RU1791449C - Способ культивировани штамма BacILLUS аUтRасIS - Google Patents

Abstract

Использование: микробиологическа  промышленность, производство вакцин. Сущность изобретени : штамм бактерий Bac.antracls 55-ВНИИВВиМ выращивают на водной питательной среде, содержащей {на 1 л) : кислотный гидролизат гов жьего м са 60-80 мл; аммоний сернокислый 1,5- 2,5 г; калий фосфорнокислый двузамещен- ный 3,0-12,0 г; натрий лимоннокислый 0,8-1,2 г; магний сернокислый 0,15-0,25 г; полипропиленгликоль 0,08-0,12 мл, в течение 46-50 ч при аэрации, при этом первые 27-29 ч скорость растворени  кислорода в среде поддерживают 3,5 ±0,2 ммоль на 1 л среды в 1 ч.

Description

ё

Изобретение относитс  к микробиологии , в частности к биотехнологии вакцинных препаратов, и может быть использовано при изготовлении вакцин.

В насто щее врем  в СССР примен ют две живые споровые вакцины против сибирской  звы: вакцину из штамма 55-ВНИИВ- ВиМ и вакцину из штамма СТИ-1.

Известен способ культивировани  возбудител  сибирской  звы в жидкой среде с питательной основной из дрожжевого экстракта . Он позвол ет за 1,5-2 суток получить в реакторе споровый материал дл  изготовлени  вакцины из штамма СТИ-1. Однакоего невозможно применить при производстве биопрепарата из штамма 55- ВНИИВВиМ, т.к. указанный штамм обладает биологическими особенност ми и не образует споры в жидкой дрожжевой среде . Это  вл етс  одной из основных характеристик невозможности получени 

вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ в реакторе по указанному способу.

Вакцину из штамма 55-ВНИИВ-ВиМ изготавливают в 3-литровых бутыл х на карто- фельно-пептонном агаре. Дл  получени  спорового материала на одну серию вакцины необходимо проделать следующие операции: подготовить 200-400 штук 3-литровых бутылей (вымыть их, залить расплавленным агаром, простерилизовать, обкатать , выдержать на стерильность), засе ть эти бутыли матричной расплодкой вакцинного штамма, поставить на инкубирование, из 10-20 бутылей приготовить мазки дл  контрол  спорообразовани , смыть с партии из 200-400 бутылей споровой материал и профильтровать его. На получение спорового материала необходимо 6-7 суток, не счита  времени на подготовку посуды и питательных сред. Все вышеуказанные операции выполн ютс  вручную. Кроме того, в

1

О

5

ю

процессе работы часть стеклопосуды бьетс , а биопрёдпри ти  испытывают трудности в обеспечении специальной стеклопосудой.

Целью изобретени   вл етс  сокращение времени на получение спорового материала .

Это достигаетс  тем, что в известном способе изготовлени  вакцины против сибирской  звы, включающем выращивание микроорганизмов при температуре 36- 37° на питательной среде, культивирование осуществл ют в реакторе с использованием разработанной нами и апробированной жидкости спорул ционно- ростовой среды следующего состава:

кислотный гидролизат

гов жьего м са60-80 мл

аммоний сернокислый

(ГОСТ 3769-78)1,5-2,5 г

калий фосфорнокислый

двузамещенный

(ГОСТ 2493-75)3,0-12,0 г

натрий лимоннокислый

(ТУ 6-09-2248-77)0,8-1,2 г

магний сернокислый (ГОСТ 4523-77)0,15-0,25 г

полипропиленгликоль

(ТУ 6-09-10-1244-77) 0,08-0,12 мл

дистиллированна  вода

(ГОСТ 6709-72)до 1000 мл

рН 7,2 ±0,2.

Другое отличие заключаетс  в иных услови х культивировани ; выращивание провод т в течение 46-50 часов. В первые 27-29 часов культуру штамма аэрируют воздухом путем барботировани  без перемешивани  мешалкой, уровень аэрации составл ет 3,5 0,2 ммоль, растворенного кислорода на 1 л среды в 1 час, затем аэри- рование прекращают и культуру выдерживают 19-21 час до завершени  спорообразовани .

