RU2686098C1

RU2686098C1 - Agent possessing antioxidant and neuroprotective properties

Info

Publication number: RU2686098C1
Application number: RU2018100703A
Authority: RU
Inventors: Людмила Дмитриевна Тимченко; Игорь Владимирович Ржепаковский; Давид Александрович Арешидзе; Сергей Иванович Писков; Светлана Суреновна Аванесян; Ярославна Александровна Кузнецова; Светлана Сергеевна Лионова; Галина Николаевна Блажнова; Марина Николаевна Сизоненко; Надежда Ивановна Бондарева; Мария Александровна Козлова; Валерий Николаевич Вакулин
Priority date: 2018-01-10
Filing date: 2018-01-10
Publication date: 2019-04-24

Abstract

FIELD: medicine; pharmaceuticals.SUBSTANCE: invention refers to pharmaceutical industry, namely to an agent with antioxidant and neuroprotective properties. Agent possessing antioxidant, neuroprotective properties, obtained by removing lipids from sublimate embryo and embryo tissues of chicken embryos, extraction with petroleum ether with further drying of defatted residue, then obtained protein-containing powder is thoroughly ground, dissolved in distilled water, mixed, added with HCl, maintained while stirring, then the obtained mass is autoclaved, and after that 1 M NaOH is neutralized and centrifugation is performed, the liquid obtained after centrifugation is serially filtered using membranes for sterilization and removal of non-hydrolysed proteins under certain conditions.EFFECT: agent described above expands the range of peptide-containing agents from natural raw materials possessing antioxidant and neuroprotective properties.1 cl, 4 tbl, 1 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к получению антиоксидантного и нейропротекторного средства на основе эмбриональных тканей птиц. Эмбриональные ткани птиц, схожие по своим свойствам с плацентой, но являющиеся более дешевым и доступным сырьем получают все большее распространение в качестве сырья для получения биопрепаратов и пищевых добавок.The invention relates to biotechnology and medicine, in particular the production of antioxidant and neuroprotective agents based on avian embryonic tissues. Embryonic tissue of birds, similar in their properties to the placenta, but which are cheaper and more affordable raw materials are becoming more common as a raw material for the production of biological products and food additives.

Полученное средство расширяет арсенал недорогих по себестоимости пептидсодержащих препаратов из природного доступного сырья, обладающих антиоксидантным и нейропротекторным свойствами.The resulting tool expands the Arsenal of low-cost peptide-containing drugs from natural available raw materials with antioxidant and neuroprotective properties.

Уровень техникиThe level of technology

Различные стрессовые ситуации, экологические проблемы, неправильное питание перегружают антиоксидантную защиту организма и могут вызвать дисбаланс взаимоотношений систем свободнорадикального окисления и общей антиоксидантной активности (

et al., 2009; Патент RU 2292214).Various stressful situations, environmental problems, unhealthy nutrition overload the body’s antioxidant defenses and can cause an imbalance in the relationship between free radical oxidation systems and the overall antioxidant activity (

et al., 2009; Patent RU 2292214).

Многие патологии центральной нервной системы, при которых наблюдаются деструктивные процессы нейронов головного мозга, связаны с активацией перекисного окисления липидов, в результате которого образуются свободные радикалы. Избыток свободных радикалов, отрицательно воздействующих на ДНК нейронов мозга, может вызвать изменение в генетическом коде и гибель клетки. Среди основных механизмов нейронального повреждения различают гиперпродукцию активных форм кислорода (Попова М.С. и др., 2008;.Зозуля Ю.А. и др., 2000; Смирнова И.Н. и др., 2006; Федорова Т.Н., 2004; Calabrese V. et al., 2000).Many pathologies of the central nervous system, in which destructive processes of brain neurons are observed, are associated with the activation of lipid peroxidation, as a result of which free radicals are formed. An excess of free radicals that negatively affect the DNA of neurons in the brain can cause a change in the genetic code and cell death. Among the main mechanisms of neuronal damage, hyperproduction of reactive oxygen species is distinguished (Popova MS, et al., 2008; .Zozulya, Yu.A., et al., 2000; Smirnova, I.N., et al., 2006; Fedorova, TN , 2004; Calabrese V. et al., 2000).

Антиоксидантная защита организма при оксидативном стрессе неспособна полностью нейтрализовать образующийся избыток активных форм кислорода. В этих условиях очевидна целесообразность использования антиоксидантных препаратов, способных защитить мозговую ткань от повреждения (Патент RU 2514632; Nonaka Sh. et al., 1998.). В последние годы повышен интерес к выявлению объектов природного происхождения, содержащих биологически активные вещества, обладающие антиоксидантными свойствами.Antioxidant protection of the body during oxidative stress is unable to completely neutralize the resulting excess reactive oxygen species. Under these conditions, it is obvious that it is advisable to use antioxidant drugs that can protect brain tissue from damage (Patent RU 2514632; Nonaka Sh. Et al., 1998.). In recent years, interest in identifying objects of natural origin containing biologically active substances with antioxidant properties has increased.

Известно антиоксидантное нейропротекторное средство - пикамилон (натриевая соль N-никотинол-γ-аминомасляной кислоты. Наличие в химической структуре пикамилона гаммааминомасляной кислоты и никотиновой кислоты обусловливает его ноотропное и вазоактивное действие. Он улучшает мозговое кровообращение и позитивно влияет на метаболизм ткани головного мозга. Препарат оказывает также антигипоксическое, антиоксидантное и антиагрегантное действие, обладает транквилизирующим эффектом. Механизм действия пикамилона обусловлен его взаимодействием с ГАМК-рецепторами (Горчакова Н.А. и др., 2010). Однако данное средство имеет ряд побочных эффектов: аллергические реакции, головную боль, головокружение, чувство тревоги.Known antioxidant neuroprotective agent - picamilon (sodium salt of N-nicotinol-γ-aminobutyric acid. The presence in the chemical structure of picamilone gammaaminobutyric acid and nicotinic acid causes its nootropic and vasoactive effect. It improves cerebral circulation and positively affects the metabolism of brain tissue. Preparate effect. also has antihypoxic, antioxidant and antiaggregant effect, has a tranquilizing effect. The mechanism of action of picamilon is due to its interaction tviem with GABA receptors (Gorchakova N.A. and others, 2010). However, this remedy has a number of side effects: allergic reactions, headache, dizziness, anxiety.

