RU2001132133A - Растения, устойчивые к гербицидам - Google Patents

Claims (52)

1. Выделенный полинуклеотид, включающий последовательность, приведенную в SEQ ID No.41.

2. Полинуклеотид, кодирующий EPSPS, за исключением кДНК, кодирующей EPSPS риса и кукурузы, который является комплементарным полинуклеотиду, который при инкубации при температуре 65 - 70°С в физиологическом растворе с цитратным буфером с ионной силой 0,1, содержащем 0,1% SDS, сопровождающейся промыванием при такой же температуре физиологическим раствором с цитратным буфером с ионной силой 0,1, содержащим 0,1% SDS, способен гибридизоваться с последовательностью, приведенной в SEQ ID No.41.

3. Полинуклеотид, кодирующий EPSPS, отличный от EPSPS кукурузы, который может быть получен путем скрининга библиотек растительной геномной ДНК с полинуклеотидом, составляющим интрон в последовательности SEQ ID No.41.

4. Выделенный полинуклеотид, включающий участок, кодирующий хлоропластный сигнальный пептид и глифосат-устойчивую 5-енолпирувилшикиматфосфатсинтетазу (EPSPS) 3' пептида, причем экспрессия указанного участка находится под контролем растительного функционального промотора, при условии, что указанный промотор не является гетерологичным по отношению к указанному участку, и хлоропластный сигнальный пептид не является гетерологичным по отношению к указанной синтазе.

5. Полинуклеотид по любому из пп.1-4, включающий следующие компоненты в направлении транскрипции 5'→3': (i) по меньшей мере один энхансер транскрипции, причем данный энхансерный участок находится выше старт-сайта транскрипции последовательности, из которой данный энхансер получен, и который сам по себе не функционирует как промотор, ни в случае эндогенного включения в последовательности, ни в случае гетерологичного присутствия в виде части конструкции; (ii) промотор гена EPSPS риса; (iii) геномную последовательность риса, которая кодирует хлоропластный сигнальный пептид EPSPS риса; (iv) геномную последовательность, которая кодирует EPSPS риса; (v) терминатор транскрипции; при этом последовательность, кодирующая EPSPS риса, модифицирована таким образом, что в результате мутации по первому положению остатком в данной позиции является Ile вместо Thr, и в результате мутации по второму положению остатком в данном положении является Ser вместо Pro, причем данные мутации введены в последовательности EPSPS, которые включают следующий консервативный участок GNAGTAMRPLTAAV в ферменте дикого типа, так, чтобы модифицированная последовательность представляла собой GNAGIAMRSLTAAV.

6. Полинуклеотид по п.5, отличающийся тем, что указанный энхансер включает последовательность, 3'-конец которой находится по меньшей мере на 40 нуклеотидов выше ближайшего старт-сайта транскрипции последовательности, из которой был получен энхансер.

7. Полинуклеотид по любому из п.5 или 6, отличающийся тем, что энхансер включает участок, 3'-конец которого находится по меньшей мере на 60 нуклеотидов выше указанного ближайшего старт-сайта.

8. Полинуклеотид по п.5, отличающийся тем, что указанный энхансер включает последовательность, 3'-конец которой находится по меньшей мере на 10 нуклеотидов выше первого нуклеотида ТАТА консенсуса последовательности, из которой был получен энхансер.

9. Полинуклеотид по любому из пп.1-8, включающий первый и второй энхансеры транскрипции.

10. Полинуклеотид по п.9, отличающийся тем, что первый и второй энхансеры совместно присутствуют в полинуклеотиде.

11. Полинуклеотид по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что 3'-конец энхансера, или первого энхансера, находится приблизительно на 100 - 1000 нуклеотидов выше кодона, соответствующего старт-сайту трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5' нетранслируемом участке.

12. Полинуклеотид по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что 3'-конец энхансера, или первого энхансера, находится приблизительно на 150 - 1000 нуклеотидов выше кодона, соответствующего старт-сайту трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5' нетранслируемом участке.

13. Полинуклеотид по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что 3'-конец энхансера, или первого энхансера, находится приблизительно на 300 - 950 нуклеотидов выше кодона, соответствующего старт-сайту трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5' нетранслируемом участке.

