RS65719B1

RS65719B1 - Terapija matičnim ćelijama kod patoloških stanja endometrijuma

Info

Publication number: RS65719B1
Application number: RS20240690A
Authority: RS
Inventors: Carlos Simon; Javier Santamaría; Antonio Pellicer; Irene Cervello
Original assignee: Asherman Therapy S L
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2024-08-30
Also published as: JP2020138984A; ES2910306T3; JP6920062B2; JP2017522288A; PL3569697T3; EP3158057B1; SMT202200155T1; HRP20191240T1; SI3158057T1; EP3569697B8; ES2736117T3; WO2015193737A1; PL3158057T3; AU2015275798A1; CN107073040A; BR112016029558A2; CY1125938T1; PT3158057T; HUE058328T2; RU2017101147A3

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na upotrebu autolognih CD 133+ matičnih ćelija koštane srži (BMDSC) za pokretanje regeneracije endometrijuma.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Kod žena u reproduktivnoj dobi mogu se razlikovati dva sloja endometrijuma: (i) funkcionalni sloj uz šupljinu materice, i (ii) bazalni sloj, koji se nalazi pored miometrijuma i ispod funkcionalnog sloja. Funkcionalni sloj nastaje nakon završetka menstruacije tokom prvog dela prethodnog menstrualnog ciklusa. Proliferacija je indukovana estrogenom (folikularna faza menstrualnog ciklusa), a kasnije promene u ovom sloju proizvode progesteron iz žutog tela (lutealna faza). Prilagođena je da obezbedi optimalno okruženje za implantaciju i rast embriona. Ovaj sloj se potpuno isprazni tokom menstruacije. Nasuprot tome, bazalni sloj se ne ispušta u bilo koje vreme tokom menstrualnog ciklusa. Regeneracija humanog endometrijuma pod sistemskim promenama steroida jajnika u svakom menstrualnom ciklusu je od suštinskog značaja za pripremu ovog organa za njegovu glavnu funkciju, tj., razvoj endometrijalnog implantacijskog prozora za postavljanje implantirajućeg blastociste, dozvoljavajući da dođe do trudnoće. Dakle, obnavljanje svih ćelijskih delova funkcionalnog sloja endometrijuma sa svakim menstrualnim ciklusom je neophodno za normalnu reproduktivnu funkciju.

[0003] Ašermanov sindrom (AS) je stanje u kojem dolazi do razaranja endometrijuma uzrokovanog ponovljenim ili agresivnim kiretažama i/ili endometritisom. On stvara obliteraciju šupljine materice sa intrauterinskim adhezijama i odsustvom funkcionalnog endometrijuma u mnogim oblastima. Žene sa ovom bolešću kao i sa atrofičnim endometrijumom (< 4 mm) često se bore sa neplodnošću, menstrualnim nepravilnostima, uključujući amenoreju, hipomenoreju i ponavljajućim gubicima trudnoće. Trenutno ne postoji specifičan tretman za ove endometrijske patologije. Prema tome, ostaje potreba da se razviju sigurne i efikasne terapije za lečenje ovih patologija.

[0004] Nagori Chaitanya B et al., Journal of Human Reproductive Science. 2011, vol. 4 (1): 43-48 opisuje regeneraciju endometrijuma korišc ́enjem autolognih odraslih matičnih c ́elija nakon čega sledi začec ́e in vitro oplodnjom kod pacijenta sa teškim Ašermanovim sindromom.

[0005] Gargett Caroline E et al., Journal of Human Reproductive Science. 2011, vol. 4 (1): 49-52 opisuje stvaranje receptivnog endometrijuma kod Ašermanovog sindroma.

[0006] Feryal Alawadhi et al., PLOS ONE. 2014, Vol. 9 (5): e96662 je opisao da transplantacija matičnih c ́elija iz koštane srži (BMDSC) poboljšava plodnost u mišjem modelu Ašermanovog sindroma.

[0007] Ma N et al., Cardiovascular Research, Oxford University Press. 2006, vol. 71 (1): 158-169 analizira potencijal CD133+ c ́elija dobijenih iz koštane srži i krvi pupčane vrpce u modelu kriopovrede.

