RU2304441C1 - Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues - Google Patents
Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues Download PDFInfo
- Publication number
- RU2304441C1 RU2304441C1 RU2005136580/15A RU2005136580A RU2304441C1 RU 2304441 C1 RU2304441 C1 RU 2304441C1 RU 2005136580/15 A RU2005136580/15 A RU 2005136580/15A RU 2005136580 A RU2005136580 A RU 2005136580A RU 2304441 C1 RU2304441 C1 RU 2304441C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tissue
- sgag
- washed
- solution
- carrier
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения одного из основных компонентов соединительной ткани - сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ) для применения их в качестве фармацевтических субстанций в медицине и ветеринарии, лекарственных средств и профилактических материалов, например глазных капель, мазей, суспензий и т.д., или в составе изделий медицинского назначения.The invention relates to medicine and can be used to obtain one of the main components of connective tissue - sulfated glycosaminoglycans (sGAG) for use as pharmaceutical substances in medicine and veterinary medicine, drugs and prophylactic materials, such as eye drops, ointments, suspensions, etc. etc., or as part of medical devices.
Известен способ получения сГАГ из трахеи крупного рогатого скота и плавников акул, включающий гидролиз суспензии ацетонового порошка из тканей 1% раствором папаина в течение суток при 62°С, последующее осаждение гидролизата ацетоном, растворение осадка в физиологическом растворе, обесцвечивание с помощью KMnO4 и осаждение ацетоном (DE №2037942, А61К 31/725).A known method of producing sGAG from cattle trachea and shark fin, including hydrolysis of a suspension of acetone powder from tissues with 1% papain solution during the day at 62 ° C, subsequent precipitation of the hydrolyzate with acetone, dissolution of the precipitate in physiological solution, decolorization using KMnO 4 and precipitation acetone (DE No. 2037942, A61K 31/725).
Однако этот достаточно простой и удобный способ не дает возможности получить высокоочищенный препарат сГАГ. Кроме того, способ не позволяет обеспечить высокий выход сГАГ и имеет высокую затратную часть.However, this rather simple and convenient method does not make it possible to obtain a highly purified preparation of sGAG. In addition, the method does not allow to provide a high output sGAG and has a high cost part.
Известен способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов из роговой оболочки глаза, включающий обработку роговицы сельскохозяйственных животных водными растворами и этанолом с последующим кипячением (RU №2056851). Недостатками способа является частичная потеря гликозаминогликанов, при диализе часть гликозаминогликанов остается в осадке, в частности кератан-сульфат. Кроме того, при обработке роговицы ферментом часть гликозаминогликанов остается в неразрушенной ткани, что приводит к снижению выхода целевого продукта, с помощью данного способа могут быть получены только растворенные сульфатированные гликозаминогликаны.A known method for the allocation of sulfated glycosaminoglycans from the cornea of the eye, including the processing of the cornea of farm animals with aqueous solutions and ethanol, followed by boiling (RU No. 2056851). The disadvantages of the method is the partial loss of glycosaminoglycans, during dialysis, part of the glycosaminoglycans remains in the sediment, in particular keratan sulfate. In addition, when processing the cornea with an enzyme, a part of the glycosaminoglycans remains in the undamaged tissue, which leads to a decrease in the yield of the target product, using this method only dissolved sulfated glycosaminoglycans can be obtained.
Известен способ выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща, при котором образец ткани подвергают ферментативному протеолизу, из полученного гидролизата выделяют специфические компоненты гликозаминогликаны с помощью осаждения их из гидролизата четвертичными аммонийными основаниями /детергентами/, проводят их поэтапную очистку и количественное определение (Adams N.E., Muir H. The glycosaminoglycans of canine menisci // Biochem. J. 1981. V.197, N2. P.385-389).A known method for the isolation of glycosaminoglycans from fibrous cartilage, in which a tissue sample is subjected to enzymatic proteolysis, specific components of glycosaminoglycans are isolated from the obtained hydrolyzate by precipitating them from the hydrolyzate with quaternary ammonium bases / detergents /, and they are gradually purified and quantified by H. Adams NE The glycosaminoglycans of canine menisci // Biochem. J. 1981. V.197, N2. P.385-389).
Известен также способ выделения гликозаминогликанов из тканей, формирующих элементы сустава, в том числе и из фиброзного хряща, заключающийся в ферментативном протеолизе измельченного образца ткани в 0,1 М ацетатном буфере, содержащем папаин в количестве одной четвертой от сырого веса ткани при температуре +60±4°С в течение 24 ч, депротеинизации полученного гидролизата трихлоруксусной кислотой в течение 24 ч при температуре +4°С, очистку выделенных гликозаминогликанов с помощью осаждения этанолом, содержащим уксуснокислые соли кальция или натрия, в течение 24 ч при температуре +4°С, количественном определении гликозаминогликанов (Карякина Е.В., Косягин Д.В. Особенности выделения гликозаминогликанов тканей, формирующих элементы сустава // Всесоюзная конф. ревматологов: Тез. докл. (7-9 декабря 1988 г.). Москва, 1988, с.108-109).There is also a method of isolating glycosaminoglycans from tissues forming joint elements, including fibrous cartilage, which involves enzymatic proteolysis of a ground tissue sample in 0.1 M acetate buffer containing papain in the amount of one fourth of the wet tissue weight at a temperature of + 60 ± 4 ° C for 24 h, deproteinization of the resulting hydrolyzate with trichloroacetic acid for 24 h at + 4 ° C, purification of the isolated glycosaminoglycans by precipitation with ethanol containing calcium acetate or sodium, for 24 hours at a temperature of + 4 ° С, quantitative determination of glycosaminoglycans (Karyakina E.V., Kosyagin D.V. Features of the isolation of glycosaminoglycans of tissues forming the elements of the joint // All-Union Conference of Rheumatologists: Abstracts (7- December 9, 1988). Moscow, 1988, pp. 108-109).
