JP2013039087A - Drinking water containing proteoglycan and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織より単離された分子量が９０万ダルトンから３００万ダルトンのコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを含有してなる飲料水に関する。より詳細には、本発明は、サケ鼻軟骨から単離された分子量１００万ダルトン以上の高分子成分であるコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを含有してなる飲料水に関する。
また、本発明は、低温保持殺菌法であるパスチャライズ法を利用することにより殺菌とコアタンパク質の変性防止を可能にしたことを特徴とするコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを含有してなる飲料水の製造方法を提供するものである。
さらに、本発明は、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織より単離された分子量が９０万ダルトンから３００万ダルトンのコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを含有してなる免疫賦活剤又はＮＫ細胞の活性化剤に関する。
The present invention relates to drinking water comprising chondroitin sulfate proteoglycan having a molecular weight of 900,000 to 3 million daltons isolated from cartilage tissue of fish, birds or mammals. More specifically, the present invention relates to a drinking water containing chondroitin sulfate proteoglycan, which is a high molecular component having a molecular weight of 1 million daltons or more isolated from salmon nasal cartilage.
In addition, the present invention provides a method for producing drinking water containing chondroitin sulfate proteoglycan characterized in that it enables sterilization and prevention of core protein denaturation by utilizing a pasteurization method which is a low temperature sterilization method. It is to provide.
Furthermore, the present invention relates to an immunostimulator or NK cell activator comprising a chondroitin sulfate proteoglycan having a molecular weight of 900,000 to 3 million daltons isolated from fish, birds or mammalian cartilage tissue.
プロテオグリカンは、１本ないし数１０本のグリコサミノグリカンと呼ばれている糖鎖が１本のコアタンパク質のセリンに共通結合した糖タンパク複合体である。以前はムコ多糖タンパク複合体とも呼ばれていた。異なる２種類の糖の繰り返し構造を有する糖鎖を持っていることを特徴としている。構成する糖の種類により、またそれぞれの単糖が硫酸基によって修飾されているか否かによって、いくつかの種類に分類される。主な糖鎖として現在知られているものに、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン及びヒアルロン酸がある。
これらの糖鎖のうち、ヒアルロン酸のみがコアたんぱく質に結合しないことが明らかになっており、プロテオグリカンのヒアルロン酸は、リンクタンパク質を介してコアタンパク質のヒアルロン酸結合領域と会合し、巨大なプロテオグリカン集合体(proteoglycan aggregate)を形成している（非特許文献１参照）。
このように、プロテオグリカンには糖鎖の種類によりいくつかのタイプがあり、中でも主な糖鎖としてコンドロイチン硫酸を有し、軟骨の細胞外マトリックスを構成するコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは、一般に大きな分子量を持つことが知られている。
プロテオグリカンとは別に、糖とタンパク質の複合体としては、細胞の表面に存在し、そのタンパク質部分の大半は細胞膜を貫通し細胞質に達しており、細胞外において糖鎖部分が該タンパク質と結合している糖タンパク質と呼ばれているものがある。プロテオグリカンの糖鎖は分岐構造を有しないが、細胞膜表面の糖タンパク質の糖鎖部分は２分岐している構造のものが多い。これは様々な成分の受容体として作用するため、必然的に２分岐しているものと考えられる。
A proteoglycan is a glycoprotein complex in which one to several tens of glycosaminoglycans are commonly linked to serine of one core protein. Formerly called mucopolysaccharide protein complex. It is characterized by having a sugar chain having a repeating structure of two different types of sugars. It is classified into several types depending on the type of saccharides to be constituted and whether or not each monosaccharide is modified with a sulfate group. Among the main sugar chains currently known are chondroitin, chondroitin sulfate, keratan sulfate, dermatan sulfate, heparan sulfate, heparin and hyaluronic acid.
Of these sugar chains, it has been clarified that only hyaluronic acid does not bind to the core protein, and the hyaluronic acid of the proteoglycan associates with the hyaluronic acid-binding region of the core protein via the link protein, and the large proteoglycan assembly The body (proteoglycan aggregate) is formed (refer nonpatent literature 1).
Thus, there are several types of proteoglycans depending on the type of sugar chain. Among them, chondroitin sulfate type proteoglycans that have chondroitin sulfate as the main sugar chain and constitute the extracellular matrix of cartilage generally have a large molecular weight. It is known.
Apart from proteoglycans, sugar-protein complexes exist on the surface of cells, and most of the protein part penetrates the cell membrane and reaches the cytoplasm, and the sugar chain part binds to the protein outside the cell. There is what is called glycoprotein. The sugar chain of proteoglycan does not have a branched structure, but the sugar chain part of the glycoprotein on the surface of the cell membrane is often branched in two. Since this acts as a receptor for various components, it is inevitably considered to be bifurcated.
一方、プロテオグリカンは、例えばヘパラン硫酸のような一部の例外を除き、細胞膜を貫通しているものはなく、一般に細胞外マトリックス（細胞外基質又は細胞間基質とも呼ばれる。）を構成する成分のひとつとして機能している。細胞外マトリックスは、文字どおり細胞外の微小環境を構築するものであり、細胞の足場ともなり、また動脈毛細血管から排出される酸素、水分、栄養素、さらにはサイトカインやホルモン等のタンパク質その他の貯留機能を有しており、必要に応じて個々の細胞に分配しているものである。逆に細胞内で代謝され、不要となった成分、炭酸ガス等が細胞外に排出され、それらが一旦細胞外マトリックスに貯留され、静脈毛細血管を通じて肝臓、肺等で処理される。細胞から排出されるものは不要物だけではなく、有用成分も排出される。排出された有用成分も一旦細胞外マトリックスに貯留され、隣接する細胞に影響を与える。
さらに体内水分量の調整機能も有している。
このように動物の身体は、細胞と細胞外マトリックスで構成されているとも言えるものである。細胞は勿論であるが、その細胞の働きをサポートしている細胞外マトリックスの重要性も無視できない。その細胞外マトリックスを構成している最も重要な成分がプロテオグリカンである。
On the other hand, with some exceptions such as heparan sulfate, proteoglycans do not penetrate the cell membrane and are generally one of the components that constitute the extracellular matrix (also called extracellular matrix or intercellular matrix). Is functioning as The extracellular matrix literally builds the extracellular microenvironment, serves as a scaffold for the cells, and discharges oxygen, water, nutrients, proteins such as cytokines and hormones, and other storage functions from arterial capillaries And is distributed to individual cells as needed. Conversely, components that are metabolized intracellularly and become unnecessary, such as carbon dioxide gas, are discharged out of the cell, and are temporarily stored in the extracellular matrix and processed in the liver, lungs, etc. through venous capillaries. Not only unnecessary items but also useful components are discharged from the cells. The discharged useful components are also temporarily stored in the extracellular matrix and affect adjacent cells.
It also has a function of adjusting the amount of water in the body.
Thus, it can be said that the animal body is composed of cells and extracellular matrix. Of course, the importance of the extracellular matrix that supports the function of the cell cannot be ignored. The most important component constituting the extracellular matrix is a proteoglycan.
