезжиривание проводят в процессе микрофильтрации. This problem is solved in that in a method for producing an enzyme preparation having collagenolytic activity, comprising isolating an enzyme from hepatopancreas of king crab by extraction in the presence of an alkali metal chloride solution, separating sediment and lipids, and purifying by successive microfiltration on membranes with a nominal pore size of 0.45 microns and ultrafiltration of the concentrate, followed by freeze drying, according to the invention, the isolation of the enzyme by extraction is carried out directly from frozen hepat pancreatic crab exposure in 0.1 1 M solution of alkali metal chloride in the ratio of 1 2.1 2.3 with periodic stirring for 14 16 hours, the sediment is separated by sequential filtration through filters with a pore size of 10.0 mm, 0.5 mm and 0.1 mm, degreasing is carried out in the process of microfiltration.
Ультрафильтрационную очистку концентрата проводят на мембранных фильтрах с лимитом пропускания 10000 Да. Ultrafiltration purification of the concentrate is carried out on membrane filters with a transmission limit of 10,000 Da.
Технический результат предлагаемого изобретения в сравнении с существующими аналогами заключается в упрощении технологии получения целевого продукта, обладающего широкой субстратной специфичностью уникальным сочетанием коллагенолитической и общепротеолитической, эластазной, ДНКазной и липолитической, а также стабильностью коллагеназы при высокой температуре (60oC).The technical result of the invention in comparison with existing analogues is to simplify the technology of obtaining the target product with a wide substrate specificity, a unique combination of collagenolytic and general proteolytic, elastase, DNase and lipolytic, as well as the stability of collagenase at high temperature (60 o C).
Проведение согласно изобретению экстракции ферментного комплекса непосредственно из замороженного гепатопанкреаса краба, помещением его в 0,1 - 1 М раствор хлорида щелочного металла в соотношении 1 2,1 2,3 в течение 14 16 ч и температуре 19 21oC, обеспечивает не только упрощение способа (не требует предварительного оттаивания и механической гомогенизации исходного сырья), но и достигает за указанное время эффекта гомогенизации, что ускоряет выход фермента и способствует полноте выхода.Carrying out according to the invention the extraction of the enzyme complex directly from the frozen hepatopancreas of the crab, placing it in a 0.1 - 1 M solution of alkali metal chloride in the ratio of 1 2.1 2.3 for 14 16 hours and a temperature of 19 21 o C, provides not only simplification method (does not require preliminary thawing and mechanical homogenization of the feedstock), but also achieves the homogenization effect in a specified time, which accelerates the release of the enzyme and contributes to the completeness of the output.
Существенно, что проведение последовательной очистки от механических загрязнений через систему фильтров (стреннеров) позволяет удалить липидную фракцию на стадии микрофильтрации. It is significant that the sequential cleaning of mechanical impurities through a system of filters (strenners) allows you to remove the lipid fraction at the microfiltration stage.
Пример. Example.
50 Кг замороженного гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschatica заливают 110 л 10% раствора хлорида натрия, выдерживают для разморозки и экстракции фермента 15 ч при периодическом перемешивании, поддерживая температуру смеси 20oC.50 Kg of frozen hepatopancreas of king crab Paralithodes camtschatica is poured 110 l of 10% sodium chloride solution, kept for defrosting and extraction of the enzyme for 15 hours with periodic stirring, maintaining the temperature of the mixture 20 o C.
Затем нерастворимые частицы отделяют последовательной фильтрацией через фильтры (стреннеры) с размером пор 10 мм, 0,5 мм и 0,1 мм. Продукт перекачивают в реакционный бак системы Ceraflo (Millipore) и подвергают микрофильтрации через мембраны с номинальным размером пор 0,45 мкн для удаления эмульгированного жира, клеточных обломков и микроорганизмов. Then, insoluble particles are separated by sequential filtration through filters (strenners) with pore sizes of 10 mm, 0.5 mm and 0.1 mm. The product is pumped into the reaction tank of the Ceraflo system (Millipore) and microfiltered through membranes with a nominal pore size of 0.45 microns to remove emulsified fat, cell debris and microorganisms.
Продукт, прошедшей мембраны, направляется в реакционный бак системы для ультрафильтрации Prostak (Millipore). Ультрафильтрацию ведут через мембраны с лимитом пропускания 10000 Да. The product passing through the membrane is sent to the reaction tank of the Prostak ultrafiltration system (Millipore). Ultrafiltration is carried out through membranes with a transmission limit of 10,000 Da.
Процесс концентрирования заканчивают из расчета 8 л концентрата, который собирают в полиэтиленовые емкости. Концентрат разливают в лотки из нержавеющей стали и высушивают лиофильно. Продолжительность процесса не превышает 57 ч. The concentration process is completed at the rate of 8 l of concentrate, which is collected in plastic containers. The concentrate is poured into stainless steel trays and freeze-dried. The duration of the process does not exceed 57 hours
Получают 400 г порошка ферментного препарата коллалитин. 400 g of collalitin enzyme preparation powder are obtained.
