CN112313338A - 重组基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于改善除草剂、细菌和真菌抗性以及提供增强的农艺性状的重组基因，该重组基因的特征在于包含具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的第一EPSPS基因和具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的第二EPSPS基因的核酸，其中重组基因与具有SEQ ID No.3的氨基酸序列的编码转录因子的基因融合。
Description
技术领域
本发明总体上涉及重组DNA技术。具体地，本发明涉及重组基因和已经使用该重组基因转化的植物，使得该植物具有除草剂、细菌和真菌抗性以及增强的农艺性状。
背景技术
水稻是世界上主要的粮食作物之一，其中水稻主要由亚洲人消费，但在世界其他地区也很著名。因此，重要的是保持水稻的生长和收获，以养活世界各地的人们。然而，为了保持生长和收获，研究人员和科学家必须面对许多挑战。显著的挑战之一是不断增长的人口，这增加了对水稻的需求。水稻生产者和农民必须确保作物充分生长，以便能够足够养活世界各地的人们。多年来，为了应对主要由生物和非生物因素引起的产量增长的下降而引起的挑战，已经进行了许多研究和实验，并且发表了无数的文献和论文。
生物因素包括害虫和昆虫的侵袭，例如食根虫(root feeder)、蛀茎虫、叶蝉和飞虱、食叶虫和吸谷虫，以及病害如鞘枯萎病、细菌性枯萎病和稻瘟病菌的侵袭。另一个常见的生物因素是杂草，它们破坏阳光、水和养分的吸收，从而杀死水稻植物。杂草的类型包括禾草类、莎草类和阔叶杂草。另一方面，非生物因素包括盐度、气候变化、养分和矿物质利用率、重金属和污染物的存在等。在本文提到的非生物因素中，盐度和气候变化这两个因素似乎是导致产量增长的下降的主要原因。这主要是因为水稻植物在温带和亚热带气候下生长，并且对盐敏感。因此，如果土壤和水的盐度发生剧烈变化，环境温度急剧上升或下降，将有可能且容易杀死水稻植物。
已经采取了各种方法和措施来应对这些挑战，例如施用肥料来提高水稻植物对病害的免疫力、施用除草剂来防止杂草生长、施用杀虫剂或农药来防止昆虫和害虫的侵袭以及控制土壤和水的盐度的常规方法。然而，这些方法具有其各自的缺点。例如，农药和除草剂中的化学物质可能会损害或甚至更严重，杀死水稻植物，同时发挥其应有的作用。
除利用常规方法外，应对这些挑战的另一种方法是通过实施重组DNA技术来生产转基因植物。该技术可以融合具有有利或良好性状的遗传物质，例如对除草剂、杂草、昆虫和害虫的抵抗力，对极端天气的抵抗力，营养和免疫特性的改善等，从而生产出具有这些“新”特征的植物，这不在物种中自然发生。许多现有文献已经公开了这种技术的使用，并且已经产生不同类型的转基因植物，例如玉米、大豆、甜菜等。
为了具有更好的性状，水稻植物还被基因修饰，从而提高产量以满足全球需求。现有技术文献已经公开了转基因水稻植物，产生多核苷酸的方法以及多核苷酸在这些转基因水稻植物的生长中的用途，下文对此进行了讨论。
美国专利号9,605,271 B2涉及已被转化以具有抗病性和可接受的农艺性状的植物。本专利文献公开了转基因水稻植物包含WRKY45基因，其中WRKY45基因与感染响应性启动子和翻译增强子可操作地连接。具体地，该文献描述了转基因植物能够抵抗稻瘟病菌和细菌性叶枯病。该文献还指出，与那些天然植物相比，农艺性状得以保持或改善。然而，实验和结果仅表明与对照植物相比，转基因植物的农艺性状降低或保持相同。
美国专利号9,434,958 B2涉及使用核酸构建体来生产具有复杂的抗病性和优异的农艺性状的水稻系，所述核酸构建体包含编码具有改善单子叶植物的抗病性功能的单子叶植物衍生蛋白的多核苷酸和具有调节多核苷酸的表达功能的启动子。该文献描述了OsUbi1、eEF1α或OsUbi7基因用作启动子。该文献还公开了水稻品系用于产生具有抗病性和良好农艺性状的转基因水稻植物的用途。尽管在抗稻瘟病菌和细菌性叶枯病方面取得了积极成果，但就农艺性状而言，结果并非完全是积极的。特别地，根据有效分蘖数，从POsUbi7启动子过表达OsWRKY45的水稻植株仅显示出比其他两个启动子更好的结果，而仅比日本晴(Nipponbare)稍好的结果。