プロテオグリカンの製造法としては、本発明者らによるアルカリ分解抽出方法がある（特許文献１参照）。この方法により、１２０万ダルトンという高分子量の精製されたプロテオグリカンを製造することができる。
また、軟骨魚類由来の軟骨を粉砕し、水を加えて水溶性成分を抽出し、水層を分離し、アルコールを加えて沈殿物を得てプロテオグリカンを製造する方法（特許文献２参照）や、エタノールを用いて鮭、鱒の頭部の軟骨組織から脱脂されたプロテオグリカンを製造する方法（特許文献３参照）などが報告されている。
ひれ／軟骨部より得られるプロテオグリカン／コンドロイチン又はその硫酸塩／グルコサミノグリカン／脂質結合タンパク質を含有してなる健康維持、成人病予防／老化防止に寄与する健康食品（特許文献４参照）、ムコ多糖類含有天然物を加圧しない加熱処理と酵素処理、酸アルカリ処理の中から選択される一種又は複数の変性処理を行いムコ多糖類結合性のアミノ酸や蛋白質を変性させることを特徴とするアミノグリカン構造、ペプチドグリカン構造、プロテオグリカン構造から選択される２種以上のムコ多糖類を含有するムコ多糖を含有してなる生体組織中の細胞外マトリックス成分の機能を亢進する食品（特許文献５参照）、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなど含有してなる細胞効果の促進に有用な組成物（特許文献６参照）などが報告されているが、いずれも精製されたプロテオグリカンを使用することは開示されていない。
また、子実体を形成したハナサナギタケIsaria japonica ＩＭ２００１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８２５３）虫草の抽出組成物を含有する機能性食品であって、当該抽出組成物は、イオン交換樹脂、ゲルろ過剤等のカラムクロマトグラフィーによって精製、分画をしたプロテオグリカン（タンパク−糖複合体）を含有することが報告されている（特許文献７参照）が、当該プロテオグリカンとはタンパク−糖複合体であり、本発明のプロテオグリカンとは異なるものである。
As a method for producing proteoglycan, there is an alkali decomposition extraction method by the present inventors (see Patent Document 1). By this method, a purified proteoglycan having a high molecular weight of 1.2 million daltons can be produced.
In addition, a method for producing proteoglycan by pulverizing cartilage derived from cartilaginous fish, adding water to extract a water-soluble component, separating an aqueous layer, adding alcohol to obtain a precipitate (see Patent Document 2), A method for producing proteoglycan defatted from the cartilage tissue of the heel and heel head using ethanol (see Patent Document 3) has been reported.
Health food containing proteoglycan / chondroitin or its sulfate / glucosaminoglycan / lipid-binding protein obtained from fin / cartilage part, health food that contributes to prevention of adult diseases / antiaging (see Patent Document 4), muco An amino acid characterized by denaturing a mucopolysaccharide-binding amino acid or protein by performing one or more denaturation treatments selected from heat treatment without pressing a polysaccharide-containing natural product, enzyme treatment, and acid-alkali treatment A food that enhances the function of an extracellular matrix component in a living tissue containing a mucopolysaccharide containing two or more mucopolysaccharides selected from a glycan structure, a peptidoglycan structure, and a proteoglycan structure (see Patent Document 5); A composition useful for promoting cell effects comprising collagen, heparan sulfate proteoglycan, etc. (Patent Document 6) Although irradiation) have been reported, it does not disclose the use of both purified proteoglycans.
In addition, it is a functional food containing an extract composition of Isaria japonica IM2001 strain (FERM P-18253) insect grass that has formed fruit bodies, and the extract composition contains column chromatography such as an ion exchange resin and a gel filter agent. It has been reported that it contains a proteoglycan (protein-sugar complex) purified and fractionated by chromatography (see Patent Document 7). The proteoglycan is a protein-sugar complex, and the proteoglycan of the present invention Are different.
鮫、鯨、鮭、エイなどの動物軟骨を粉砕し、酸で処理したのち、酵素で処理し、得られた消化液を乾燥し粉末化することを特徴とする対イオンがカルシウムであるコンドロイチン硫酸タンパク質複合体を含んでなる食品（特許文献８参照）、サケ軟骨から抽出されたコンドロイチン硫酸と、ヒアルロン酸と、ＩＩ型コラーゲンとを有効成分として含有することを特徴とする肌荒れ治療又は予防用組成物（特許文献９参照）などの動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸を含有する食品類が報告されているが、いずれも本発明における精製されたプロテオグリカンの使用を開示するものではない。 Chondroitin sulfate, whose counter ion is calcium, is characterized by crushing animal cartilage such as salmon, whale, salmon, ray, etc., treating with acid, treating with enzyme, and drying and pulverizing the resulting digestive juice A composition for treating or preventing rough skin, comprising as an active ingredient a food comprising a protein complex (see Patent Document 8), chondroitin sulfate extracted from salmon cartilage, hyaluronic acid, and type II collagen Foods containing chondroitin sulfate derived from animal cartilage such as products (see Patent Document 9) have been reported, but none disclose the use of purified proteoglycans in the present invention.
また、一般にタンパク質、糖質、脂質、ミネラル類、ビタミン類は、もともと低分子成分であったり、消化酵素によって低分子化され、主として小腸の絨毛から吸収される。
一方、消化酵素によって低分子化されない細菌、ウイルス、カビ、糖鎖、コラーゲン等の一部のタンパク質等の高分子成分は、小腸の絨毛から吸収されるのではなく、非自己抗原として小腸のところどころに存在するパイエルパッチ（又はパイエル板とも言う。）と呼ばれているリンパ小節の集合体である免疫組織に吸収される。パイエルパッチを被覆している上皮細胞の一つにＭ細胞と呼ばれているものがある。非自己抗原としての高分子成分はＭ細胞に取り込まれ、続いてパイエルパッチ内のマクロファージや樹状細胞に貪食され、Ｔ細胞、Ｂ細胞に抗原呈示され、Ｔ細胞が産生するＩＬ−１２がＮＫ細胞を活性化させているものと一般的に理解されている。
このように、低分子成分は栄養素として絨毛から吸収されるが、高分子成分は、非自己抗原としてＭ細胞からパイエルパッチ内に取り込まれ、免疫賦活という機能を果たしているもので、両者は全く異なるものである。
高分子のままＭ細胞に取り込ませるためには、胃や小腸での分解を防ぐ難消化性であり、かつ毒性がなく、また、最終的には分解酵素の作用を受け分解し、体内に蓄積しない成分でなければならない。
In general, proteins, carbohydrates, lipids, minerals, and vitamins are originally low molecular components or are made low molecular by digestive enzymes and absorbed mainly from the small intestinal villi.
On the other hand, high molecular components such as bacteria, viruses, molds, sugar chains, and some proteins such as collagen that are not reduced in molecular weight by digestive enzymes are not absorbed from the villi of the small intestine, but are located in the small intestine as non-self antigens. It is absorbed into the immune system, which is a collection of lymph nodes called Peyer patches (also called Peyer patches). One of the epithelial cells covering the Peyer patch is called an M cell. Macromolecular components as non-self antigens are taken up by M cells, then phagocytosed by macrophages and dendritic cells in Peyer patches, and presented to T cells and B cells, and IL-12 produced by T cells is NK. It is generally understood that cells are activated.
In this way, the low molecular component is absorbed from the villi as a nutrient, but the high molecular component is incorporated into Peyer's patch from the M cell as a non-self antigen and functions as an immunostimulator. Is.
In order to be taken up by M cells as a polymer, it is indigestible to prevent degradation in the stomach and small intestine and is not toxic. Finally, it is degraded by the action of degrading enzymes and accumulates in the body. Must not be an ingredient.
さらに、プロテオグリカンは数々の優れた機能を有しており、多くの研究者がこれらの機能に注目し、様々な研究が進行している。いくつかの例をあげると、人工関節の制作、創傷治癒剤の開発、潰瘍性大腸炎の修復剤、関節リウマチ・変形性関節症の炎症抑制剤等が挙げられる。
しかし、プロテオグリカンは難消化性の高分子物質であり、その多くは溶解性に乏しく、プロテオグリカンの経口投与により生体内に吸収されるか否かは十分に解明されていなかっただけでなく、プロテオグリカンはコアタンパク質を有しており、経時安定性に問題があるだけでなく、熱変性を受けやすく、その取扱いも難しいとされていた。
Furthermore, proteoglycans have a number of excellent functions, and many researchers are paying attention to these functions, and various studies are ongoing. Some examples include the production of artificial joints, the development of wound healing agents, the repair agents for ulcerative colitis, and the anti-inflammatory agents for rheumatoid arthritis and osteoarthritis.
