RU2006124570A - Способ детекции патогенных микобактерий в клинических образцах - Google Patents

Claims (15)

1. Способ детекции патогенных микобактерий в клиническом образце, где указанный способ включает стадии

a. очистки клинического образца от загрязнений, включая слизь, общепринятыми способами, для получения обработанного клинического образца,

b. обработки очищенных клинических образцов, полученных на стадии (a), буфером для лизиса для инактивации живых патогенных микобактерий,

c. выделения геномной ДНК из клинического образца со стадии (b),

d. подвергания выделенной ДНК амплификации PCR с применением олигопраймеров SEQ ID No:5 и 6, и получения SEQ ID No:4,

e. подвергания SEQ ID No:4 дальнейшей амплификации PCR и получения амплифицированного продукта PCR,

f. анализа амплифицированного продукта PCR со стадии (e) посредством способа, выбранного из электрофореза в геле, полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) для детекции присутствия патогенных микобактерий в образце.

2. Способ по п.1, где продукт PCR SEQ ID No:4 имеет следующую последовательность:

3. Способ по п.1, где клинический образец выбирают из мокроты, спинномозговой жидкости, образца промывания желудка, крови, образцов биоптата тканей, или аспиратов костного мозга и других жидкостей или тканей организма.

4. Способ по п.1, где очистку образца на стадии (a) от загрязнений (живых организмов, отличных от микобактерий, и слизи) проводят посредством раствора для деконтаминации с последующим концентрированием образца центрифугированием.

5. Способ по п.4, где раствор для деконтаминации содержит изотиоцианат гуанидина в диапазоне приблизительно 0,5-2,0М помимо щелочи средней силы и муколитического средства.

6. Способ по п.1, где буфер для лизиса содержит изотиоцианат гуанидина в диапазоне приблизительно 0,5-8,0М, Трис-Cl pH 7,6 в диапазоне приблизительно 20-100 мМ, N-лаурил саркозил в диапазоне приблизительно 0,5-2%, EDTA в диапазоне приблизительно 0,1-20 мМ, β-меркаптоэтанол в диапазоне приблизительно 1,0-25,0 мМ и ацетат аммония (CH₃COONH₄) в диапазоне приблизительно 0,3-1,0M.

7. Способ по п.1, где выделенная ДНК из клинических образцов свободна от неспецифической ДНК и ингибиторов PCR.

8. Способ по п.1, где амплификации ДНК на стадии (e) достигают посредством условий проведения циклов PCR с понижением температуры, где указанные условия предусматривают стадии с начальной температурой отжига в диапазоне 62-72°C с последующим понижением температуры в диапазоне приблизительно 0,2-1°C на цикл PCR для первых 10-25 циклов, являющихся стадией с понижением температуры, до оптимальной температуры отжига приблизительно 56-62°C для других 30 циклов PCR.

9. Способ по п.1, где олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающие амплификацию фрагмента ДНК для специфической детекции патогенных микобактерий в клинических образцах, выбирают из группы

a. 5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3' (SEQ ID No:5), являющийся прямым праймером.

b. 5'GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3' (SEQ ID No:6), являющийся обратным праймером.

10. Способ по п.1, где длина олигонуклеотидных праймеров составляет между 5 и 100 нуклеотидами.

11. Диагностический набор для детекции патогенных микобактерий в клиническом образце, содержащий

a. прямой праймер SEQ ID No:5 и

b. обратный праймер SEQ ID No:6

12. Диагностический набор по п.11, где SEQ ID No:5 представляет собой

5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3'

13. Диагностический набор по п.11, где SEQ ID No:6 представляет собой

5' GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3'.

14. Применение праймеров, имеющих последовательности SEQ. ID No:5 и SEQ ID No:6 для детекции патогенных микобактерий в клиническом образце.

15. Набор из праймеров SEQ ID No:5 и 6, где

a. 5' TGGATCCGTTGACCATGAGGTGTAATG 3' (SEQ ID No:5), являющийся прямым праймером.

b. 5' GGAATTCCACTACGCACGGACTCTC 3' (SEQ ID No:6), являющийся обратным праймером.