RU2027759C1 - Method of hyaluronidase preparing - Google Patents
Method of hyaluronidase preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2027759C1 RU2027759C1 SU5025578A RU2027759C1 RU 2027759 C1 RU2027759 C1 RU 2027759C1 SU 5025578 A SU5025578 A SU 5025578A RU 2027759 C1 RU2027759 C1 RU 2027759C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hyaluronidase
- extract
- centrifugation
- enzyme
- purification
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к энзимологии, в частности к способам получения ферментов, которые могут быть использованы в качестве субстанций для лекарственных препаратов. The invention relates to enzymology, in particular to methods for producing enzymes that can be used as substances for drugs.
Известен способ получения гиалуронидазы путем измельчения семенников убойных животных, экстракции из них фермента физиологическим раствором, содержащим 0,25% хлороформа, центрифугирования, высушивания экстракта в сублимационном аппарате при 60-70оС, обработки порошка ацетоном [1].A method of producing hyaluronidase by grinding of the testes of slaughtered animals, extraction of these enzyme saline containing 0.25% chloroform, centrifugation, drying the extract in a sublimation apparatus at 60-70 ° C, treating with acetone powder of [1].
Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода целевого продукта, полученный препарат обладает низкой удельной активностью и содержит много балластных белков, что нежелательно при его использовании в медицине. Кроме того, применение ацетона в производстве взрыво- и пожароопасно. However, the known method does not provide a high yield of the target product, the resulting preparation has a low specific activity and contains many ballast proteins, which is undesirable when used in medicine. In addition, the use of acetone in the production of explosive and fire hazard.
Известен способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота [2] , по которому исходные замороженные сухим льдом ткани тестикул гомогенизируют в равном количестве воды. К полученной суспензии добавляют ледяную уксусную кислоту до рН 4,0 и оставляют при 4-5оС на 15 ч. Осадок отделяют центрифугированием и экстрагируют дополнительной водой. Надосадочные фракции объединяют, доводят рН до 4,5, добавляют сульфат аммония до 10-12% -ного насыщения и осадок части балластных белков отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 30-40%-ного насыщения, осадок, содержащий ферментативную активность, отделяют центрифугированием, растворяют, диализуют против холодной проточной воды в течение 24 ч и лиофилизуют. Все операции проводят при 0-5оС.A known method of producing hyaluronidase from the testes of cattle [2], in which the original frozen testicle tissue frozen with dry ice is homogenized in an equal amount of water. To this suspension was added glacial acetic acid to pH 4.0 and left at 4-5 ° C for 15 hours. The precipitate was separated by centrifugation and extracted with additional water. The supernatant fractions are combined, the pH is adjusted to 4.5, ammonium sulfate is added to 10-12% saturation and the precipitate of part of the ballast proteins is separated by centrifugation. Ammonium sulfate is added to the supernatant to 30-40% saturation, the precipitate containing enzymatic activity is separated by centrifugation, dissolved, dialyzed against cold running water for 24 hours and lyophilized. All operations are carried out at 0-5 o C.
Выход составляет 2,5 г (0,25%) из 1 кг исходного сырья. Активность 54.4 усл.ед. в 1 мг. The yield is 2.5 g (0.25%) of 1 kg of feedstock. Activity 54.4 conv. in 1 mg.
