RU2225441C1 - Method for preparing collagenase preparation - Google Patents
Method for preparing collagenase preparation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2225441C1 RU2225441C1 RU2003106162/13A RU2003106162A RU2225441C1 RU 2225441 C1 RU2225441 C1 RU 2225441C1 RU 2003106162/13 A RU2003106162/13 A RU 2003106162/13A RU 2003106162 A RU2003106162 A RU 2003106162A RU 2225441 C1 RU2225441 C1 RU 2225441C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagenase
- carried out
- preparation
- buffer
- acetate
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению высокоочищенных, высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности, а также для исследовательских целей. The invention relates to biotechnology, in particular to the production of highly purified, highly active enzyme preparations that can be used in medicine, biochemistry and the food industry, as well as for research purposes.
В настоящее время известны очищенные препараты коллагеназ, выпускаемые зарубежными фирмами, например Sigma, ICN. Эти ферментные препараты приготовлены из культуральной жидкости Clostridium hystoliticum, патогенного микроорганизма, являющегося возбудителем газовой гангрены. В связи с этим препараты дороги, их применение в пищевой и медицинской промышленности невозможно из-за опасности микробного заражения. В то же время гепатопанкреас крабов, особенно, камчатского краба, богат протеолитическими ферментами, в том числе и коллагеназами. Гепатопанкреас является доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов. Currently known purified preparations of collagenases produced by foreign companies, for example Sigma, ICN. These enzyme preparations are prepared from the culture fluid of Clostridium hystoliticum, a pathogen that causes gas gangrene. In this regard, drugs are expensive, their use in the food and medical industry is impossible because of the danger of microbial infection. At the same time, hepatopancreas of crabs, especially Kamchatka crab, is rich in proteolytic enzymes, including collagenases. Hepatopancreas is an affordable, cheap and non-toxic raw material for enzyme preparations.
Известен способ получения коллагеназы, предусматривающий гомогенизацию гепатопакреас промысловых крабов в забуференных водных растворах путем автолиза, проводимого при перемешивании в течение 2-8 час при температуре 0-30oС, к полученному раствору добавляют раствор хитозана с рН 2,0-6,5 до достижения концентрации 0,01-0,4 мас.%. Полученные раствор после отделения нерастворимого материала подвергают последовательно ультрафильтрации на мембране, отсекающей примесные вещества с мол.м. 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с мол.м. 30 кДа и менее, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность лиофилизуют. Удельная активность коллагеназы 10800-11200 ед/мг белка. Липиды в препарате отсутствуют.A known method for producing collagenase, which provides for the homogenization of hepatopacreas of commercial crabs in buffered aqueous solutions by autolysis, carried out with stirring for 2-8 hours at a temperature of 0-30 o C, a solution of chitosan with a pH of 2.0-6.5 to achieve a concentration of 0.01-0.4 wt.%. After separation of the insoluble material, the resulting solution is subsequently subjected to ultrafiltration on a membrane that cuts off impurities from mol.m. 100 kDa and more, collecting the solution passing through the membrane, and then on the membrane, cutting off substances from mol.m. 30 kDa or less, collecting an enzyme that does not pass through the membrane. A solution containing enzymatic activity is lyophilized. The specific activity of collagenase is 10800-11200 u / mg protein. There are no lipids in the drug.
В известном способе удается отделить раствор от сопутствующих липидов и белков с мол. весом выше 100000 и ниже 30000, что приводит к более полному удалению примесных белков, а также изъять из процесса экологически грязные органические и неорганические соединения. Способ, при его небольших затратах материалов, технологического времени и сырья, практически лишен недостатков, за исключением хитозана, который может инъактивировать фермент (Патент РФ, 2039819, C 12 N 9/48, 20.07.95). In the known method, it is possible to separate the solution from concomitant lipids and proteins with mol. weighing above 100,000 and below 30,000, which leads to a more complete removal of impurity proteins, as well as to remove environmentally dirty organic and inorganic compounds from the process. The method, at its low cost of materials, technological time and raw materials, is practically devoid of drawbacks, with the exception of chitosan, which can inactivate the enzyme (RF Patent, 2039819, C 12 N 9/48, 07/20/95).
