RU2132688C1 - Method of preparing biologically active preparations from embryonal tissues - Google Patents
Method of preparing biologically active preparations from embryonal tissues Download PDFInfo
- Publication number
- RU2132688C1 RU2132688C1 RU96115729A RU96115729A RU2132688C1 RU 2132688 C1 RU2132688 C1 RU 2132688C1 RU 96115729 A RU96115729 A RU 96115729A RU 96115729 A RU96115729 A RU 96115729A RU 2132688 C1 RU2132688 C1 RU 2132688C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- target product
- embryos
- supernatant
- separation
- tissues
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биохимической технологии получения на основе эмбриональных тканей биологически активных препаратов с фиксированными фармакологическими свойствами, несмотря на неопределенность их химического состава. Технологические процессы на основе изобретения могут быть использованы в фармацевтической промышленности для изготовления неспецифических био- (преимущественно цито- и наиболее предпочтительно иммуно-) корректоров и, в особенности, биостимуляторов широкого спектра действия. The invention relates to biochemical technology for the production of biologically active preparations with fixed pharmacological properties on the basis of embryonic tissues, despite the uncertainty of their chemical composition. Technological processes based on the invention can be used in the pharmaceutical industry for the manufacture of nonspecific bio- (mainly cyto- and most preferably immuno-) correctors and, in particular, broad-spectrum biostimulants.
Потребность в препаратах такого типа является массовой и систематически возрастает в связи с продолжающимся загрязнением природной среды ксенобиотиками (в том числе - радионуклидами), появлением новых (типа ВИЧ) инфекций и существенным ослаблением физических нагрузок на большинство урбанизированного населения. The need for drugs of this type is massive and is systematically increasing due to the ongoing pollution of the environment by xenobiotics (including radionuclides), the emergence of new (such as HIV) infections and a significant weakening of physical activity in most urbanized populations.
Поэтому технологические процессы изготовления указанных препаратов должны удовлетворять комплексу трудносовместимых требований. К важнейшим из них относятся:
пригодность для коррекции физиологического статуса человека в широком спектре возможных патологий и причин их возникновения, минимум противопоказаний к применению и доступность для медицинских учреждений и населения, зависящая преимущественно, во-первых, от производительности технологических процессов и затрат ресурсов на их осуществление и, во-вторых, от стабильности целевого продукта и соответственно его пригодности для длительного хранения с сохранением стерильности и фармакологических свойств.Therefore, the manufacturing processes of these preparations must satisfy a set of difficultly compatible requirements. The most important of them are:
suitability for correcting the physiological status of a person in a wide range of possible pathologies and the causes of their occurrence, a minimum of contraindications for use and accessibility for medical institutions and the population, depending mainly, firstly, on the productivity of technological processes and the cost of resources for their implementation and, secondly , from the stability of the target product and, accordingly, its suitability for long-term storage while maintaining sterility and pharmacological properties.
Два первых требования могут быть в принципе выполнены при использовании эмбриональных тканей, взятых в основном из эмбрионов животных, в качестве общеизвестного и общепризнанного ныне источника биологически активных веществ широкого спектра действия. The first two requirements can in principle be met by using embryonic tissues, taken mainly from animal embryos, as a well-known and universally recognized source of biologically active substances with a wide spectrum of action.
Например, из заявки Франции 2413912 на группу изобретений "Лекарственные средства на основе зародыша и способ их получения" известен способ получения биологически активных средств на основе эмбриональной ткани, который предусматривает измельчение и гомогенизацию мягких тканей эмбрионов животных в смеси с физиологическим раствором. For example, from the application of France 2413912 for the group of inventions "Medicines based on the germ and the method of their production" there is a method for producing biologically active agents based on embryonic tissue, which involves grinding and homogenization of the soft tissues of animal embryos mixed with saline.
Биологически активные средства, полученные описанным простейшим способом, были применены на сельскохозяйственных животных, что позволило повысить их продуктивность на 7-15% в сравнении с контролем. Biologically active agents obtained by the described simplest method were used on farm animals, which made it possible to increase their productivity by 7-15% in comparison with the control.
Однако обремененность иммунодепрессантами и высокомолекулярными антигенами, допустимая при использовании этих средств в животноводстве, не позволила получить заметный иммуностимулирующий эффект у людей. Кроме того, биохимический состав описанного препарата существенно колеблется от партии к партии и потому он непригоден для длительного хранения. However, the burden of immunosuppressants and high molecular weight antigens, permissible when using these funds in animal husbandry, did not allow to obtain a noticeable immunostimulating effect in humans. In addition, the biochemical composition of the described preparation varies significantly from batch to batch and therefore it is unsuitable for long-term storage.
Более совершенен способ получения биологически активных средств согласно Европейской заявке 0249563 на изобретение "Экстракты зародышевых тканей органов животных, пригодные для инъекции человеку". Этот способ наряду с измельчением и гомогенизацией мягких тканей эмбрионов животных предусматривает удаление нежелательных примесей при экстракции водорастворимых активных веществ. A more advanced method for producing biologically active agents according to European application 0249563 for the invention "Extracts of germinal tissues of animal organs, suitable for injection into humans." This method along with grinding and homogenization of soft tissues of animal embryos involves the removal of undesirable impurities during the extraction of water-soluble active substances.