Основным недостатком этого способа получения гиалуронидазы являются многостадийность процесса, использование нескольких стадий, включающих центрифугирование, и невысокая удельная активность препарата. Кроме того, применение сульфата аммония, обладающего пирогенными свойствами, создает дополнительные трудности при получении препарата медицинского назначения. Полное удаление сульфата аммония из субстанции активного вещества требует длительного диализа, что является нетехнологичным процессом. При использовании этого способа получения гиалуронидазы в промышленности возникают экологические проблемы из-за большого расхода сульфата аммония. The main disadvantage of this method of obtaining hyaluronidase are the multi-stage process, the use of several stages, including centrifugation, and low specific activity of the drug. In addition, the use of ammonium sulfate, which has pyrogenic properties, creates additional difficulties in obtaining a medical product. The complete removal of ammonium sulfate from the substance of the active substance requires long-term dialysis, which is a low-tech process. When using this method of obtaining hyaluronidase in industry, environmental problems arise due to the high consumption of ammonium sulfate.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения, согласно которому семенники крупного рогатого скота измельчают, экстрагируют фермент водным раствором уксусной кислоты, отделяют экстракт от осадка центрифугированием, очищают его сорбцией фермента на белой глине и десорбируют при рН 4,5-4,7 [3]. Closest to the proposed is a production method, according to which the testes of cattle are crushed, the enzyme is extracted with an aqueous solution of acetic acid, the extract is separated from the precipitate by centrifugation, it is purified by sorption of the enzyme on white clay and stripped at pH 4.5-4.7 [3] .
Преимущество предлагаемого способа по сравнению с известным способом-прототипом заключается в повышении удельной активности целевого продукта - 140 усл.ед. в мг против 10-20 усл.ед./мг. The advantage of the proposed method compared with the known method of the prototype is to increase the specific activity of the target product is 140 srvc. in mg against 10-20 conventional units / mg.
Предлагаемый способ получения гиалуронидазы заключается в следующем. The proposed method of obtaining hyaluronidase is as follows.
Замороженные семенники убойных животных измельчают в гомогенизаторе, гиалуронидазу экстрагируют из них разбавленной уксусной кислотой, полученный экстракт концентрируют ультрафильтрацией в тангенциальном потоке, часть балластных белков удаляют осаждением из раствора 15% полиэтиленгликоля со средней молекулярной массой 1-20 тыс. Да и последующей катинообменной хроматографией на СМ-целлюлозе. The frozen testes of the slaughtered animals are crushed in a homogenizer, the hyaluronidase is extracted from them with diluted acetic acid, the resulting extract is concentrated by ultrafiltration in a tangential flow, part of the ballast proteins is removed by precipitation from a solution of 15% polyethylene glycol with an average molecular weight of 1-20 thousand Da and subsequent cathodine chromatography cellulose.
Определяющими отличиями предлагаемого способа получения гиалуронидазы от способа-прототипа являются:
концентрирование экстракта осуществляют ультрафильтрацией в экспериментально подобранном оптимальном режиме, что позволяет повысить удельную активность целевого продукта при практически полном сохранении его суммарной активности;
очистку целевого продукта от балластных белков проводят добавляя к концентрату полиэтиленгликоль (ПЭГ) и осаждая балластные белки. Дополнительную очистку проводят с помощью катионообменной хроматографии.The defining differences of the proposed method for producing hyaluronidase from the prototype method are:
concentration of the extract is carried out by ultrafiltration in an experimentally selected optimal mode, which allows to increase the specific activity of the target product with almost complete preservation of its total activity;
purification of the target product from ballast proteins is carried out by adding polyethylene glycol (PEG) to the concentrate and precipitating ballast proteins. Additional purification is carried out using cation exchange chromatography.