Недостатком известных способов является большая продолжительность проведения исследований (4-5 суток), что не позволяет оперативно получить информацию о состоянии внутрисуставных соединительнотканых структур.A disadvantage of the known methods is the long duration of the study (4-5 days), which does not allow to quickly obtain information about the state of intraarticular connective tissue structures.
Известен способ получения сульфатированных гликозаминогликанов, заключающийся в обработке роговицы сельскохозяйственных животных водными растворами и эталоном с последующим кипячением, при этом роговицы сельскохозяйственных животных помещают в смесь равных частей физраствора и дистиллированной воды в соотношении роговицы и водной смеси 1:1, трехкратно замораживают при 0°С, измельчают до частиц размером 0,1×0,1 мм, добавляют этанол до концентрации 1%, гомогенизируют, повторно добавляют этанол до конечной концентрации 5%, после чего кипятят в течение 5-10 мин (RU №2118524, A61F 9/00, А61К 35/14, опубл. 10.09.1998).A known method of producing sulfated glycosaminoglycans, which consists in treating the cornea of farm animals with aqueous solutions and a standard, followed by boiling, while the corneas of farm animals are placed in a mixture of equal parts of saline and distilled water in the ratio of the cornea and water mixture 1: 1, three times frozen at 0 ° C , crushed to particles with a size of 0.1 × 0.1 mm, add ethanol to a concentration of 1%, homogenize, re-add ethanol to a final concentration of 5%, and then boil t for 5-10 minutes (RU No. 211 18524, A61F 9/00, A61K 35/14, publ. 09/10/1998).
Недостатками указанного способа является то, что такая обработка трудоемка, высокозатратна и не обеспечивает полного выхода и освобождение из раствора сГАГ, а также от примеси белковых и других антигенных молекул, которые присутствуют в указанных тканях, что существенно снижает чистоту конечного продукта. Данный способ получения сГАГ из роговицы выбран за прототип, поскольку наиболее близок по своему техническому решению к предлагаемому изобретению.The disadvantages of this method is that such processing is time-consuming, costly and does not provide complete exit and release from the sGAG solution, as well as from impurities of protein and other antigenic molecules that are present in these tissues, which significantly reduces the purity of the final product. This method of obtaining sGAG from the cornea is selected as the prototype, because it is closest in its technical solution to the proposed invention.
Задачей изобретения является повышение качества выделения сГАГ для использования в биохимии, для получения чистых сложных полисахаридов, а также фармацевтических субстанций путем ферментной обработки биологических тканей, выделения сГАГ на носителе из коллагена костной ткани и их очистки и как результат применения этих этапов увеличение выхода высококачественного конечного продукта, снижение количества белка в препарате, снижение его антигенных характеристик и повышение его биосовместимости.The objective of the invention is to improve the quality of isolation of sGAG for use in biochemistry, to obtain pure complex polysaccharides, as well as pharmaceutical substances by enzymatic treatment of biological tissues, isolation of sGAG on a carrier from bone collagen and their purification, and as a result of applying these steps to increase the yield of high-quality final product , a decrease in the amount of protein in the preparation, a decrease in its antigenic characteristics and an increase in its biocompatibility.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является получение высокоочищенных сГАГ для получения фармацевтических субстанций, которые могут широко использоваться для получения фармацевтических препаратов и ряда изделий медицинского назначения, в состав которых входят сГАГ.The technical result achieved by using the invention is to obtain highly purified sGAG to obtain pharmaceutical substances, which can be widely used to obtain pharmaceuticals and a number of medical devices, which include sGAG.
Технический результат достигается тем, что в способе получения сГАГ по настоящему изобретению измельченную биологическую ткань промывают в нагретом до 65°С буферном растворе, обрабатывают ферментом в определенном режиме, удаляют из перевара жиры и остатки ткани, селективно выделяют из него сГАГ на носителе из костного коллагена, элюируют с носителя раствором хлористого натрия в уксусной кислоте или слабыми растворами щелочи, осаждают органическими растворами, высушивают и стерилизуют.The technical result is achieved by the fact that in the method for producing sGAG of the present invention, the crushed biological tissue is washed in a buffer solution heated to 65 ° C, treated with an enzyme in a specific mode, fats and tissue residues are removed from the digest, and sGAG is selectively isolated from it on a bone collagen carrier , elute from the carrier with a solution of sodium chloride in acetic acid or weak alkaline solutions, precipitated with organic solutions, dried and sterilized.
Сырьем для получения сГАГ могут быть любые ткани природного происхождения (от животных или при необходимости донорская ткань человека), содержащие протегликаны (роговица, хрящ, кость, трахея, печень, тонкий кишечник и т.д.). Известно, что именно в состав протеогликанов входят сГАГ, такие как хондроитин-сульфаты, кератан-, гепаран- и дерматан-сульфаты. Кроме того, к сГАГ относится гепарин, который в тканях организма не связан с белком. Первые в составе протеогликанов связаны с гиалуроновой кислотой коровыми протеинами, которые характеризуются высокой антигенностью (Стейси М. и Баркер С.«Углеводы живой ткани». М., Мир, 1965, стр.35-38).Any tissue of natural origin (from animals or, if necessary, human donor tissue) containing proteglycans (cornea, cartilage, bone, trachea, liver, small intestine, etc.) can be the raw material for obtaining sGAG. It is known that sGAGs, such as chondroitin sulfates, keratan, heparan and dermatan sulfates, are precisely the constituents of proteoglycans. In addition, heparin, which in the tissues of the body is not associated with protein, belongs to sGAG. The former in the composition of proteoglycans are associated with hyaluronic acid by core proteins, which are characterized by high antigenicity (Stacy M. and Barker S. “Carbohydrates of living tissue”. M., Mir, 1965, pp. 35-38).
Технология получения сГАГ требует начальной механической обработки ткани, когда ткань первоначально очищается от остатков мягких тканей и крови. Затем ткань измельчают: мягкие ткани в замороженном состоянии пропускают через мясорубку, твердые, например хрящ или кость, нарезают или распиливают на фрагменты.The technology for producing sGAG requires initial mechanical processing of the tissue, when the tissue is initially cleaned of the remnants of soft tissues and blood. Then the tissue is crushed: soft tissues in a frozen state are passed through a meat grinder, hard ones, such as cartilage or bone, are cut or sawn into fragments.