Известна фармацевтическая нейропротекторная и антиоксидантная композиция, содержащая 100-250 мг 3-оксипиридина или его фармацевтически приемлемого производного, или фармацевтически приемлемой соли этого производного и 100-400 мг холина альфосцерата, отличающаяся тем, что дополнительно содержит 400-500 мг фармацевтически приемлемого производного магния, 10-50 мг пиридоксина или его фармацевтически приемлемого производного, 10-50 мг никотинамида, 15-30 мг идебенона, 15-30 мг убихинона (коэнзима Q10) и 5-40 мг фармацевтически приемлемого производного цинка и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества (Патент RU 2385722). К недостаткам данной композиции относится дороговизна конечного продукта.Known pharmaceutical neuroprotective and antioxidant composition containing 100-250 mg of 3-hydroxypyridine or its pharmaceutically acceptable derivative, or pharmaceutically acceptable salt of this derivative and 100-400 mg of choline alfoscerate, characterized in that it additionally contains 400-500 mg of pharmaceutically acceptable magnesium derivative, 10-50 mg pyridoxine or its pharmaceutically acceptable derivative, 10-50 mg nicotinamide, 15-30 mg idebenone, 15-30 mg ubiquinone (coenzyme Q10) and 5-40 mg pharmaceutically acceptable zinc derivative and pharmaceutically acceptable excipients (Patent RU 2385722). The disadvantages of this composition is the high cost of the final product.

К настоящему времени доказано, что многочисленные продукты, полученные из гидролизованных пищевых белков, обладают заслуживающей внимания антиоксидантной активностью против перекисного окисления липидов (Kitts D.D., Weiler K., 2003).To date, it has been proven that numerous products derived from hydrolyzed dietary proteins have noteworthy antioxidant activity against lipid peroxidation (Kitts D.D., Weiler K., 2003).

Исследователями была выявлена антиоксидантная активность в гидро-лизатах на основе креветок (Suetsuna K., 2000), сока после приготовления тунца (Jao C.L., Kо W.C., 2002), сайды Аляски {Theragra chalcogramma) (Je J.Y., et al., 2005; Kim S.K. et al., 2001), Area subcrenata Lischke (Song Li., 2008).Researchers identified antioxidant activity in shrimp-based hydro-lysates (Suetsuna K., 2000), juice after cooking tuna (Jao CL, Ko WC, 2002), Alaska Sides {Theragra chalcogramma) (Je JY, et al., 2005; Kim SK et al., 2001), Area subcrenata Lischke (Song Li., 2008).

Однако наибольший интерес вызывают гидролизаты различных эмбриональных тканей и белков куриного яйца (Lee S.K. et al., 2002; Li Y.F. et al., 2012; Lu C.L., Baker R.C., 1987; Park P.J. et al., 2001; Sakanaka S. et. al., 2004; Sakanaka S., Tachibana Y., 2006; Sun H. et al., 2014), схожие по своим свойствам с плацентой, но являющиеся более дешевым и доступным сырьем для получения средств с антиоксидантным и нейропротекторным свойствами.However, hydrolysates of various embryonic tissues and proteins of chicken eggs are of the greatest interest (Lee SK et al., 2002; Li YF et al., 2012; Lu CL, Baker RC, 1987; Park PJ et al., 2001; Sakanaka S. et. al., 2004; Sakanaka S., Tachibana Y., 2006; Sun H. et al., 2014), similar in their properties to the placenta, but being cheaper and more affordable raw materials for the production of antioxidant and neuroprotective agents.

Известен способ приготовления ферментативного гидролизата из утиных яиц (Chen Y. et al., 2009). Для этого утиные яйца очищали, разбивали и разделяли. Белок яйца в количестве 600 мл гомогенизировали (IKA-T25BS1, Германия) на низкой скорости в течение 60 с. После гомогенизации белок в 10 раз разбавляли 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0) и затем использовали для эксперимента. Папаин, трипсин, химотрипсин, алкалазу и флавозерм (от Sigma-Aldrich Co., США) добавляли при соотношениях фермента к субстрату (отношения ф/с) 1%, 2%, 3%, 4% и 5%. Оптимальные параметры температуры и рН: папаин (40°С, рН 7,0); трипсин и химотрипсин (40°C, рН 8,0); алкалазу и флавозерм (50°C, рН 8,0). Полученные гидролизаты нагревали в кипящей воде в течение 5 мин для инактивации ферментов, а затем центрифугировали при 4°C и 5000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант фильтровали через ватман №1 и фильтрат хранили при 5°C. К недостаткам данной композиции относится дороговизна конечного продукта.A known method for preparing an enzymatic hydrolyzate from duck eggs (Chen Y. et al., 2009). To do this, duck eggs were cleaned, smashed and divided. Egg protein in the amount of 600 ml was homogenized (IKA-T25BS1, Germany) at low speed for 60 s. After homogenization, the protein was 10 times diluted with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) and then used for the experiment. Papain, trypsin, chymotrypsin, alcalase and flavozerm (from Sigma-Aldrich Co., USA) were added at a ratio of enzyme to the substrate (f / s ratio) of 1%, 2%, 3%, 4% and 5%. Optimum temperature and pH parameters: papain (40 ° C, pH 7.0); trypsin and chymotrypsin (40 ° C, pH 8.0); alcalase and flavozerm (50 ° C, pH 8.0). The resulting hydrolysates were heated in boiling water for 5 minutes to inactivate the enzymes, and then centrifuged at 4 ° C and 5000 rpm for 10 minutes. The supernatant was filtered through Whatman # 1 and the filtrate was stored at 5 ° C. The disadvantages of this composition is the high cost of the final product.

Sun Н. с соавторами (2014) готовили однородную суспензию яиц куриного эмбриона с использованием высокоскоростного гомогенизатора (1000 об/мин, 5 мин). Гомогенат (1 г) смешивали с 10 мл раствора пепсина (1 г пепсина в 200 мл 0,1 моль/л HCl) и смесь инкубировали на встряхивающей водяной бане при 37°C в течение 2 часов. рН повышали до 7,5 с помощью 0,1 моль/л NaHCO₃. Далее добавляли 10 мл раствора трипсина (1 г трипсина в 200 мл 0,1 моль/л NaHCO₃) и инкубировали на встряхивающей водяной бане при 37°C в течение 2 часов. Затем образцы гидролизата инкубировали в кипящей воде в течение 3-10 мин для дезактивации ферментативной активности. Центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин и разделяли на две фракции: супернатант, в виде биодоступной фракции и остаточной фракции. Супернатант лиофилизировали (сублимационная сушилка Dura-Dry MP, FTS Systems, Inc., Ridge, NY), измельчали и хранили при минус 70°C. К недостаткам данной композиции относится дороговизна конечного продукта.Sun N. et al. (2014) prepared a homogeneous suspension of chicken embryo eggs using a high-speed homogenizer (1000 rpm, 5 min). The homogenate (1 g) was mixed with 10 ml of pepsin solution (1 g of pepsin in 200 ml of 0.1 mol / l HCl) and the mixture was incubated in a shaking water bath at 37 ° C for 2 hours. The pH was raised to 7.5 with 0.1 mol / L NaHCO ₃ . Next, 10 ml of trypsin solution (1 g of trypsin in 200 ml of 0.1 mol / l NaHCO ₃ ) was added and incubated in a shaking water bath at 37 ° C for 2 hours. Then the samples of the hydrolyzate were incubated in boiling water for 3–10 min to deactivate the enzyme activity. Centrifuged at 10,000 g for 10 min and divided into two fractions: the supernatant, in the form of a bioavailable fraction and the residual fraction. The supernatant was lyophilized (Dura-Dry MP Freeze Dryer, FTS Systems, Inc., Ridge, NY), ground, and stored at minus 70 ° C. The disadvantages of this composition is the high cost of the final product.