除现有技术文献中公开的问题外，因此，本发明需要提供一种重组基因，以产生具有改善的除草剂、细菌和真菌抗性以及增强的农艺性状如产量和株高增加的转基因植物。
发明内容
本发明公开了一种重组基因，其特征在于包含具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的第一EPSPS基因和具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的第二EPSPS基因的核酸，其与具有SEQID No.3的氨基酸序列的编码转录因子的基因融合。特别地，第一EPSPS基因是从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CP4获得的，第二EPSPS基因是从水稻(Oryza sativa)获得的，并且编码转录因子的基因是水稻WRKY45。
本发明的目的是提供一种具有除草剂、细菌和真菌抗性以及增强的农艺性状的重组基因。
本发明的另一个目的是提供一种重组基因，其被导入载体中以产生用于转基因植物的生长的宿主细胞。
本发明的另外的目的是提供一种重组基因，其被导入载体中以产生用于转基因植物的生长的水稻植物细胞。
本发明的目的仍然是提供一种重组基因，其具有对白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)(Xoo)的细菌抗性。
本发明的又一个目的是提供一种重组基因，其具有对稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的真菌抗性。
本发明的另一个目的是提供一种重组基因，其具有增强的农艺性状，例如产量和株高。
本发明的又一个目的是提供一种具有除草剂、细菌和真菌抗性以及增强的农艺性状的重组基因。
附图说明
现在将参考附图描述本发明，其中：
图1A和图1B说明了萌发过程，其中种子在具有潮霉素的棉花球上萌发。
图2A是表格，其在表格中列出了在每个转基因水稻植物的全部分蘖上带有种子的穗的百分比，图2B是表格，其在表格中列出了在每个转基因水稻植物中长穗的百分比，并且图2C是表格，其在表格中列出了从每个转基因水稻植物采集的种子的重量。
图3A和图3B示出了转基因水稻植物的穗的测量。
图4示出了转基因水稻植物生长的分蘖的数量。
图5示出了转基因水稻植物的外观。
图6A和图6B示出了重组基因的序列。
具体实施方式
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用各种实施方式。特定装置、技术和应用程序的描述仅作为实例提供。对本文描述的实例的各种修改对于本领域普通技术人员将是显而易见的，并且在不脱离各种实施方式的范围的情况下，本文中定义的一般原理可以应用于其他实例和应用。因此，各种实施方式不旨在限于本文描述和示出的实例，而是与符合权利要求的范围相一致。
如前所述，水稻是最重要的农作物之一，为了满足世界人口增长的需求，有必要保持或增加水稻的生长。然而，水稻不是在任何条件下都可以轻易在任何地方生长的植物，水稻植物必须克服许多不同类型的生物和非生物胁迫，以使其健康生长并产生更高的产量。
通常，植物的生长受激素调节，并且已知许多用于调节植物生长的激素，例如水杨酸(SA)、油菜素甾醇(BR)、茉莉酮酸酯(JA)、乙烯(ET)、赤霉酸(GA)、脱落酸(ABA)和生长素(AU)。特别地，SA是酚类植物激素，其在调节和介导植物的生长中起作用，并且在信号传导和介导植物对病原体的防御中具有能力。还以其调节信号介导植物对其他非生物胁迫(例如干旱、环境温度的急剧升高或降低、重金属耐受性和渗透胁迫)的响应而闻名。