Однако при этом в экстракт не переходят многие биологически активные вещества, что снижает стимулирующий эффект при использовании целевого продукта. Кроме того, экстракт подобно вышеуказанному препарату имеет биохимический состав, который существенно колеблется от партии к партии, что также отражается на стабильности его фармакологических свойств при длительном хранении. However, at the same time, many biologically active substances do not pass into the extract, which reduces the stimulating effect when using the target product. In addition, the extract, like the above preparation, has a biochemical composition that varies significantly from batch to batch, which also affects the stability of its pharmacological properties during long-term storage.
Поэтому нередко прибегают к искусственным приемам воздействия на эмбриональную ткань в надежде повысить эффективность и стабильность целевых продуктов в качестве средств лечения и профилактики иммунной системы человека. Therefore, they often resort to artificial methods of influencing embryonic tissue in the hope of increasing the efficiency and stability of the target products as a means of treatment and prevention of the human immune system.
Из числа аналогов такого типа к предлагаемому изобретению наиболее близок способ изготовления биологически активных препаратов на основе эмбриональных тканей, известный из описания изобретения к патенту Украины 2164. Этот способ предусматривает:
измельчение мягких эмбриональных тканей,
их гомогенизацию в дисперсионной среде на основе воды до разрушения клеточных оболочек,
отделение (например, фильтрованием или центрифугированием) неразрушенных клеточных элементов,
гидролиз гомогената в присутствии консерванта при температуре 4-45oC в течение времени от двух суток до шести недель, причем тем дольше, чем ниже температура,
термообработку гидролизата при температуре 60-120oC до денатурации балластных веществ,
отделение денатурированных термолабильных веществ и выделение из гидролизата термостабильного целевого продукта со средней молекулярной массой менее 10 кДа путем фракционирования, выполняемого, например:
- ультрафильтрацией, или
- центрифугированием при ускорении свыше 1500 g в течение 20-40 мин, или
- диализом через полупроницаемую пленку и/или
- гельфильтрацией,
стерилизацию, разлив и укупорку препарата.Of the analogues of this type, the closest to the proposed invention is a method of manufacturing biologically active preparations based on embryonic tissues, known from the description of the invention to the patent of Ukraine 2164. This method provides:
soft embryonic tissue grinding,
their homogenization in a dispersion medium based on water to the destruction of cell membranes,
separation (for example, by filtration or centrifugation) of intact cellular elements,
hydrolysis of the homogenate in the presence of a preservative at a temperature of 4-45 o C for a time from two days to six weeks, and the longer, the lower the temperature,
heat treatment of the hydrolyzate at a temperature of 60-120 o C to denature the ballast substances
separation of denatured thermolabile substances and isolation from the hydrolyzate of a thermostable target product with an average molecular weight of less than 10 kDa by fractionation, performed, for example:
- ultrafiltration, or
- centrifugation when accelerating over 1500 g for 20-40 minutes, or
- dialysis through a semipermeable film and / or
- gel filtration,
sterilization, spill and capping of the drug.
Целевым продуктом при этом служит супернатант, содержащий в качестве действующего начала смесь относительно низкомолекулярных термостабильных веществ неопределенного состава со средней молекулярной массой в пределах 0,7-10,0 кДа. The target product is a supernatant containing, as an active principle, a mixture of relatively low molecular weight thermostable substances of uncertain composition with an average molecular weight in the range of 0.7-10.0 kDa.
Однако описанный способ
обладает тем более низкой производительностью, чем ниже температура гидролиза,
связан с существенными энергозатратами и, что особенно важно,
не обеспечивает стабильность качества целевого продукта из-за принципиальной невозможности надежного управления гидролизом. Поэтому в гидролизате всегда присутствует весьма сложная смесь химически и биохимически нестабильных продуктов преимущественно белковой природы. Лишь некоторые из них, но далеко не все, удается удалить термообработкой гидролизата и осаждением денатурированных белков, которые негативно влияют на стойкость целевого продукта при хранении и которые (даже при молекулярной массе менее 10 кДа) способны оказывать непредвиденное побочное действие.However, the described method
has the lower productivity, the lower the hydrolysis temperature,
associated with significant energy consumption and, most importantly,
it does not ensure the stability of the quality of the target product due to the fundamental impossibility of reliable control of hydrolysis. Therefore, a very complex mixture of chemically and biochemically unstable products of predominantly protein nature is always present in the hydrolyzate. Only some of them, but by no means all, can be removed by heat treatment of the hydrolyzate and precipitation of denatured proteins that adversely affect the shelf life of the target product and which (even with a molecular weight of less than 10 kDa) can have unforeseen side effects.