Накопление биомассы завершаетс  через 12 часов после посева. Спуст  27-29 часов 95-100% выросших клеток образуют споры, которые наход тс  на разных стади х созревани . В последующие 19-21 час инкубировани  происход т созревание спор и полный лизис вегетативного материала . На завершающем эта.пе выращивани  культура состоит из зрелых светопреломл - ющих спор, количество которых в 1 мл составл ет 100-300 млн.

Способ получени  спор разработан на 5-литровом ферментере Бромма (фирма ЛКБ, Швеци ) и воспроизведен в 63-литровом реакторе. Указанный способ может быть осуществлен в сосудах дл  культивировани  различного объема, но дл  этого не

обходимо знать массообменные по кислороду характеристики используемых сосудов . Массообмен по кислороду можно определить по сульфитному методу, разработанному Купером и усовершенствованному во ВНИИВВиМ Бакуловым И.А, с соавторами (Тез.докл.научн.-теоре- тич.конф. ВНИИВВиМ 14-16 но бр  1983 г., с.178-180, г.Покров),

Пример1. Определениемассообмена по кислороду в 63-литровом реакторе, выращивание культуры штамма 55-ВНЙИВВиМ и получение спор.

Определение массообменна.

В реактор заливают 39 литров дистиллированной воды, в ней раствор ют порошок сульфита натри  в.количестве 240,0 г. Отдельно в 1 литре дистиллированной воды раствор ют кристаллы сернокислой меди в

количестве 10,0 г. Раствор сернокислой меди заливают в реактор и получают 40 литров смеси растворов с содержанием сульфита натри  6,0 г/л и сернокислой меди 0,25 г/л. Из реактора с помощью шприца объемом 5 мл и присоединенных к нему 2 пипеток с узким канальцем набирают 5 мл раствора {1-  проба до аэрации), которые перенос т в колбу с 70 мл свежеприготовленного 0,01 N раствора йода. В шприце с

пробой не должно быть пузырьков воздуха. Подают сжатый воздух в количестве 0,5 дм /л воды/мин или 20 дм /40 л воды/мин, Фиксируют врем  аэрации,

Оттитровыввают 1-ю пробу (до аэрации)

в растворе йода добавлением 0,01 N раствора гипосульфита натри  до перехода жидкости из коричневого в желтый цвет. Затем добавл ют 3-4 капли 0,5%-ного раствора крахмала. Цвет жидкости становитс  темносиним . Продолжают добавл ть раствор гипосульфита натри  до полного обесцвечивани  жидкости.

Например, на титрование пробы потребовалось 6,2 мл раствора гипосульфита натри .

Шприц с пипетками и колбу дл  титровани  промывают дистиллированной водой, По истечении времени аэрации (30 минут ) воздух отключают, отбирают 2-ю пробу

(аэраци  0,5 дм3/д/мин) и оттитровывают ее так же, как и 1-ю пробу.

Например, на титрование пробы потребовалось 8,6 мл раствора гипосульфита натри .

По формуле определ ют уровень аэрации:

Tt - То х 2.5 ммоль

Вр х 5 мл

х 1 час, где:

где То - количество гипосульфита натри , израсходованного на титрование пробы до аэрации;

TI - после аэрации; Вр - врем  аэрации (час); 5 мл - объем пробы; 2,5 ммоль - один литр 0,01 N раствора гипосульфита св зывает 2,5 ммоль 02. Например

( 8,6 мп -6,2 мл ) х 2.5 ммоль

0,5 часа х 5 мл 2,4 ммоль 02/л/час,

х 1 час

т.е. при подаче 0,5 дм воздуха/л/мин в реакторе создаетс  уровень аэрации,рав- ный 2,4 ммоль 02/л/час.

Сразу после отбора 2-й пробы вновь подают сжатый воздух дл  барботировани  в количестве 1 дм /л/мин. По истечении 30-минутного аэрировани  воздух отключают , отбирают 3-ю пробу (аэрирование 1 дм /л/мин), оттитровывают ее, определ ют уровень аэрации по формуле, причем в этот же раз То будет служить TI из предыдущего расчета.