SUŠTINA PRONALASKA

[0008] Ovaj pronalazak se odnosi, bar delimično, na otkriće da autologne matične ćelije CD 133+ koštane srži (BMDSC) mogu regenerisati vaskularizaciju koja dovodi do stvaranja autolognog funkcionalnog endometrijuma de novo. Shodno tome, pronalazak obezbeđuje metode za indukciju regeneracije endometrijuma. Metod može da obuhvata primenu efikasne količine autolognih CD 133+ matičnih c ́elija dobijenih iz koštane srži (BMDSC) u uteralne arterije subjekta kome je to potrebno da bi se indukovala regeneracija endometrijuma.

[0009] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovane autologne CD133+ matične c ́elije dobijene iz koštane srži (BMDSC) za upotrebu u izazivanju regeneracije endometrijuma kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu se izolovani CD133+ BMDSC primenjuje u uteralne arterije subjekta i pri čemu se subjekt ima atrofiju endometrijuma koja je otporna na hormonski tretman.

[0010] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovane autologne CD133+ matične c ́elije izvedene iz koštane srži (BMDSC) za upotrebu u lečenju Ašermanovog sindroma ili atrofije endometrijuma kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu se izolovani CD 133+ BMDSC primenjuje u uteralne arterije subjekta i pri čemu subjekt ima atrofiju endometrijuma koja je otporna na hormonski tretman.

[0011] Poznato je da subjekt ima Ašermanov sindrom ili atrofiju endometrijuma. Subjekt ima atrofiju endometrijuma koja je otporna na hormonski tretman. U nekim realizacijama, subjekt je imao jedan ili više prethodnih neuspeha implantacije embriona. U nekim realizacijama, autologni CD133+ BMDSC se pripremaju davanjem subjektu agensa za mobilizaciju BMDSC iz koštane srži u perifernu krv subjekta; i izolovanje CD 133+ BMDSC iz periferne krvi subjekta. U nekim realizacijama, agens za mobilizaciju BMDSC je faktor koji stimuliše koloniju granulocita (G-CSF). U nekim realizacijama, autologni CD 133+ BMDSC je izolovan iz periferne cirkulacije subjekta aferezom korišc ́enjem anti-CD 133 antitela. U nekim realizacijama, CD 133+ BMDSC se administriraju u uteralne arterije kroz kateter. U nekim realizacijama, CD 133+ BMDSC se primenjuje u spiralne arteriole materice subjekta.

[0012] Neki aspekti obelodanjivanja obezbeđuju postupak za pokretanje regeneracije endometrija, postupak koji obuhvata izolovanje matičnih ćelija iz autologne CD 133+ koštane srži (BMDSC) od ispitanika kome je to potrebno; i davanje efikasne količine izolovanog CD 133+ BMDSC u arterije materice ispitanika da bi se pokrenula regeneracija endometrijuma.

[0013] U nekim otelotvorenjima, granulocitni faktor stimulacije kolonije (G-CSF) se daje ispitaniku pre izolovanja autologne BMDSC. U nekim otelotvorenjima, autologni CD 133+ BMDSC su izolovani iz perifernog krvotoka ispitanika putem afereze koristeći anti-CD133 antitelo. U nekim otelotvorenjima, CD 133+ BMDSC se daje u arterije materice preko katetera. U nekim otelotvorenjima, CD 133+ BMDSC se daje u spiralne arteriole materice ispitanika. U nekim otelotvorenjima, ispitanik je imao jedan ili više prethodnih neuspeha implantacije embriona.

[0014] Svako od ograničenja pronalaska može da obuhvati različite realizacije pronalaska. Stoga se predviđa da svako od ograničenja pronalaska koje uključuje bilo koji element ili kombinacije elemenata može biti uključeno u svaki aspekt pronalaska. Ovaj pronalazak nije ograničen na detalje konstrukcije i raspored komponenti date u sledec ́em opisu ili ilustrovane na crtežima. Pronalazak je sposoban za druga izvođenja i da se praktikuje ili sprovodi na različite načine. Takođe, frazeologija i terminologija korišc ́ena ovde služe za opis i ne treba ih smatrati ograničavajuc ́im. Upotreba izraza „uključuje“, „sadrži“ ili „obuhvata“, „ima“, „uključuje“ i njihove varijacije ovde, treba da obuhvati stavke koje su navedene kasnije i njihove ekvivalente, kao i dodatne stavke.

KRATAK OPIS SLIKA

[0015]

Sl. 1 je šematski prikaz ispitivanja (A) i vremenske linije (B) događaja prikazanih na Sl. 1A.