14. Полинуклеотид по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что 3'-конец энхансера, или первого энхансера, находится приблизительно на 770 - 790 нуклеотидов выше кодона, соответствующего старт-сайту трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5' нетранслируемом участке.

15. Полинуклеотид по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что 3'-конец энхансера, или первого энхансера, находится приблизительно на 300-380 нуклеотидов выше кодона, соответствующего старт-сайту трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5' нетранслируемом участке.

16. Полинуклеотид по любому из пп.1-13 и 15, отличающийся тем, что 3'-конец энхансера, или первого энхансера, находится приблизительно на 320 - 350 нуклеотидов выше кодона, соответствующего старт-сайту трансляции сигнального пептида EPSPS, или первого нуклеотида интрона в 5' нетранслируемом участке.

17. Полинуклеотид по любому из пп.1-16, отличающийся тем, что участок, расположенный выше промотора гена EPSPS риса, включает по меньшей мере один энхансер, полученный из последовательности, расположенной выше старт-сайта транскрипции промоторов полиубихитина кукурузы или актина риса.

18. Полинуклеотид по п.17, включающий в направлении 5'→3' первый энхансер, включающий участок, усиливающий транскрипцию, полученный из последовательности, которая расположена выше старт-сайта транскрипции промотора актина риса, и второй энхансер, включающий усиливающий транскрипцию участок, полученный из последовательности, расположенной выше старт-сайта транскрипции промотора актина риса.

19. Полинуклеотид по любому из пп.1-18, отличающийся тем, что нуклеотиды 5'-конца кодона, составляющего старт-сайт трансляции хлоропластного сигнального пептида EPSPS риса, являются предпочтительными по Козаку.

20. Полинуклеотид по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что 5'-конец геномной последовательности риса, которая кодирует хлоропластный сигнальный пептид EPSPS риса, находится в нетранслируемом участке, который включает последовательность, которая функционирует как интрон.

21. Полинуклеотид по п.20, отличающийся тем, что нетранслируемый участок включает интрон, при этом интроном является интрон ADHI кукурузы.

22. Полинуклеотид по любому из п.21 или 22, отличающийся тем, что нетранслируемый участок включает последовательность, приведенную в SEQ ID NO.48.

23. Полинуклеотид по п.22, отличающийся тем, что нетранслируемый участок включает интрон, при этом интроном является интрон 1 актина риса или интрон полиубихитина кукурузы.

24. Полинуклеотид по любому из пп.1-23, который включает энхансер трансляции, полученный из вируса, расположенный в нетранслируемом участке 5'-конца геномной последовательности риса, которая кодирует хлоропластный сигнальный пептид EPSPS риса.

25. Полинуклеотид по любому из пп.1-24, дополнительно включающий участки, кодирующие белки, способные придавать растительному материалу, содержащему его, по меньшей мере одно из следующих желательных для сельского хозяйства свойств: устойчивость к насекомым, грибкам, вирусам, бактериям, нематодам, стрессу, обезвоживанию и гербицидам.

26. Полинуклеотид по п.25, отличающийся тем, что гербицид является другим, нежели глифосат.

27. Полинуклеотид по любому из п.25 или 26, отличающийся тем, что участки, придающие устойчивость к насекомым, кодируют кристаллические токсины, полученные из Bt, включающие секретируемые токсины Bt; ингибиторы протеаз, лектины, токсины Xenhorabdus/Photorhabdus; участки, придающие устойчивость к грибкам выбраны из группы, состоящей из участков, кодирующих известные AFP, дефенсины, хитиназы, глюканазы, Avr-Cf9; участки, придающие устойчивость к бактериям, выбраны из группы, состоящей из участков, кодирующих цекропины и техиплесин, а также их аналоги; участки, придающие устойчивость к вирусам, выбраны из группы, состоящей из участков, кодирующих белки вирусной оболочки, двигательные белки, вирусные репликазы, а также антисмысловые и рибозимные последовательности, которые обеспечивают устойчивость к вирусам; участки, придающие устойчивость к стрессовым воздействиям, солевому режиму и засухе, выбраны из участков, кодирующих глутатион-S-трансферазу и пероксидазу, последовательность, которая составляет известную регуляторную последовательность CBF1, а также генов, которые обеспечивают накопление трегалозы.