Существенным признаком изобретения является то, что измельченную ткань промывают 2 раза нагретым до 65°С 0,1 М фосфатным буфером рН 5,8-6,0 в соотношении на 1 часть ткани 1,5-2 объема буфера и затем выдерживают в новой порции нагретого буфера в течение 15-30 минут. Этот этап позволяет оптимизировать условия дальнейшего воздействия фермента на перевариваемую ткань, значительно повысить выход сГАГ и сократить сроки инкубации тканей в условиях повышенной температуры, обеспечивая тем самым большую сохранность получаемого продукта. Промытую ткань подвергают ферментативному гидролизу при 65°С в течение 6-24 часов.An essential feature of the invention is that the crushed tissue is washed 2 times heated to 65 ° C with 0.1 M phosphate buffer pH 5.8-6.0 in a ratio of 1.5-2 buffer volumes per 1 part of tissue and then kept in a new portion heated buffer for 15-30 minutes. This stage allows you to optimize the conditions for the further action of the enzyme on the digested tissue, significantly increase the yield of sGAG and reduce the time of incubation of tissues at elevated temperatures, thereby ensuring greater safety of the resulting product. The washed tissue is subjected to enzymatic hydrolysis at 65 ° C for 6-24 hours.
В качестве фермента, расщепляющего тканевые антигены - белки, гликопротеины и протеогликаны, был применен 0,1-0,4% раствор активированного папаина, который, как хорошо известно, при данных условиях разрушает белки и отщепляет полисахаридные цепи сГАГ от протеогликанов. При этом полисахаридные цепи сГАГ полностью сохраняются. Для большинства типов соединительной ткани (роговица, склера, тонкий кишечник, легкое) концентрация папаина 0,1-0,2% является оптимальной при температурном режиме переваривания 65°С и времени инкубации 6 часов. Однако при обработке более твердых и плотных тканей, таких как трахея или кость, эта концентрация должна быть увеличена до 0,3-0,4%, а время переваривания до 24 часов.As an enzyme that breaks down tissue antigens - proteins, glycoproteins, and proteoglycans, a 0.1-0.4% solution of activated papain was used, which, as is well known, under these conditions destroys proteins and cleaves sGAG polysaccharide chains from proteoglycans. In this case, the polysaccharide chains of sGAG are completely preserved. For most types of connective tissue (cornea, sclera, small intestine, lung), papain concentration of 0.1-0.2% is optimal at a temperature of digestion of 65 ° C and an incubation time of 6 hours. However, when processing harder and denser tissues, such as trachea or bone, this concentration should be increased to 0.3-0.4%, and the digestion time to 24 hours.
Полученный таким образом тканевой перевар охлаждают до 4°С и выдерживают при этой температуре в течение 2-24 часов. При данной температуре и времени инкубации происходит осаждение тканевых остатков и застывание липидов, которые затем удаляют фильтрованием на холоду. Непереваренные остатки ткани (например, кости) затем промывают, например, дистиллированной водой, нагретой до 60-80°С, которую потом объединяют с основным переваром. Этот этап необходим для снижения потерь сГАГ при последующем их выделении.Thus obtained tissue digest is cooled to 4 ° C and maintained at this temperature for 2-24 hours. At a given temperature and incubation time, tissue residues precipitate and lipids solidify, which are then removed by filtration in the cold. The undigested tissue residues (for example, bones) are then washed, for example, with distilled water heated to 60-80 ° C, which is then combined with the main digest. This stage is necessary to reduce the loss of sGAG during their subsequent isolation.
Эффективность воздействия фермента на материал определяется по выходу в перевар сГАГ, а именно по их окрашиванию 1,9-диметиленовым синим с последующей оценкой спектрофотометрически при длине волны 535 нм (по методу Farndel). Существенным признаком изобретения является и то, что сГАГ селективно выделяют на твердом носителе из коллагена костной ткани с размерами частиц от 0,01 до 0,35 см3, предпочтительно 0,125 см3. Нами экспериментально установлено, что костный коллаген аффинно (по сродству) способен связывать сГАГ и ряд других биологически активных веществ. Именно на этом принципе базируется применение его в качестве носителя, действующего как субстрат для аффинной хроматографии. Коллаген из костной ткани удовлетворяет всем основным требованиям, предъявляемым к носителям (матрицам), применяемым в аффинной хроматографии для разделения, концентрирования и очистки биологически активных веществ. Так, он содержит большое число групп, способных афинно связываться с лигандом; не разрушается при связывании с лигандом и не утрачивает своих свойств при последующей элюции с него биомолекул растворами кислот или щелочей; обеспечивает быстрое и равномерное протекание раствора; а при определенных условиях слабо или совсем не реагирует с другими макромолекулами. К достоинствам коллагена из костной ткани как носителя следует также отнести его достаточную пластичность и устойчивость к действию растворов кислот, щелочей и солей. Его пористо-волокнистая структура, имеющая большую реакционную поверхность и высокую способность связывания, обеспечивает возможность последующего концентрирования лиганда и, как следствие этого, повышение выхода конечного очищенного продукта.The effectiveness of the effect of the enzyme on the material is determined by the release of sHAG into the digest, namely, their staining with 1.9-dimethylene blue, followed by spectrophotometric evaluation at a wavelength of 535 nm (according to the Farndel method). An essential feature of the invention is that sGAG is selectively isolated on a solid carrier from bone collagen with particle sizes from 0.01 to 0.35 cm 3 , preferably 0.125 cm 3 . We experimentally established that bone collagen is affinity (by affinity) able to bind sGAG and a number of other biologically active substances. It is on this principle that its use as a carrier, acting as a substrate for affinity chromatography, is based. Collagen from bone tissue meets all the basic requirements for carriers (matrices) used in affinity chromatography for the separation, concentration and purification of biologically active substances. So, it contains a large number of groups capable of affinity to bind to the ligand; does not collapse upon binding to the ligand and does not lose its properties upon subsequent elution of biomolecules from it with solutions of acids or alkalis; provides fast and uniform course of solution; and under certain conditions, weakly or completely does not react with other macromolecules. The advantages of collagen from bone tissue as a carrier should also include its sufficient plasticity and resistance to the action of solutions of acids, alkalis and salts. Its porous-fibrous structure, having a large reaction surface and high binding ability, provides the possibility of subsequent concentration of the ligand and, as a consequence, an increase in the yield of the final purified product.