Соответственно в основу изобретения положена задача путем усовершенствования приемов подготовки сырья и уточнения условий его переработки создать такой способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей, который обеспечивал бы существенное повышение стабильности фармакологических свойств целевого продукта при повышении производительности процесса и сокращении затрат на его осуществление. Accordingly, the invention is based on the task, by improving the methods for preparing raw materials and clarifying the conditions for its processing, to create a method for the manufacture of biologically active preparations from embryonic tissues, which would provide a significant increase in the stability of the pharmacological properties of the target product while increasing the productivity of the process and reducing the cost of its implementation.
Поставленная задача решена тем, что в способе изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей, включающем измельчение мягких эмбриональных тканей, их гомогенизацию в дисперсионной среде на основе воды до разрушения клеточных оболочек, отделение неразрушенных клеточных элементов, фракционирование супернатанта с выделением целевого продукта со средней молекулярной массой менее 10 кДа, стерилизацию, разлив и укупорку препарата, согласно изобретению целевой продукт выделяют и одновременно с выделением стерилизуют фракционированием супернатанта по молекулярной массе непосредственно после отделения неразрушенных клеточных элементов. The problem is solved in that in a method for the manufacture of biologically active preparations from embryonic tissues, including grinding of soft embryonic tissues, their homogenization in a dispersion medium based on water until cell membranes are destroyed, separation of intact cell elements, fractionation of the supernatant with the release of the target product with an average molecular weight less than 10 kDa, sterilization, spill and corking of the preparation, according to the invention, the target product is isolated and simultaneously sterilized fractionation of the supernatant by molecular weight immediately after separation of intact cell elements.
Исключение гидролиза и изменение порядка выполнения оставшихся операций обуславливают не только существенное повышение производительности процесса и сокращение затрат, что благоприятно сказывается на доступности целевого продукта для широких слоев населения экологически опасных территорий, но и практически исключает появление в целевом продукте неконтролируемых примесей, возникших при гидролизе сырья, и тем самым стабилизирует его фармакологические свойства. The exclusion of hydrolysis and a change in the order of the remaining operations lead not only to a significant increase in the productivity of the process and cost reduction, which favorably affects the availability of the target product for wide layers of the population of environmentally hazardous areas, but also virtually eliminates the appearance in the target product of uncontrolled impurities arising from the hydrolysis of raw materials, and thereby stabilizes its pharmacological properties.
Первое дополнительное отличие состоит в том, что супернатант после отделения неразрушенных клеточных элементов одновременно фракционируют и стерилизуют ультрафильтрацией, которая представляет собой один из наиболее эффективных процессов выделения из сложных смесей веществ с заданным максимальным значением молекулярной массы и исключает бактериальное заражение целевого продукта при его разливе и укупорке в стерильных условиях. The first additional difference is that the supernatant after separation of the undisturbed cellular elements is simultaneously fractionated and sterilized by ultrafiltration, which is one of the most effective processes for isolating substances from complex mixtures with a given maximum molecular weight and eliminates bacterial infection of the target product when it is bottled and capped under sterile conditions.
Второе дополнительное отличие, которое может быть использовано согласно изобретению как независимо от первого, так и в сочетании с первым дополнительным отличием, состоит в том, что эмбрионы перед измельчением мягких тканей замораживают и размораживают. Уже было установлено, что охлаждение до примерно +4oC и выдерживание при этой температуре изолированных мягких тканей теплокровных животных способствует подавлению в них процессов синтеза, сохранению достаточной активности окислительно-восстановительных процессов и интенсификации катаболических процессов (см., например: Тканевая терапия/коллектив авторов/. Под ред. Н.А.Пучковской- Киев: ЗДОРОВ'Я, 1975, с. 5, абзац 6-й сверху; с. 6, абзац 5-й сверху; с.12). Однако нам (по имеющимся у нас данным - впервые) удалось экспериментально установить, что замораживание эмбрионов, то есть их перевод в твердое состояние, и размораживание перед отделением мягких тканей для последующего измельчения способствует, как можно увидеть далее в примерах, заметному росту биологической активности целевого продукта.The second additional difference, which can be used according to the invention both independently of the first and in combination with the first additional difference, is that the embryos are frozen and thawed before grinding soft tissues. It has already been established that cooling to approximately +4 o C and keeping isolated soft tissues of warm-blooded animals at this temperature helps to suppress synthesis processes in them, maintain sufficient activity of redox processes and intensify catabolic processes (see, for example: Tissue therapy / collective authors / .Under the editorship of N.A. Puchkovskaya- Kiev: HEALTH'YA, 1975, p. 5, paragraph 6th above; p. 6, paragraph 5th above; p.12). However, according to our data, for the first time, we were able to experimentally establish that freezing embryos, i.e., converting them to a solid state, and thawing them before separating soft tissues for subsequent grinding, as can be seen in the examples below, contributes to a noticeable increase in the biological activity of the target product.