28. Полинуклеотид по п.27, отличающийся тем, что участки, обеспечивающие устойчивость к насекомым, выбраны из группы, состоящей из генов cryIAc, cryIAb, cry3А, Vip 1А, Vip 1B, ингибиторов цистеиновой протеазы и лектина подснежника.

29. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, который является модифицированным так, чтобы были удалены мотивы нестабильности мРНК и/или нежелательные участки сплай-синга, или предпочтительные для урожайных культур кодоны могут использоваться так, что экспрессия модифицированного таким образом полинуклеотида в растениях приводит в результате к получению подобного белка, имеющего такую же активность/функцию, как и белок, полученный путем экспрессии кодирующих белок участков немодифицированного полинуклеотида в организме, в котором они являются эндогенными.

30. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, где степень идентичности модифицированного полинуклеотида и полинуклеотида, эндогенно содержащегося в указанном растении, и кодирующего по существу такой же белок, является такой, чтобы предотвратить косупрессию модифицированной и эндогенной последовательностей.

31. Полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов, где указанная степень составляет менее 70%.

32. Вектор, включающий полинуклеотид по любому из предшествующих пунктов.

33. Растительный материал, который был трансформирован полинуклеотидом по любому из пп.1-31, или вектором по п.32.

34. Растительный материал, который был трансформирован полинуклеотидом по любому из пп.1-31, или вектором по п.32, и который был или является дополнительно трансформированным полинуклеотидом, включающим участки, кодирующие белки, способные придавать растительному материалу, содержащему его, по меньшей мере одно из следующих желательных для сельского хозяйства свойств: устойчивость к насекомым, грибкам, вирусам, бактериям, нематодам, стрессу, обезвоживанию и гербицидам.

35. Морфологически нормальные, способные к воспроизведению целые растения, которые были регенерированы из материала по любому из п.33 или 34, их потомство - семена и части.

36. Морфологически нормальные, способные к воспроизведению целые растения, которые включают полинуклеотид по любому из пп.1-31, и которые получаются в результате скрещивания растений, регенерированных из материала, трансформированного полинуклеотидом по любому из пп.1-31, или вектором по п.32, с растениями, которые были трансформированы полинуклеотидом, включающим участки, кодирующие белки, способные придавать растительному материалу, содержащему его, по меньшей мере одно из следующих желательных для сельского хозяйства свойств: устойчивость к насекомым, грибкам, вирусам, бактериям, нематодам, стрессу, обезвоживанию и гербицидам, потомство полученных растений, их семена и части.

37. Растения по любому из п.35 или 36, выбранные из группы, состоящей из полевых культур, фруктов и овощей, таких как брюква "canola", подсолнечник, табак, сахарная свекла, хлопок, кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, томаты, манго, персик, яблоко, груша, клубника, банан, дыня, картофель, морковь, салат-латук, капуста, лук, разные виды сои, сахарный тростник, горох, конские бобы, тополь, виноград, цитрусовые, люцерна, рожь, овес, дернообразующие и кормовые травы, лен и масличный рапс, а также растений, продуцирующих орехи, если они не упоминались отдельно, их потомство, семена и части.

38. Растения кукурузы по любому из пп.35-37.

39. Способ селективной борьбы с сорняками на поле, включающем сорняки и растения или их потомство по любому из пп.35-38, включающий нанесение на поле гербицида типа глифосата в количестве, достаточном для борьбы с сорняками без существенного влияния на растения.

40. Способ по п.39, дополнительно включающий нанесение на поле либо до, либо после применения глифосатного гербицида, одного или нескольких из следующих средств: гербицида, инсектицида, фунгицида, нематицида, бактериоцида и антивирусного средства.

41. Способ получения растений, которые являются по существу толерантными или по существу устойчивыми к глифосатному гербициду, включающий следующие стадии: (i) трансформация растительного материала полинуклеотидом по любому из пп.1-31, или вектором по п.32; (ii) отбор трансформированного таким образом материала и (iii) регенерация отобранного таким образом материала в морфологически нормальные способные к воспроизведению целые растения.