已经进行了各种研究并发表了综述，解释植物合成这些激素的复杂共混物是为了激活一组独特的防御相关基因来对抗病原体。SA和JA途径经常与其他植物激素途径(包括ABA、GA、BR和AU途径)相互作用，形成大型网络，该网络共同调节生长和免疫之间的权衡(Denance等人，2013；Wang等人，2007)。水稻通常合成高水平的SA，而SA在病原体侵袭期间不会发生明显变化(Silverman等人，1995)。然而，外源施用SA或其功能类似物(苯并噻二唑，BTH)将诱导对具有不同生命周期和感染策略的多种病原体的防御反应(Iwai等人，2007；Shimono等人，2007)。因此，基于现有的研究，我们认为水稻中防御信号转导是由SA信号而非SA合成介导的。
水稻中的SA信号传导途径由两个子途径组成，已知这两个子途径已经受到WRKY45和OsNPR1的调控。几种化学诱导剂，其也称为植物激活剂，如BTH，通过作用于SA信号传导途径来保护植物免受疾病侵袭。此外，SA功能类似物BTH会上调一些致病相关(PR)基因和转录因子(TF)基因，例如OsWRKY62、OsNAC4和OsHSF1，并依赖WRKY45(Nakayama等人，2013)。据报道，过表达OsNPR1(OsNPR1-OX)的转基因水稻植物显示出强烈受抑制的生长和发育，具有对水稻细菌性枯萎病菌白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)(Xoo)的增强的抗性(Li等人，2016)。此外，OsWRKY45也是BTH诱导的水稻特异性转录因子。WRKY45的过表达显示出对由真菌稻瘟病菌菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病菌和由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)(Xoo)引起的细菌性叶枯病的极端抗性，它们是两种主要的水稻病(Takatsuji，2014)。然而，许多报告和评论表明，WRKY45的过表达导致植物生长的缺陷和适应成本(Shimono等人，2007；Goto等人，2015；Tao等人，2011)。因此，为了优化WRKY45的表达，研究进一步分析了利用水稻启动子的缺陷。因此，基于研究和报道，认为WRKY45的过表达的优化可能获得缺陷的控制和可能的植物生长增强。
除生长和抗病性外，抗除草剂也是一种非生物胁迫，其影响水稻植物的生长、发育和产量。除草剂(包括甘氨酸和草甘膦)抑制植物中莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶。重要的是要理解植物中的莽草酸途径产生支持植物生长的芳香酸、木质素、类黄酮、酚类和其他次生代谢产物(Shah等人，1986；Franz等人，1997)。该途径的抑制导致芳香族氨基酸(尤其是植物中的蛋白质合成)和吲哚-3-乙酸(IAA)的产生减少(Muller等人，1998)，其最终导致植物死亡(Funke等人，2006)。鉴于这些关于EPSPS的公知的事实，主要针对水稻的除草剂抗性进行了研究，而不是其他物理性状。很少或甚至不知道EPSPS的表达是否影响水稻植物的生长、竞争能力、产量和寿命。相反，调查研究仅集中于该基因在除草剂抗性中的能力。
以前有报道说，过表达水稻EPSPS基因的转基因稻草杂交种在不暴露于草甘膦的情况下表现出非常强劲并且一致的植物生长和繁殖力的提高(Wang等人，2014)。然而，在一封给New Phycologist的编辑者的信中提出对该报告的异议，因为据认为缺乏证据证明水稻EPSPS转基因赋予草甘膦抗性，或者转基因杂草稻比其野生型更具竞争性配合(Gressel等人，2014)。尽管据称转基因稻草杂草具有草甘膦抗性，但作者未提供有关序列修饰或其针对草甘膦的蛋白质产物Km或Ki的信息。此外，没有关于转基因水稻与亲本品种的数据(Gressel等人，2014)。此外，缺乏有关转基因的分子数据和缺乏通过经修饰的EPSPS基因赋予栽培水稻的产量增加幅度的数据，需要它们作为比较其赋予杂草稻产量增加的基线。