Sl. 2 je angiografija koja pokazuje put sonde iz arterija materice kroz spiralne arteriole gde su CD 133+ ćelije locirane kroz ne-invazivnu radiologiju.

Sl. 3 pokazuje histeroskopiju šupljine materice od jednog pacijenta sa atrofičnim endometrijumom pre, 3-6 i 9 meseci posle autolognog BMSC tretmana.

Sl. 4 pokazuje debljinu endometrijuma kod 6 pacijenata sa atrofičnim endometrijumom/Ašermanovim sindromom uključenim u ovu studiju, pre i 3 meseca nakon autologne BMSC terapije.

Sl. 5 prikazuje srednju SD debljinu endometrijuma pre i 3 meseca posle autolognog BMSC tretmana. Sl. 6 prikazuje 3D ultrazvučne slike koje demonstriraju poboljšanje zapremine endometrijuma dobijeno 3 meseca nakon autologne BMSC terapije u poređenju sa bazalnim statusom pre tretmana.

Sl. 7A-7B prikazuju preoperativne i postoperativne histeroskopske slike. Histeroskopski nalazi kod pacijenata sa Ašermanovim sindromom (Slika 7A) ili atrofijom endometrijuma (Slika 7B) pre terapije matičnim c ́elijama (1. pregled), i 2-3 meseca (2. pregled) i 4-6 meseci (3. pregled) nakon terapije matičnim c ́elijama. Ozbiljnost adhezija endometrijuma je ocenjena prema klasifikaciji Američkog društva za plodnost.

Sl. 8A-8I pokazuju analize tkiva. Imunohistokemijski rezultati za detekciju zrelih krvnih sudova u endometrijumu od pacijenta 7 pre (SL. 8A), 3 meseca (SL. 8B) i 6 meseci (SL. 8C) nakon autologne ćelijske terapije a-sma+, CD31+ pozitivne ćelije identifikuju zrele krvne sudove (20x). Sl. 8D prikazuje humani miometrijum koji se koristi kao pozitivna kontrola za asma bojenje, a humani krajnik koji se koristi kao pozitivna kontrola za CD31 (SL. 8E). Sl. 8F pokazuje negativnu kontrolu koja je rezultat odsustva primarnog antitela. Sl. 8G prikazuje detaljan prikaz posude identifikovane na Sl. 8C (40x). Na SL. 8H, prikazana je dinamika ukupnog broja zrelih krvnih sudova kod 8 pacijenata pre i 3 i 6 meseci nakon ćelijske terapije, što ukazuje na neoangiogeni efekat osetljiv na vreme. Sl. 81 prikazuje statističku analizu srednje ± SEM ukupnih zrelih krvnih sudova pre i 3 i 6 meseci nakon tretmana.

Sl. 9 prikazuje dizajn ispitivanja. Histeroskopsku rekonfirmaciju i ocenjivanje AS ili EA obavio je jedan hirurg u proliferativnoj fazi. Mobilizacija BMDSC je indukovana G-CSF injekcijom, a pet dana kasnije, CD 133+ ćelije su izolovane iz periferne krvi kroz aferezu i odmah ubačene u spiralne arterije interventnom radiologijom. Druga i treća histeroskopija izgleda je izvršena da bi se procenila šupljina materice nakon tretmana matičnim ćelijama. Pacijenti su zatim pozvani da pokušaju da začnu.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0016] Predmetni pronalazak se zasniva, bar delimično, na otkriću novog terapeutskog pristupa za pokretanje regeneracije endometrija korišćenjem autologne terapije matičnim ćelijama. Konkretno, predmetni pronalazak se zasniva na nalazu da autologne matične ćelije CD 133+ koštane srži (BMDSC) mogu regenerisati vaskularizaciju koja dovodi do stvaranja autolognog funkcionalnog endometrijuma de novo. Iako je poznato da je BMDSCs izvor ne-hematopoetskih ćelija u različitim delovima ćelijama endometrijuma (stroma, žlezdani epitel i luminalni epitel), nije poznato koja podpopulacija BMDSCs promoviše popravku endometrijuma. Predmetni pronalazak obezbeđuje sigurne i efikasne terapije zasnovane na c ́elijama za izazivanje regeneracije endometrijuma i lečenje patologija povezanih sa degeneracijom endometrijuma kao što su Ašermanov sindrom i atrofija endometrijuma.