Известен также способ получения коллагеназы, предусматривающий использование в качестве исходного сырья замороженный гепатопанкреас камчатского краба Paralithodes camtshatica, из которого выделяют экстракцией комплекс ферментов, помещением его в раствор 0,1-1,0 М хлорида щелочного металла. Смесь выдерживают в течение 14-16 час, поддерживая температуру 19-21oС, при соотношении сырья и хлорида щелочного металла 1:2,2-2,3, периодически перемешивая. Осадок отделяют последовательной фильтрацией через фильтры с размером пор 10 мм, 0,5 мм, и 0,1 мм. Отделение липидной фракции осуществляют микрофильтрацией на мембранах с размером пор 0,45 мкм, ультрафильтрацию проводят на мембранных фильтрах с лимитом пропускания 10000 Да.There is also known a method for producing collagenase, which involves the use of frozen hepatopancreas of king crab Paralithodes camtshatica as a starting material, from which an enzyme complex is isolated by extraction by placing it in a solution of 0.1-1.0 M alkali metal chloride. The mixture was incubated for 14-16 hours, maintaining a temperature of 19-21 o With a ratio of raw materials and alkali metal chloride of 1: 2.2-2.3, periodically mixing. The precipitate was separated by sequential filtration through filters with pore sizes of 10 mm, 0.5 mm, and 0.1 mm. The lipid fraction is separated by microfiltration on membranes with a pore size of 0.45 μm, ultrafiltration is carried out on membrane filters with a transmission limit of 10,000 Da.
Полученный концентрат лиофильно высушивают. The resulting concentrate is freeze-dried.
Коллагенолитическая активность полученного препарата составляет не менее 2000 ед. Мандл/мг, содержание белка в препарате - 97%. Collagenolytic activity of the resulting drug is at least 2000 units. Mandl / mg, the protein content in the preparation is 97%.
Недостатком известного способа является длительность процесса как на стадии гомогенизации сырья, так и на стадии выделения коллагеназы, включающую последовательную фильтрацию, микрофильтрацию, ультрафильтрацию, что снижает выход продукта (Патент РФ 2096456, C 12 N 9/48, 20.11.97). The disadvantage of this method is the length of the process both at the stage of homogenization of the feedstock and at the stage of collagenase isolation, including sequential filtration, microfiltration, ultrafiltration, which reduces the yield of the product (RF Patent 2096456, C 12 N 9/48, 20.11.97).
Кроме того, известен способ получения коллагеназы, включающий гомогенизацию гематопанкреаса крабов в солевом буферном растворе (2,0 М раствор хлористого натрия), фракционированием материала сульфатом аммония, отделение центрифугированием нерастворимых веществ и очистку с использованием гидрофобной хроматографии, причем сорбцию фермента на сорбент осуществляют при уравновешивании последнего буферным раствором соли в концентрации не менее 1,0 М, а элюцию фермента проводят при ступенчатом уменьшении концентрации буферного раствора соли до 0,025 М. Полученный элюат обессоливают диализом. In addition, a method for producing collagenase is known, including the homogenization of crab hematopancreas in saline buffer solution (2.0 M sodium chloride solution), fractionation of the material with ammonium sulfate, separation by centrifugation of insoluble substances and purification using hydrophobic chromatography, the enzyme being sorbed on a sorbent by equilibration the latter with a buffer solution of salt at a concentration of not less than 1.0 M, and the elution of the enzyme is carried out with a stepwise decrease in the concentration of buffer solution of salt to 0.025 M. The eluate was desalted by dialysis.
В качестве буферного раствора при сорбции продукта используют сульфат аммония, а при десорбции - бикарбонат аммония. Для удаления балластных белков и пигментов фракционирование материала сульфатом аммония осуществляют путем многократного его переосаждения указанным реагентом до 50% насыщения. В качестве сорбента используют поливинил пирралидоновые носители типа Fractogel или Toyperl. Ammonium sulfate is used as a buffer solution for sorption of the product, and ammonium bicarbonate is used for desorption. To remove ballast proteins and pigments, the fractionation of the material with ammonium sulfate is carried out by repeatedly reprecipitating this reagent to 50% saturation. As the sorbent, polyvinyl pyrrolidone carriers of the Fractogel or Toyperl type are used.