Третье дополнительное (ко второму) отличие состоит в том, что эмбрионы замораживают до температуры не ниже -80oC, поскольку замораживание до более низких температур, не влияя на повышение биологической активности целевого продукта, существенно удлиняет размораживание и снижает производительность процесса.The third additional (to the second) difference is that the embryos are frozen to a temperature not lower than -80 o C, since freezing to lower temperatures, without affecting the increase in the biological activity of the target product, significantly prolongs the thawing and reduces the productivity of the process.
Четвертое дополнительное (к третьему) отличие состоит в том, что эмбрионы замораживают постепенно, то есть при плавном понижении температуры. Это также способствует повышению активности целевого продукта. The fourth additional (to the third) difference is that the embryos freeze gradually, that is, with a smooth decrease in temperature. It also helps to increase the activity of the target product.
Пятое дополнительное отличие, которое может быть использовано согласно изобретению как независимо от любого из указанных выше дополнительных отличий, так и в сочетании с любым из них или с их произвольной совокупностью, состоит в том, что в качестве целевого продукта выделяют вещества со средней молекулярной массой менее 5,0 кДа. Как показали исследования, целевой продукт с указанной характеристикой обладает вполне достаточной (иммуно) стимулирующей активностью при практически полном отсутствии побочных реакций. The fifth additional difference, which can be used according to the invention both independently of any of the above additional differences, or in combination with any of them or with their arbitrary combination, is that substances with an average molecular weight of less than 5.0 kDa. As studies have shown, the target product with the specified characteristic has quite sufficient (immuno) stimulating activity with almost complete absence of adverse reactions.
Далее сущность изобретения поясняется
описанием предложенного способа в общем виде,
перечнем и нормативными значениями контролируемых показателей качества целевого продукта;
описанием метода сравнительных испытаний биологической активности целевого продукта и
конкретными примерами осуществления изобретательского замысла и результатами оценки целевых продуктов.Further, the invention is illustrated
a description of the proposed method in General,
the list and normative values of the controlled quality indicators of the target product;
a description of the method of comparative tests of the biological activity of the target product and
specific examples of the implementation of the inventive concept and the results of the evaluation of target products.
Предложенный способ в общем виде предусматривает:
отбор эмбрионов сельскохозяйственных животных (обычно у коров и, возможно, овец или свиней в первой половине беременности) в убойных цехах предприятий мясной промышленности,
предварительную обработку отобранных эмбрионов, в том числе
- обязательную обработку, то есть отделение плаценты, обескровливание (обычно через неперевязанную пуповину), обмывку проточной водой для удаления следов околоплодной жидкости и крови и помещение обескровленных и обмытых эмбрионов в холодильную камеру с температурой не выше 12oC (обычно на срок не более суток) и
- возможную дополнительную обработку: замораживание (в частности, ступенчатое) до температуры ниже 0oC (но предпочтительно не ниже -80oC) эмбрионов после обескровливания и обмывки и их размораживание;
отделение головы, копыт, желчного пузыря (с осторожностью), желудка и кишечника;
отделение мягких тканей от костей;
измельчение мягких тканей (обычно на куттерах);
гомогенизацию измельченных мягких тканей в дисперсионной среде на основе воды (обычно в изотоническом растворе) до разрушения клеточных оболочек (с использованием аппаратов типа "коллоидная мельница");
отделение неразрушенных клеточных элементов и элементов волокнистых тканей (например: центрифугированием при 1-80 тыс. об/мин, или фильтрованием, как правило, на вакуумном нутч-фильтре);
одновременное выделение целевого продукта со средней молекулярной массой менее 10 (предпочтительно менее 5) кДа и его стерилизацию фракционированием супернатанта с использованием средств, служащих "бактериальными фильтрами" (предпочтительно с использованием волоконных ультрафильтрационных установок);
разлив и укупорку целевого продукта (обычно - в стеклянные ампулы) в стерильных условиях.The proposed method in General provides:
selection of embryos of farm animals (usually from cows and, possibly, sheep or pigs in the first half of pregnancy) in slaughter shops of meat industry enterprises,
pretreatment of selected embryos, including
- obligatory treatment, that is, separation of the placenta, bleeding (usually through an unbundled umbilical cord), washing with running water to remove traces of amniotic fluid and blood, and placing bloodless and washed embryos in a refrigerator with a temperature of no higher than 12 o C (usually for a period not exceeding 24 hours) ) and
- possible additional processing: freezing (in particular stepwise) to a temperature below 0 o C (but preferably not lower than -80 o C) of embryos after bleeding and washing and thawing them;
separation of the head, hooves, gall bladder (with caution), stomach and intestines;
separation of soft tissues from bones;
soft tissue grinding (usually on cutters);
homogenization of the crushed soft tissues in a dispersion medium based on water (usually in an isotonic solution) until cell membranes are destroyed (using apparatuses of the "colloid mill"type);
separation of undamaged cellular elements and fibrous tissue elements (for example: by centrifugation at 1-80 thousand rpm, or by filtration, as a rule, on a vacuum suction filter);
simultaneous isolation of the target product with an average molecular weight of less than 10 (preferably less than 5) kDa and its sterilization by fractionation of the supernatant using means that serve as "bacterial filters" (preferably using fiber ultrafiltration units);
pouring and capping the target product (usually in glass ampoules) under sterile conditions.