Li Xi с соавторами (2012) для приготовления гидролизата все содержимое инкубационных куриных яиц гомогенизировали, лиофилизировали и хранили при 20°C до использования. Яичный порошок куриного эмбриона сначала растворяли в воде (5%, масса/объем), а затем рН образца доводили до 2,0 с помощью 1 н HCl и смесь инкубировали с пепсином при 800 Ед/мл на встряхивающей ванне в течение 2 ч при 37°C со скоростью встряхивания 100 об/мин. Затем образец нейтрализовали 1 М NaOH до рН 7,0 и добавляли панкреатин (2 мг/мл) и смесь желчных экстрактов (0,3 мг/мл) для дальнейшей инкубации на протяжении 2 часов. Для дезактивации ферментативной активности проводили кипячение в течение 10 мин. После гидролиза в смесь (1:1, об/об) добавляли петролейный эфир для экстракции биоактивных веществ в течение 4 ч с использованием магнитной мешалки. Затем смесь переносили в колбу, соединенную с обратным холодильником, где дополнительную экстракцию проводили на водяной бане при 80°C в течение 4 часов. Процесс разделения двух экстрактов проводили с помощью высокоскоростной центрифуги. Затем водорастворимую часть лиофилизировали. К недостаткам данной композиции относится дороговизна конечного продукта.Li Xi et al. (2012) to prepare the hydrolyzate, the entire contents of the incubation chicken eggs were homogenized, lyophilized, and stored at 20 ° C until use. Chicken embryo egg powder was first dissolved in water (5% w / v), then the sample was adjusted to pH 2.0 with 1N HCl and the mixture was incubated with pepsin at 800 U / ml in a shaking bath for 2 hours at 37 ° C with a shaking speed of 100 rpm Then the sample was neutralized with 1 M NaOH to pH 7.0 and Pancreatin (2 mg / ml) and a mixture of bile extracts (0.3 mg / ml) were added for further incubation for 2 hours. To deactivate the enzyme activity, boiling was performed for 10 min. After hydrolysis, petroleum ether was added to the mixture (1: 1, v / v) to extract bioactive substances for 4 h using a magnetic stirrer. Then the mixture was transferred to a flask connected to a reflux condenser, where additional extraction was carried out in a water bath at 80 ° C for 4 hours. The separation process of the two extracts was performed using a high-speed centrifuge. Then the water-soluble portion was lyophilized. The disadvantages of this composition is the high cost of the final product.

Наиболее близким к способу получения средства по настоящему изобретению является способ изготовления биологически активных препаратов на основе эмбриональных тканей. Этот способ предусматривает: измельчение мягких эмбриональных тканей, их гомогенизацию в дисперсионной среде на основе воды до разрушения клеточных оболочек, отделение (например, фильтрованием или центрифугированием) неразрушенных клеточных элементов, гидролиз гомогената в присутствии консерванта при температуре 4-45°C в течение времени от двух суток до шести недель, причем тем дольше, чем ниже температура, термообработку гидролизата при температуре 60-120°C до денатурации балластных веществ, отделение денатурированных термолабильных веществ и выделение из гидролизата термостабильного целевого продукта со средней молекулярной массой менее 10 кДа путем фракционирования, выполняемого, например: ультрафильтрацией, или центрифугированием при ускорении свыше 1500 g в течение 20-40 мин, или диализом через полупроницаемую пленку и/или гельфильтрацией, стерилизацию, разлив и укупорку препарата. Целевым продуктом при этом служит супернатант, содержащий в качестве действующего начала смесь относительно низкомолекулярных термостабильных веществ неопределенного состава со средней молекулярной массой в пределах 0,7-10,0 кДа (Патент RU 2132688).The closest to the method of obtaining funds according to the present invention is a method of manufacturing biologically active preparations based on fetal tissues. This method involves: grinding soft embryonic tissues, homogenizing them in a water-based dispersion medium until the cell membranes are destroyed, separating (for example, filtering or centrifuging) unbroken cellular elements, hydrolyzing the homogenate in the presence of a preservative at 4-45 ° C for a period of time two days to six weeks, and the longer, the lower the temperature, the heat treatment of the hydrolyzate at a temperature of 60-120 ° C before the denaturation of the ballast substances, the separation of the denatured thermolabile ve properties and isolation from a hydrolyzate of a thermostable target product with an average molecular weight of less than 10 kDa by fractionation, performed, for example, by ultrafiltration or centrifugation with acceleration above 1500 g for 20-40 min, or dialysis through a semipermeable film and / or gel filtration, sterilization, spill and capping drug. The target product is a supernatant containing a mixture of relatively low molecular weight thermostable substances of uncertain composition with an average molecular weight in the range of 0.7-10.0 kDa (Patent RU 2132688).

Однако описанный способ связан с существенными энергозатратами и обладает низкой производительностью.However, the described method is associated with significant energy consumption and has low productivity.

Технический результат изобретения заключается в получении недорогих по себестоимости средства, обладающего антиоксидантными и нейропротекторными свойствами, из доступного природного сырья.The technical result of the invention is to obtain inexpensive at the cost of funds with antioxidant and neuroprotective properties of the available natural raw materials.

Раскрытие изобретенияDISCLOSURE OF INVENTION

Средство, обладающее антиоксидантным и нейропротекторным свойствами, представляющее собой содержащий в качестве действующего начала не менее 0,4% аминокислот и 0,9% низкомолекулярных пептидов продукт кислотного гидролиза обезжиренного сублимата эмбриональных и внеэмбриональных тканей куриных эмбрионов.An agent with antioxidant and neuroprotective properties, which contains as the active principle at least 0.4% of amino acids and 0.9% of low molecular weight peptides, the product of acid hydrolysis of defatted sublimate of embryonic and extraembryonic chick embryo tissues.