Известный способ позволяет эффективно удалять примеси пигментов и белков, однако выход продукта составляет 22-24% и вследствие этого непригоден для условий масштабного производства (Патент РФ 2121503, С 12 N 9/48, 10.11.98). The known method allows you to effectively remove impurities of pigments and proteins, however, the product yield is 22-24% and therefore unsuitable for conditions of large-scale production (RF Patent 2121503, C 12 N 9/48, 10.11.98).
Наиболее близким к заявляемому является способ получения препарата коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых видов краба, включающий гомогенизацию его в 0,1 М ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделение супернатанта центрифугированием и осаждение препарата сульфатом аммония 60-70% насыщения. Осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 5,2-6,4 с добавлением 0,1-1,0 мМ Са2+. Затем проводят ионообменную хроматографию на аминированных силикатных материалах при рН 5,2-6,4, коллагеназу элюируют буферным раствором, содержащим 1 М NaCl, в присутствии 15-25% изопропанола при рН 7,0-8,5. Для дополнительной очистки и концентрации фермента коллагеназу высаливают из элюирующего раствора, насыщая его сульфатом аммония до 60%. Слой, содержащий активную коллагеназу, отделяют, диализируют и лиофильно высушивают.Closest to the claimed is a method of producing a collagenase preparation from hepatopancreas of commercial crab species, comprising homogenizing it in 0.1 M ammonium acetate, pH 6.4, containing 0.1-1.0 mm calcium acetate, separating the supernatant by centrifugation and precipitating the drug with ammonium sulfate 60-70% saturation. The precipitate containing collagenase is separated by centrifugation, dissolved in 0.1 M ammonium acetate pH 5.2-6.4 with the addition of 0.1-1.0 mm Ca 2+ . Then, ion-exchange chromatography is carried out on aminated silicate materials at pH 5.2-6.4, collagenase is eluted with a buffer solution containing 1 M NaCl in the presence of 15-25% isopropanol at pH 7.0-8.5. For additional purification and concentration of the enzyme, collagenase is salted out from the eluting solution, saturating it with ammonium sulfate up to 60%. The layer containing active collagenase is separated, dialyzed and freeze-dried.
В качестве аминированных силикатных материалов используют аминосилохром, аминоаэросил, аминосиликагель. Aminosilochrome, aminoaerosil, aminosilica gel are used as aminated silicate materials.
Выход коллагеназы составляет 50%, очистка в 40 раз. Collagenase yield is 50%, purification 40 times.
К недостаткам способа следует отнести невысокий выход и недостаточную очистку целевого продукта. Последнее особенно важно при медицинском применении препарата. Кроме того, применение анионообменной хроматографии приводит к потере ценных компонентов, изоэлектрическая точка которых выше 5. Обессоливание препарата коллагеназ диализом приводит к потере ферментов, т.к. коллагеназа за время диализа (2 суток) частично гидролизует диализные мешки. Длительное пребывание ферментов в дистиллированной воде с рН 5,6 приводит к частичной инактивации ряда протеолитических ферментов (Патент РФ 2008353, C 12 N 9/64, 28.02.94 г.). The disadvantages of the method include a low yield and insufficient purification of the target product. The latter is especially important for medical use of the drug. In addition, the use of anion exchange chromatography leads to the loss of valuable components, the isoelectric point of which is higher than 5. The desalination of the collagenase preparation by dialysis leads to the loss of enzymes, because collagenase during dialysis (2 days) partially hydrolyzes dialysis bags. A long stay of enzymes in distilled water with a pH of 5.6 leads to partial inactivation of a number of proteolytic enzymes (RF Patent 2008353, C 12 N 9/64, 02.28.94).