В случаях использования апирогенной дистиллированной воды в качестве дисперсионной среды для приготовления гомогената в целевой продукт перед разливом добавляют хлорид натрия до достижения изотонической точки. In cases where pyrogen-free distilled water is used as a dispersion medium for the preparation of homogenate, sodium chloride is added to the target product before the spill to reach an isotonic point.
В целевой продукт, закладываемый на длительное хранение, может быть добавлен подходящий консервант, например хинозол, в достаточном для достижения антисептического эффекта и фармакологически приемлемом количестве, в частности около 0,8-1,0 г/л. Кроме того, такой продукт может быть дополнительно стерилизован любым из известных способов. A suitable preservative, for example, chinosol, may be added to the target product for long-term storage in a quantity sufficient to achieve an antiseptic effect and a pharmacologically acceptable amount, in particular about 0.8-1.0 g / l. In addition, such a product can be further sterilized by any of the known methods.
В целевом продукте в соответствии с утвержденной в 1994 г. Фармакопейным комитетом Министерства здравоохранения Украины Временной фармакопейной статьей ВФС 42У "Эрбисол для инъекций (Erbisolum pro injectionibus)" контролируют методами, предусмотренными "Государственной фармакопеей" и обозначаемой далее ГФ:
прозрачность (препарат должен выдерживать сравнение с эталонным раствором 1; ГФ XI, вып. 1, с. 198);
цветность (окраска препарата не должна быть интенсивнее эталона 3а; ГФ XI, вып. 1, с. 194), причем препарат без консервантов практически бесцветен, а при использовании хинозола имеет желто-коричневый цвет;
pH от 6,5 до 7,5 (при потенциометрическом определении; ГФ XI, вып. 1, с. 113);
механические включения (препарат должен выдерживать требования, указанные во Временной инструкции по контролю инъекционных растворов на механические включения И 42-3-85);
стерильность (препарат должен быть стерилен при определении методом мембранной фильтрации; ГФ XI, вып. 2, с. 187);
токсичность (препарат должен быть нетоксичен in vivo при внутривенном введении лабораторным животным в дозе 0,5 мл/кг и наблюдении в течение 48 часов; ГФ XI, вып. 2, с. 182);
пирогенность (препарат должен быть апирогенен in vivo при внутривенном введении лабораторным животным в дозе 0,5 мл/кг смеси, приготовленной в соотношении по объему 1/1 из испытуемого образца и 0,9% изотонического раствора хлорида натрия для инъекций, при наблюдении в течение 48 часов; ГФ XI, вып. 2, с. 183);
содержание белков (при обработке 1 мл препарата 1 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивании раствор должен оставаться прозрачным, что свидетельствует об отсутствии белков);
содержание пептидов в 1 мл препарата - от 1,0 до 3,0 мг/мл (по биуретовой реакции);
сухой остаток - от 14 до 20 мг/мл (при высушивании до постоянной массы 10 мл препарата при температуре от 100 до 105oC);
биологическую активность, которая при определении описанным ниже методом должна быть не ниже 3 единиц.In the target product, in accordance with the Pharmacopoeia Committee of the Ministry of Health of Ukraine approved in 1994, the Interim Pharmacopoeia Article VFS 42U "Erbisolum for injection (Erbisolum pro injectionibus)" is controlled by the methods provided by the "State Pharmacopoeia" and hereinafter referred to as the Global Fund:
transparency (the drug must be able to withstand comparison with reference solution 1; GF XI, issue 1, p. 198);
color (the color of the drug should not be more intense than standard 3a; GF XI, issue 1, p. 194), moreover, the preparation without preservatives is practically colorless, and when using quinosol, it is yellow-brown;
pH from 6.5 to 7.5 (with potentiometric determination; GF XI, issue 1, p. 113);
mechanical inclusions (the drug must withstand the requirements specified in the Interim Instructions for the control of injection solutions for mechanical inclusions AND 42-3-85);
sterility (the drug must be sterile when determined by membrane filtration; GF XI, issue 2, p. 187);
toxicity (the drug should be non-toxic in vivo when administered intravenously to laboratory animals at a dose of 0.5 ml / kg and observed for 48 hours; GF XI, issue 2, p. 182);
pyrogenicity (the drug should be pyrogen-free in vivo when intravenously administered to laboratory animals at a dose of 0.5 ml / kg of a mixture prepared in a ratio of 1/1 by volume of the test sample and 0.9% isotonic sodium chloride solution for injection, when observed during 48 hours; GF XI, issue 2, p. 183);
protein content (when processing 1 ml of the drug, 1 ml of a 5% trichloroacetic acid solution and stirring, the solution should remain transparent, which indicates the absence of proteins);
the peptide content in 1 ml of the drug is from 1.0 to 3.0 mg / ml (by biuret reaction);
dry residue - from 14 to 20 mg / ml (when dried to a constant weight of 10 ml of the drug at a temperature of from 100 to 105 o C);
biological activity, which, when determined by the method described below, must be at least 3 units.