Например, на титрование 3-й пробы было израсходовано 13 мл раствора гипосульфита натри . Определ ют уровень аэрации:

(13 мл-8.6 мл )х 2.5 ммоль , 0,5 часа 5 мл 4,4 ммоль 02/л/час

1 час

Сразу после отбора 3-й пробы вновь подают сжатый воздух дл  барботировани  в количестве 1,5 дм /л/мин..После 30-минутного аэрировани  воздух отключают, отбирают 4-ю пробу (аэраци  1,5 дм3/л/мин). оттитровывают ее, определ ют по формуле уровень аэрации, причем То будет Ti из предыдущего расчета.

Например, на титрование 4-й пробы было израсходовано 19,6 мл раствора гипосульфита натри . Определ ют уровень аэрации:

(19.6 мл -13 мл ) х 2,5 ммоль1

0,5 часа -5мл час

6,6 ммоль 02/л/час

После каждого отбора пробы и ее титровани  шприц, пипетки и колбу тщательно промывают дистиллированной водой.

Таким образом, получают числовые зна- чени  3-х измерений, которые используют дл  построени  графика.

Полученный график позвол ет определить скорость растворени  кислорода (уровень аэрации) при подаче известного количества воздуха дл  барботировани  среды и, наоборот, количество воздуха, которое потребуетс  дл  создани  необходимого уровн  аэрации,

Выращивание культуры штамма 55- ВНИИВВиМ и получение спор.

В реакторе объемом 63 литра приготавливают 40 литров спорул ционно-ростовой среды по прописи (см.выше). Реактивы раствор ют в той же последовательности, в которой они написаны, Устанавливают рН среды 7,2 ±0,2 добавлением 20%-ного раствора гидроокиси кали . Среду стерилизуют при 121°С в течение 45 минут и охлаждают доЗО-35°С.

В реактор с питательной средой заливают через пробоотборник посевной материал - споровую суспензию штамма 55-ВНИИВВиМвколичестве2-10х1010жиз- неспособных спор, что составл ет 0,5- 2,5x10 спор на 1 мл среды. Весь посевной материал должен содержатьс  в объеме 0,5-2,0 л....

Устанавливают температуру инкубиро- вани  37°С, в питательную среду подают сжатый воздух через барботер в объеме 0.8 дм /л/ среды, что по графику массообмена соответствует уровню аэрации 3,5 ммоль 02/л/час, Культивируют 27 часов. Следующие 21 час культуру инкубируют при той же температуре, но без аэрировани .

Через 27 и 48 часов культивировани  из реактора отбирают пробы культуры, исследуют их на чистоту роста и спорообразова- ние.

Культура вакцинного штамма 55-ВНИ- ИВВиМ, выращенна  в этих услови х, состоит из зрелых жизнеспособных спор, количество которых в 1 мл составл ет 100- 300 млн.

Использование предлагаемого способа получени  споровой формы вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ возбудител  сибирской  звы обеспечивает следующие преимущества:

позвол ет получать в реакторах большие объемы спорового материала дл  изготовлени  вакцины против сибирской  звы:

значительно снижает затраты труда «а изготовление вакцины против сибирской  звы, ликвидирует т желый ручной труд, позвол ет механизировать производственный процесс;

сокращает врем  на получение спорового материала в 3-4 раза.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ культивировани  штамма Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ на пита

   тельной среде,содержащей органиче-кислотный гидролизат

   схий источник азота до максимальногогов жьего м са -60-80 мл;

   образовани  спор, отличающийс аммоний сернокислый - 1,5-2,5 г;

   тем, что, с целью сокращени  времени накалий фосфорнокислый

   получении спорового материала, в среду5 двузамещенный -3,0-12.0 г;

   дополнительно ввод т калий фосфорно-натрий лимоннокислый -0,8-1.2 г;

   кислый двузамещенный, натрий лимон-магний сернокислый -0.15-0,25 г;

   нокислый, магний сернокислый,полипропиленгликоль -0,08-0.12 мл;

   полипропиленгликоль и воду, а в качест-вода- до 1000мл, ве источника азота используют кислот-10 при этом культивирование осуществл ют в

   ный гидролизат гов жьего м са итечение46-50ч, из них первые 27-29 ч при

   аммоний сернокислый, при этом указан-аэрации, поддержива  скорость раствореные компоненты ввод т в следующем со-ни  кислорода в среде 3,5+0,2 ммоль на 1 л

   отношении:среды в 1 ч.