However, proteoglycans are indigestible polymer substances, many of which have poor solubility, and it has not been fully elucidated whether or not they are absorbed into the body by oral administration of proteoglycans. It has a core protein and is not only problematic in terms of stability over time, but is also susceptible to thermal denaturation and its handling is difficult.
本発明は、プロテオグリカンを含有してなる免疫賦活剤、食品添加剤、及びそれを含有してなる飲食品、特に飲料水を提供する。
本発明者らは、精製された高分子量のプロテオグリカン、特に白ザケの軟骨を構成しているコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの精製方法及び製造方法を開発してきた（特許文献１参照）。また、本発明者らは、プロテオグリカンが有している有用な機能に注目してきた。
しかし、プロテオグリカンは高分子量の固体であり、取扱いが制限されているだけでなく、摂取も容易ではなかった。また、溶液にする場合には溶媒が可食性のものではならないだけでなく、溶液中でのプロテオグリカンのコアタンパク質の変性や安定性が大きな問題となる。
さらに、プロテオグリカンは、コアタンパク質を有しており、タンパク質は熱変性を起こすことが知られており、プロテオグリカンのコアタンパク質も高温殺菌をすると、コアタンパク質部分が変性し、プロテオグリカンが本来の持っている機能を失うことになる。しかし、タンパク質部分が変性し、該プロテオグリカン本来の持つ機能を失うことを避けるため、余り低温だと殺菌しきれないという問題があった。
The present invention provides an immunostimulant comprising a proteoglycan, a food additive, and a food or drink comprising the same, particularly a drinking water.
The present inventors have developed a purification method and a production method of purified high molecular weight proteoglycan, particularly chondroitin sulfate type proteoglycan constituting white salmon cartilage (see Patent Document 1). In addition, the present inventors have focused on useful functions possessed by proteoglycans.
However, proteoglycans are high molecular weight solids that are not only restricted in handling but also not easy to ingest. In addition, in the case of making a solution, not only the solvent is not edible, but also denaturation and stability of the proteoglycan core protein in the solution becomes a big problem.
Furthermore, proteoglycan has a core protein, and it is known that the protein undergoes heat denaturation. When the core protein of proteoglycan is also pasteurized at high temperature, the core protein part is denatured and the proteoglycan originally has You will lose functionality. However, there is a problem that the protein portion cannot be sterilized at a too low temperature in order to avoid denatured protein and losing the original function of the proteoglycan.
本発明者らは、本発明者らが開発してきたアルカリ分解抽出方法（特許文献１参照）により製造されるプロテオグリカンに着目した。当該プロテオグリカンは、軟骨の細胞外マトリックスを構成するコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンであり、一般に大きな分子量を持つことが知られている。動物の種類、及び成長の度合いにより、分子量が変化すること、修飾する硫酸基の結合位置及び量が変化することが知られており、動物種によっては、２００万〜２５０万ダルトンという巨大なコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンも存在することが知られている。また、硫酸基の量の変化がまた全体の分子量の変化に繋がっているので、当該プロテオグリカンの正確な分子量を確定することは難しいとされている。 The present inventors paid attention to proteoglycans produced by the alkaline decomposition extraction method (see Patent Document 1) that has been developed by the present inventors. The proteoglycan is a chondroitin sulfate type proteoglycan that constitutes the extracellular matrix of cartilage, and is generally known to have a large molecular weight. It is known that the molecular weight changes depending on the type of animal and the degree of growth, and the binding position and amount of the sulfate group to be modified change. Depending on the animal species, a huge chondroitin of 2 million to 2.5 million daltons It is known that sulfate-type proteoglycans also exist. In addition, since the change in the amount of sulfate groups also leads to a change in the overall molecular weight, it is difficult to determine the exact molecular weight of the proteoglycan.
本発明者らは、このようにして分離精製されたコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが、消化器官内では難消化性であるのに、水には易溶であることを見出した。また、コンドロイチン硫酸型のプロテオグリカンが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化作用を有していることを見出した。これは、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが、ＮＫ細胞を活性化することによる免疫賦活作用を有していると言うことだけでなく、パイエルパッチを被覆している上皮細胞のＭ細胞に取り込まれることを意味しており、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが高分子量の形で生体内に吸収され得るものであることを見出したことになる。
さらに、本発明者らは、牛乳の殺菌方法として知られるパスチャライズ法による殺菌方法が、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの水溶液の殺菌に有効であり、かつコアタンパク質を変性させないことを見出した。この方法は、牛乳の場合には、賞味期限を長く取れないという欠点があり、牛乳生産者に普遍的に用いられている方法ではない。しかし、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの水溶液の場合には、殺菌とコアタンパク質の変性防止という二律背反的な条件を同時に解決できる極めて有効な方法であることを見出した。
即ち、本発明者らは、飲料などとして利用可能な、比較的長期間にわたって安定にかつ安全に保存可能な、新規なコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの水溶液を提供することに成功した。
The present inventors have found that chondroitin sulfate type proteoglycan separated and purified in this way is indigestible in the digestive tract, but is easily soluble in water. Moreover, it discovered that chondroitin sulfate type proteoglycan had the activation effect | action of a natural killer (NK) cell. This means that chondroitin sulfate type proteoglycan not only has an immunostimulatory effect by activating NK cells, but is also taken up by M cells of epithelial cells covering Peyer patches. Thus, it has been found that chondroitin sulfate type proteoglycan can be absorbed into a living body in a high molecular weight form.
Furthermore, the present inventors have found that a pasteurization method known as a milk sterilization method is effective in sterilizing an aqueous solution of chondroitin sulfate proteoglycan and does not denature the core protein. In the case of milk, this method has a drawback that it cannot take a long shelf life, and is not a method that is universally used by milk producers. However, in the case of an aqueous solution of chondroitin sulfate type proteoglycan, it has been found that this is an extremely effective method that can simultaneously solve the contradictory conditions of sterilization and prevention of core protein denaturation.
That is, the present inventors have succeeded in providing a novel aqueous solution of chondroitin sulfate proteoglycan that can be used as a beverage and can be stably and safely stored for a relatively long period of time.
本発明は、高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを含有してなる水溶液に関する。当該水溶液は、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを変性させることなく長期にわって安定にかつ安全に保存することができるだけでなく、当該コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは高分子量の状態で生体内に取り込まれ、さらに免疫賦活作用などの有用な作用を有するものである。したがって、当該水溶液は、経口摂取に適しており、食品添加剤としてだけでなく、飲料水や医薬製剤としても使用することができる。
また、本発明は、高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを水に溶解させる工程、及び得られた水溶液を６３℃〜６５℃で３０分間加熱殺菌を行うパスチャライズ法により殺菌処理する工程、を含有してなるコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの水溶液の製造方法に関する。当該水溶液を飲料水（以下、単に飲料と言うこともある。）とする場合には、本発明は、高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの水溶液を含有してなる飲料を製造する工程、当該飲料をボトリングする工程、及びボトリングされた飲料を６３℃〜６５℃で３０分間加熱殺菌を行うパスチャライズ法により殺菌処理する工程、を含有してなるコンドロイチン型プロテオグリカンを含有してなる飲料の製造方法に関する。
The present invention relates to an aqueous solution containing a high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan. The aqueous solution can not only denature the chondroitin sulfate proteoglycan, but can be stored stably and safely for a long time, and the chondroitin sulfate proteoglycan is taken into the living body in a high molecular weight state and further immunostimulated. It has a useful action such as action. Therefore, the aqueous solution is suitable for oral intake and can be used not only as a food additive but also as a drinking water or a pharmaceutical preparation.