Ниже описан один из способов получения средства согласно изобретению. Такие параметры являются оптимальными, но не единственно возможными, поскольку гидролиз можно осуществить различными концентрациями соляной кислоты и при других параметрах автоклавирования, а также при других соотношениях разбавителя и сублимата эмбриональных и внеэмбриональных тканей куриных эмбрионов, получая тот же качественный набор биологически активных веществ, который и определяет антиоксидантные и нейропротекторные свойства средства. Сами же антиоксидантные и нейропротекторные свойства средства, являются суммарным действием, как низкомолекулярных пептидов, так и других компонент, образующихся при гидролизе эмбриональных и внеэмбриональных тканей куриных эмбрионов. Данные параметры определяют только количество образующихся в процессе гидролиза биологически активных веществ.The following describes one of the methods of obtaining funds according to the invention. Such parameters are optimal, but not the only possible, since the hydrolysis can be carried out with different concentrations of hydrochloric acid and with other parameters of autoclaving, as well as with different diluent and sublimate ratios of embryonic and extraembryonic chicken embryo tissues, obtaining the same qualitative set of biologically active substances that determines the antioxidant and neuroprotective properties of the tool. The antioxidant and neuroprotective properties of the agent themselves are the total effect of both low molecular weight peptides and other components formed during the hydrolysis of chicken embryonic and extraembryonic tissues. These parameters determine only the amount of biologically active substances formed during the hydrolysis process.

Средство, обладающее антиоксидантным и нейропротекторным свойствами, получают следующим способом. Из сублимата эмбриональных и внеэмбриональных тканей 10-ти суточных куриных эмбрионов удаляют липиды 5-ти кратной экстракцией петролейным эфиром с последующим высушиванием обезжиренного остатка, полученный белоксодержащий порошок тщательно измельчают, затем растворяют в дистиллированной воде в количестве (1:25-30), перемешивают и затем к раствору добавляют НС1 до ее концентрации 0,5-0,6% и выдерживают при 50-55°C в течение 60 мин при перемешивании, затем полученную массу автоклавируют при 125-130°C в течение 60-65 мин, а после нейтрализуют 1 М NaOH до рН 6,8-7,2, центрифугируют при 4600-4800 g в течение 100-120 мин при температуре 2-4°C, полученную после центрифугирования жидкость последовательно фильтруют с применением мембран для стерилизации и удаления не гидролизованных белков.A tool with antioxidant and neuroprotective properties, get the following way. From the sublimate of embryonic and extraembryonic tissues of 10-day chicken embryos, lipids are removed by 5-fold extraction with petroleum ether, followed by drying the defatted residue, the resulting protein-containing powder is thoroughly crushed, then dissolved in distilled water in an amount (1: 25-30), mixed and then HC1 is added to the solution to a concentration of 0.5-0.6% and kept at 50-55 ° C for 60 minutes with stirring, then the resulting mass is autoclaved at 125-130 ° C for 60-65 minutes, and after neutralize with 1 M NaOH to pH 6.8-7, 2, centrifuged at 4600-4800 g for 100-120 minutes at a temperature of 2-4 ° C, the liquid obtained after centrifugation is sequentially filtered using membranes for sterilization and removal of non-hydrolyzed proteins.

Основные физико-химические показатели средства представлены в таблицах 1-2. Плотность (ρ20) определялась по Европейской Фармакопее и была рассчитана как отношение массы вещества к его объему при 20°C. Для определения использовался стеклянный пикнометр. Количество сухого вещества определяли весовым методом с помощью влагомера Ohaus MB 25 (Ohaus Corporation, США) при 105°C. Ионометрию проводили с использованием рН-метра S400-B (Mettler Toledo, Испания). Степень гидролиза (%) определялась как отношение аминного азота к общему азоту. Аминный азот, определяли методом формальдегидного титрования, а общий азот титримет-рическим методом по Кьельдалю. Концентрацию пептидов определяли би-уретовым методом с 1% пептоном в качестве стандарта и с использованием УФ-спектрофотометра СФ-102 (ООО «НПО ИНТЕРФОТОФИЗИКА», Россия). Количество моносахариддов определяли реакцией с пикриновой кислотой (по Креселиусу-Зейферту) с использованием УФ-спектрофотометра СФ-102 (ООО «НПО ИНТЕРФОТОФИЗИКА», Россия). Анализ состава свободной аминокислоты проводили в автоматическом анализаторе аминокислот ARACUS (ABACUS, Германия).The main physico-chemical indicators of the tools are presented in tables 1-2. Density (ρ20) was determined by the European Pharmacopoeia and was calculated as the ratio of the mass of a substance to its volume at 20 ° C. A glass pycnometer was used for the determination. The amount of dry matter was determined by the gravimetric method using an Ohaus MB 25 moisture meter (Ohaus Corporation, USA) at 105 ° C. Ionometry was performed using a pH meter S400-B (Mettler Toledo, Spain). The degree of hydrolysis (%) was determined as the ratio of amino nitrogen to total nitrogen. Amine nitrogen was determined by the method of formaldehyde titration, and total nitrogen by the Kjeldahl method of titrimetry. The concentration of peptides was determined by the bi-ureth method with 1% peptone as a standard and using an SF-102 UV spectrophotometer (NPO Interfotophysica, Russia). The number of monosaccharides was determined by reaction with picric acid (according to Crecelius-Seifert) using an SF-102 UV spectrophotometer (NPO INTERPHOTOFIZIKA LLC, Russia). The analysis of the composition of free amino acids was performed in an automatic amino acid analyzer ARACUS (ABACUS, Germany).

Результаты свидетельствуют о том, что полученное средство, содержит в качестве действующего начала не менее 0,4% аминокислот (аминный азот 68,6±2,8 мг %) и 0,9% низкомолекулярных пептидов (940±88 мг %) (таб. 1).The results indicate that the obtained agent contains as active principle at least 0.4% of amino acids (amine nitrogen 68.6 ± 2.8 mg%) and 0.9% of low molecular weight peptides (940 ± 88 mg%) (tab . one).

Примечание: ¹Значения, указанные для Asp, включают Asp+Asn; Значения, указанные для Glu, включают Glu+Gln; *Незаменимые аминокислоты.Note: ¹ Values for Asp include Asp + Asn; Values given for Glu include Glu + Gln; * Essential amino acids.

Метионин, гистидин, лизин, лейцин, фенилаланин, аргинин, тирозин и пролин считаются общепринятыми антиоксидантами. Антиоксидантным действием также обладают гистидинсодержащие дипептиды - анзерин и кар-нозин. Гамма-аминомасляная кислота, лизин, глицин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, аргинин, триптофан, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, валин, тирозин и аланин, присутствующие в полученном средстве, обладают выраженным нейропротекторным действием (таб. 2).Methionine, histidine, lysine, leucine, phenylalanine, arginine, tyrosine, and proline are considered common antioxidants. Histidine-containing dipeptides, anzerin and carosin, also have an antioxidant effect. Gamma-aminobutyric acid, lysine, glycine, isoleucine, leucine, phenylalanine, arginine, tryptophan, glutamic acid, aspartic acid, valine, tyrosine and alanine present in the resulting agent have a pronounced neuroprotective effect (tab. 2).