Биологическую активность полученного вещества определяют по поглощению красителя (нитросиний тетразолий) макрофагами под влиянием целевого продукта. Для этого из брюшной полости мышей или крыс вымывают физиологическим или буферным раствором клеточный пул, содержащий до 30% фагоцитирующих клеток. Полученную смесь вносят во флаконы из стекла с плоским дном и инкубируют в термостате при 37oC не менее 1 часа. После этого флаконы трижды промывают физиологическим или буферным раствором для удаления неприлипших клеток.The biological activity of the obtained substance is determined by the absorption of the dye (nitrosine tetrazolium) by macrophages under the influence of the target product. For this, a cell pool containing up to 30% of phagocytic cells is washed out of the abdominal cavity of mice or rats with physiological or buffer solution. The resulting mixture is introduced into bottles of glass with a flat bottom and incubated in an incubator at 37 o C for at least 1 hour. After this, the vials are washed three times with physiological or buffer solution to remove non-adherent cells.
Далее вносят в одну часть флаконов порцию жидкости, состоящей соответственно из 0,5/0,5/1 частей физиологического раствора, целевого продукта и 0,1% раствора красителя, а в другую часть флаконов - порцию жидкости, состоящей соответственно из 1/1 частей физиологического раствора и 0,1% раствора красителя. Клетки с указанной экспериментальной и контрольной смесями инкубируют в течение 1 часа, затем снова трижды промывают для удаления остатков красителя. Во флаконы с отмытыми клетками добавляют диметилсульфоксид и 2М едкую щелочь в соотношении 1:1. Через 10-15 мин измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 630 нм. Next, a portion of the liquid, consisting of 0.5 / 0.5 / 1 parts of physiological saline, the target product and 0.1% dye solution, respectively, is added to one part of the vials, and a portion of the liquid, consisting respectively of 1/1, to the other part of the vials parts of saline and 0.1% dye solution. Cells with the indicated experimental and control mixtures were incubated for 1 hour, then washed three times again to remove stain residues. In vials with washed cells add dimethyl sulfoxide and 2M caustic alkali in a ratio of 1: 1. After 10-15 minutes, the optical density of the solution is measured at a wavelength of 630 nm.
Биологическую активность оценивают соотношением оптических плотностей в эксперименте и контроле. Biological activity is evaluated by the ratio of optical densities in the experiment and control.
Пример 1. Example 1
Для получения целевого продукта были взяты эмбрионы свиней и крупного рогатого скота (далее - КРС). To obtain the target product, pig and cattle embryos (hereinafter - cattle) were taken.
После обязательной предварительной обработки: отделения плаценты, обескровливания, обмывки проточной водой для удаления следов околоплодной жидкости и крови и суточного выдерживания обескровленных и обмытых эмбрионов в холодильной камере при температуре около 4oC отделили головы, копыта, желчные пузыри, части желудочно-кишечного тракта и мягкие ткани от костей.After mandatory pretreatment: separation of the placenta, bleeding, washing with running water to remove traces of amniotic fluid and blood, and daily holding of bloodless and washed embryos in a refrigerator at a temperature of about 4 o C, the heads, hooves, gall bladders, parts of the gastrointestinal tract were separated and soft tissue from the bones.
Затем мягкие ткани измельчили на куттере с отверстиями в решетке диаметром 3 мм и фарш дважды пропустили через коллоидную мельницу для гомогенизации с использованием апирогенной дистиллированной воды в качестве дисперсионной среды. Then the soft tissues were crushed on a cutter with holes in the grate with a diameter of 3 mm and minced meat was twice passed through a colloidal mill for homogenization using pyrogen-free distilled water as a dispersion medium.
Гомогенат отцентрифугировали в течение 15 мин при 3 тыс. об/мин для отделения неразрушенных клеточных элементов и элементов волокнистых тканей, осадок передали на утилизацию, а в надосадочную жидкость добавили хлорид натрия до его конечной концентрации 0,9% и смесь подвергли стерилизующей ультрафильтрации для выделения целевого продукта со средней молекулярной массой менее 10 кДа. The homogenate was centrifuged for 15 min at 3 thousand rpm to separate undamaged cellular and fibrous tissue elements, the precipitate was transferred for disposal, and sodium chloride was added to the supernatant to a final concentration of 0.9% and the mixture was subjected to sterilizing ultrafiltration to isolate the target product with an average molecular weight of less than 10 kDa.
Далее описанным выше методом определили биологическую активность, которая для продукта, полученного из свиных эмбрионов, оказалась в 5,0 раз, а из эмбрионов КРС - в 4,0 раза выше контроля. Further, the biological activity was determined by the method described above, which was 5.0 times for the product obtained from pork embryos, and 4.0 times higher than the control for cattle embryos.