The present invention also includes a step of dissolving high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan in water, and a step of sterilizing the obtained aqueous solution by a pasteurization method in which heat sterilization is performed at 63 ° C. to 65 ° C. for 30 minutes. The manufacturing method of the aqueous solution of the chondroitin sulfate type proteoglycan which becomes. When the aqueous solution is used as drinking water (hereinafter sometimes simply referred to as a beverage), the present invention provides a process for producing a beverage containing an aqueous solution of a high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan, The present invention relates to a method for producing a beverage containing chondroitin-type proteoglycan comprising a step of bottling and a step of sterilizing a bottling beverage by a pasteurization method in which heat sterilization is performed at 63 ° C. to 65 ° C. for 30 minutes.
さらに、本発明は、高分子量のコンドロイチン型プロテオグリカンを含有してなる免疫賦活剤に関する。また、本発明は、高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを含有してなるＮＫ細胞の活性化剤に関する。より詳細には、本発明は、ＮＫ細胞の活性化による免疫賦活剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to an immunostimulator comprising a high molecular weight chondroitin type proteoglycan. The present invention also relates to an NK cell activator comprising a high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan. More specifically, the present invention relates to an immunostimulator by NK cell activation.
本発明をさらに詳細に説明すれば次のとおりとなる。
（１）高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを含有してなる水溶液。
（２）コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの分子量が、９０万ダルトンから３００万ダルトンである前記（１）に記載の水溶液。
（３）コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を０．００２５Ｎ〜０．０５Ｎのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の溶液に０〜１０℃で浸漬する工程、並びに浸漬後の溶液を回収する工程を含有してなる方法（特許文献１に記載の方法）により製造されたものである前記（１）又は（２）に記載の水溶液。
（４）プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織である前記（３）に記載の水溶液。
（５）高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織より単離された分子量が９０万ダルトンから３００万ダルトンのコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである前記（１）から（４）のいずれかに記載の水溶液。
（６）魚類の軟骨組織が、サケ鼻軟骨である前記（４）又は（５）に記載の水溶液。
（７）高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの含有量が、０．００１質量％から１質量％である前記（１）から（６）のいずれかに記載の水溶液。
（８）高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの含有量が、０．０１質量％から０．０５質量％である前記（１）から（７）のいずれかに記載の水溶液。
（９）水溶液が、パスチャライズ法により殺菌処理されたものである前記（１）から（８）のいずれかに記載の水溶液。
（１０）パスチャライズ法により殺菌処理が、６３℃〜６５℃で３０分間加熱殺菌を行うものである前記（９）に記載の水溶液。
The present invention will be described in more detail as follows.
(1) An aqueous solution containing a high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan.
(2) The aqueous solution according to (1) above, wherein the molecular weight of the chondroitin sulfate proteoglycan is 900,000 to 3 million daltons.
(3) A step in which chondroitin sulfate type proteoglycan immerses a biological sample containing proteoglycan in a solution of 0.0025 N to 0.05 N alkali metal salt or alkaline earth metal salt at 0 to 10 ° C., and after immersion The aqueous solution according to (1) or (2), which is produced by a method comprising a step of recovering the solution of (1) described in Patent Document 1.
(4) The aqueous solution according to (3), wherein the biological sample containing proteoglycan is fish, birds or mammalian cartilage tissue.
(5) The high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan is a chondroitin sulfate type proteoglycan having a molecular weight of 900,000 to 3 million daltons isolated from fish, birds or mammalian cartilage tissue. The aqueous solution in any one.
(6) The aqueous solution according to (4) or (5), wherein the fish cartilage tissue is salmon nasal cartilage.
(7) The aqueous solution according to any one of (1) to (6), wherein the content of the high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan is 0.001% by mass to 1% by mass.
(8) The aqueous solution according to any one of (1) to (7), wherein the content of the high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan is 0.01% by mass to 0.05% by mass.
(9) The aqueous solution according to any one of (1) to (8), wherein the aqueous solution has been sterilized by a pasteurization method.
(10) The aqueous solution according to (9), wherein the sterilization treatment is performed by heat sterilization at 63 ° C to 65 ° C for 30 minutes by a pasteurization method.
（１１）水溶液が、食品添加剤として使用される前記（１）から（１０）のいずれかに記載の水溶液。
（１２）水溶液が、飲料水として使用される前記（１）から（１０）のいずれかに記載の水溶液。
（１３）前記（１）から（１０）のいずれかに記載の水溶液を含有してなる食品添加剤。
（１４）食品添加剤が、さらに、食品用添加物を含有してなる前記（１３）に記載の食品添加剤。
（１５）前記（１）から（１０）のいずれかに記載の水溶液を含有してなる飲食品。
（１６）飲食品が、さらに、食品用添加物を含有してなる前記（１５）に記載の飲食品。
（１７）前記（１）から（１０）のいずれかに記載の水溶液を含有してなる飲料水。
（１８）飲料水が、さらに、食品用添加物を含有してなる前記（１７）に記載の飲料水。
（１９）食品用添加物が、アスタキサンチン、ミネラル類、ビタミン類、及びアミノ酸類からなる群から選ばれる１種又は２種以上である、前記（１８）に記載の飲料水。
(11) The aqueous solution according to any one of (1) to (10), wherein the aqueous solution is used as a food additive.
(12) The aqueous solution according to any one of (1) to (10), wherein the aqueous solution is used as drinking water.
(13) A food additive comprising the aqueous solution according to any one of (1) to (10).
(14) The food additive according to (13), wherein the food additive further contains a food additive.
(15) A food or drink comprising the aqueous solution according to any one of (1) to (10).
(16) The food or drink according to (15), wherein the food or drink further contains a food additive.
(17) Drinking water comprising the aqueous solution according to any one of (1) to (10).
(18) The drinking water according to (17), wherein the drinking water further contains a food additive.
(19) The drinking water according to (18), wherein the food additive is one or more selected from the group consisting of astaxanthin, minerals, vitamins, and amino acids.
（２０）高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを水に溶解させる工程、及び得られた水溶液をパスチャライズ法により殺菌処理する工程、を含有してなる前記（９）に記載のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの水溶液の製造方法。
（２１）パスチャライズ法により殺菌処理が、６３℃〜６５℃で３０分間加熱殺菌を行うものである前記（２０）に記載の方法。
（２２）高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを水に溶解させる工程、及び得られた水溶液をパスチャライズ法により殺菌処理する工程、を含有してなる前記（１７）から（１９）のいずれかに記載の飲料の製造方法。
（２３）パスチャライズ法により殺菌処理が、６３℃〜６５℃で３０分間加熱殺菌を行うものである前記（２２）に記載の方法。
（２４）パスチャライズ法により殺菌処理が、ボトリングする工程の後に行われる前記（２２）又は（２３）に記載の方法。
(20) The aqueous solution of chondroitin sulfate proteoglycan according to (9), comprising a step of dissolving a high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan in water and a step of sterilizing the obtained aqueous solution by a pasteurization method. Production method.
(21) The method according to (20), wherein the sterilization treatment is performed by heat sterilization at 63 ° C to 65 ° C for 30 minutes by a pasteurization method.
(22) The method according to any one of (17) to (19), comprising a step of dissolving high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan in water and a step of sterilizing the obtained aqueous solution by a pasteurization method. A method for producing a beverage.