Материалом для получения твердого носителя является губчатая кость млекопитающих. Коллаген этой ткани на 95% состоит из коллагена I типа и характеризуется очень слабой растворимостью в растворах кислот или щелочей и высокой устойчивостью к действию протеолитических ферментов.The material for obtaining a solid carrier is the spongy bone of mammals. The collagen of this tissue is 95% composed of type I collagen and is characterized by very weak solubility in solutions of acids or alkalis and high resistance to proteolytic enzymes.
Размеры кусочков коллагена, используемые в качестве сорбента, определены нами экспериментально при выделении на них сГАГ. При этом минимальный размер кусочка равен 0,01 см3, так как он обеспечивает минимальные рабочие объемы и достаточную поверхность связывания. Максимальный размер определен как 0,35 см 3, так как превышение данного размера затрудняет прохождение в поры носителя циркулирующих растворов.The sizes of collagen pieces used as a sorbent were determined experimentally by us when sGAG was isolated on them. In this case, the minimum size of the piece is equal to 0.01 cm 3 , as it provides minimum working volumes and a sufficient binding surface. The maximum size is defined as 0.35 cm 3 , since exceeding this size makes it difficult for circulating solutions to pass into the pores of the carrier.
Селективное выделение сГАГ на коллагеновом носителе ведут при комнатной температуре в течение 4-24 часов. При низкой концентрации сГАГ в переваре достаточно всего нескольких часов инкубации для их связывания с субстратом, тогда как при высокой концентрации это время, как правило, составляет 24 часа. Время инкубации установлено экспериментально по исчезновению сГАГ из инкубационного раствора: при низкой концентрации они не определяются уже через 4-10 часов инкубации, а при высокой - через 24 часа инкубации.Selective isolation of sGAG on a collagen carrier is carried out at room temperature for 4-24 hours. At a low concentration of sGAG in the digest, only a few hours of incubation are sufficient for their binding to the substrate, whereas at a high concentration this time, as a rule, is 24 hours. The incubation time was established experimentally by the disappearance of sGAG from the incubation solution: at low concentrations they are not detected after 4-10 hours of incubation, and at high concentration after 24 hours of incubation.
Затем коллагеновый носитель отмывают слабыми (0,05-0,1 N) растворами кислоты для удаления неспецифически связавшихся веществ и, в частности, белковых молекул. Концентрация кислоты была установлена опытным путем. Так, при концентрации соляной кислоты ниже 0,05 N часть неспецифически связанных белков может оставаться на коллагеновом субстрате и впоследствии загрязнять получаемый продукт, тогда как при концентрации кислоты выше 0,1 N может происходить частичное снятие сГАГ с коллагенового субстрата. Отмывание субстрата ведут до полного исчезновения белка в смыве.Then, the collagen carrier is washed with weak (0.05-0.1 N) acid solutions to remove non-specifically bound substances and, in particular, protein molecules. The acid concentration was established experimentally. So, at a hydrochloric acid concentration below 0.05 N, part of the non-specifically bound proteins may remain on the collagen substrate and subsequently contaminate the resulting product, while at an acid concentration above 0.1 N, partial removal of sGAG from the collagen substrate may occur. Washing of the substrate leads to the complete disappearance of the protein in the washout.
Выход белка в элюат определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и по Бредфорду при длине волны 260 и 280 нм.The protein yield in the eluate was determined by the Lowry Pharmacopoeia spectroscopically at a wavelength of 400 nm and Bradford at a wavelength of 260 and 280 nm.
Существенным признаком изобретения является то, что сГАГ с субстрата снимают 0,6-1,5 N раствором хлорида натрия в 0,8 N уксусной кислоте. При использовании данной смеси (соли и кислоты) не происходит разрушения носителя потому, что при данных условиях многие белки и особенно коллаген не растворимы, тогда как концентрация соли в растворе является оптимальной для снятия сГАГ с коллагенового носителя. Нами установлено экспериментально, что при концентрации соли ниже 0,6 N не все сГАГ сходят с колонки, и время их выхода существенно увеличивается, а при концентрации соли выше 1,5 N может нарастать содержание белка в элюате за счет снятия белков с носителя. Применение разработанной смеси позволяет существенно повысить чистоту получаемого вещества и исключить из этапа очистки сГАГ такие трудоемкие процессы, как диализ против насыщенного раствора соли и последующее обессоливание раствора сГАГ перед осаждением спиртом. Кроме того, это позволяет сократить не только затраты на используемые реактивы, но и время выделения чистого продукта, что является очень важным при промышленном производстве субстанции сГАГ.An essential feature of the invention is that sGAG is removed from the substrate with a 0.6-1.5 N solution of sodium chloride in 0.8 N acetic acid. When using this mixture (salt and acid), the carrier does not break down because under these conditions many proteins, and especially collagen, are insoluble, while the salt concentration in the solution is optimal for removing sGAG from the collagen carrier. We found experimentally that at a salt concentration below 0.6 N not all sGAGs leave the column, and their release time increases significantly, and at a salt concentration above 1.5 N, the protein content in the eluate can increase due to the removal of proteins from the carrier. The use of the developed mixture allows one to significantly increase the purity of the obtained substance and to exclude from the stage of purification of sGAG such laborious processes as dialysis against saturated salt solution and subsequent desalination of the sGAG solution before precipitation with alcohol. In addition, this allows to reduce not only the costs of the reagents used, but also the time for the isolation of the pure product, which is very important in the industrial production of sGAG substance.