После контроля прозрачности, цветности, pH, механических включений, стерильности, токсичности, пирогенности и содержания, белков, пептидов и сухого остатка, которые соответствовали нормам вышеупомянутой Временной фармакопейной статьи ВФС 42У "Эрбисол для инъекций", целевой продукт в стерильных условиях разлили и укупорили в стеклянные ампулы. After controlling the transparency, color, pH, mechanical inclusions, sterility, toxicity, pyrogenicity and content, proteins, peptides and solids, which met the standards of the above-mentioned Temporary Pharmacopoeia article VFS 42U "Erbisol for injection", the target product was poured and sealed in sterile conditions glass ampoules.
Пример 2. Example 2
Для получения целевого продукта были взяты свежие и замороженные эмбрионы КРС. Fresh and frozen cattle embryos were taken to obtain the desired product.
Целевой продукт из свежих эмбрионов (ЦПСЭ) был получен в основном так, как описано в примере 1, с теми отличиями, что перед отделением мягких тканей их не выдерживали в холодильнике, и что при стерилизующей ультрафильтрации в качестве целевого продукта были выделены вещества со средней молекулярной массой до 5 кДа. The target product from fresh embryos (CPSE) was obtained mainly as described in example 1, with the differences that they were not kept in the refrigerator before separation of the soft tissues, and that substances with medium molecular weight were isolated as the target product during sterilizing ultrafiltration weighing up to 5 kDa.
Для получения целевого продукта из замороженных эмбрионов (ЦПЗЭ) способ, описанный в примере 1, был дополнен такими операциями, как замораживание обескровленных и обмытых эмбрионов в скороморозильной камере до температуры около -40oC, выдерживание при этой температуре в течение 48 часов и их самопроизвольное размораживание при комнатной температуре. Как и в примере 1, при стерилизующей ультрафильтрации в качестве целевого продукта были выделены вещества со средней молекулярной массой до 10 кДа.To obtain the target product from frozen embryos (CPZE), the method described in example 1 was supplemented with operations such as freezing bloodless and washed embryos in a freezer to a temperature of about -40 o C, keeping at this temperature for 48 hours and spontaneous thawing at room temperature. As in example 1, with sterilizing ultrafiltration, substances with an average molecular weight of up to 10 kDa were isolated as the target product.
Биологическая активность ЦПСЭ оказалась в 7,8, а ЦПЗЭ - в 10,8 раза выше контроля. The biological activity of CPSE turned out to be 7.8, and CPSE - 10.8 times higher than the control.
Пример 3. Example 3
Для получения целевого продукта были взяты эмбрионы КРС, постепенно (при понижении температуры со скоростью -2 oC/час) замороженные до -80oC в морозильнике, снабженном регулятором температуры, а затем разморожены при комнатной температуре.To obtain the target product, cattle embryos were taken, gradually (at lowering the temperature at a rate of -2 o C / h) frozen to -80 o C in a freezer equipped with a temperature controller, and then thawed at room temperature.
ЦПЗЭ был получен, как указано в примере 2, с использованием при гомогенизации пригодного для инъекций 0,9% изотонического раствора хлорида натрия. CPE was obtained, as described in example 2, using a homogenization suitable for injection 0.9% isotonic sodium chloride solution.
Биологическая активность ЦПЗЭ оказалась в 11,0 раз выше контроля. The biological activity of CPE was 11.0 times higher than the control.
Пример 4. Example 4
Для получения целевого продукта были взяты эмбрионы КРС, постепенно (при понижении температуры со скоростью -2,5 oC/час) замороженные до -90oC в морозильнике, снабженном регулятором температуры, а затем разморожены при комнатной температуре.To obtain the target product, cattle embryos were taken, gradually (at lowering the temperature at a rate of -2.5 o C / h) frozen to -90 o C in a freezer equipped with a temperature controller, and then thawed at room temperature.
ЦПЗЭ был получен, как указано в примере 2, с использованием при гомогенизации пригодного для инъекций 0,9% изотонического раствора хлорида натрия. CPE was obtained, as described in example 2, using a homogenization suitable for injection 0.9% isotonic sodium chloride solution.
Биологическая активность ЦПЗЭ оказалась в 10,8 раз выше контроля. The biological activity of CPE was 10.8 times higher than the control.
Пример 5. Example 5
Для получения целевого продукта были взяты эмбрионы КРС, из которых описанным выше способом-прототипом с использованием гидролиза гомогената в присутствии консерванта (хинозола) при температуре 40oC в течение трех суток, термообработки гидролизата при температуре 120oC до денатурации балластных веществ, отделения денатурированных термолабильных веществ и ультрафильтрации гидролизата получен целевой продукт со средней молекулярной массой менее 10 кДа.To obtain the target product, cattle embryos were taken, of which the prototype described above using hydrolysis of a homogenate in the presence of a preservative (chinosol) at a temperature of 40 o C for three days, heat treatment of the hydrolyzate at a temperature of 120 o C to denature the ballast substances, separating the denatured thermolabile substances and ultrafiltration of the hydrolyzate obtained the target product with an average molecular weight of less than 10 kDa.