(23) The method according to (22), wherein the sterilization treatment is performed by heat sterilization at 63 ° C to 65 ° C for 30 minutes by a pasteurization method.
(24) The method according to (22) or (23), wherein the sterilization treatment is performed after the bottling step by a pasteurization method.
（２５）高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを含有してなる免疫賦活剤又はＮＫ細胞の活性化剤。
（２６）コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの分子量が、９０万ダルトンから３００万ダルトンである前記（２５）に記載の免疫賦活剤又はＮＫ細胞の活性化剤。
（２７）コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが、プロテオグリカンを含有する生物学的試料を０．００２５Ｎ〜０．０５Ｎのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の溶液に０〜１０℃で浸漬する工程、並びに浸漬後の溶液を回収する工程を含有してなる方法（特許文献１に記載の方法）により製造されたものである前記（２５）又は（２６）に記載の免疫賦活剤又はＮＫ細胞の活性化剤。
（２８）プロテオグリカンを含有する生物学的試料が、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織である前記（２７）に記載の免疫賦活剤又はＮＫ細胞の活性化剤。
（２９）高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが、魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織より単離された分子量が９０万ダルトンから３００万ダルトンのコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである前記（２５）から（２８）のいずれかに記載の免疫賦活剤又はＮＫ細胞の活性化剤。
（３０）魚類の軟骨組織が、サケ鼻軟骨である前記（２８）又は（２９）に記載の免疫賦活剤又はＮＫ細胞の活性化剤。
（３１）高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが、前記（１）から（１０）のいずれかに記載の水溶液である、前記（２５）から（３０）のいずれかに記載の免疫賦活剤又はＮＫ細胞の活性化剤。
(25) An immunostimulator or NK cell activator comprising a high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan.
(26) The immunostimulant or NK cell activator according to (25) above, wherein the molecular weight of chondroitin sulfate proteoglycan is 900,000 to 3 million daltons.
(27) A step in which chondroitin sulfate proteoglycan immerses a biological sample containing proteoglycan in a solution of 0.0025 N to 0.05 N alkali metal salt or alkaline earth metal salt at 0 to 10 ° C., and after immersion The immunostimulant or the NK cell activator according to (25) or (26), which is produced by a method comprising the step of recovering the solution of (a method described in Patent Document 1).
(28) The immunostimulator or NK cell activator according to (27) above, wherein the biological sample containing proteoglycan is fish, birds or mammalian cartilage tissue.
(29) The high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan is a chondroitin sulfate type proteoglycan having a molecular weight of 900,000 to 3 million daltons isolated from fish, birds or mammalian cartilage tissue. The immunostimulant or NK cell activator according to any one of the above.
(30) The immunostimulator or the NK cell activator according to (28) or (29), wherein the fish cartilage tissue is salmon nasal cartilage.
(31) The immunostimulator or NK cell according to any one of (25) to (30), wherein the high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan is the aqueous solution according to any one of (1) to (10). Activator.
本発明は、創傷治癒剤、潰瘍性大腸炎の修復剤、関節リウマチ・変形性関節症の炎症抑制剤などとして有用であることが知られているプロテオグリカンを、プロテオグリカンとして高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを使用することにより容易に経口摂取することができる水溶液として提供するものであり、本発明の水溶液は、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを変性させることなく長期にわたって安定にかつ安全に保存することができるだけでなく、当該コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは高分子量の状態で生体内に取り込まれ、さらに免疫賦活作用などの有用な作用を有するものである。したがって、本発明の水溶液は、経口摂取に適しており、食品添加剤としてだけでなく、飲食品、及び飲料などだけでなく、健康食品や健康飲料としても使用することができる。
また、水溶液とすることで、一定の濃度を維持することができ、取扱いの容易な高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンとすることができるだけでなく、正確な計量が可能となる。さらに、飲料とすることで、食事時に限らず、いつでも、どこでも飲用できるという利便性を得ることができる。
The present invention relates to a proteoglycan known to be useful as a wound healing agent, a ulcerative colitis repair agent, an anti-inflammatory agent for rheumatoid arthritis and osteoarthritis, etc., and a high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan as a proteoglycan The aqueous solution of the present invention can be stored stably and safely over a long period of time without denaturing the chondroitin sulfate proteoglycan. The chondroitin sulfate type proteoglycan is incorporated into a living body in a high molecular weight state, and has a useful action such as an immunostimulatory action. Therefore, the aqueous solution of the present invention is suitable for oral intake and can be used not only as a food additive, but also as a health food and a health drink as well as a food and drink and a beverage.
In addition, when the aqueous solution is used, a constant concentration can be maintained, and not only a high-molecular-weight chondroitin sulfate proteoglycan that can be easily handled can be obtained, but also accurate measurement is possible. Furthermore, the convenience of being able to drink anytime, anywhere can be obtained not only at the time of a meal by setting it as a drink.
本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは、主な糖鎖としてコンドロイチン硫酸を有するものであり、水溶性でなければならない。魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織より単離されたものが好ましい。魚類としては、サケ、エイ、サメなどが挙げられる。魚類の軟骨組織としては、鼻軟骨組織の利用が好ましい。鳥類としては、ニワトリなどが挙げられ、その軟骨が好ましい。哺乳類の軟骨組織としては、ウシの喉軟骨や気管支軟骨、クジラの軟骨等が挙げられる。
本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは、魚類の軟骨組織、特にサケの鼻軟骨組織が好ましく、さらには北海道で漁獲された白ザケの軟骨組織、特に鼻軟骨より単離されたものが好ましい。
本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの分子量としては、９０万ダルトン以上、好ましくは１００万ダルトン以上のものが挙げられ、例えば９０万ダルトンから３００万ダルトン、好ましくは９０万ダルトンから２００万ダルトン、１００万ダルトンから２００万ダルトンが挙げられる。
The high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention has chondroitin sulfate as a main sugar chain and must be water-soluble. Those isolated from fish, birds or mammalian cartilage tissue are preferred. Examples of fish include salmon, rays, and sharks. As the fish cartilage tissue, it is preferable to use nasal cartilage tissue. Examples of birds include chickens, and the cartilage is preferred. Examples of mammalian cartilage tissues include bovine throat cartilage, bronchial cartilage, and whale cartilage.
The high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is preferably fish cartilage tissue, particularly salmon nasal cartilage tissue, and more preferably isolated from white salmon cartilage tissue caught in Hokkaido, particularly nasal cartilage. .
The molecular weight of the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention includes 900,000 daltons or more, preferably 1,000,000 daltons or more, for example, 900,000 daltons to 3 million daltons, preferably 900,000 daltons to 2 million daltons 1 million to 2 million daltons.