Ультрафильтрационный процесс концентрирования и разделения белков характеризуется высокой экономичностью, эффективностью и в последнее время находит все более широкое применение в лабораторной практике и промышленной биотехнологии. Ультрафильтрационные установки с тангенциальным потоком жидкости на основе полых волокон имеют развитую площадь фильтрации и считаются наиболее эффективными и надежными в эксплуатации. Вместе с тем использование ультрафильтрации для концентрирования растворов грубых экстрактов биологически активных веществ не является очевидной, традиционной процедурой, так как в каждом случае требует специального исследования для тщательного подбора условий ведения процесса и типа используемых мембран или волокон. Это обусловлено тем, что целевые белки и, в частности, ферменты могут значительно инактивироваться при концентрировании за счет явлений концентрационной поляризации на поверхности волокон, их денатурирующего воздействия, а также разрушаться протеазами, присутствующими в исходных смесях белковых компонентов. The ultrafiltration process of protein concentration and separation is characterized by high efficiency, efficiency, and recently finds more and more widespread application in laboratory practice and industrial biotechnology. Ultrafiltration installations with a tangential fluid flow based on hollow fibers have a developed filtration area and are considered the most effective and reliable in operation. However, the use of ultrafiltration to concentrate solutions of coarse extracts of biologically active substances is not an obvious, traditional procedure, since in each case it requires special research to carefully select the conditions for the process and the type of membranes or fibers used. This is due to the fact that the target proteins and, in particular, enzymes can be significantly inactivated during concentration due to the effects of concentration polarization on the surface of the fibers, their denaturing effect, as well as destroyed by proteases present in the initial mixtures of protein components.
В результате проведенных исследований были найдены оптимальный для эффективной экстракции и концентрирования ультрафильтрацией состав буферного раствора и тип полых волокон. As a result of the studies, the composition of the buffer solution and the type of hollow fibers optimal for effective extraction and concentration by ultrafiltration were found.
Для концентрирования экстракта был использован разделительный аппарат АР-0,1 с полыми волокнами из фенилона С-типа 15ПА. Однако в процессе ультрафильтрации наблюдалось значительное снижение активности гиалуронидазы. Применение для концентрирования аналогичного разделительного аппарата АР-0,1 с волокнами типа 50 ПА с диаметром пор, близким к размерам гиалуронидазы, позволило устранить эту потерю активности. Различие в эффективности двух типов волокон, вероятно, обусловлено тем, что узкопористые волокна одновременно с целевой гиалуронидазой концентрируют примесные протеазы, которые при этом расщепляют часть целевого продукта. Широкопористые волокна удаляют большее количество балластных белков, включая протеазы, и кроме того позволяют увеличить скорость концентрирования. To concentrate the extract, an AP-0.1 separation apparatus with hollow fibers of 15P phenylone C-type was used. However, a significant decrease in hyaluronidase activity was observed during ultrafiltration. The use for concentration of a similar separation apparatus AP-0.1 with fibers of type 50 PA with pore diameters close to the sizes of hyaluronidase allowed to eliminate this loss of activity. The difference in the effectiveness of the two types of fibers is probably due to the fact that the narrowly porous fibers simultaneously with the target hyaluronidase concentrate impurity proteases, which in doing so cleave part of the target product. Broad-porous fibers remove a larger amount of ballast proteins, including proteases, and also increase the concentration rate.
При ультрафильтрации на разделительном аппарате с этим типом полых волокон происходит не только концентрирование, но и дополнительная очистка фермента за счет удаления с фильтратом половины балластных белков с молекулярной массой менее 50 КДа при практически полном сохранении исходной активности гиалуронидазы. During ultrafiltration on a separation apparatus with this type of hollow fibers, not only concentration occurs, but also an additional purification of the enzyme due to removal of half of the ballast proteins with a molecular mass of less than 50 KDa with the filtrate, while the initial activity of hyaluronidase is almost completely preserved.
Для осаждения части балластных белков применяли ПЭГ. Использование для этой цели 5-25% ПЭГ показало, что оптимальной является концентрация 15%, при которой наблюдается максимальное удаление балластных белков при сохранении собственно целевого продукта в растворе. Применение ПЭГа со средними молекулярными массами 1000, 1500, 6000 или 20000 дает примерно одинаковые результаты и удаляет 70% балластных белков из используемого концентрата. PEG was used to precipitate part of the ballast proteins. The use of 5-25% PEG for this purpose showed that the concentration of 15% is optimal, at which the maximum removal of ballast proteins is observed while maintaining the actual target product in solution. The use of PEGs with average molecular weights of 1000, 1500, 6000 or 20,000 gives approximately the same results and removes 70% of ballast proteins from the concentrate used.