42. Способ по п.41, отличающийся тем, что трансформация включает введение полинуклеотида в материал путем: (i) биолистической бомбардировки материала частицами, покрытыми полинуклеотидом; или (ii) насаживания материала на волокна из карбида кремния, которые покрыты раствором, содержащим полинуклеотид; или (iii) введения полинуклеотида или вектора в Agrobacterium и совместного культивирования трансформированного таким образом Agrobacterium с растительным материалом, который в результате этого подвергается трансформации, после чего подвергается регенерации.

43. Способ по п.42, отличающийся тем, что трансформированный материал отбирают по устойчивости к глифосату.

44. Применение полинуклеотида по любому из пп.1-31, или вектора по п.32, для получения тканей растений и/или морфологически нормальных способных к воспроизведению целых растений, которые являются по существу толерантными, или по существу устойчивыми к глифосатному гербициду.

45. Применение полинуклеотида по любому из пп.1-31, или вектора по п.32, для получения гербицидной мишени для in vitro скрининга потенциальных гербицидов с высокой пропускной способностью.

46. Способ отбора биологического материала, трансформированного так, чтобы экспрессировать ген, представляющий интерес, при этом трансформированный материал включает полинуклеотид по любому из пп.1-31, или вектор по п.32, и при этом отбор включает воздействие глифосата, или его соли, на трансформированный материал, и отбор выжившего материала.

47. Способ по п.46, отличающийся тем, что биологический материал имеет растительное происхождение.

48. Способ по п.47, отличающийся тем, что растение является однодольным.

49. Способ по п.48, отличающийся тем, что однодольное растение, выбрано из группы, состоящей из ячменя, пшеницы, кукурузы, риса, овса, ржи, сорго, ананаса, сахарного тростника, банана, лука, спаржи и лука-порея.

50. Способ регенерации способного к воспроизведению трансформированного растения, содержащего чужеродную ДНК, включающий следующие стадии:

(a) получение способной к регенерации ткани из указанного растения, подлежащего трансформации;

(b) трансформация указанной способной к регенерации ткани, содержащей указанную чужеродную ДНК, при этом указанная чужеродная ДНК включает подвергающуюся отбору последовательность ДНК, при этом упомянутая последовательность функционирует в способной к регенерации ткани как средство отбора;

(c) через промежуток времени, составляющий приблизительно от одного до 60 дней, после стадии (b), помещение указанной способной к регенерации ткани со стадии (b) в среду, способствующую продуцированию побегов из указанной ткани, при этом указанная среда дополнительно содержит соединение, использующееся для отбора способной к регенерации ткани, содержащей указанную подвергающуюся отбору последовательность ДНК, для того, чтобы сделать возможной идентификацию или селекцию трансформированной регенерируемой ткани;

(d) после образования по меньшей мере одного побега из подлежащей отбору ткани со стадии (с), перенос указанного побега во вторую среду, способствующую продуцированию корней из указанного побега для получения проростка, при этом вторая среда необязательно содержит упомянутое соединение; и

(e) выращивания указанного проростка в способное к воспроизведению трансгенное растение, при этом чужеродная ДНК передается потомству растения по менделевскому типу, при этом между стадией (b) и стадией (с) существует необязательная стадия, включающая помещение трансформированного материала на среду, продуцирующую каллюс, при этом чужеродная ДНК представляет собой или подлежащая отбору последовательность ДНК, содержащаяся в чужеродной ДНК, включает полинуклеотид по любому из пп.1-31, или вектор по п.32, и указанное соединение представляет собой глифосат или его соль.

51. Способ по п.50, отличающийся тем, что растение является однодольным растением, выбранным из группы, состоящей из банана, пшеницы, риса, кукурузы и ячменя.

52. Способ по любому из п.50 или 51, отличающийся тем, что указанную способную к регенерации ткань выбирают из группы, состоящей из зародышевых каллюсов, соматических зародышей, незрелых зародышей и т.п.