[0017] Ljudska materica se uglavnom sastoji od endometrijuma, a spoljašnji sloj glatkih mišića nazvan je miometrijum. Funkcionalni sloj humanog endometrijuma je visoko regenerativno tkivo koje prolazi mesečne cikluse rasta, diferencijacije i osipanja tokom reproduktivnih godina žene. Fluktuirajući nivoi cirkulišućeg estrogena i progesterona diktiraju ovo dramatično remodeliranje humanog endometrijuma. Regeneracija endometrijuma prati i rađanje i resekciju endometrijuma. Regeneracija endometrijuma iz bazalnog sloja doprinosi zameni funkcionalnog sloja, nakon čega sledi njegovo odlepljivanje tokom menstruacije i porođaja. Međutim, endometrijum može da ne reaguje na estrogen i ne regeneriše se kod određenih patologija, na primer, Ašermanov sindrom i atrofični endometrijum. Takvi ispitanici mogu imati abnormalnu proliferaciju endometrijuma i postati neplodni.

[0018] Ašermanov sindrom (AS) (ili Fričov sindrom) je stanje koje se karakteriše adhezijama i/ili fibrozom endometrija najčešće povezanog sa dilatacijom i kiretažom intrauterinske šupljine. Brojni drugi pojmovi su korišćeni za opisivanje uslova i srodnih uslova, uključujući: intrauterinske adhezije (IUA), atrezija materice/grlića materice, traumatska atrofija materice, sklerotični endometrijum, endometrijska skleroza i intrauterinska sinehija.

[0019] Trauma bazalnog sloja endometrija, na primer, nakon dilatacije i kiretaže (D&C) koja se izvodi nakon pobačaja, ili porođaja, ili za medicinski abortus, može dovesti do razvoja intrauterinskih ožiljaka što rezultira adhezijama koje mogu da izblede materničnu šupljinu do određene mere. U krajnjoj liniji, cela šupljina može biti u ožiljcima i okluzijama. Čak i sa relativno malim brojem ožiljaka, endometrijum možda neće reagovati na estrogen, a ispitanik može imati sekundarne menstrualne nepravilnosti (kao što je amenoreja, hipomenoreja ili oligomenoreja) i postati neplodan. AS takođe može biti rezultat drugih karličnih operacija, uključujući carske rezove, uklanjanje fibroidnih tumora (miomektomija) i drugih uzroka kao što su IUD, ozračenje karlice, šistosomijaza i genitalna tuberkuloza. Hronični endometrioza genitalne tuberkuloze je značajan uzrok teških intrauternih adhezija (IUA) u zemljama u razvoju, što često dovodi do totalne obliteracije šupljine materice koju je teško lečiti.

[0020] Histeroskopija je zlatni standard za dijagnostiku AS. Snimanje putem sonohisterografije ili histerosalpingografije otkriva obim nastanka ožiljka. U zavisnosti od stepena ozbiljnosti, AS može dovesti do neplodnosti, ponovljenih pobačaja, bola od zarobljene krvi i budućih opstetričkih komplikacija. Ako se ne leči, opstrukcija menstrualnog toka koja je rezultat adhezije može dovesti do endometrioze u nekim slučajevima.

[0021] Kod atrofičnog endometrijuma, endometrijum postaje suviše tanak zbog niskog nivoa estrogena. Da bi se smatrala atrofičnom, debljina endometrijuma treba da bude manja od 4 - 5 mm na transvaginalnom ultrazvučnom snimku. Odnos veličine materice i grlića materice će takođe imati tendenciju smanjenja i može se približiti: 1. MRI takođe može pokazati smanjenje debljine endometrijuma slično onome koji je primećen kod ultrazvuka. Faktori koji mogu izazvati atrofiju endometrijuma uključuju produženu oralnu kontracepciju, hipoestrogeno stanje (disfunkcija jajnika) i upotrebu tamoksifena.

[0022] Ovde je opisan postupak za izazivanje regeneracije endometrijuma. Postupak obuhvata davanje efikasne količine autolognih CD 133+ matičnih c ́elija dobijenih iz koštane srži (BMDSC) u uteralne arterije subjekta kome je to potrebno da bi se indukovala regeneracija endometrijuma.

[0023] Metod može da obuhvata izolovanje autolognih CD 133+ matičnih c ́elija dobijenih iz koštane srži (BMDSC) od subjekta kome je to potrebno; i davanje efikasne količine izolovanog CD 133+ BMDSC u uteralne arterije subjekta da bi se indukovala regeneracija endometrijuma.