Антиоксидантная активность полученного средства была определена in vitro тремя методами: методом нейтрализации АБТС радикальной активности, анализом ингибирования перекисного окисления липидов и электрохимическим методом.Antioxidant activity of the obtained product was determined in vitro by three methods: the method of neutralizing ABTS radical activity, analysis of inhibition of lipid peroxidation and the electrochemical method.

Метод нейтрализации АБТС радикальной активности воспроизводился в соответствии с методикой, описанной Metelitza D.I. et al. (2001). Исходные растворы включали хромоген, содержащий АБТС-радикал (АБТС⁺), Трис-HCl буфер (20 ммоль/л, рН 7,4) и 0,95 ммоль/л раствор тролокса. Рабочий раствор готовили растворением хромогена, содержащего АБТС⁺ в 20 мл Трис-HCl буфере. К 1,98 мл рабочего раствора добавили 0,02 мл заявленного средства, выдержали 3 мин и замеряли оптическую плотность при длине волны 734 нм на УФ-спектрофотометре СФ 102 (ООО НПО ИНТЕРОФОТОФИКА, Россия). В качестве эталона использовали раствор тролокса (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты). В отрицательном контроле вместо заявленного средства использовали дистиллированную воду.The method of neutralizing ABTS of radical activity was reproduced in accordance with the methodology described by Metelitza DI et al. (2001). Stock solutions included a chromogen containing an ABTS radical (ABTS ⁺ ), a Tris-HCl buffer (20 mmol / L, pH 7.4) and a 0.95 mmol / L trolox solution. The working solution was prepared by dissolving the chromogen containing ABTS ⁺ in 20 ml of Tris-HCl buffer. 0.02 ml of the declared agent was added to 1.98 ml of the working solution, held for 3 minutes and measured the optical density at a wavelength of 734 nm on a UV 102 spectrophotometer (INTEROPHOTOFIKA NPO, Russia). Trolox solution (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) was used as a reference. In the negative control, distilled water was used instead of the claimed agent.

По результатам проведенного исследования было выявлено, что полученное средство обладает высокой антиоксидантной активностью при ингибировании АБТС-радикала, тролоксовый эквивалентный антиоксидантного потенциала составил 1,84 мкМ/мл тролокса.According to the results of the study, it was found that the obtained agent has a high antioxidant activity in inhibiting the ABTS-radical, Trolox equivalent antioxidant potential was 1.84 μM / ml Trolox.

Ингибирующую активность перекисного окисления липидов полученного средства измеряли в эмульсионной системе в соответствии со способом, описанным Qian Z.J. et al. (2008). К 4 мл фосфатного буфера (50 мМ, рН 7,0) внесли изучаемое средство (0,04 мл) и добавили 0,1 г олеиновой кислоты в 4-х мл этанола (99,5 мас. %, водный раствор). Общий объем довели до 10 мл дистиллированной водой, смешали в герметичной конической пробирке с закручивающейся крышкой и инкубировали при 40°C, в темноте в течение 7 суток. Степень окисления оценивали ежедневно с использованием тиоцианата железа. Для этого реакционный раствор содержащий липиды (100 мкл) смешивали с 4,7 мл этанола (75 мас %, водный раствор), 0,1 мл водного раствора тиоцианата аммония (30% мас/об) и 0,1 мл раствора хлорида железа (II) (20 мМ в 3,5% (об/об) HCl). Через 3 мин поглощающую способность измеряли при 500 нм с использованием УФ-спектрофотометра СФ 102 (ООО НПО ИНТЕРОФОТОФИКА, Россия). Тролокс использовался в качестве антиоксидантного эталона. В отрицательном контроле вместо заявленного средства использовали деионизированную воду.The inhibiting activity of lipid peroxidation of the obtained agent was measured in an emulsion system in accordance with the method described by Qian Z.J. et al. (2008). The test agent (0.04 ml) was added to 4 ml of phosphate buffer (50 mM, pH 7.0) and 0.1 g of oleic acid in 4 ml of ethanol (99.5 wt.%, Aqueous solution) was added. The total volume was brought to 10 ml with distilled water, mixed in a sealed conical tube with a screw cap, and incubated at 40 ° C in the dark for 7 days. The degree of oxidation was evaluated daily using iron thiocyanate. For this, the reaction solution containing lipids (100 μl) was mixed with 4.7 ml of ethanol (75% by weight, an aqueous solution), 0.1 ml of an aqueous solution of ammonium thiocyanate (30% w / v) and 0.1 ml of ferric chloride solution ( Ii) (20 mM in 3.5% (v / v) HCl). After 3 min, the absorbing ability was measured at 500 nm using a UV 102 spectrophotometer (NPO INTEROPHOTOFIKA LLC, Russia). Trolox was used as an antioxidant reference. In the negative control, instead of the claimed agent, deionized water was used.

Анализ ингибирования перекисного окисления липидов в моделирующей эмульсии олеиновой кислоты, свидетельствует о том, что полученное средство показало значительно более высокую степень ингибирования перекисного окисления липидов, чем тролокс в концентрации 0,95 ммоль/л. На Фиг. 1 представлено ингибирование перекисного окисления липидов под влиянием средства на основе эмбриональных тканей птиц.An analysis of inhibition of lipid peroxidation in a modeling emulsion of oleic acid suggests that the obtained agent showed a significantly higher degree of inhibition of lipid peroxidation than trolox at a concentration of 0.95 mmol / l. FIG. 1 shows the inhibition of lipid peroxidation under the influence of an agent based on avian embryonic tissue.

Общая антиоксидантная способность электрохимическим методом определялась в соответствии с

et al. (2010) и Hoyos-Arbelaez J. et al. (2017) на жидкокристаллическом приборе «Цвет-Яуза-01-AA» с амперометрическим детектированием (Россия). В качестве эталонного вещества использовали раствор галловой кислоты. В процессе анализа калибровочный график строится для 5 последовательных измерений каждого из 5 калибровочных растворов галловой кислоты. Результатом является среднее арифметическое 5 измерений. На основе полученных данных построен калибровочный график, который описывается уравнением Y=аХ+b,The total antioxidant capacity by the electrochemical method was determined in accordance with

et al. (2010) and Hoyos-Arbelaez J. et al. (2017) on the Tsvet-Yauza-01-AA liquid crystal device with amperometric detection (Russia). Gallic acid solution was used as a reference substance. In the course of the analysis, the calibration graph is constructed for 5 consecutive measurements of each of the 5 gallic acid calibration solutions. The result is an arithmetic average of 5 measurements. Based on the data obtained, a calibration graph is constructed, which is described by the equation Y = aX + b,

где: X - массовая концентрация галловой кислоты, мг/лwhere: X - mass concentration of gallic acid, mg / l

Y - сигнал галловой кислоты (площадь пика), хА/сY - signal of gallic acid (peak area), xA / s

С использованием метода электрохимического анализа в заявленном средстве обнаружен высокий уровень общей антиоксидантной способности в пересчете на галловую кислоту - 3,3 мг/л.Using the method of electrochemical analysis, the claimed agent detected a high level of total antioxidant capacity in terms of gallic acid - 3.3 mg / l.