从这是否与其中作物的产量增加渗入相关杂草中的其他情况类似的角度来看，这将把数据放在杂草稻繁殖力增加上。许多研究表明，作物中的内源基因提高了相关杂草的生长速度和/或繁殖力，与杂草一起可以使农作物进行异花授粉(Ellstrand，2003)。在将增产性状引入作物时，它们就可以快速渗入相关的侵染杂草(Arrigo等人，2011；Perez-Jones等人，2006；Rehman等人，2006；Weissmann等人，2005)。因此，水稻杂草杂交种的生长增强和繁殖力增加可能是由水稻中其他提高产量的基因而非修饰的水稻EPSPS转基因引起的。
由于上述问题，因此需要提供一种重组基因，其具有改善的除草剂、细菌和真菌抗性以及水稻植物的增强的农艺性状。因此，本发明公开了一种重组基因，其具有包含具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的第一EPSPS基因和具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的第二EPSPS基因的核酸，其中该重组基因与具有SEQ ID No.3的氨基酸序列的编码转录因子的基因融合。本发明强调重组基因改善除草剂、细菌和真菌抗性并具有增强的农艺性状。
在本发明的一个实施方式中，第一EPSPS基因获自具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)CP4，并且第二EPSPS基因获自具有SEQ IDNo.2的氨基酸序列的水稻(Oryza sativa)。然后，将重组基因与具有SEQ ID No.3的氨基酸序列的编码WRKY45的转录因子的水稻(Oryza sativa)基因融合。在图6A和图6B中示出序列。使用本领域技术人员通常已知的方法来合成和制备根癌农杆菌CP4 EPSPS和水稻EPSPS以及水稻WRKY45的片段。然后使用重叠PCR技术将这些片段与其他片段(例如一系列启动子和终止子)连接起来以形成完整的目标基因。
通常，启动子有助于开始特定基因的转录，而终止子有助于结束和标记特定基因的转录结束。前面已经讨论过，启动子和终止子影响基因的过表达，其将影响植物的生长条件。因此，本发明的目的是优化用于获得具有增强的物理性状的植物的启动子以及终止子的类型。在本发明的一个实施方式中，第一EPSPS基因的表达由至少一个启动子调节，并且该启动子优选是玉米(Zea mays)泛素启动子。在本发明的另一个实施方式中，第二EPSPS基因的表达以及编码转录因子的基因也由至少一个启动子调节，并且该启动子优选是单独的CaMV 35s启动子。
为了确定重组基因的有效性，必须使用重组基因产生转基因植物。在本发明的另外的实施方式中，将重组基因克隆到载体中，优选克隆到pCAMBIA1301 T-DNA的Acc65I和PmlI位点。然后将载体传播到宿主细胞中。根据本发明，宿主细胞优选是植物细胞，并且该植物细胞可以选自田间作物、水果和蔬菜。更特别地，植物细胞可以选自谷物，例如玉米、水稻、小麦、大麦、高粱，小米、燕麦等。它还可以选自其他田间作物，例如大豆、棉花、甜菜、油菜等。在本发明的优选实施方式中，植物细胞优选获自水稻植物。本发明中使用的植物细胞的类型不应限于本文提及的那些。将载体繁殖到植物细胞中的方法可包括但不限于以下方法：(i)用多核苷酸涂覆的颗粒的材料的基因枪轰击；(ii)通过刺穿涂覆有包含多核苷酸的溶液的材料或碳化硅纤维；(iii)通过将多核苷酸或载体引入土壤杆菌(Agrobacterium)中并将如此转化的土壤杆菌与植物材料共培养，从而将其转化和再生。在本发明的更优选的实施方式中，将载体引入商业化的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中。然后使培养物生长以获得具有本发明目的基因的繁殖体或种子，然后将其生长成转基因植物。产生载体、宿主细胞和转基因植物的过程被认为是本领域技术人员应熟悉的常规实验室程序。因此，本文所提及的方法不应受到限制，因为它们可能需要根据具体情况进行修改。