Порошок желтовато-серого цвета, легко растворимый в дистиллированной воде или буферном растворе с легким специфическим запахом. A yellowish-gray powder, readily soluble in distilled water or a buffer solution with a slight specific odor.
Коллагенолитическая активность составляет не менее 2000 ед Мандл/мг (сустрат 14-C-коллаген 1 типа).Collagenolytic activity is not less than 2000 units Mandl / mg (sustrate 14 -C-collagen type 1).
Содержание белка в препарате составляет 97% The protein content in the drug is 97%
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96121409A RU2096456C1 (en) | 1996-11-10 | 1996-11-10 | Method of preparing enzyme preparation showing collagenolytic activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96121409A RU2096456C1 (en) | 1996-11-10 | 1996-11-10 | Method of preparing enzyme preparation showing collagenolytic activity |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2096456C1 true RU2096456C1 (en) | 1997-11-20 |
| RU96121409A RU96121409A (en) | 1998-01-20 |
Family
ID=20187010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96121409A RU2096456C1 (en) | 1996-11-10 | 1996-11-10 | Method of preparing enzyme preparation showing collagenolytic activity |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2096456C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000022102A1 (en) * | 1998-10-13 | 2000-04-20 | Sergei Mikhailovich Erkhov | Biologically active substance, raw material and method for producing the same |
| WO2009154502A1 (en) * | 2008-06-09 | 2009-12-23 | Shmoilov Alexandr Mikhailovich | Method for producing a combined preparation exhibiting collagenase activity |
| RU2584601C1 (en) * | 2015-01-29 | 2016-05-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Method of extracting proteolytic terrilytin enzyme |
-
1996
- 1996-11-10 RU RU96121409A patent/RU2096456C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. RU, патент, 2039819, кл. C 12 N 9/64, 1995. 2. RU, патент, 2034028, кл. C 12 N 9/64, 1995. 3. EP, заявка, 0402321, кл. C 12 N 9/64, 1990. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000022102A1 (en) * | 1998-10-13 | 2000-04-20 | Sergei Mikhailovich Erkhov | Biologically active substance, raw material and method for producing the same |
| WO2009154502A1 (en) * | 2008-06-09 | 2009-12-23 | Shmoilov Alexandr Mikhailovich | Method for producing a combined preparation exhibiting collagenase activity |
| RU2584601C1 (en) * | 2015-01-29 | 2016-05-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Method of extracting proteolytic terrilytin enzyme |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1227132A (en) | Preparation having a higher collagenolytic activity and pharmaceutical compositions containing same | |
| EP0767833A1 (en) | Composition containing collagenase and chymopapain for isolating hepatocytes and pancreatic islet cells | |
| EP0393035B1 (en) | Method for the isolation of active enzyme(s) from krill tissue | |
| RU2096456C1 (en) | Method of preparing enzyme preparation showing collagenolytic activity | |
| DK167226B1 (en) | PROCEDURE FOR SELECTIVE REDUCTION OF PROTEASE ACTIVITY IN PROTEASE-CONTAINING LACTASE PREPARATIONS | |
| CN117551186A (en) | Method for preparing collagen peptide by countercurrent immobilized enzyme column enzymolysis | |
| US5061627A (en) | Method for preparing enzymes from crustaceans | |
| RU2280076C1 (en) | Enzyme preparation from hepatopancreas of commercial crab species and method for production of the same | |
| CN108191991A (en) | A kind of method of purification of Polysaccharide in Pleurotus eryngii | |
| RU2055482C1 (en) | Method of protein-nucleinic hydrolysate preparing | |
| RU2265052C2 (en) | Method for preparing collagenase preparation | |
| JPH0394676A (en) | Enzyme compounds for indicating collagen degradation activity and method of its isolation and purification | |
| CN107629145B (en) | Method for extracting hyaluronic acid from wood frog skin | |
| RU2781287C1 (en) | Method for obtaining microbial protein from microbial biomass of a producer of methane-oxidizing bacteria by an enzymatic method | |
| US20220204922A1 (en) | Purified fish proteases with high specific activities and its process of production | |
| SU899611A1 (en) | Process for producing pearl paste from fish scale | |
| RU2584601C1 (en) | Method of extracting proteolytic terrilytin enzyme | |
| RU2352634C1 (en) | Method for making enzyme preparation of fish materials | |
| RU2034028C1 (en) | Method of preparing of proteolytic complex | |
| RU2269913C1 (en) | Method for producing of chitin | |
| RU2039819C1 (en) | Method for production of collagenase | |
| RU2679419C1 (en) | Method of obtaining a biologically active concentrate from the maral skin | |
| KR100353396B1 (en) | Sialic acid combined polypeptide mixture having high concentration of sialic acid | |
| RU2112036C1 (en) | Method of collagenase preparing | |
| SU582745A3 (en) | Method of producing tuberculin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20101111 |