Осаждение сГАГ из элюта ведут в присутствии этанола при 4°С в течение 24 часов. К одной части элюата прибавляют 2,5 части 95% этанола. Надосадок удаляют центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Затем осадок промывают этанолом и высушивают.The precipitation of sGAG from the elute is carried out in the presence of ethanol at 4 ° C for 24 hours. 2.5 parts of 95% ethanol are added to one part of the eluate. The supernatant was removed by centrifugation at 1500 rpm for 10 minutes. Then the precipitate is washed with ethanol and dried.
Существенным признаком изобретения является то, что сГАГ с субстрата можно успешно снимать и слабыми (0,015-0,025 N) растворами щелочи. Это могут быть NaOH, КОН, Са(ОН)2 и т.д. Концентрация щелочного раствора также установлена нами экспериментально и является оптимальной для снятия сГАГ с коллагена. При концентрации раствора NaOH ниже 0,015 N не все сГАГ сходят с колонки, и время их выхода существенно увеличивается. При концентрации щелочи выше 0,025 N начинается процесс разрушения сГАГ и отмечается увеличение содержания белка в элюате за счет разрушения самого коллагенового субстрата.An essential feature of the invention is that sGAG from the substrate can also be successfully removed with weak (0.015-0.025 N) alkali solutions. It can be NaOH, KOH, Ca (OH) 2 , etc. The concentration of alkaline solution was also established by us experimentally and is optimal for the removal of sGAG from collagen. At a concentration of NaOH solution below 0.015 N, not all sGAGs leave the column, and their release time increases significantly. When the alkali concentration is higher than 0.025 N, the process of destruction of sGAG begins and an increase in the protein content in the eluate is noted due to the destruction of the collagen substrate itself.
В обоих случаях элюцию сГАГ продолжают до тех пор, пока их выход с колонки не прекратится, что контролируется наличием их в растворе по методу Farndel.In both cases, elution of sGAG is continued until their exit from the column ceases, which is controlled by their presence in solution according to the Farndel method.
Раствор сГАГ, снятый с коллагенового носителя щелочью, нейтрализуют уксусной кислотой до рН 7,0 и затем ведут из него осаждение сГАГ этанолом в соотношении на 1 часть элюата 2,5 части этанола. Осаждение ведут с помощью центрифугирования в течение 10 минут при 1500 об/мин при 4°С. При данной скорости, времени и температуре происходит осаждение всех сГАГ и выдерживается оптимум их сохранности. Высушивание осадка осуществляют абсолютным спиртом или ацетоном.The sGAG solution, taken from the collagen carrier with alkali, is neutralized with acetic acid to pH 7.0, and then sAGH is precipitated from it with ethanol in a ratio of 2.5 parts of ethanol to 1 part of the eluate. Precipitation is carried out by centrifugation for 10 minutes at 1500 rpm at 4 ° C. At a given speed, time and temperature, all sGAGs are precipitated and their optimum safety is maintained. Drying the precipitate is carried out with absolute alcohol or acetone.
С целью предотвращения возможного бактериального загрязнения порошок сГАГ сразу после высушивания упаковывают в стерильные флаконы. Полученный таким образом порошок сГАГ стерилизуют радиационным методом. Данный метод стерилизации отработан экспериментально и не приводит к разрушению препарата и не снижает его биологическую активность.In order to prevent possible bacterial contamination, sGAG powder is immediately packaged in sterile vials immediately after drying. The thus obtained sGAG powder is sterilized by the radiation method. This sterilization method has been tested experimentally and does not lead to the destruction of the drug and does not reduce its biological activity.
Сравнительный анализ количественного и качественного выхода полученного продукта показал, что содержание сГАГ в образцах составляет 98%, а содержание белка не превышает 1,5-2%, что значительно улучшает данные характеристики продукта по сравнению с прототипом (3-6%).A comparative analysis of the quantitative and qualitative yield of the obtained product showed that the sGAG content in the samples is 98%, and the protein content does not exceed 1.5-2%, which significantly improves these product characteristics compared to the prototype (3-6%).
Биологическую активность полученных сГАГ определяли в условиях клеточных культур и в модельных экспериментах на животных с помощью методик, описанных нами ранее (Панасюк А.Ф., Ларионов Е.В. «Хондроитинсульфаты и их роль в обмене хондроцитов и межклеточного матрикса хрящевой ткани». Научно-практическая ревматология, 2000, №2, стр.46-55).The biological activity of the obtained sGAGs was determined in cell cultures and in animal model experiments using the techniques described previously (Panasyuk AF, Larionov EV “Chondroitin sulfates and their role in the exchange of chondrocytes and intercellular matrix of cartilage tissue.” Scientific -practical rheumatology, 2000, No. 2, pp. 46-55).
Краткая технология получения сГАГ.Brief technology for obtaining sGAG.
1 килограмм трахеи свиней отмывают от крови, нарезают на полоски и замораживают. Размельченную ткань дважды промывают 2 литрами нагретого до 65°С 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0. Затем буфер сливают и ткань инкубируют в новой порции нагретого 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 в течение 30 минут. Далее ткань помещают в 0,3% раствора активированного папаина и инкубируют в течение 16 часов при 65°С при периодическом перемешивании раствора. После переваривания раствор охлаждают, фильтруют и пропускают через колонку с губчатым коллагеном из костной ткани крупного рогатого скота с размерами частиц 0,03-0,3 см3, предпочтительно 0,125 см3. Инкубацию ведут в течение 24 часов, затем коллагеновый носитель последовательно отмывают от инкубационной среды и неспецифически связавшихся с носителем биологических молекул 0,1 N соляной кислотой. Затем сГАГ снимают с носителя раствором 1,0 N хлорида натрия в 0,8 N СН3СООН.1 kilogram of pig trachea is washed from the blood, cut into strips and frozen. The crushed tissue is washed twice with 2 liters of 0.1 N phosphate buffer heated to 65 ° C. PH 5.8-6.0. Then the buffer is drained and the tissue is incubated in a new portion of heated 0.1 N phosphate buffer pH 5.8-6.0 for 30 minutes. Next, the tissue is placed in a 0.3% solution of activated papain and incubated for 16 hours at 65 ° C with periodic stirring of the solution. After digestion, the solution is cooled, filtered and passed through a column of spongy collagen from bone tissue of cattle with a particle size of 0.03-0.3 cm 3 , preferably 0.125 cm 3 . The incubation is carried out for 24 hours, then the collagen carrier is successively washed from the incubation medium and 0.1 N hydrochloric acid that are not specifically bound to the carrier of biological molecules. Then sGAG is removed from the carrier with a solution of 1.0 N sodium chloride in 0.8 N CH 3 COOH.