Его биологическая активность была всего в 2,3 раза выше контроля. Its biological activity was only 2.3 times higher than the control.
Промышленная применимость предложенного способа обоснована как стабильностью показателей качества (и особенно биологической активности, которая во всех случаях более чем в 4 раза выше контроля), так и сокращением расхода энергии в среднем на 15%, и возможностью выполнения всего технологического цикла не более чем за 60 часов (обычно - за сутки). The industrial applicability of the proposed method is justified both by the stability of quality indicators (and especially biological activity, which in all cases is more than 4 times higher than the control), and by reducing energy consumption by an average of 15%, and the ability to complete the entire technological cycle in no more than 60 hours (usually per day).
Claims (6)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA96072998A UA35631C2 (en) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | Method for producing biologically active preparations from embryonic tissues |
| UA96072998 | 1996-07-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU96115729A RU96115729A (en) | 1999-02-20 |
| RU2132688C1 true RU2132688C1 (en) | 1999-07-10 |
Family
ID=21689144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96115729A RU2132688C1 (en) | 1996-07-25 | 1996-07-29 | Method of preparing biologically active preparations from embryonal tissues |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2132688C1 (en) |
| UA (1) | UA35631C2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2445106C1 (en) * | 2010-07-01 | 2012-03-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system disorders of cardiovascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune genesis |
| WO2012166004A1 (en) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Protein-polypeptide complex with a specific activity on the nervous system, process for preparing same and pharmaceutical composition on the basis thereof |
| WO2012166005A1 (en) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Protein-polypeptide complex with a specific activity on skin tissue, process for preparing same and pharmaceutical composition on the basis thereof |
| RU2686098C1 (en) * | 2018-01-10 | 2019-04-24 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Кавказский федеральный университет" | Agent possessing antioxidant and neuroprotective properties |
-
1996
- 1996-07-25 UA UA96072998A patent/UA35631C2/en unknown
- 1996-07-29 RU RU96115729A patent/RU2132688C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2445106C1 (en) * | 2010-07-01 | 2012-03-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Pharmaceutical composition for treating central and peripheral nervous system disorders of cardiovascular, traumatic, toxic, hypoxic and autoimmune genesis |
| WO2012166004A1 (en) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Protein-polypeptide complex with a specific activity on the nervous system, process for preparing same and pharmaceutical composition on the basis thereof |
| WO2012166005A1 (en) | 2011-05-30 | 2012-12-06 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Protein-polypeptide complex with a specific activity on skin tissue, process for preparing same and pharmaceutical composition on the basis thereof |
| RU2686098C1 (en) * | 2018-01-10 | 2019-04-24 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Кавказский федеральный университет" | Agent possessing antioxidant and neuroprotective properties |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| UA35631C2 (en) | 2001-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA007814B1 (en) | Casein derived peptides and uses thereof in therapy | |
| CA1179263A (en) | Chymopapain and method for its use | |
| JP2008509073A (en) | Casein-derived peptides and their therapeutic use | |
| EP0240348B1 (en) | Agent for the removal of nucleic acids and/or endotoxin and method for the removal thereof | |
| TWI586362B (en) | Novel protein material | |
| RU2132688C1 (en) | Method of preparing biologically active preparations from embryonal tissues | |
| KR20180028229A (en) | The Method of High-yield and High-purity Manufacturing of Allo-collagen Composition Extracted From Human origin | |
| JP2013039087A (en) | Drinking water containing proteoglycan and method for producing the same | |
| RU2621311C1 (en) | Method for obtaining proteoglycan | |
| TW201410160A (en) | Beverage and method of manufacturing same | |
| US20230142873A1 (en) | Bacterium of the christensenellaceae family and composition containing same for preventing and/or treating renal insufficiency | |
| RU2222337C1 (en) | Method for obtaining immunostimulant | |
| JP3805975B2 (en) | Wound healing agent | |
| RU2304441C1 (en) | Method for obtaining sulfated glycosaminoglycans out of biological tissues | |
| RU2302427C2 (en) | Method for producing intravenous injection immunoglobulin preparation and preparation produced in this way | |
| RU2610669C1 (en) | Method for production of proteolytic preparation for medical use | |
| TWI574696B (en) | Novel protein material | |
| CN113768159B (en) | Composition for improving cartilage function | |
| JPH0670085B2 (en) | Chondroitin sulfate derivative | |
| RU2273486C1 (en) | Method for separating sulfated glycosoamineglycanes from biological tissue | |
| RU2221591C1 (en) | Method for preparing preparation for active immunization against tularemia | |
| JPH03505200A (en) | Processes for the production of therapeutically active agents, especially for use in wound care or geriatrics, and preparations containing such agents. | |
| RU2041715C1 (en) | Biologically active remedy, method for its producing, preparation containing the mentioned remedy and method for applying the preparation | |
| RU2128514C1 (en) | Method of anti-inflammatory agent preparing | |
| SU623556A1 (en) | Hyaluronidase production method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120730 |