本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンとしては、本発明者らが開発したアルカリ分解抽出方法（特許文献１参照）で製造されたものが好ましいが、これに限定されるものではない。当該アルカリ分解抽出方法は、プロテオグリカンを含有する魚類、鳥類又は哺乳類の軟骨組織を、０．００２５Ｎ〜０．０５Ｎのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の溶液に０〜１０℃で浸漬し、次いで浸漬後の溶液から目的の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを単離する方法である。一般に、熱やアルカリに不安定なタンパク質を含有しているプロテオグリカンをアルカリ溶液で処理することは禁忌とされており、アルカリ溶液を用いた場合にはその多くが分解され高分子量のプロテオグリカンはほとんど得られず、コンドロイチン硫酸などの分解物しか得られなかった。本発明者らは低温で希薄なアルカリ溶液を用いることにより、プロテオグリカンをほとんど分解することなく、高分子量のままのプロテオグリカンを単離することに成功したものである。この製造方法で得られた高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは固体として得られるが、意外なことに高分子量であるにも関わらず、水溶性であった。この製造方法は、特許文献１に詳細に記載されているので、特許文献１を参照されたい。 The high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is preferably produced by the alkali decomposition extraction method (see Patent Document 1) developed by the present inventors, but is not limited thereto. The alkaline decomposition extraction method involves immersing a fish, bird or mammalian cartilage tissue containing proteoglycan in a solution of 0.0025 N to 0.05 N alkali metal salt or alkaline earth metal salt at 0 to 10 ° C., This is a method for isolating a target high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan from a solution after immersion. In general, it is contraindicated to treat proteoglycans containing proteins that are unstable to heat or alkali with an alkaline solution, and when an alkaline solution is used, many of them are decomposed and almost no high molecular weight proteoglycan is obtained. Only a degradation product such as chondroitin sulfate was obtained. The present inventors have succeeded in isolating proteoglycan having a high molecular weight with almost no degradation of proteoglycan by using a dilute alkaline solution at low temperature. The high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan obtained by this production method is obtained as a solid, but surprisingly it was water soluble despite its high molecular weight. This manufacturing method is described in detail in Patent Document 1, so refer to Patent Document 1.
本発明の水溶液は、前記した水溶性の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを水に溶解させたものである。水は飲料水に適したものであれば特に制限はないが、十分に殺菌されたものが好ましい。必要に応じて、逆浸透膜によるろ過や加熱処理を行ったものが好ましい。
本発明の水溶液における高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの濃度としては、特に制限はないが、水溶性であると言っても溶解度は極めて低い場合が多いことから、１質量％以下、好ましくは０．５質量％以下、さらには０．０５質量％以下が好ましい。好ましい範囲としては、０．００１質量％から１質量％、より好ましくは０．００１質量％から０．０５質量％、更に好ましくは０．０１質量％から０．０５質量％である。
均一な水溶液とするために、比較的長時間、例えば、１から１０時間、好ましくは１から５時間程度、攪拌を継続することが好ましい。
水に精製された高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを添加し、室温又はそれ以下の温度で十分に攪拌することにより、本発明の水溶液を製造することができる。
The aqueous solution of the present invention is obtained by dissolving the water-soluble high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan in water. The water is not particularly limited as long as it is suitable for drinking water, but is preferably sufficiently sterilized. What performed the filtration by a reverse osmosis membrane and heat processing as needed is preferable.
The concentration of the high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan in the aqueous solution of the present invention is not particularly limited. However, even if it is water-soluble, the solubility is often very low. 5 mass% or less, Furthermore, 0.05 mass% or less is preferable. A preferable range is 0.001% by mass to 1% by mass, more preferably 0.001% by mass to 0.05% by mass, and still more preferably 0.01% by mass to 0.05% by mass.
In order to obtain a uniform aqueous solution, stirring is preferably continued for a relatively long time, for example, 1 to 10 hours, preferably about 1 to 5 hours.
The aqueous solution of the present invention can be produced by adding purified high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan to water and sufficiently stirring at room temperature or lower.
本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは、固体であり、粉状又は綿状であり、通常はそのままの形状では容易に経口摂取することは難しい。しかし、本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは高分子物質であるにも拘わらず、溶解度は低いが水溶性という大きな特徴があることを見出した。この特徴を利用することにより、該プロテオグリカンを効率よく容易にかつ正確な量を経口摂取させることができることを見出したことが本発明の大きな特徴のひとつである。
本発明の水溶液は、経口摂取する際に水に溶解させて、使用時に製造することもできるが、溶解速度が必ずしも速くなく、時間がかかるという欠点があった。このために、水溶液としたものを供給しようとしたが、防腐剤を入れられないため日持ちがせず、１２週間保管することは不可能であった。さらに、殺菌のために高温処理した場合には、プロテオグリカンのコアタンパク質が変性を起こすという問題点もあった。
The high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is solid, powdery or cottony, and is usually difficult to ingest orally in its intact form. However, although the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is a high molecular weight substance, it has been found that it has a great feature of being water-soluble but having low solubility. It is one of the major features of the present invention that it has been found that by utilizing this feature, the proteoglycan can be ingested efficiently and easily in an accurate amount.
The aqueous solution of the present invention can be dissolved in water when ingested and manufactured at the time of use. However, the dissolution rate is not always fast and it takes time. For this reason, an attempt was made to supply an aqueous solution, but it could not be stored for 12 weeks because it could not contain a preservative and could not be stored for 12 weeks. Furthermore, there has been a problem that the proteoglycan core protein is denatured when it is treated at a high temperature for sterilization.
本発明におけるパスチャライズ法は、牛乳の殺菌方法として知られる方法であるが、必ずしも十分な殺菌ではなく賞味期限を長く取れないという欠点があった。しかし、本発明の水溶液の場合には、極めて有効な殺菌処理であることがわかった。
パスチャライズ法は、通常は６３℃〜６５℃で３０分間の加熱殺菌で行われ、本発明におけるパスチャライズ法も、この通常の条件で十分であることが、大腸菌、大腸菌群、及び一般生菌数についての菌検査により確認された。
また、６３℃又は６５℃で３０分間の加熱殺菌処理をしても、本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは変性していないことが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認することができた。
なお、パスチャライズ法により殺菌処理は、飲料水をボトリングした後に行われるのが好ましい。
The pasteurization method in the present invention is a method known as a milk sterilization method, but it is not necessarily sufficient sterilization and has a drawback that it does not take a long shelf life. However, in the case of the aqueous solution of the present invention, it has been found that this is a very effective sterilization treatment.
The pasteurization method is usually performed by heat sterilization at 63 ° C. to 65 ° C. for 30 minutes, and it is necessary for the pasteurization method in the present invention that the normal conditions are sufficient for the number of E. coli, coliforms and general viable bacteria. It was confirmed by the fungus test.
In addition, it was confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC) that the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention was not denatured even after heat sterilization at 63 ° C. or 65 ° C. for 30 minutes. .
The sterilization treatment by the pasteurization method is preferably performed after bottling the drinking water.
さらに、本発明者らは、本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが、難消化性であるが、最終的にはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）により分解されるので、副作用の危険性は皆無に近く、副作用のない免疫抗原となりうる可能性に注目し、本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが、免疫細胞を活性化させていることを確認した。
即ち、４０代から６０代の健常者９名（男性３名、女性６名）をモニターとして、本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを水に溶かした水溶液を連続１２週間、毎日朝晩２回一定量を飲用させて、飲用開始前と飲用開始１２週後におけるＮＫ細胞の活性度（％）の変化を測定した。
その結果、健常者９名の平均値においてＮＫ細胞の活性度（％）が、飲用開始前と飲用開始１２週後とで有意に差ができることを確認した（図１参照）。
Furthermore, the present inventors have found that the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is indigestible, but is ultimately degraded by matrix metalloprotease (MMP), so there is no risk of side effects. Focusing on the possibility of being an immune antigen with no side effects, it was confirmed that the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention activated immune cells.
That is, 9 healthy persons in their 40s to 60s (3 males and 6 females) were monitored, and an aqueous solution of the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention dissolved in water was continuously twice a day for 12 weeks. A certain amount was drunk, and the change in NK cell activity (%) was measured before the start of drinking and 12 weeks after the start of drinking.
As a result, it was confirmed that the NK cell activity (%) in the average value of 9 healthy subjects can be significantly different between before the start of drinking and 12 weeks after the start of drinking (see FIG. 1).