На заключительной стадии очистки гиалуронидазы использовали катионообменную хроматографию, что позволяет дополнительно повысить удельную активность фермента. Преимущественно проводили хроматографию на карбок- симетилцеллюлозе фирмы "Whatman". Этот сорбент входит в перечень хроматографических носителей, разрешенных для производства медицинских иммунобиоло- гических препаратов. At the final stage of hyaluronidase purification, cation exchange chromatography was used, which allows one to further increase the specific activity of the enzyme. Whatman was predominantly chromatographed on carboxymethyl cellulose. This sorbent is included in the list of chromatographic carriers authorized for the production of medical immunobiological preparations.
Полученная на предыдущей стадии очистки надосадочную жидкость наносили на катинообменную колонку, промывали буфером и элюировали фермент буфером, содержащим 0,6 М NaCl. The supernatant obtained in the previous purification step was applied to a cathine exchange column, washed with a buffer, and the enzyme was eluted with a buffer containing 0.6 M NaCl.
Полученный препарат в 100 мл содержал 780 мг белка (0,078% от массы исходного сырья) и имел удельную активность 140 усл.ед. в 1 мл, т.е. превышал удельную активность фермента, полученного по известному способу-прототипу, в 27 раз. The resulting preparation in 100 ml contained 780 mg of protein (0.078% by weight of the feedstock) and had a specific activity of 140 conventional units. in 1 ml, i.e. exceeded the specific activity of the enzyme obtained by the known method of the prototype, 27 times.
Предлагаемый способ получения гиалуронидазы позволяет получить препарат, практически свободный от бычьего сывороточного альбумина (БСА) - одного из белков, вызывающих аллергические реакции организма. Способ экономичен, он требует меньшего расхода реактивов на единицу целевого продукта, экологически чище, взрыво- и пожаробезопаснее. The proposed method for producing hyaluronidase allows you to get a drug that is practically free of bovine serum albumin (BSA) - one of the proteins that cause allergic reactions of the body. The method is economical, it requires less reagent consumption per unit of the target product, more environmentally friendly, explosion and fire safety.
В связи с тем, что в известных научно-технических и патентных источниках сведений об аналогичном способе получения гиалуронидазы не обнаружено, можно сделать вывод о том, что заявляемое техническое решение отвечает критериям "новизна и изобретательский уровень". Due to the fact that in the well-known scientific, technical and patent sources, information about a similar method for producing hyaluronidase is not found, we can conclude that the claimed technical solution meets the criteria of "novelty and inventive step".
П р и м е р 1. 1 кг замороженных семенников убойных животных измельчают в гомогенизаторе, добавляют 2,5 л воды, 18 мл ледяной уксусной кислоты, перемешивают и оставляют при 4-5оС на 2-12 ч. Далее все операции проводят при 0-5оС. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием при 5.000g 10 мин и концентрируют до 0,1 л на установке УПЛ-0,6 с полыми волокнами 50ПА. Концентрат диафильтруют на этой же установке, используя 0,2 л буфера, содержащего 0,05 М NaAc и 0,15 М NaCl рН 4,7. К концентрату добавляют ПЭГа с молекулярной массой 1500 до 15% (вес/объем), перемешивают и оставляют на 2-12 ч. Осадок центрифугируют и отбрасывают. Супернатант в объеме 110 мл наносят на катионообменную колонку с СМ-целлюлозой "Whatman" (3х7 см), уравновешенную 0,05 М NaCl, рН 4,7. Колонку промывают 0,2 М NaCl, растворенного в этом же буфере, и фермент элюируют 0,1 л 0,6 М NaCl в 0,05 М NaAc рН 4,7.PRI me R 1. 1 kg of frozen testes of slaughtered animals is crushed in a homogenizer, add 2.5 l of water, 18 ml of glacial acetic acid, mix and leave at 4-5 about C for 2-12 hours. Next, all operations are carried out at 0-5 ° C. The extract is separated from the precipitate by centrifuging at 5.000g for 10 minutes and concentrated to 0.1 liters per installation UPL-0,6 hollow fiber 50 Pa. The concentrate is diafiltered in the same apparatus using 0.2 L of buffer containing 0.05 M NaAc and 0.15 M NaCl pH 4.7. PEG was added to the concentrate with a molecular weight of 1500 to 15% (w / v), stirred and left for 2-12 hours. The precipitate was centrifuged and discarded. The supernatant in a volume of 110 ml was applied on a cation exchange column with Whatman CM cellulose (3x7 cm), balanced with 0.05 M NaCl, pH 4.7. The column is washed with 0.2 M NaCl dissolved in the same buffer, and the enzyme is eluted with 0.1 L of 0.6 M NaCl in 0.05 M NaAc pH 4.7.