[0024] Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovane autologne CD133+ matične c ́elije dobijene iz koštane srži (BMDSC) za upotrebu u izazivanju regeneracije endometrijuma kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu se izolovani CD133+ BMDSC primenjuje u uteralne arterije subjekta i pri čemu subjekt ima atrofiju endometrijuma koja je otporna na hormonski tretman.

[0025] Prema drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovane autologne CD133+ matične ćelije dobijene iz koštane srži (BMDSC) za upotrebu u lečenju Ašermanovog sindroma ili atrofije endometrijuma kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu se izolovani CD133+ BMDSC primenjuje u arteriju materice subjekta i pri čemu subjekt ima atrofiju endometrijuma koja je otporna na hormonski tretman.

[0026] Kako se ovde koristi, "ispitanik" uključuje sve sisare, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pse, mačke, konje, ovce, koze, krave, svinje, ljude i primate koji nisu ljudi. U nekim izvođenjima, ispitanik je žena.

[0027] Subjekat kome je potrebna regeneracija endometrijuma je subjekt č iji endometrijum ne uspeva da se regeneriše kao odgovor na estrogen i ima tanku endometrijalnu oblogu. Takvi subjekti često doživljavaju abnormalnu proliferaciju endometrijuma i postaju neplodni. Optimalna debljina sluznice endometrijuma je između 10 i 15 mm, dostižuc ́i maksimalnu debljinu u vreme implantacije oko 21. dana menstrualnog ciklusa žene. U nekim realizacijama, subjekt kome je potreban tretman ima debljinu endometrijuma u vreme implantacije koja je manja od 5 mm, manja od 4 mm, manja od 3 mm, manja od 2 mm ili manja od 1 mm. U nekim realizacijama, subjekt ima menstrualne nepravilnosti koje se karakterišu smanjenjem protoka i trajanjem krvarenja (amenoreja, hipomenoreja ili oligomenoreja) i/ili ponavljajuc ́im gubicima trudnoc ́e. Poznato je da osoba ima Ašermanov sindrom ili atrofiju endometrijuma. Subjekt ima atrofiju endometrijuma koja je otporna na hormonski tretman. U nekim realizacijama, subjekt je imao jedan ili više prethodnih neuspeha implantacije embriona. Pokazalo se da matične c ́elije dobijene iz koštane srži (BMDSC) doprinose kao egzogeni izvor popravljanju tkiva i regeneraciji različitih organa i tkiva. U ljudskom i mišjem endometrijumu, BMDSC su takođe izvor nehematopoetskih c ́elija u različitim c ́elijskim odeljcima endometrijuma (stroma, žlezdani epitel i luminalni epitel). Oni uglavnom doprinose formiranju c ́elija strome endometrijuma i u mnogo manjoj meri endometrijalnih žlezdanih i luminalnih epitelnih odeljaka.

[0028] BMDSCs uključuju hematopoetske matične ćelije (HSC) i mezenhimalne matične ćelije (MSC). Međutim, koja podpopulacija BMDSCs promoviše popravak endometrijuma je nepoznat.

[0029] Pronalazači ovog patenta su po prvi put pokazali kod ljudi sposobnost CD133+ matičnih ćelija izvedenih iz koštane srži dostavljenih u arterije materice preko hirurških i kateternih sistema za isporuku da bi se pokrenula regeneracija endometrija. Autologna cirkulacija CD133+ BMDSC je izolovana nakon prethodne mobilizacije koštane srži i ponovo implantirana u spiralne arteriole materice istog pacijenta. CD133+ BMDSC regeneriše vaskularizaciju koja dovodi do stvaranja autolognog funkcionalnog endometrijuma de novo. CD 133 je glikoprotein koji je takođe poznat kod ljudi i glodara kao Prominin 1 (PROMI). To je protein koji vezuje holesterol u pet transmembrana, koji se lokalizuje na izbočine membrane i često se izražava na odraslim matičnim ćelijama, gde se smatra da funkcioniše u održavanju svojstava matičnih ćelija suzbijanjem diferencijacije.

[0030] CD133<+>BMDSC predmetnog pronalaska može biti izveden iz primarnih matičnih ćelija ili može biti izveden iz uspostavljene linije matičnih ćelija. U nekim realizacijama, matične ćelije mogu biti embrionalne matične ćelije, matične ćelije odraslih, matične ćelije iz pupčane vrpce, somatske matične ćelije, koštane srži ili mobilisane matične ćelije koštane srži. U poželjnim realizacijama, matične ćelije su odrasle matične ćelije.