在图6A和图6B中示出整个重组基因的序列。如前所述，重组基因是从基因的组合中合成的，并且也在图6A和图6B中识别和示出这些基因的序列。为了便于参考，对基因的序列进行编号，并将其列表附加在下面：
SEQ.ID NO.1–根癌农杆菌菌株CP4 EPSPS基因
SEQ.ID NO.2–水稻EPSPS基因
SEQ.ID NO.3–水稻WRKY45基因
SEQ.ID NO.4–CaMv多聚A信号
SEQ.ID NO.5–潮霉素
SEQ.ID NO.6–CaMv35s启动子，重复的
SEQ.ID NO.7–玉米(Zea mays)泛素启动子
SEQ.ID NO.8–Nos(胭脂碱合酶)3’UTR(多聚A信号)
SEQ.ID NO.9–CaMV 35s启动子
SEQ.ID NO.10–Nos(胭脂碱合酶)3’UTR(多聚A信号)
具体地，转基因植物的生长经历萌发过程，其中种子首先在具有潮霉素的棉花球上萌发。萌发过程包括多个步骤，并且当种皮破裂并且从种子上发现根时，认为萌发过程完成。因此，假定已经成功萌发的种子可以生长并成为具有重组基因以及必需特性的转基因植物。图1A和图1B示出了种子萌发的萌发过程。在萌发之前，必须将种子在水中浸泡两天。之后，让种子在装有湿棉花球或纸的容器中萌发。潮湿的棉花球含有约30mg/L的潮霉素B，潮霉素的存在有助于筛选转基因种子。约7天后，将具有嫩枝和根的萌发的种子转移至土壤中进行进一步培养。所有程序均在室温下，在BSL2转基因温室中在正常白天和夜晚循环中进行。对于本领域技术人员来说显而易见的是，本文提到的程序被认为是一般实验室程序。可以对这些程序进行修改，以使其符合所使用的特定类型的植物所要求的条件。
农民和研究人员在增强水稻植物生长和增加水稻产量的任务中，强调并监测了一系列农艺性状。在本发明中，发明人集中于特定的农艺性状，例如转基因植物的产量和株高。通过记录转基因植物的物理特性来监测转基因植物的生长。在本发明的实施方式中，记录的物理特性包括分蘖数、穗数、无穗分蘖数、无种子穗数、有种子穗数、植物的长、中、短穗数以及种子的重量。
图2A是表格，其在表格中列出了在每个转基因水稻植物的全部分蘖中带有种子的穗的百分比。参照图2A，每株植物的平均分蘖数为45.5，并且每个植物的平均穗数为41.13。可以看出，在这些分蘖和穗中，仅约4个分蘖生长而没有任何穗，并且约8个穗生长而没有任何种子。此外，图2A显示，带有种子的穗在分蘖总数中的平均百分比为72.89％。还应注意，在正在生长的8个转基因植物中，其中一个转基因植物(即T1/7)在分蘖总数中具有种子的穗的百分比最高，其为83.33％。在这方面，重要的是要有较高的百分比，因为该百分比决定了水稻的产量。因此，百分比越高，植物的穗包含的种子越多，最终有助于水稻的产量。图4示出了水稻植物，其在底部被切开以显示水稻植物中生长的分蘖。
图2B所示的另一个农艺性状是转基因植物中生长的穗的长度，这有助于株高。图2B显示，每个植物具有平均为63.38％的长穗。还应注意，在正在生长的8个转基因植物中，转基因植物T1/7在其植物中的长穗百分比最高，其为72.73％。植物获得的穗越长，植物越高并且它拥有的种子越多，从而增加了植物的产量。图3A和图3B示出了从转基因植物获得的穗的长度，其中两个穗都超过25cm。因此，对于转基因植物而言重要的是不仅要具有大量的分蘖和穗，并且还要具有较高的植物且具有更长的穗长度。
正在监测和记录的另一个物理性状是种子的重量。在本发明中，以克为单位记录每1000粒种子的重量。图2C中记录的平均重量为24.725g，并且记录的最重的重量也来自转基因植物T1/7。种子的重量表明，穗可容纳水稻种子，而不是空稻壳。因此，种子越重，稻壳中所含的米越多，从而增加了水稻的产量。