Выход гиалуронидазы составил 780 мг (0,078% к массе исходного сырья) с удельной активностью 140 усл.ед. в 1 мг. The yield of hyaluronidase was 780 mg (0.078% by weight of the feedstock) with a specific activity of 140 conventional units. in 1 mg.
П р и м е р 2. Все операции проводят как описано в примере 1, используя для ультрафильтрации половолоконный разделительный аппарат АР-15ПА. PRI me R 2. All operations are carried out as described in example 1, using ultrafiltration hollow fiber separation apparatus AR-15PA.
Выход гиалуронидазы при этом составил 840 мг (0,084% к массе исходного сырья) с удельной активностью 40 усл.ед. в 1 мг. The yield of hyaluronidase in this case was 840 mg (0.084% by weight of the feedstock) with a specific activity of 40 conventional units. in 1 mg.
П р и м е р 3. Все операции проводят как описано в примере 1, используя 13% ПЭГ. PRI me R 3. All operations are carried out as described in example 1, using 13% PEG.
Выход составил 840 мг с удельной активностью 105 усл.ед. в 1 мг. The yield was 840 mg with a specific activity of 105 conventional units. in 1 mg.
П р и м е р 4. Все операции проводят как описано в примере 1, используя 18% ПЭГ. PRI me R 4. All operations are carried out as described in example 1, using 18% PEG.
Выход фермента составил 540 мг (0,054% к массе исходного сырья) с удельной активностью 130 усл.ед. в 1 мг. The enzyme yield was 540 mg (0.054% by weight of the feedstock) with a specific activity of 130 conventional units. in 1 mg.
П р и м е р 5. Способ проводят по примеру 1. При этом катионообменную хроматографию проводят на смоле КБ-2Э-7, проводя сорбцию гиалуронидазы при рН 4,7, а десорбцию при этом же рН 0,6 М NaCl. Выход фермента при этом составил 360 мг (0,036% к массе исходного сырья) с удельной активностью 80 усл.ед./мг. PRI me R 5. The method is carried out as in example 1. At the same time, cation exchange chromatography is carried out on a KB-2E-7 resin, performing sorption of hyaluronidase at pH 4.7, and desorption at the same pH of 0.6 M NaCl. The yield of the enzyme was 360 mg (0.036% by weight of the feedstock) with a specific activity of 80 conventional units / mg.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5025578 RU2027759C1 (en) | 1992-02-03 | 1992-02-03 | Method of hyaluronidase preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5025578 RU2027759C1 (en) | 1992-02-03 | 1992-02-03 | Method of hyaluronidase preparing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2027759C1 true RU2027759C1 (en) | 1995-01-27 |
Family
ID=21596032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5025578 RU2027759C1 (en) | 1992-02-03 | 1992-02-03 | Method of hyaluronidase preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2027759C1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0892045A3 (en) * | 1997-06-17 | 2001-02-07 | Pharma Dessau GmbH | Process for the production of a preparation containing hyaluronidase |
| CN103103170A (en) * | 2013-02-06 | 2013-05-15 | 甘肃天森药业有限公司 | Production process for cow or sheep hyaluronidase |
| RU2658605C2 (en) * | 2016-07-01 | 2018-06-21 | Наталья Владимировна Глазова | Method for producing hyaluronidase from testis of large cattle |
| RU2671537C2 (en) * | 2016-09-01 | 2018-11-02 | Общество с ограниченной ответственностью "Самсон-Мед" | Hyaluronidase preparation and method of its preparation |