Следующим этапом исследований стало изучение нейропротекторного действия полученного средства in vivo на лабораторных животных при моделировании экспериментальной интоксикации хлоридом алюминия (AlCl₃) в дозе 100 мг/кг на протяжении 90 дней. В результате интоксикации хлоридом алюминия (AlCl₃) в дозе 100 мг/кг в гиппокампе крыс развивается комплекс изменений соответствующих картине болезни Альцгеймера.The next stage of the research was the study of the neuroprotective effect of the obtained in vivo drug on laboratory animals in the simulation of experimental toxicity with aluminum chloride (AlCl ₃ ) at a dose of 100 mg / kg for 90 days. As a result of intoxication with aluminum chloride (AlCl ₃ ) at a dose of 100 mg / kg, a complex of changes corresponding to the pattern of Alzheimer's disease develops in the rat hippocampus.

Эксперимент проводили на 60 самках крыс линии Вистар, разделенных на 3 группы:The experiment was carried out on 60 female Wistar rats, divided into 3 groups:

I группа: интактные животные (n=20);Group I: intact animals (n = 20);

II группа (контроль) - животные с моделью экспериментальной алюминиевой интоксикации (n=20);Group II (control) - animals with a model of experimental aluminum intoxication (n = 20);

III группа (опытная) - животные с моделью экспериментальной алюминиевой интоксикации, получали подкожные инъекции заявленного средства с 80 по 85 сутки исследования в дозе 4,5 мг (пептидов) на кг живой массы.Group III (experimental) - animals with a model of experimental aluminum intoxication, received subcutaneous injections of the claimed agent from 80 to 85 days of the study at a dose of 4.5 mg (peptides) per kg of body weight.

На 91 день исследования животных умерщвляли в камере с углекислым газом и отбирали мозг.On the 91st day of the study, animals were killed in a cell with carbon dioxide and the brain was collected.

Данные, полученные в результате исследования, обрабатывали используя программное обеспечение GraphPad Prism версия 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Межгрупповое различие было измерено односторонним анализом дисперсии (ANOVA), за которым следовал поспеет Даннета. Значение Р<0,05 считалось статистически значимым.Data from the study was processed using GraphPad Prism version 5 software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). The intergroup difference was measured by a one-way analysis of variance (ANOVA), followed by Dunnett’s follow-up. A P value <0.05 was considered statistically significant.

Результаты, подтверждающие нейропротекторное действие заявленного средства представлены в таблицах 3 и 4.The results confirming the neuroprotective effect of the claimed agent are presented in Tables 3 and 4.

Достоверность различий от параметров интактной группы: *≤0,005; **≤0,0005. Достоверность различий параметров экспериментальной группы от контроля:

≤0,005.The significance of differences from the parameters of the intact group: * ≤0,005; ** ≤0,0005. The reliability of differences in the parameters of the experimental group from the control:

≤0.005.

Достоверность различий от параметров интактной группы *≤0,05, **≤0,005, ***≤0.0005. Достоверность различий параметров экспериментальной группы от контроля:

≤0,05;

≤0,005.The significance of differences from the parameters of the intact group * ≤0.05, ** ≤0.005, *** ≤0.0005. The reliability of differences in the parameters of the experimental group from the control:

≤0.05;

≤0.005.

Результаты морфологических изменений в гиппокампе крыс контрольной группы в целом соответствует картине болезни Альцгеймера.The results of morphological changes in the hippocampus of rats in the control group as a whole correspond to the picture of Alzheimer's disease.

Применение крысам опытной группы полученного средства приводит к нормализации показателей характеризующих популяцию нейронов в гипокампе, что свидетельствует о его нейропротекторном действии.The use of the obtained product in rats of the experimental group leads to the normalization of indicators characterizing the population of neurons in the hippocampus, which indicates its neuroprotective action.

ЛитератураLiterature

Горчакова, Н.А. Фармакология спорта / Н.А. Горчакова, Я.С. Гудивок, Л.М. Гунина и др. - К.: Изд-во Олимп. Литература, 2010. - 640 с.Gorchakova, N.A. Pharmacology of sports / N.A. Gorchakova, Ya.S. Gudivok, L.M. Gunina and others. - K .: Publishing House of Olympus. Literature, 2010. - 640 p.

Зозуля, Ю.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга / Ю.А. Зозуля, В.А. Барабой, Д.А. Сутковой. - М.: Знание, 2000. - С. 226-231.Zozulya, Yu.A. Free radical oxidation and antioxidant protection in the pathology of the brain / Yu.A. Zozulya, V.A. Baraboy, D.A. Day. - M .: Knowledge, 2000. - p. 226-231.

Патент RU 2292214. Средство, обладающее антиоксидантной активностью // Шилова И.В., Краснов Е.А, Кувачева Н.В., Новожеева Т.П. - Опубл. 10.05.2009.Patent RU 2292214. Means with antioxidant activity // Shilova I.V., Krasnov E.A., Kuvacheva N.V., Novozheeva T.P. - Publ. 05/10/2009

Патент RU 2385722. Фармацевтическая нейропротекторная, антиоксидантная, антигипоксантная, антиапоптотическая и мембранопротекторная композиция и способ лечения // Кожока Т.Г., Филимонов В.А., Ясинский С.Я. - Опубл. 10.04.2010.Patent RU 2385722. Pharmaceutical neuroprotective, antioxidant, antihypoxant, antiapoptotic and membrane-protective composition and method of treatment // Kozhoka TG, Filimonov VA, Yasinsky S.Ya. - Publ. 04/10/2010.

Патент RU 2514632. Антиоксидантное, стресс- и нейропротекторное фармакологическое средство - коменат калия // Шурыгина Л.В., Злищева Э.И., Кравцов А.А., Андросова Т.В., Злищева Л.И., Полещук Л.А., Скороход Н.С. - Опубл. 27.04.2014.Patent RU 2514632. Antioxidant, stress and neuroprotective pharmacological agent - potassium comenate // Shurygina LV, Zlischeva EI, Kravtsov AA, Androsova TV, Zlischeva LI, Poleschchuk L. A., Skorohod N.S. - Publ. 04/27/2014.

Патент RU 2132688. Способ изготовления биологически активных препаратов из эмбриональных тканей // Шорох Д.Б., Писоцкий А.А., Шевченко А.А., Волощенко Ю.В., Диденко Н.Ю. - Опубл. 10.07.1999.Patent RU 2132688. A method of manufacturing biologically active preparations from embryonic tissues // Shorokh D. B., Pisotsky A. A., Shevchenko A. A., Voloschenko Y. V., Didenko N. Yu. - Publ. 07/10/1999.