[0031] U nekim realizacijama, CD133+ BMDSC se pripremaju davanjem ispitaniku sredstva za mobilizaciju BMDSC iz koštane srži u perifernu krv ispitanika; izolovanje CD133<+>BMDSC iz periferne krvi ispitanika. U nekim otelotvorenjima, sredstvo za mobilizaciju matičnih ćelija je izabrano iz grupe koja se sastoji iz faktora za stimulaciju kolonije granulocita (G-CSF), faktora stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga (GM-CSF) i pleriksafor (AMD3100). U nekim realizacijama, sredstvo za mobilizaciju matičnih ćelija je G-CSF.

[0032] U nekim realizacijama, autologni CD133<+>BMDSC su izolovani iz periferne cirkulacije ispitanika procesom koji se naziva afereza korišćenjem anti-CD 133 antitela (videti, na primer, Sovalat H, Scrofani M, Eidenschenk A, Pasquet S, Rimelen V, Henon P. Identifikacija i izolacija iz odrasle humane koštane srži ili G-CSF-mobilizovane periferne krvi CD34(+)/CD133(+)/CXCR4(+)/Lin(-)CD45(-) ćelije, sa morfološkim, molekularnim i fenotipskim karakteristikama vrlo malih embrionalnih (VSEL) matičnih ćelija. Exp Hematol.2011 Apr;39(4):495-505.

[0033] Afereza, koja je dobro poznata u struci, odnosi se na proces ili proceduru u kojoj se krv izvlači iz subjekta donora i razdvaja na njene komponente, od kojih su neke zadržane, kao što su populacije matičnih ćelija, a ostatak vraća transfuzijom kod donatora. Afereza traje duže od celokupnog davanja krvi. Da bi se prikupila krv, potrebno je oko 10-20 minuta, dok donacija afereze može trajati oko 1-2 sata. Proizvod afereze se odnosi na heterogenu populaciju ćelija prikupljenih iz procesa afereze.

[0034] U nekim realizacijama, CD133<+>BMDSC su izolovani iz izolovanog BMDSC upotrebom anti-CD 133 antitela. U nekim realizacijama, CD133<+>BMDSC su odabrani korišćenjem anti-CD133 antitela sve dok CD133<+>BMDSC nisu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.9% ili 100% čist. U nekim realizacijama, CD133<+>BMDSC su najmanje 95%, 98%, 99%, 99.9% ili 100% čisti.

[0035] Davanje CD133<+>BMDSC, ili terapeutskih sastava koji sadrže takve ćelije, ispitaniku kome je to potrebno, može se postići, npr., transplantacijom, implantacijom (npr. samih ćelija ili ćelija kao deo kombinacije matričnih ćelija), injekcija (npr. direktno u arterije materice), infuzija, dostava preko katetera, ili bilo koji drugi način poznat u tehnici za obezbeđivanje ć elijske terapije. U jednom otelotvorenjima, ć elije se dostavljaju intraarterijalnom kateterizacijom. Kateterizaciona procedura materične arterije je široko opisana i upotrebljena u embolizaciji mioma materice (Ravina JH, Herbreteau D, Ciraru-Vigneron N, et al. Arterijska embolizacija za lečenje mioma materice. Lancet 1995;346(8976):671-2, čiji je ceo sadržaj ovde uključen u celini).

[0036] CD133<+>BMDSC su primenjeni u arterijama materice ispitanika. Ove arterije snabdevaju matericu krvlju. U nekim otelotvorenjima, CD 133+ BMDSC se daje u spiralne arteriole materice ispitanika. Spiralne arterije su male arterije koje privremeno dovode krv u endometrijum materice tokom lutealne faze menstrualnog ciklusa. Ove arterije su veoma osetljive na estrogene i progesterone, prodiru u funkcionalni sloj endometrija, rastu i šalju grane u njemu i pokazuju veoma različite i jedinstvene obrasce.