Задачей изобретения является повышение выхода, удельной активности, чистоты препарата и сокращения времени проведения процесса. The objective of the invention is to increase the yield, specific activity, purity of the drug and reduce the time of the process.
Поставленная задача достигается тем, что в способе получения препарата коллагеназы, включающем гомогенизацию гепатопанкреаса крабов, отделение экстракта (супернатанта) центрифугированием, осаждение коллагеназы сульфатом аммония, повторное центрифугирование для отделения осадка коллагеназы, растворение последнего в ацетатно-аммиачном буфере и хроматографическую очистку раствора препарата с последующей элюцией сорбированных ферментов, концентрированием, обессоливанием элюата и лиофильной сушкой препарата, очистку препарата ведут методом аффинной хроматографии, при этом сорбцию коллагеназы осуществляют на аффинном сорбенте - макропористом кремнеземе, содержащем ковалентно связанный антибиотик - полимиксин М, элюцию ведут трисовым буфером с добавлением ацетата кальция, а концентрирование и обессоливание ведут ультрафильтрацией. The problem is achieved in that in a method for producing a collagenase preparation, including homogenization of crab hepatopancreas, separation of the extract (supernatant) by centrifugation, precipitation of collagenase with ammonium sulfate, repeated centrifugation to separate the collagenase precipitate, dissolving the latter in ammonium acetate buffer and chromatographic purification of the drug with a chromatographic purification solution elution of sorbed enzymes, concentration, desalination of the eluate and freeze drying of the drug, the preparation is purified by affinity chromatography, sorption of collagenase is carried out on an affinity sorbent - macroporous silica containing a covalently bound antibiotic - polymyxin M, elution is carried out with Tris buffer with calcium acetate, and concentration and desalination are carried out by ultrafiltration.
Гомогенизацию обычно проводят в ацетат-аммонийном буфере, содержащем ацетат кальция при рН 6,4-6,2, осаждение - путем добавления сульфата аммония 60-70% насыщения, сорбцию ведут в присутствии ацетат-аммонийного буфера, а элюцию - трисовым буфером с добавлением ацетата кальция при рН 8,0-8,5. Homogenization is usually carried out in an ammonium acetate buffer containing calcium acetate at pH 6.4-6.2, precipitation is carried out by adding 60-70% saturation ammonium sulfate, sorption is carried out in the presence of ammonium acetate, and elution is performed with Tris buffer with addition calcium acetate at pH 8.0-8.5.
Предпочтительно ультрафильтрацию вести на установке с мембраной, задерживающей белки с М.М. выше 10 кДа. Preferably, the ultrafiltration is carried out on an installation with a membrane retaining proteins with M.M. above 10 kDa.
Наиболее перспективным для избирательной очистки коллагеназы при ее получении является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, позволяющей разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а поэтому достигать более высоких результатов при выделении ферментов. The most promising method for selective purification of collagenase when it is obtained is the affinity chromatography method, based on the affinity of enzymes for specific substrate analogs or inhibitors covalently linked to an insoluble carrier, which allows enzymes to be separated on the basis of their biological specificity, and therefore achieve better results in the isolation of enzymes.
Известно, что антибиотики-полипептиды, например бацитрацин и грамицидин С, успешно используемые в качестве лигандов аффинной хроматографии, не специфичны по отношению к протеиназам гепатопанкреаса камчатского краба. Для этих ферментов групповой специфичностью обладают аффинные сорбенты с антибиотиком полимиксином М в качестве лиганда. Полимиксин М представляет собой природный циклопептид. Характерные для циклопептидов особенности пространственной структуры и оригинальный набор природных и неприродных аминокислот способствуют узнаванию лиганда коллагеназами. При этом происходит избирательное связывание коллагеназы с нерастворимым носителем. Элюция коллагеназы 0,05 мМ трисовым буфером рН 8,0-8,5 является, в отличии от элюции солевым и спиртовыми растворами, очень мягкой и способствует полному сохранению активности ферментов. It is known that antibiotic polypeptides, for example, bacitracin and gramicidin C, successfully used as affinity chromatography ligands, are not specific for king crab hepatopancreas proteinases. For these enzymes, affinity sorbents with antibiotic polymyxin M as a ligand possess group specificity. Polymyxin M is a natural cyclopeptide. The spatial structure features characteristic of cyclopeptides and the original set of natural and unnatural amino acids contribute to ligand recognition by collagenases. In this case, selective binding of collagenase to an insoluble carrier occurs. Elution of collagenase with 0.05 mM Tris buffer pH 8.0-8.5 is, unlike elution with saline and alcohol solutions, very mild and contributes to the complete maintenance of enzyme activity.