Попова, М.С. Индукция клеточного цикла, амилоид-бета и свободные радикалы в механизме развития нейродегенеративных процессов в мозге / М.С. Попова, М.Ю. Степаничев // Нейрохимия. - 2008. - Т. 25. - №3. - С. 170-178.Popova, M.S. Induction of the cell cycle, amyloid-beta and free radicals in the mechanism of development of neurodegenerative processes in the brain / MS. Popova, M.Yu. Stepanichev // Neurochemistry. - 2008. - T. 25. - №3. - p. 170-178.

Смирнов, И.Н. Клиническая эффективность и антиоксидантная активность мексидола при хронических цереброваскулярных заболеваниях / И.Н. Смирнова, Т.Н. Федорова, М.М. Танашян, З.А. Суслина // Нервные болезни. - 2006 .- №1. - С. 33-36.Smirnov, I.N. Clinical efficacy and antioxidant activity of mexidol in chronic cerebrovascular diseases / I.N. Smirnova, T.N. Fedorov, M.M. Tanashyan, Z.A. Suslin // Nervous diseases. - 2006 .- №1. - p. 33-36.

Федорова, Т.Н. Окислительный стресс и защита головного мозга от ишемического повреждения: Дисс. д-ра биол. наук: 03.00.04: Москва. - 2004. - 298 с.Fedorova, T.N. Oxidative stress and protection of the brain from ischemic damage: Diss. Dr. Biol. Sciences: 03.00.04: Moscow. - 2004. - 298 p.

Calabrese, V. NO synthase and NO-dependet signal pathways in brain aging and neuredegenerative disorders: the role of oxidant/antioxidant balance / V. Calabrese, Т.Е. Bates, A.M. Stella // Neurochem. - 2000. - V.25. - P. 1315-1341.Calabrese, V.No. synthase and NO-dependet signal pathways in the brain. Calabrese, I.E. Bates, A.M. Stella // Neurochem. - 2000. - V.25. - P. 1315-1341.

Chen, Y.C. Antioxidative activities of hydrolysates from duck egg white using enzymatic hydrolysis / Y.C Chen, H.S. Chang, C.T. Wang, F.Y. Cheng // Asian-Aust. J. Anim. Sci. - 2009. - 22, (11). - P. 1587-1593.Chen, Y.C. Antioxidative activities of hydrolysates from duck egg white using enzymatic hydrolysis / Y.C. Chen, H.S. Chang, C.T. Wang, F.Y. Cheng // Asian-Aust. J. Anim. Sci. - 2009. - 22, (11). - P. 1587-1593.

B. Antioxidant and anti-inflammatory properties of cancer preventive peptide lunasin in RAW 264.7 macrophages / B.

, C.-C. Hsieh, B.O. Lumen // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2009. - 390. - P. 803-808.

B. Antioxidant and anti-inflammatory properties of cancer preventive peptide in RAW 264.7 macrophages / B.

, C.-C. Hsieh, BO Lumen // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2009. - 390. - p. 803-808.

Hoyos-Arbelaez, J. Electrochemical methods as a tool for determining the antioxidant capacity of food and beverages. A review / J. Hoyos-Arbelaez, M. Vazquez, J. Contreras-Calderon // Food Chem. - 2017. - 221. - P. 1371-1381. doi:10.1016/j.foodchem.2016.11.017.Hoyos-Arbelaez, J. Electrochemical methods for food and beverages. A review / J. Hoyos-Arbelaez, M. Vazquez, J. Contreras-Calderon // Food Chem. - 2017. - 221. - p. 1371-1381. doi: 10.1016 / j.foodchem.2016.11.0.017.

Jao, C.L. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging by protein hydrolysates from tuna cooking juice / C.L. Jao, W.C. Ко // Fisheries Sci. - 2002. - 68. - P. 430-435.Jao, C.L. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging protein by hydrolysates from tuna cooking juice / C.L. Jao, W.C. Co. // Fisheries Sci. - 2002. - 68. - p. 430-435.

Je, J.Y. Antioxidant activity of peptide isolated from Alaska pollack (Theragra chalcogramma) frame protein hydrolysate / J.Y. Je, P.J. Park, S.K. Kim // Food Res. Int. - 2005. - 38. - P. 45-50.Je, J.Y. Antioxidant activity of peptide isolated from Alaska pollack (Theragra chalcogramma) frame protein hydrolysate / J.Y. Je, P.J. Park, S.K. Kim // Food Res. Int. - 2005. - 38. - p. 45-50.

Kim, S.K. Isolation and characterization of antioxidative peptides from gelatin hydrolysate of Alaska pollack skin / S.K. Kim, Y.T. Kim, H.G. Byun, K.S. Nam, D.S. Joo, F. Shahidi // J. Agr. Food Chem. - 2001. - 49. - P. 1984-1989.Kim, S.K. Isolation and characterization of antioxidant peptides from gelatin hydrolysate of Alaska pollack skin / S.K. Kim, Y.T. Kim, H.G. Byun, K.S. Nam, D.S. Joo, F. Shahidi // J. Agr. Food Chem. - 2001. - 49. - P. 1984-1989.

Kitts, D.D. Bioactive proteins and peptides from food sources. Applications of bioprocesses used in isolation and recovery / D.D. Kitts, K. Weiler // Curr. Pharm. Design. - 2003. - 9. - P. 1309-1323.Kitts, D.D. Bioactive proteins and peptides from food sources. Applications of bioprocesses used in D.D. Kitts, K. Weiler // Curr. Pharm. Design. - 2003. - 9. - p. 1309-1323.

Lee, S.K. Antioxidant activity of phosvitin in phosphatidylcholine liposomes and meat model systems / S.K. Lee, J.H. Han, E.A. Decker // J. Food Sci. - 2002. - 67. - P. 37-41.Lee, S.K. Antioxidant activity of phosvitin in phosphatidylcholine liposomes and meat model systems / S.K. Lee, J.H. Han, E.A. Decker // J. Food Sci. - 2002. - 67. - p. 37-41.

Li, Y.F. Bioactivities of chicken essence / Y.F. Li, R.R. He, B. Tsoi, H. Kurihara // Journal of Food Science. - 2012. - 77 (4). - P. 105-110. doi:10.1111/j.1750-3841.2012.02625.x.Li, Y.F. Bioactivities of chicken essence / Y.F. Li, R.R. He, B. Tsoi, H. Kurihara // Journal of Food Science. - 2012. - 77 (4). - P. 105-110. doi: 10.1111 / j.1750-3841.2012.02625.x.