[0027] CD133<+>BMDSC se daju u efektivnoj količini. "Efikasna količina" se odnosi na količinu dovoljnu da izazove željeni biološki odgovor, tj. pokrene regeneraciju endometrijuma. Efikasna količina uključuje onu količinu koja je potrebna za usporavanje, smanjenje, inhibiciju, ublažavanje ili preokretanje jednog ili više simptoma povezanih sa AS ili atrofijom endometrija. U nekim realizacijama, ovi termini se odnose na:

· Ponovni početak menstruacije nakon tretmana matičnim ćelijama CD133<+>BMSC;

· Povećanje debljine endometrijuma; (Debljina endometrija se meri kao dužina od gornje do donje granice miometrijuma u fundusu endometrijumske šupljine. Na primer, povećanje može biti povećanje od 50% od maksimalne debljine ikad dobijene hormonskom zamenskom terapijom (HRT) mereno uzdužnom osi ultrazvuka vagine na dnu materice (vgr od 4 do 6 mm);

· Histeroskopski i histološki dokazi de novo formiranja endometrijuma; i/ili ·Funkcionalnost rekonstruisanog endometrijuma u pogledu stope rađanja, trudnoće i implantacije nakon postavljanja embriona kod ovih pacijenata.

[0038] U nekim realizacijama, najmanje 45 miliona CD133<+>BMDSC je usađeno u ispitanika. U nekim otelotvorenjima, najmanje 50, 55, 60, 65 miliona CD133<+>BMDSC je usađeno u ispitanika.

[0039] Efikasna količina može biti određena od strane stručnjaka u ovoj oblasti koristeći rutinske metode. U nekim otelotvorenjima, efikasna količina je količina koja rezultira bilo kakvim poboljšanjem stanja koje se tretira. Stručnjak u ovoj oblasti može da odredi odgovarajuće doze i opsege terapeutskih agenasa za upotrebu, na primer, na osnovu in vitro i/ili in vivo testiranja i/ili drugog znanja o dozama jedinjenja. Kada se daju ispitaniku, efektivne količine terapeutskog sredstva će, naravno, zavisiti od određene bolesti koja se leči; ozbiljnost bolesti; pojedinačne parametre pacijenta uključujući starost, fizičko stanje, veličinu i težinu, istovremeni tretman, učestalost lečenja i način primene. Ovi faktori su dobro poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti i mogu se rešavati samo sa rutinskim eksperimentisanjem. U nekim otelotvorenjima, koristi se maksimalna doza, tj. najviša sigurna doza u skladu sa zdravom medicinskom procenom.

[0040] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim Primerima, koji ni na koji način ne treba tumačiti kao dodatno ograničavanje.

PRIMERI

Primer 1

Materijali i postupci

Dizajn

[0041] Sledi eksperimentalno nekontrolisano ispitivanje kod 16 pacijenata sa refraktornom AS odobrenom od IRB-a u Hospital Clinico de Valencia, Španija i finansiran od strane Ministarstva zdravlja Španije (Ref EC 11-299). Mobilizacija BMDSC je izvedena upotrebom granulocita-CSF (G-CSF) (5 mg/kg/12 h sc tokom 4 dana). Sedam dana kasnije, izvedena je periferna krvna afereza sa izolacijom CD 133+ ćelija. Zatim, autologne CD 133+ ćelije su unesene u spiralne arteriole ne-invazivnom radiološkom intervencijom kroz materičnu arteriju koristeći 2.5 F mikrokatetera. Status endometrijalne šupljine procenjen je histeroskopijom, vaginalnim ultrazvukom i histologijom pre i 3, 6 i 9 meseci nakon intervencije matičnim c ́elijama.

Pacijenti i metodi

Kriterijumi za uključivanje

[0042] U ispitivanje je uključeno šesnaest pacijenata sa dijagnozom refraktornog Ašermanovog sindroma koji je prethodno lečen operacijom najmanje sedam puta ili sa atrofijom endometrijuma (< 4 mm) otpornom na hormonsko lečenje sa rekurentnim neuspehom. Svi pacijenti su upućeni od strane njihovih lekara širom sveta da uđu u kliničko eksperimentalno ispitivanje koje je podržalo špansko Ministarstvo zdravlja. Starosna dob pacijenata bila je od 20-45 godina i svi su imali normalnu funkciju jetre, srca i bubrega. Potvrđeno je odsustvo menstrualnog krvarenja u prirodnom ciklusu ili nakon hormonske substituicone terapije (HRT). Odsustvo psihijatrijske patologije, HIV-a, hepatitisa B ili C, i sifilisa, kao i spremnost da se učestvuje u ispitivanju su takođe potvrđeni.

Kriterijumi za isključivanje

[0043] Pacijenti su isključeni iz ispitivanja ako nema pristupa perifernim venama ili ako imaju splenomegaliju.