сГАГ осаждают этанолом - на 1 объем элюта 2,5 объема спирта при 4°С. Осадок отделяют центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут, затем его отмывают этанолом, высушивают и стерилизуют. Количественный анализ сГАГ спектрофотометрически по Farndel - содержание сГАГ в препарате 98-99%. Белок по Лоури в модификации Бредфорда - менее 0,5%.sGAG precipitated with ethanol - per volume of elute 2.5 volumes of alcohol at 4 ° C. The precipitate was separated by centrifugation at 1500 rpm for 15 minutes, then it was washed with ethanol, dried and sterilized. Quantitative analysis of sGAG spectrophotometrically according to Farndel - the content of sGAG in the preparation 98-99%. Protein according to Lowry in the modification of Bradford - less than 0.5%.
Следовательно, действия приводят к снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом. Предлагаемый способ обработки ткани позволяет получать не менее 98% выхода сГАГ и снизить антигенность субстанции за счет удаления коровых белков, входящих в состав протеогликанов, а это позволяет повысить биосовместимость данного материала и уменьшить число осложнений при его применении в виде лекарственного средства или в составе изделий медицинского назначения. Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.Therefore, the actions lead to a decrease in antigenicity, since the amount of protein is significantly reduced compared to the selected prototype. The proposed method of tissue processing allows to obtain at least 98% of the sGAG yield and reduce the antigenicity of the substance by removing core proteins that are part of proteoglycans, and this allows to increase the biocompatibility of this material and reduce the number of complications when it is used as a medicine or as a part of medical devices destination. For a better understanding of the essence of the invention is illustrated by examples of specific performance.
Пример 1. Получение сГАГ из роговиц глаз свиней. 1 килограмм глазных роговиц свиней очищают от механических примесей, отмывают 2 литрами нагретого до 65°С 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 и затем помещают роговицы в новую порцию нагретого 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 на 15 минут. Буфер сливают и ткань помещают в 0,2% раствор активированного папаина и инкубируют в течение 8 часов при 65°С. После переваривания ткани раствор охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Очищенный перевар пропускают через колонку с носителем из коллагена, полученного из костной ткани сельскохозяйственных животных. Размер коллагеновых частиц варьирует от 0,03 до 0,35 см3. Инкубацию ведут в течение 20 часов, затем коллагеновый носитель отмывают 0,05 N соляной кислотой, избавляясь полностью от остатков инкубационной среды и неспецифически севших на носитель молекул. сГАГ снимают с носителя раствором 1,5 N хлорида натрия в 0,8 N СН3СООН и осаждают этанолом при соотношении на 1 объем элюата 2,5 объема спирта. Надосадок удаляют центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Осадок отмывают ацетоном, высушивают и стерилизуют.Example 1. Obtaining sGAG from the cornea of pigs. 1 kilogram of pig’s eye cornea is cleaned of mechanical impurities, washed with 2 liters of 0.1 N phosphate buffer pH 5.8-6.0 heated to 65 ° C and then placed in a new portion of heated 0.1 N phosphate buffer pH 5.8 -6.0 for 15 minutes. The buffer is drained and the tissue is placed in a 0.2% solution of activated papain and incubated for 8 hours at 65 ° C. After digesting the tissue, the solution was cooled to room temperature and filtered. The purified digest is passed through a column with a carrier of collagen obtained from the bone tissue of farm animals. The size of collagen particles varies from 0.03 to 0.35 cm 3 . The incubation is carried out for 20 hours, then the collagen carrier is washed with 0.05 N hydrochloric acid, completely eliminating the remnants of the incubation medium and the molecules that have not specifically settled on the carrier. sGAG is removed from the carrier with a solution of 1.5 N sodium chloride in 0.8 N CH 3 COOH and precipitated with ethanol at a ratio of 2.5 volumes of alcohol per 1 volume of eluate. The supernatant was removed by centrifugation at 1500 rpm for 10 minutes. The precipitate is washed with acetone, dried and sterilized.
Количественный анализ сГАГ, проведенный спектрофотометрически по Farndel, показал, что содержание сГАГ в препарате 98,5%.A quantitative analysis of sGAG, performed spectrophotometrically according to Farndel, showed that the content of sGAG in the preparation is 98.5%.
Белок по Лоури в модификации Бредфорда - 0,85%.Protein according to Lowry in the modification of Bradford - 0.85%.
Концентрация выделенных сГАГ - 5,0 мг на г сырой тканиThe concentration of excreted sGAG - 5.0 mg per g of crude tissue
По прототипу - концентрация сГАГ - 4,23 мг на г сырой ткани.According to the prototype, the concentration of sGAG is 4.23 mg per g of raw tissue.
Полученный препарат сГАГ в расчете на сухой вес содержит:The resulting preparation sGAG based on dry weight contains:
Приведенные данные свидетельствуют о том, что химический состав полученного препарата характерен для сГАГ, при этом очевидно преобладание сГАГ с малым содержанием уроновых кислот. Это указывает на присутствие в препарате большого количества кератан-сульфата потому, что, в отличие от хондроитин-сульфатов, он вместо уроновых кислот содержит гексозу, а именно галактозу.The data presented indicate that the chemical composition of the obtained preparation is characteristic of sGAG, while the predominance of sGAG with a low content of uronic acids is obvious. This indicates the presence of a large amount of keratan sulfate in the preparation because, unlike chondroitin sulfates, it contains hexose instead of uronic acids, namely galactose.