Сущность способа заключается в следующем. The essence of the method is as follows.
В качестве источника коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых видов краба, который гомогенизируют в 0,1 мМ ацетате аммония рН 6,4, содержащем 0,1-1,0 мМ ацетата кальция, отделяют экстракт центрифугированием, добавляют сульфат аммония 60-70% насыщения. Осадок, содержащий коллагеназу, отделяют центрифугированием, растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,0-6,5 с добавлением 0,1-1,0 мМ ацетата кальция. As a source of collagenase, hepatopancreas of commercial crab species is used, which are homogenized in 0.1 mM ammonium acetate, pH 6.4, containing 0.1-1.0 mM calcium acetate, the extract is separated by centrifugation, ammonium sulfate is added at 60-70% saturation. The precipitate containing collagenase is separated by centrifugation, dissolved in 0.1 M ammonium acetate pH 6.0-6.5 with the addition of 0.1-1.0 mm calcium acetate.
В качестве хроматографического метода очистки используют аффинную хроматографию с использованием в качестве аффинного сорбента макропористого кремнезема, содержащего ковалентно присоединенный антибиотик - полимиксин М. As a chromatographic purification method, affinity chromatography is used using macroporous silica containing a covalently attached antibiotic, polymyxin M, as an affinity sorbent.
Сорбцию ферментов проводят в динамической или статическом режиме. При этом происходит избирательное связывание коллагеназ с нерастворимым носителем. Затем носитель со связанным белком промывают соответствующим буферным раствором. При этом происходит отделение примесей в том числе и окрашенных. Sorption of enzymes is carried out in dynamic or static mode. In this case, selective binding of collagenases to an insoluble carrier occurs. Then the carrier with the bound protein is washed with an appropriate buffer solution. In this case, the separation of impurities, including colored ones, occurs.
Носитель со связанным белком промывают тем же ацетатаммонийным буфером рН 6,0-6,5, а десорбцию проводят 0,05 М трисовым буфером рН 8,0-8,5 с 1 мМ ацетата кальция. Для концентрации и обессоливания элюат подвергают ультрафильтрации на установке с мембраной, задерживающей белки с молекулярной массой выше 10 кДа. Элюат концентрируют и промывают 10-кратным объемом дистиллированной воды и затем лиофильно высушивают. The carrier with the bound protein is washed with the same ammonium acetate buffer pH 6.0-6.5, and desorption is carried out with 0.05 M Tris buffer pH 8.0-8.5 with 1 mM calcium acetate. For concentration and desalination, the eluate is subjected to ultrafiltration in an installation with a membrane that retains proteins with a molecular weight of more than 10 kDa. The eluate is concentrated and washed with a 10-fold volume of distilled water and then freeze-dried.
Очищенный фермент можно использовать в случае необходимости в виде раствора, но в основном высушивают лиофильно после обессоливания ультрафильтрацией. The purified enzyme can be used, if necessary, in the form of a solution, but mainly freeze-dried after desalting by ultrafiltration.
В результате получают очищенный ферментный препарат коллагеназы, обладающий коллагенолитической активностью, определяемую известными методами. Выход по активности 75-100%. Удельная активность коллагеназы повышается в 2-3 раза и составляет 0,6-0,9 ед/А280.The result is a purified enzyme preparation of collagenase having collagenolytic activity determined by known methods. The output for the activity of 75-100%. The specific activity of collagenase increases by 2–3 times and amounts to 0.6–0.9 units / A 280 .