本発明の水溶液は、食品添加剤として各種の食品に添加することができる。添加される食品としては、本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが変性しないものであれば特に制限はなく、各種の調味料、スープ類、飲料などが挙げられる。
本発明の飲食品は、このようにして本発明の水溶液が添加された飲食品である。本発明の飲食品には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品なども包含されている。
特に、本発明の水溶液は液体状態であり、そのままの状態でも飲料に適しているものである。また、通常の各種の飲料に本発明の水溶液を添加配合して使用することもできる。このような飲料としては、本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが変性しないものであれば特に制限はなく、例えば、乳酸飲料、乳酸菌飲料、濃厚乳性飲料、果汁飲料、無果汁飲料、果肉飲料、機能性飲料、透明炭酸飲料、果汁入り炭酸飲料、果実着色炭酸飲料などの清涼飲料水などの嗜好飲料、ワイン、ワインソーダ、リキュール、カクテルなどのアルコール飲料などが挙げられる。
The aqueous solution of the present invention can be added to various foods as a food additive. The food to be added is not particularly limited as long as the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is not denatured, and includes various seasonings, soups, beverages and the like.
The food / beverage products of this invention are food / beverage products to which the aqueous solution of this invention was added in this way. The food / beverage products of the present invention also include health foods, functional foods, foods for specified health use, dietary supplements, foods for the sick, and the like.
In particular, the aqueous solution of the present invention is in a liquid state, and is suitable for beverages as it is. Moreover, the aqueous solution of the present invention can be added to and mixed with various ordinary beverages. Such a beverage is not particularly limited as long as the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention is not denatured. For example, lactic acid beverages, lactic acid bacteria beverages, concentrated milk beverages, fruit juice beverages, fruitless beverages, pulp Examples include beverages, functional beverages, transparent carbonated beverages, carbonated beverages containing fruit juice, and soft drinks such as fruit-colored carbonated beverages, and alcoholic beverages such as wine, wine soda, liqueurs, and cocktails.
高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンを含有してなる本発明の飲料は、通常の飲料だけでなく、健康食品や機能性食品としての飲料として提供することができる。本発明の飲料には、通常の飲料の処方設計に用いられている糖類、香料、果汁、食品添加剤などを適宜添加することができる。このような添加物としては、ビタミン類（Ａ、Ｂ群、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、葉酸、パントテン酸、ビオチン、これらの誘導体等）、ミネラル類（鉄、マグネシウム、カルシウム、亜鉛等）、ポリフェノール（カテキン類、アントシアニン類、プロアントシアニジンなどの縮合型タンニン、イソフラボン類、フラボノイド類等）、カロテノイド（リコピン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、ルテイン等）、サポニン（ジンセサノイド、グリチルリチン酸等）、キサンチン誘導体（カフェイン等）、アミノ酸類、タンパク質（コラーゲン、エラスチン等）、甘味料（エリスリトール、トレハロース、スクラロース、アセスルファムＫ、フェニルアラニン化合物等）、有機酸類（クエン酸、リンゴ酸等）などが挙げられる。
特に、プロテオグリカンが負の電荷を持つ特徴を利用し、正の電荷を持つミネラル類、ビタミン類、アミノ酸類の担体として利用した飲料水とすることもできる。このような飲料水を経口摂取することにより、プロテオグリカンの持つ免疫賦活作用に加え、これらミネラル類、ビタミン類、アミノ酸類を同時に摂取することができ、健康食品や機能性食品としての飲料として有用となる。
また、アスタキサンチン（astaxanthin）はカロチノイドの１種であり、鮭、イクラ、マス、オキアミ、エビ・カニ類などに含まれる赤色色素であるが、近年、アスタキサンチンの各種健康増進機能が注目されており、本発明の飲料水にアスタキサンチンを配合することにより、高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの有する機能と相まって、健康食品や機能性食品としての飲料としてさらに有用となる。
The beverage of the present invention comprising a high molecular weight chondroitin sulfate type proteoglycan can be provided not only as a normal beverage but also as a beverage as a health food or a functional food. To the beverage of the present invention, sugars, fragrances, fruit juices, food additives, and the like used in usual beverage formulation design can be appropriately added. As such additives, vitamins (A, B group, C, D, E, K, folic acid, pantothenic acid, biotin, derivatives thereof, etc.), minerals (iron, magnesium, calcium, zinc, etc.), Polyphenols (catechins, anthocyanins, proanthocyanidins and other condensed tannins, isoflavones, flavonoids, etc.), carotenoids (lycopene, astaxanthin, zeaxanthin, lutein, etc.), saponins (ginsesanoids, glycyrrhizic acid, etc.), xanthine derivatives (caffeine) Etc.), amino acids, proteins (collagen, elastin, etc.), sweeteners (erythritol, trehalose, sucralose, acesulfame K, phenylalanine compounds, etc.), organic acids (citric acid, malic acid, etc.) and the like.
In particular, it is possible to use drinking water used as a carrier for minerals, vitamins and amino acids having a positive charge by utilizing the characteristic that proteoglycan has a negative charge. By ingesting such drinking water, in addition to the immunostimulatory action of proteoglycans, these minerals, vitamins and amino acids can be ingested simultaneously, and it is useful as a beverage as a health food or functional food. Become.
In addition, astaxanthin is a kind of carotenoid and is a red pigment contained in salmon, salmon roe, trout, krill, shrimp and crab, etc. In recent years, various health promotion functions of astaxanthin have attracted attention. By incorporating astaxanthin into the drinking water of the present invention, it becomes more useful as a beverage as a health food or a functional food, in combination with the function of the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンの製造：
−４０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を電動のミートチョッパーで細かく破砕しミンチ状にしたものをアセトンに浸漬し、鼻軟骨から脱脂及び脱水を行った。処理後の鼻軟骨を通風又は減圧乾燥したもの２４．００ｇを出発原料とした。５リットルの抽出用容器にあらかじめ５℃に冷却しておいた蒸留水２９９７．７５ｇを入れ、さらに固形のカセイソーダ２．２５ｇを投入し、総量３０００．００ｇ（０．０２Ｎ）のカセイソーダ水溶液を準備した。この抽出容器に出発原料２４．００ｇを投入し、スターラーを用いて攪拌しながら、９時間浸漬した。
浸漬終了後、内容物を１ｍｍ角のステンレススチール製こし器をセットした別の容器に移し、鼻軟骨を除去して、プロテオグリカンを含む抽出液を回収した。
抽出液を遠心分離機を用いて３０００ｒｐｍ、２０分の遠心分離を行い、固形分及び油脂分を除去して、プロテオグリカンを含む液相を回収した。さらに、この液相を濾過し、濾液の６倍量の蒸留水を加えた後、１０万の分画分子量を有する限外濾過膜分離装置を用いて分画と濃縮を同時に行った。
得られた濃縮液を乾燥炉で１６時間乾燥させ、完全に水分を蒸発させた。その結果、２４．００ｇの出発原料から、換算値でその３０．２９％に相当する７．５０ｇの乾燥固形分を得ることができた。
得られた乾燥固形分は、固形分中にタンパク質１１．８％、灰分１８．４％、炭水化物６７．８％、脂質０．０％が存在し、推定純度は９１．１％と算出された。また、プロテオグリカンの分子量は約１２０万ダルトンであった。
Production of high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycans:
The nasal cartilage extracted from the head of a salmon salmon frozen at −40 ° C. was finely crushed with an electric meat chopper and minced, and immersed in acetone to degrease and dehydrate the nasal cartilage. 24.00 g of the nasal cartilage that had been treated and ventilated or dried under reduced pressure was used as a starting material. Distilled water 2997.75 g which had been cooled to 5 ° C. in advance was put in a 5 liter extraction container, and 2.25 g of solid caustic soda was added to prepare a total amount of 3000.00 g (0.02N) of caustic soda aqueous solution. . 24.00 g of the starting material was put into this extraction container and immersed for 9 hours while stirring using a stirrer.