| WO2022060235A1 (en) * | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Pharmfactor Sp. Z O.O. | Method of obtaining hyaluronidase from bovine testes |
-
1992
- 1992-02-03 RU SU5025578 patent/RU2027759C1/en active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 1. Гуров В.А. Справочник по органопрепаратам.-М.: 1970, с.96. * |
| 2. Патент Великобритании N 682933, кл. C 12N 9/24, опублик. 1952. * |
| 3. Авторское свидетельство СССР N 1666534, кл. C 12N 9/26, опублик. 1991. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0892045A3 (en) * | 1997-06-17 | 2001-02-07 | Pharma Dessau GmbH | Process for the production of a preparation containing hyaluronidase |
| EP1624057A3 (en) * | 1997-06-17 | 2007-03-07 | Riemser Arzneimittel AG | Process for the obtention of a composition containing hyaluronidase |
| CN103103170A (en) * | 2013-02-06 | 2013-05-15 | 甘肃天森药业有限公司 | Production process for cow or sheep hyaluronidase |
| RU2658605C2 (en) * | 2016-07-01 | 2018-06-21 | Наталья Владимировна Глазова | Method for producing hyaluronidase from testis of large cattle |
| RU2671537C2 (en) * | 2016-09-01 | 2018-11-02 | Общество с ограниченной ответственностью "Самсон-Мед" | Hyaluronidase preparation and method of its preparation |
| WO2022060235A1 (en) * | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Pharmfactor Sp. Z O.O. | Method of obtaining hyaluronidase from bovine testes |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5332503A (en) | Process for purifying collagenase | |
| US3998947A (en) | Process for obtaining a plasminogen activator | |
| JPS59137417A (en) | Preparation of colonization stimulation factor and kallikrein originated from human urine | |
| NO138145B (en) | PROCEDURE FOR PREPARING AN ENZYME PREPARATION | |
| US4314994A (en) | Process for obtaining a plasminogen activator | |
| RU2027759C1 (en) | Method of hyaluronidase preparing | |
| US2808362A (en) | Preparation of hyaluronidase | |
| US4027012A (en) | Process for the extraction of components having anticoagulant activity "in vivo" from snake venoms and products obtained | |
| Gerwing et al. | Activation phenomenon of Clostridium botulinum type E toxin | |
| Stehle | The chemistry of the hormones of the posterior lobe of the pituitary gland | |
| US4532214A (en) | Method for isolation of aminoacylase | |
| Ives et al. | Purification of CA-7, a thrombolytic fungal protease | |
| EP0059182B1 (en) | A process for isolating aminoacylase enzyme from a mammal kidney extract | |
| US3622462A (en) | Process for manufacture of an enzyme preparation | |
| US3477913A (en) | Method of production of urokinase | |
| RU2584601C1 (en) | Method of extracting proteolytic terrilytin enzyme | |
| RU2225441C1 (en) | Method for preparing collagenase preparation | |
| KR950012897B1 (en) | Method for purification of strep to kinas and strepto dornase | |
| US3016337A (en) | Process for depyrogenation and purification of streptokinase | |
| RU2003688C1 (en) | Method for processing commercial protosubtilin into protolysine | |
| RU2039819C1 (en) | Method for production of collagenase | |
| RU1799599C (en) | Method of lectin preparation | |
| SU1108102A1 (en) | Method of obtaining peroxidase | |
| RU2139067C1 (en) | Method of preparing albumin from human placentas | |
| NO135709B (en) |