Пример 1. Example 1
20 г гепатопанкреаса крабов предварительно гомогенизируют и экстрагируют фермент буфером рН 6,4 (0,1 М ацетата аммония), затем осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения 10000 об/мин, к супернатанту добавляют сульфат аммония 60% насыщения и через 20 часов снова центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в 0,1 М ацетате аммония рН 6,1-6,4 и наносят на колонку (1•5 см) с полимиксин-силохромом, уравновешенным тем же буфером. Элюцию активных ферментов проводят 0,05 М трисовым буфером рН 8,0. 20 g of crab hepatopancreas are pre-homogenized and the enzyme is extracted with a buffer of pH 6.4 (0.1 M ammonium acetate), then the precipitate is separated by centrifugation at a speed of 10,000 rpm, 60% saturation of ammonium sulfate is added to the supernatant and centrifuged again after 20 hours at the same conditions. The resulting precipitate was dissolved in 0.1 M ammonium acetate pH 6.1-6.4 and applied to a column (1 • 5 cm) with polymyxin-silochrome balanced by the same buffer. Elution of active enzymes is carried out with 0.05 M Tris buffer pH 8.0.
Элюат подвергают ультрафильтрации на мембране YM 10 Millipor, концентрируют до небольшого объема (не более 2 мл), промывают 10-кратным количеством дистиллированной воды, высушивают лиофильно. The eluate is subjected to ultrafiltration on a YM 10 Millipor membrane, concentrated to a small volume (not more than 2 ml), washed with 10 times the amount of distilled water, dried freeze-dried.
Выход по активности 100%, очистка в 120 раз, удельная активность 0,6 ед/А280.The yield of activity is 100%, purification 120 times, specific activity 0.6 u / A 280 .
Пример 2. Example 2
Процесс экстракции и осаждения белков сульфатом аммония производится аналогично примеру 1. The process of extraction and precipitation of proteins by ammonium sulfate is carried out analogously to example 1.
Раствор сульфат-пасты, полученной из 20 г гепатопанкреаса краба добавляют к 3 г. полимиксин-силохрома, уравновешенного 0,1 М ацетатом аммония рН 6,1, осторожно перемешивают 20 мин, раствор декантируют, сорбент промывают тем же буфером. Элюцию проводят добавлением 3-кратного количества 0,05 М трисового буфера рН 8,5. Элюат подвергают ультрафильтрации. Концентрируют, промывают, высушивают лиофильно. A solution of sulfate paste obtained from 20 g of crab hepatopancreas is added to 3 g of polymyxin-silochrom balanced with 0.1 M ammonium acetate pH 6.1, carefully mixed for 20 minutes, the solution is decanted, the sorbent is washed with the same buffer. Elution is carried out by adding 3 times the amount of 0.05 M Tris buffer pH 8.5. The eluate is subjected to ultrafiltration. Concentrate, washed, freeze-dried.
Выход по активности 75%, удельная активность 0,6 ед/A280, очистка в 60 раз.The activity yield is 75%, the specific activity is 0.6 units / A 280 , and the purification is 60 times.