After the immersion, the contents were transferred to another container with a 1 mm square stainless steel strainer, the nasal cartilage was removed, and the extract containing proteoglycan was collected.
The extract was centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes using a centrifuge to remove solids and oils and fats, and a liquid phase containing proteoglycans was recovered. Furthermore, after filtering this liquid phase and adding 6 times the amount of distilled water of the filtrate, fractionation and concentration were simultaneously performed using an ultrafiltration membrane separator having a fractional molecular weight of 100,000.
The obtained concentrated liquid was dried in a drying furnace for 16 hours to completely evaporate water. As a result, 7.50 g of dry solids corresponding to 30.29% in terms of conversion value could be obtained from 24.00 g of starting material.
The obtained dry solid had 11.8% protein, 18.4% ash, 67.8% carbohydrate, 0.0% lipid in the solid, and the estimated purity was calculated to be 91.1%. . The molecular weight of proteoglycan was about 1.2 million daltons.
プロテオグリカン水溶液の製造：
４℃に冷却された蒸留水９９９．９ｇに、分子量約１２０万ダルトンのコンドロイチン硫酸型プロテオグリカン０．１ｇを加え、均一な水溶液を得るため磁気スターラーを用い３時間攪拌することにより、質量比で０．０１％のプロテオグリカン水溶液を製造した。
Production of aqueous proteoglycan solution:
By adding 0.1 g of chondroitin sulfate type proteoglycan having a molecular weight of about 1.2 million daltons to 999.9 g of distilled water cooled to 4 ° C., and stirring for 3 hours using a magnetic stirrer to obtain a uniform aqueous solution, the mass ratio becomes 0 A 0.01% aqueous proteoglycan solution was prepared.
プロテオグリカン水溶液の殺菌試験：
実施例２で製造されたプロテオグリカン水溶液の１００ｍＬ溶液を６本作成した。
この６本を、６３℃加熱用と６５℃加熱用に３本づつ２組に分け、それぞれを所定の温度で３０分間加熱殺菌処理した。加熱処理後、それらについて菌検査を行った。菌検査は一般生菌については標準寒天培地法により、また大腸菌・大腸菌群については、クロモカルトコリフォーム寒天培地法を用いた。セレウス菌の検査はＮＧＫＧ法によった。
この結果、一般生菌数については、３×１０２個／ｇであり、大腸菌及び大腸菌群についてはいずれも陰性であった。したがって、パスチャライズ法により、十分に殺菌処理できることが確認された。
Bactericidal test of aqueous proteoglycan solution:
Six 100 mL solutions of the aqueous proteoglycan produced in Example 2 were prepared.
These 6 pieces were divided into two groups of 3 pieces for 63 ° C. heating and 65 ° C. heating, and each was subjected to heat sterilization treatment at a predetermined temperature for 30 minutes. After the heat treatment, the fungus was examined. Bacteria testing was performed using the standard agar medium method for general viable bacteria, and the chromocalcoliform agar medium method for Escherichia coli and coliforms. The test for Bacillus cereus was performed by the NGKG method.
As a result, the number of viable bacteria was 3 × 10 2 cells / g, and both E. coli and coliform groups were negative. Therefore, it was confirmed that the pasteurization method can sufficiently sterilize.
加熱処理後におけるプロテオグリカンの検査：
実施例２で製造されたプロテオグリカン水溶液の１００ｍＬ溶液を２本作成した。
この２本を、それぞれ６３℃加熱用と６５℃加熱用とし、それぞれを所定の温度で３０分間加熱殺菌処理した。加熱処理後、それらの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行い、加熱処理前のＨＰＬＣ分析結果と比較した。ＨＰＬＣは日立ハイテクノロジーズ社のLaChrom Eliteシステムを用いた。
この結果、６３℃の加熱処理及び６５℃の加熱処理を行ったいずれのサンプルも、加熱処理前のＨＰＬＣ分析結果と変化は見られず、プロテオグリカンの構造の変化はないことが確認された。
Inspection of proteoglycans after heat treatment:
Two 100 mL solutions of the aqueous proteoglycan produced in Example 2 were prepared.
The two were for heating at 63 ° C. and for heating at 65 ° C., respectively, and each was heat sterilized at a predetermined temperature for 30 minutes. After the heat treatment, their high performance liquid chromatography (HPLC) analysis was performed and compared with the HPLC analysis results before the heat treatment. The HPLC used Hitachi High-Technologies LaChrom Elite system.
As a result, none of the samples subjected to the heat treatment at 63 ° C. and the heat treatment at 65 ° C. showed any change from the HPLC analysis result before the heat treatment, and it was confirmed that there was no change in the structure of proteoglycan.
プロテオグリカン水溶液のＮＫ細胞の活性化：
４０代から６０代の健常者９名（男性３名、女性６名）のモニターに、飲用開始前にＮＫ細胞の活性化を測定した。ＮＫ細胞の活性化の測定後、それぞれのモニターに、実施例１で製造したプロテオグリカンを水に溶かした０．１％水溶液２００ｍｇ／日（１００ｍｇ×２回）を連続１２週間、毎日朝晩２回、一定量の飲用をしてもらった。
飲用開始１２週後に、それぞれのモニターから血液を採取し、ＮＫ細胞の活性化の測定を行った。
ＮＫ細胞の活性度の測定は、５１Ｃｒ遊離法によった。この方法は、５１Ｃｒによって標識された標的細胞ヒト前骨髄性白血病Ｋ−５６２にエフェクター細胞であるＮＫ細胞を加えて培養し、標識された標的細胞の障害により遊離した５１Ｃｒを測定することによって活性値を算出するものである。
測定結果は、Wilcoxonの符号順位和検定によって統計学的な処理を行った。飲用開始前と飲用開始１２週後の９名のモニターの平均値を図１に示す。その結果、飲用開始前と飲用開始１２週後において、有意差があった（ｐ＜０．０５）。
この結果、本発明の高分子量のコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンが免疫細胞を活性化させていることが確認された。
Activation of NK cells in aqueous proteoglycan solution:
The activation of NK cells was measured on the monitor of 9 healthy persons (3 men, 6 women) in their 40s to 60s before starting drinking. After measuring the activation of NK cells, each monitor was treated with 200 mg / day (100 mg × 2 times) of a 0.1% aqueous solution in which the proteoglycan produced in Example 1 was dissolved in water, continuously for 12 weeks, twice daily in the morning and evening. I had a certain amount of drinking.
Twelve weeks after the start of drinking, blood was collected from each monitor, and activation of NK cells was measured.
The activity of NK cells was measured by the 51 Cr release method. In this method, target cells labeled with 51 Cr are cultured by adding NK cells as effector cells to human promyelocytic leukemia K-562 and measuring 51 Cr released by the damage of the labeled target cells. The activity value is calculated.
The measurement results were statistically processed by the Wilcoxon sign rank sum test. The average value of 9 monitors before the start of drinking and 12 weeks after the start of drinking is shown in FIG. As a result, there was a significant difference between the start of drinking and 12 weeks after the start of drinking (p <0.05).
As a result, it was confirmed that the high molecular weight chondroitin sulfate proteoglycan of the present invention activated immune cells.
本発明は、多くの有用な機能を有するプロテオグリカンを含有してなる、健康の増進、生活の質の向上に資する有用な飲料水、及びその製造方法を提供するものであり、飲食品分野における産業上の利用可能性を有している。 The present invention provides a useful drinking water containing proteoglycan having many useful functions, which contributes to the promotion of health and the improvement of quality of life, and a method for producing the same. Has the above applicability.
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