附图的图5示出了转基因植物的外观。如图5所示，转基因植物高而细长，它们的大部分叶子直立，而在植物底部的少量叶片则向地面弯曲。原始和普通的水稻植物又高又细长。然而，它们的叶子多半弯曲，包括穗。这也是农民总是种出彼此分开的水稻植物的原因之一。水稻植物之间的空间为弯曲的叶片和穗提供了生存空间，避免了过度拥挤而导致水稻植物死亡。弯曲的穗主要是由于成熟的种子引起的，成熟种子的重量最终使穗向下弯曲。也存在一些情况，其中穗太弱而无法容纳种子的重量，最终跌倒并掉到地上。倒在地上的成熟种子将是浪费，最终降低了水稻的产量。弯曲的叶和穗也阻挡了从植物底部新生长的叶片的阳光，从而阻碍了水稻植物的生长。
与这些水稻植物不同，从本发明获得的转基因水稻植物不需要种植具有宽间距的转基因水稻植物，因为叶和穗直立生长。因此，这允许农民在特定空间内安排和种植更多的水稻植物。此外，直立的叶子结构使阳光直射到植物的底部，使植物底部的叶子得以生长。与普通和原始水稻植物相比，从转基因水稻植物生长的穗似乎也更强壮。有了更强的穗，长在其上的种子就不会轻易弯曲并掉落在地上，而是它们可以被完全收获。
除农艺性状外，本发明中公开的重组基因产生对除草、细菌和真菌具有抗性的转基因水稻植物。特别地是，转基因植物对细菌-白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)(Xoo)和真菌–稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的生长具有抗性。有多种方法可以检查转基因植物对除草剂的抗性，即使用种子或植物进行温室盆栽试验、培养皿测定、分子试验或放射性标记的实验室试验。在本发明的优选实施方式中，草甘膦已用于检查转基因植物的除草剂抗性。在检查中，以2.8L/ha的草甘膦喷洒转基因植物三周时间。此后，检查转基因植物的状况以确定在用草甘膦喷洒两周时间后它们是否能够存活。从实验中可以看出，转基因植物在施用草甘膦后能存活下来，而转基因植物没有明显变化。相反，喷洒草甘膦的未转化的水稻在两到三天后开始枯萎并死亡。在首次施用草甘膦后，再次用草甘膦喷洒转基因植物和未转化的水稻植物。在第二次施用时，转基因植物再次未显示出枯萎或死亡的迹象。将转基因植物保持在温室中以进一步生长。因此从实验得出结论，转基因植物对除草剂具有抗性。
至于细菌抗性，转基因植物应具有对细菌-白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)(Xoo)的抗性，因为转基因植物包含一种水稻(Oryza sativa)WRKY45的基因，众所周知该基因具有这种抗性。通常，水稻植物中的细菌性叶枯病的收缩会引起幼苗的枯萎、叶片变黄和干燥，最终导致植物死亡。该病偏好25至34℃的温度，和高于70％的相对湿度。细菌性叶枯病很容易在两到三周时间内杀死受感染的幼苗。成年植物可能能够存活，这取决于感染的强度，但是它肯定会影响水稻的产量和质量。已知许多方法可用于控制和抵抗水稻植物中的细菌性叶枯病，并且它们包括生物和化学控制方法。然而，这些方法不如利用赋予对细菌的抗性的基因的水稻植物的栽培有效。在本发明的优选实施方式之一中，收集细菌性叶枯病感染的叶并切成小块用于接种程序。该程序是一般和通常已知的实验室程序，并且对于技术人员而言应该是显而易见的。接种的转基因植物生长14天的时间，并进行观察。通过确定是否存在幼苗枯萎迹象以及变黄和干燥的叶来观察细菌性叶枯病的严重性。观察到大多数转基因植物都没有这种迹象。将植物保持在温室中以备进一步观察。因此，通过这可以得出结论，转基因植物对细菌-白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)(Xoo)具有抗性。
真菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)可引起水稻植物的稻瘟病菌，其影响水稻的几乎所有部分，即叶、根颈、节、颈、穗的部分，甚至是叶鞘，除了植物的根部之外。没有其中真菌在何时何地侵袭的特定的生长阶段，认为在水稻植物的所有生长阶段都侵袭。可以观察到真菌侵袭的收缩以及诸如病变和斑点的症状。随着时间的流逝，如果没有适当的处理，这些病变可能扩大并一起生长，杀死被感染的叶或植物的一部分。认为，严重的感染可能杀死水稻植株并造成产量损失。为了避免和预防此类真菌感染，应采取预防措施，例如使用无病种子和平衡营养率的方式燃烧先前感染过的稻草和秸秆。然而，研究表明，这些并不是控制和预防此类真菌侵袭的最有效方法。相反，最好的预防措施是利用和种植具有抗性性状的水稻。在本发明的优选实施方式之一中，收集真菌感染的叶并切成小块用于接种程序。该程序是一般和通常已知的实验室程序，并且对于技术人员而言应该是显而易见的。接种的转基因植物生长14天的时间，并进行观察。通过确定整个植物上是否有病变迹象可以观察到细菌性叶枯病的严重程度。观察到大多数转基因植物都没有这种迹象。将植物保持在温室中以备进一步观察。因此，通过这可以得出结论，转基因植物对真菌-稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)具有抗性。
除上述外，对于技术人员来说显而易见的应该是，选择任何实验来检查转基因植物的除草剂、细菌和真菌抗性。实验步骤和程序不限于上述，并且它们可以根据需要不同植物的需要进行修改。
尽管上面仅详细描述了某些示例性实施方式，但是本领域技术人员将容易理解，在实质上不脱离本发明的新颖教导和优点的情况下，可以对示例性实施方式进行许多修改。另外，上述公开的实施方式的方面可以其他组合方式进行组合以形成另外的实施方式。因此，所有这样的修改意在包括在本发明的范围内。
Claims (17)
1.用于改善除草剂、细菌和真菌抗性以及提供增强的农艺性状的重组基因，所述重组基因的特征在于包含具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的第一EPSPS基因和具有SEQ ID No.2的氨基酸序列的第二EPSPS基因的核酸，其中所述重组基因与具有SEQ ID No.3的氨基酸序列的编码转录因子的基因融合。
2.根据权利要求1所述的重组基因，其中所述第一EPSPS基因获自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4。
3.根据权利要求1所述的重组基因，其中所述第二EPSPS基因获自水稻(Oryzasativa)。
4.根据权利要求1所述的重组基因，其中所述编码转录因子的基因是水稻WRKY45。
5.根据权利要求1所述的重组基因，其中所述第一EPSPS基因的表达至少由启动子调节。
6.根据权利要求5所述的重组基因，其中所述第一EPSPS基因的表达优选地由玉米(Zeamays)泛素启动子调节。
7.根据权利要求1所述的重组基因，其中所述第二EPSPS基因和编码所述转录因子的基因的表达至少由启动子调节。
8.根据权利要求7所述的重组基因，其中所述第二EPSPS基因和编码所述转录因子的基因的表达优选地由单独的CaMV 35s启动子调节。
9.根据权利要求1所述的重组基因，其中所述细菌抗性包括抵抗白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)(Xoo)的生长。
10.根据权利要求1所述的重组基因，其中所述真菌抗性包括抵抗稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的生长。
11.根据权利要求1所述的重组基因，其中所述农艺性状选自植物产量和植物株高中的任一种或组合。
12.一种包含权利要求1所述的重组基因的载体。
13.一种包含权利要求12所述的载体的宿主细胞。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述植物细胞选自玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、大豆、棉花、甜菜和油菜。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述植物细胞优选为水稻植物。
17.一种包含权利要求13所述的宿主细胞的转基因植物。
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