Предлагаемый способ является более экономичным за счет применения аффинного сорбента. Метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, позволяет выделять ферменты на основе их биологической специфичности, исключать потери в процессе выделения ценных ферментов, а поэтому достигать более высокой степени очистки по сравнению с ионообменной и другими видами хроматографической техники. Применение трисового буфера без добавления высоких концентраций соли и спирта полностью сохраняет активность коллагенолитических ферментов. The proposed method is more economical due to the use of an affinity sorbent. The affinity chromatography method, based on the affinity of enzymes for specific substrate analogs or inhibitors covalently bound to an insoluble carrier, allows enzymes to be isolated on the basis of their biological specificity, to exclude losses during the isolation of valuable enzymes, and therefore to achieve a higher degree of purification compared to ion exchange and other types of chromatographic techniques. The use of Tris buffer without adding high concentrations of salt and alcohol completely preserves the activity of collagenolytic enzymes.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить до 75-100% выход целевого продукта, повысить удельную активность в 2-3 раза, сократить время процесса и потери фермента за счет замены диализа в диализных мешках диализом с помощью ультрафильтрации. Обессоливание элюата методом ультрафильтрации вместо диализа значительно сокращает время процесса обессоливания, сохраняет активность фермента, а также приводит к получению концентрированных растворов, время высушивания которых также сокращается. Thus, the proposed method allows to increase the yield of the target product to 75-100%, increase the specific activity by 2–3 times, reduce the process time and enzyme loss by replacing dialysis in dialysis bags with dialysis using ultrafiltration. The desalting of the eluate by ultrafiltration instead of dialysis significantly reduces the time of the desalination process, preserves the activity of the enzyme, and also leads to concentrated solutions, the drying time of which is also reduced.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003106162/13A RU2225441C1 (en) | 2003-03-05 | 2003-03-05 | Method for preparing collagenase preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003106162/13A RU2225441C1 (en) | 2003-03-05 | 2003-03-05 | Method for preparing collagenase preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2225441C1 true RU2225441C1 (en) | 2004-03-10 |
| RU2003106162A RU2003106162A (en) | 2004-09-10 |
Family
ID=32390828
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003106162/13A RU2225441C1 (en) | 2003-03-05 | 2003-03-05 | Method for preparing collagenase preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2225441C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7951913B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-05-31 | Biotika A.S. | Method of polymyxin B recovery from fermentation broth |
| US8119371B2 (en) | 2006-06-15 | 2012-02-21 | Biotika A.S. | Process for the preparation of polymyxin B employing (PAENI) Bacillus polymyxa |
-
2003
- 2003-03-05 RU RU2003106162/13A patent/RU2225441C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7951913B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-05-31 | Biotika A.S. | Method of polymyxin B recovery from fermentation broth |
| US8119371B2 (en) | 2006-06-15 | 2012-02-21 | Biotika A.S. | Process for the preparation of polymyxin B employing (PAENI) Bacillus polymyxa |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4683294A (en) | Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them | |
| Lin et al. | Partial purification of hog kidney sodium-D-glucose cotransport system by affinity chromatography on a phlorizin polymer | |
| US4814277A (en) | Method of inactivating reproductive filterable pathogens | |
| US4247452A (en) | Purification of pertussis haemagglutinins | |
| RU2225441C1 (en) | Method for preparing collagenase preparation | |
| RU2054044C1 (en) | Method of preparing human recombinant gamma-interferon without n-terminal methionine | |
| US5061627A (en) | Method for preparing enzymes from crustaceans | |
| CN113789319B (en) | Method for separating maggot kinase from fly maggots and application thereof | |
| Muffler et al. | Downstream processing in marine biotechnology | |
| RU2230325C2 (en) | Method for preparing purified preparation of botulinic toxin type a | |
| US3775254A (en) | Purification of low molecular weight enzymes | |
| US4100028A (en) | Method for purification of proteolytic enzymes | |
| RU2027759C1 (en) | Method of hyaluronidase preparing | |
| RU2584601C1 (en) | Method of extracting proteolytic terrilytin enzyme | |
| JPS63132898A (en) | Separation and purification of protein | |
| US4030977A (en) | Method for purification of physiologically active substance using enzyme-enzyme inhibitor system | |
| SU942427A1 (en) | Method for purifying proteolytic enzymes | |
| US11926853B2 (en) | Botulinum toxin producing method | |
| RU2008353C1 (en) | Method of collagenase preparation producing | |
| RU2065876C1 (en) | Process for recovering enzyme agent from muscle tissue of fish | |
| SU1671691A1 (en) | Method for preparation of -n-acetylglucoseaminidase of bacillus subtilis vkpm v-2471 | |
| SU1377292A1 (en) | Method of cleaning proteinases of cysteic type | |
| CN1563086A (en) | Technique for preparing bioactive peptide of bursa of Fabricius | |
| Hatti-Kaul et al. | 3 Downstream Processing of Proteins | |
| RU2003106162A (en) | METHOD FOR PRODUCING COLLAGENASE PRODUCT |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090306 |