Поэтому после предварительной обработки препарата β-гиалуронидазой (по 9), которая гидролизует только хондроитин-сульфаты, в препарате было вновь определено содержание сГАГ. Оказалось (см. табл.1), что полученный с помощью предлагаемого способа препарат представляет собой смесь хондроитин-сульфатов и кератан-сульфата в соотношении 1:2. Последнее полностью соответствует литературным данным по содержанию данных сГАГ в ткани роговицы.Therefore, after preliminary treatment of the preparation with β-hyaluronidase (9 each), which hydrolyzes only chondroitin sulfates, the content of sGAG was again determined in the preparation. It turned out (see Table 1) that the preparation obtained using the proposed method is a mixture of chondroitin sulfates and keratan sulfate in a ratio of 1: 2. The latter is fully consistent with published data on the content of sGAG data in corneal tissue.
Таким образом, предлагаемые действия приводят к повышению выхода конечного продукта, повышению его качества и снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом.Thus, the proposed actions lead to an increase in the yield of the final product, an increase in its quality and a decrease in antigenicity, since the amount of protein is significantly reduced in comparison with the selected prototype.
Пример 2. Получение с ГАГ из легкого свиней. 1 килограмм легкого свиней нарезают на полоски, отмывают от крови водой, ткань замораживают и затем гомогенизируют до однородной массы. Размельченную ткань размораживают и двукратно промывают 1.5 литрами нагретого до 65°С 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0. Буфер сливают и ткань помещают в новую порцию нагретого 0,1N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 на 15 минут. Отмытую ткань заливают равным объемом 0,25% раствора активированного папаина и инкубируют в течение 12 часов при 65°С при периодическом перемешивании раствора. После переваривания раствор охлаждают до 4°С, фильтруют и пропускают через колонку с губчатым коллагеном из костной ткани свиней с размерами частиц 0,1 - 0,25 см3. Инкубацию ведут в течение 16 часов, затем коллагеновый носитель последовательно отмывают от инкубационной среды и неспецифически налипших на носитель частиц 0,1 N соляной кислотой. сГАГ снимают с носителя раствором 0,02 М NaOH, щелочь нейтрализуют уксусной кислотой до рН 7,0 и сГАГ осаждают этанолом в соотношении на 1 часть раствора сГАГ 2,5 части этанола при 4°С. сГАГ осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут при 4°С, осадок отмывают сначала этанолом, потом ацетоном, высушивают и стерилизуют радиационным методом.Example 2. Getting with GAG from the lungs of pigs. 1 kilogram of light pigs is cut into strips, washed from the blood with water, the tissue is frozen and then homogenized to a homogeneous mass. The crushed tissue is thawed and washed twice with 1.5 liters of 0.1 N phosphate buffer, pH 5.8-6.0, heated to 65 ° C. The buffer is drained and the tissue is placed in a new portion of heated 0.1N phosphate buffer pH 5.8-6.0 for 15 minutes. The washed tissue is poured with an equal volume of 0.25% activated papain solution and incubated for 12 hours at 65 ° C with periodic stirring of the solution. After digestion, the solution is cooled to 4 ° C, filtered and passed through a column with spongy collagen from pig bone tissue with a particle size of 0.1 - 0.25 cm 3 . The incubation is carried out for 16 hours, then the collagen carrier is washed successively from the incubation medium and 0.1 N hydrochloric acid particles that are not specifically adhering to the carrier. sGAG is removed from the carrier with a solution of 0.02 M NaOH, alkali is neutralized with acetic acid to pH 7.0, and sGAG is precipitated with ethanol in a ratio of 1 part sGAG to 2.5 parts of ethanol at 4 ° C. sGAG is precipitated by centrifugation at 1500 rpm for 15 minutes at 4 ° C, the precipitate is washed first with ethanol, then with acetone, dried and sterilized by the radiation method.
Количественный анализ сГАГ спектрофотометрически по Farndel -содержание сГАГ в препарате 98-99%.Quantitative analysis of sGAG spectrophotometrically according to Farndel — the content of sGAG in the preparation is 98-99%.
Белок по Лоури в модификации Бредфорда - менее 1,5%.Protein according to Lowry in the modification of Bradford - less than 1.5%.
Действия приводят к снижению антигенности, поскольку значительно снижается количество белка по сравнению с выбранным прототипом.Actions lead to a decrease in antigenicity, since the amount of protein is significantly reduced compared to the selected prototype.
Пример 3. Получение с ГАГ из губчатой кости млекопитающих. Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую кость животных механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,0 см или механически разрушают до размера частиц 0,2-1 см. 1 кг напиленной кости двукратно отмывают 1,5 литрами нагретого до 65°С 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0. Буфер сливают и ткань помещают в новую порцию нагретого 0,1 N фосфатного буфера рН 5,8-6,0 на 20 минут. Пластины кости помещают в раствор активированного 0,4% папаина при 65°С в термостат на 24 часа. Перевар сливают и костные пластины промывают кратным объемом дистиллированной воды, нагретой до 70°С. Перевар и отмывку объединяют, полученный раствор охлаждают до 4°С в течение 20 часов, фильтруют и заливают в колонку с костным коллагеном с размерами частиц 0,05-0,3 см3, инкубируют в течение 24 часов, затем коллагеновый носитель последовательно отмывают от инкубационной среды и неспецифически налипших на носитель частиц 0,1 N соляной кислотой. сГАГ осаждают из раствора этанолом в соотношении 1:2,5, осадок центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин, отмывают этанолом, осадок высушивают, упаковывают и стерилизуют автоклавированием.Example 3. Obtaining GAG from the cancellous bone of mammals. Passing the necessary veterinary control, the cancellous bone of animals is mechanically cleaned of muscles and tendons, sawn into 1.0 cm thick plates or mechanically destroyed to a particle size of 0.2-1 cm. 1 kg of sawn bone is washed twice with 1.5 liters of heat to 65 ° C 0.1 N phosphate buffer pH 5.8-6.0. The buffer is drained and the tissue is placed in a new portion of heated 0.1 N phosphate buffer pH 5.8-6.0 for 20 minutes. Bone plates are placed in a solution of activated 0.4% papain at 65 ° C in a thermostat for 24 hours. The digest is drained and the bone plates are washed with a multiple volume of distilled water heated to 70 ° C. The digest and washing are combined, the resulting solution is cooled to 4 ° C for 20 hours, filtered and poured into a bone collagen column with particle sizes of 0.05-0.3 cm 3 , incubated for 24 hours, then the collagen carrier is washed successively from incubation medium and non-specifically adhering particles of 0.1 N hydrochloric acid to the carrier. sGAG is precipitated from the solution with ethanol in a ratio of 1: 2.5, the precipitate is centrifuged for 15 minutes at 1500 rpm, washed with ethanol, the precipitate is dried, packaged and sterilized by autoclaving.