Li, Xi Chicken embryo extracts enhance spleen lymphocyte and peritoneal macrophages function / Xi Li, Y. Su, J. Sun, Y. Yang // J. of Ethnopharmacol. -2012. - 144. - P. 255-260. doi:10.1016/j.jep.2012.09.001.Li, Xi Chicken embryo extracts enhance spleen lymphocyte and peritoneal macrophages function / Xi Li, Y. Su, J. Sun, Y. Yang // J. of Ethnopharmacol. -2012. - 144. - P. 255-260. doi: 10.1016 / j.jep.2012.09.001.

Lu, C.L. Characteristics of egg yolk phosvitin as an antioxidant for inhibiting metal-catalyzed phospholipid oxidations / C.L. Lu, R.C. Baker // Poult. Sci. - 1987. - 65. - P. 2065-2070.Lu, C.L. Characteristics of egg yolk phosvitin as an antioxidant for inhibiting metal-catalyzed phospholipid oxidations / C.L. Lu, R.C. Baker // Poult. Sci. - 1987. - 65. - p. 2065-2070.

Metelitza, D.I. Initiation and inhibition of free radical processes in H₂O₂-metmyoglobin (methemoglobin)-2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) systems / D.I. Metelitza, A.N. Eryomin, D.O. Sviridov, V.S. Kamyshnikov // Biokhimiya. - 2001. - Vol. 66 (5). - P. 628-639.H ₂ O ₂ -metmyoglobin (methemoglobin) -2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) systems / DI Metelitza, AN Eryomin, DO Metelitza, DI Initiation and inhibition of free radicals , VS Kamyshnikov // Biokhimiya. - 2001. - Vol. 66 (5). - P. 628-639.

Nonaka, Sh. Lithium protects rat cerebellar granule cells against apoptosis induced by anticonvulsants, phenytoin and carbamazepine / Sh. Nonaka, N. Katsube and D.-M. Chuang // JPET. - 1998. - Vol. 286. - P. 539-547.Nonaka, Sh. Lithium protects rat cerebellar granule cells against apoptosis induced by anticonvulsants, phenytoin and carbamazepine / Sh. Nonaka, N. Katsube and D.-M. Chuang // JPET. - 1998. - Vol. 286. - p. 539-547.

Park, PJ. Purification and characterization of antioxidative peptides from protein hydrolysate of lecithin-free egg yolk / P.J. Park, W.K. Jung, K.S. Nam, F. Shahidi, S.K. Kim // J. AOCS. - 2001. - 78. - P. 651-656.Park, PJ. Characteristics of antioxidative peptides from protein hydrolysate of lecithin-free egg yolk / P.J. Park, W.K. Jung, K.S. Nam, F. Shahidi, S.K. Kim // J. AOCS. - 2001. - 78. - p. 651-656.

J. Electrochemical determination of antioxidant capacity of fruit tea infusions / J.

L. Valek, T. Stipcevic, S. Martinez // Food Chem. - 2010. - 121 (3). - P. 820-825. doi:10.1016/j.foodchem.2009.12.090.

Electrochemical determination of antioxidant capacity of fruit tea infusions / J.

L. Valek, T. Stipcevic, S. Martinez // Food Chem. - 2010. - 121 (3). - P. 820-825. doi: 10.1016 / j.foodchem.2009.12.090.

Qian, Z.J. Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purified from hydrolysate of bullfrog skin / Z.J. Qian, W.K. Jung, S.K. Kim // Rana catesbeiana Shaw. Bioresource Technology. - 2008. - 99(6). - P. 1690-1698.Qian, Z.J. Hydrolysate of bullfrog skin / Z.J. Qian, W.K. Jung, S.K. Kim // Rana catesbeiana Shaw. Bioresource Technology. - 2008. - 99 (6). - P. 1690-1698.

Sakanaka, S. Antioxidant activity of egg-yolk protein hydrolysates in a linoleic acid oxidation system / S. Sakanaka, Y. Tachibana, N. Ishihara, L.R. Juneja // Food Chem. - 2004. - 86. - P. 99-103.Sakanaka, S. Antioxidant activity of egg yolk protein hydrolysates in a linoleic acid oxidation system / S. Sakanaka, Y. Tachibana, N. Ishihara, L.R. Juneja // Food Chem. - 2004. - 86. - p. 99-103.

Sakanaka, S. Active oxygen scavenging activity of egg-yolk protein hydrolysates and their effects on lipid oxidation in beef and tuna homogenates / S. Sakanaka, Y. Tachibana // Food Chem. - 2006. - 95. - P. 243-249.Sakanaka, S. Sakanaka, Y. Tachibana // Food Chem. - 2006. - 95. - p. 243-249.

Song, Li. Antioxidant activities of hydrolysates of Area subcrenata prepared with three proteases / Li. Song, T. Li, R. Yu, Ch. Yan, Sh. Ren and Yu Zhao // Mar. Drugs. - 2008. - 6. - P. 607-619. doi:10.3390/md6040607.Song, Li. Antioxidant activities of hydrolysates of Area subcrenata prepared with three proteases / Li. Song, T. Li, R. Yu, Ch. Yan, Sh. Ren and Yu Zhao // Mar. Drugs. - 2008. - 6. - p. 607-619. doi: 10.3390 / md6040607.

Suetsuna, K. Antioxidant peptides from the protease digest of prawn (Penaeus japonicus) muscle / K. Suetsuna // Mar. Biotechnol. - 2000. - 2. - P. 5-10.Suetsuna, K. Antioxidant peptides from the protease (Penaeus japonicus) muscle / K. Suetsuna // Mar. Biotechnol. - 2000. - 2. - p. 5-10.

Sun, H. Antioxidant activities of chick embryo egg hydrolysates / H. Sun, T. Ye, Y. Wang, L. Wang, Y. Chen, B. Li // Food Sci. & Nutr. - 2014. - 2 (1). - P. 58-64. doi: 10.1002/fsn3.77/Sun, H. Antioxidant hydrolysates / ch. Embryo egg hydrolysates / H. Sun, T. Ye, Y. Wang, L. Wang, Y. Chen, B. Li // Food Sci. & Nutr. - 2014. - 2 (1). - P. 58-64. doi: 10.1002 / fsn3.77 /

Claims

An agent with antioxidant and neuroprotective properties, obtained by removing lipids from the sublimate of embryonic and extraembryonic tissues of 10-day-old chicken embryos by 5-fold extraction with petroleum ether, followed by drying the defatted residue, then the resulting protein-containing powder is thoroughly crushed, dissolved in distilled water, 1: 25-30, stirred and then HCl is added to the solution to a concentration of 0.5-0.6% and maintained at 50-55 ° C for 60 minutes with stirring, then obtained this mass is autoclaved at 125-130 ° C for 60-65 min, and then neutralized with 1 M NaOH to pH 6.8-7.2, centrifuged at 4600-4800 g for 100-120 min at 2-4 ° C C, the liquid obtained after centrifugation is successively filtered using membranes to sterilize and remove non-hydrolyzed proteins.