Количественный анализ сГАГ спектрофотометрически по Farndel - содержание сГАГ в препарате 98,6%.Quantitative analysis of sGAG spectrophotometrically according to Farndel - the content of sGAG in the preparation of 98.6%.
Приведенные действия приводят к снижению антигенности субстанции потому, что значительно снижается количество липидов и белка по сравнению с выбранным прототипом.The above actions lead to a decrease in the antigenicity of the substance because the amount of lipids and protein is significantly reduced compared to the selected prototype.
Таким образом, видно, что предлагаемый способ обработки ткани позволяет повысить выход сГАГ, довести их чистоту до 98-99% и снизить антигенность за счет удаления белковых компонентов, входящих в состав данной ткани. Последнее обеспечивает высокую биосовместимость сГАГ и резко снижает число осложнений при применении данного препарата в виде лекарственного средства или в составе изделий медицинского назначения.Thus, it is seen that the proposed method for processing tissue allows to increase the yield of sGAG, increase their purity to 98-99% and reduce antigenicity by removing the protein components that make up this tissue. The latter provides high biocompatibility of sGAG and dramatically reduces the number of complications when using this drug in the form of a medicinal product or as part of medical devices.
Настоящее изобретение промышленно применимо, освоено в лабораторных условиях, результаты которых показывают практическую ценность полученной фармацевтической субстанции в медицине и ветеринарии, лекарственных средств и профилактических материалов, например глазных капель, мазей, суспензий и т.д., или в составе изделий медицинского назначения.The present invention is industrially applicable, mastered in the laboratory, the results of which show the practical value of the obtained pharmaceutical substance in medicine and veterinary medicine, drugs and prophylactic materials, such as eye drops, ointments, suspensions, etc., or as part of medical devices.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005136580/15A RU2304441C1 (en) | 2005-10-27 | 2005-10-27 | Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005136580/15A RU2304441C1 (en) | 2005-10-27 | 2005-10-27 | Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005136580A RU2005136580A (en) | 2007-06-10 |
| RU2304441C1 true RU2304441C1 (en) | 2007-08-20 |
Family
ID=38312020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005136580/15A RU2304441C1 (en) | 2005-10-27 | 2005-10-27 | Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2304441C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2658918C1 (en) * | 2017-12-01 | 2018-06-26 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) | Method for isolating glycosaminoglycans from secondary collagen-containing wastes |
| RU2759517C1 (en) * | 2021-04-02 | 2021-11-15 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycoaminoglycans from biological tissues |
-
2005
- 2005-10-27 RU RU2005136580/15A patent/RU2304441C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2658918C1 (en) * | 2017-12-01 | 2018-06-26 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) | Method for isolating glycosaminoglycans from secondary collagen-containing wastes |
| RU2759517C1 (en) * | 2021-04-02 | 2021-11-15 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycoaminoglycans from biological tissues |
| RU2759517C9 (en) * | 2021-04-02 | 2022-01-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АВЕО" | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2005136580A (en) | 2007-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4420470B2 (en) | Abalone polysaccharide extraction method | |
| JP3731150B2 (en) | Purification method of cartilage-type proteoglycan | |
| US6946551B2 (en) | Preparation of hyaluronic acid from eggshell membrane | |
| CN109349419B (en) | Compound yak bone collagen peptide powder for repairing human body cells | |
| CN1875988A (en) | Method for preparing low molecular weighted glucidamin collagen composition, its product and use | |
| WO2023000370A1 (en) | Method for preparing undenatured type ii collagen | |
| JPS5837001A (en) | Production of hyaluronic acid | |
| RU2304441C1 (en) | Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues | |
| Manjusha et al. | Isolation and characterization of glycosaminoglycans and a study of its bioactive potential in two commercially important species of cephalopods, Loligo duvauceli and Sepia pharaonis | |
| CN113151385A (en) | Method for efficiently preparing livestock and poultry cartilage collagen polypeptide | |
| RU2621311C1 (en) | Method for obtaining proteoglycan | |
| CN104448037B (en) | A kind of preparation technology of chondroitin sulfate potassium salt | |
| JP2004210715A (en) | Inhibitor of formation of osteoclast | |
| WO2007049987A1 (en) | Method for producing sulphated glycosaminoglycans from a biological tissues | |
| CN104725532B (en) | A kind of method of chondroitin sulfate and dermatan sulfate content in accurate quantification control heparin/heparan | |
| RU2273486C1 (en) | Method for separating sulfated glycosoamineglycanes from biological tissue | |
| Tonégawa | Isolation and characterization of a particulate cell‐aggregation factor from sea urchin embryos | |
| CN1272365A (en) | Physiological active material | |
| JPH0450293B2 (en) | ||
| RU2562581C1 (en) | Method of producing biologically active agent from sea cucumber, having general tonic and immunomodulating properties | |
| RU2673802C1 (en) | Method of manufacture of sterile pharmaceutical substance | |
| KR102180261B1 (en) | Method for extraction of heparin derived from by-product of pork | |
| RU2562595C2 (en) | Production of product with biologically active properties from holothurians | |
| RU2139715C1 (en) | Method of preparing glycosamonoglycans | |
| RU2759517C9 (en) | Method for obtaining pharmaceutical sulfated glycosaminoglycans from biological tissues |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111028 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20121120 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171028 |