Metodologija

1. Mobilizacija matičnih ćelija koštane srži (BMSC)

[0044] Da bi se pokrenuo postupak mobilizacije, ispunjeni su sledeći uslovi:

· Pacijent je obavešten o postupku i dobio je formular za pristanak najmanje 24 sata pre mobilizacije.

· Izvršena je odgovarajuća medicinska procena sa relevantnim komplementarnim istraživanjima i potvrđena je od strane lekara odgovornog za sećanje iz BMSC-a.

· Dostupni su relevantni rezultati seroloških testova (HIV, HBcAg, HBsAg, HCV, sifilis).

· Ocenjivane su vene kako bi se utvrdila njihova prikladnost za postupak.

[0045] Zatim je BMSC mobilizacija u perifernu krv indukovana pomoću G-CSF (5 mcg/kg sc svakih 12 sati) tokom 4 dana.

2. Ponovno prikupljanje BMSC

[0046] Ponovno prikupljanje BMSC je urađeno konvencionalnom procedurom afereze korišćenjem periferne vene. Pozitivna selekcija CD 133+ c ́elija je izvršena prema protokolu PO-7610-02 koji je odobrila Hospital Clinico Universitario uz primenu tri ispiranja i naknadnu selekciju CD133+ c ́elija. Prvo, c ́elije su isprane i inkubirane sa monoklonskim antitelom, zatim su isprane još dva puta i na kraju su podvrgnute selekciji CD133+.

[0047] Procedura selekcije je sprovedena maksimalno 3 sata ili dok se nije prikupilo najmanje 50 miliona CD 133+ c ́elija.

3. Transplantacija CD133+ ćelija u arteriole materice pomoću intraarterijske kateterizacije [0048] Dvadeset četiri sata nakon njihove izolacije, autologne CD133+ c ́elije su razblažene u 15-30 cc fiziološkog rastvora i zatim usađene u spiralne arterije. C ́elije su sakupljene kroz sterilni špric u posudu i donete na odeljenje radiologije pre ukapavanja. Najmanje 45 miliona c ́elija je usađeno. Postupak kateterizacije uteralne arterije je široko opisan i korišc ́en u embolizaciji mioma materice. Potrebna radiološka oprema za ovu proceduru bila je radiohirurška C-ruka ili angiografska sala sa ultrazvučnim skeniranjem. Ukratko, nakon dobijanja pristupa zajedničkoj femoralnoj arteriji pomoc ́u Seldingerove tehnike, 4F kateter je stavljen u arteriju i korišćen je za kateterizaciju obe hipogastrične arterije koristec ́i angiografski kateter sa krivom kobre 2 i Terumo vodičem 0,035 in. Mikrokateter 2,5 F je postavljen sa vodičem 0,014 in kroz kobrin kateter i uteralna arterija se kateterizira do uzlazne krive ili dok mikrokateter ne dostigne svoj najdistalniji nivo. Kada je kateter stabilizovan i njegov položaj proveren, CD 133+ BMSC je usađen u suspenziju fiziološkog rastvora. Prečnik katetera za injekciju c ́elija bio je 500-600 mikrona i 15cc je perfuzirano.

[0049] Nakon intervencije, pacijent je ostao preko noc ́i u bolnici i sledec ́eg dana je otpušten bez komplikacija.

[0050] Ova tehnika ima za cilj repopulaciju vaskularne niše endometrija kod pacijenata obolelih od Ašermanovog sindroma ili atrofije endometrijuma upotrebom CD133<+>BMSC, kako bi se rekonstruisao funkcionalni endometrijum koji može omogućiti implantaciju embriona kod pacijenata podvrgnutih ART-u sa rekurentnim neuspehom usled endometrijuma. Stoga su se za uspešno lečenje uzeli u obzir sledeći indikatori:

·Ishod menstruacije, menstruacija se mora ponovo pokrenuti nakon tretmana CD133<+>BMSC.

·Povećanje debljine endometrijuma. Minimum 50% od maksimalne debljine ikad dobijene sa HRT-om izmerena uzdužnom osi ultrazvuka vagine na dnu materice (vgr od 4 do 6 mm)

·Histeroskopski i histološki dokazi de novo formiranja endometrijuma

·Funkcionalnost rekonstruisanog endometrijuma u pogledu stope rađanja, trudnoće i implantacije nakon ponovnog postavljanja embriona kod ovih pacijenata.

Rezultati

[0051]

Tabela 1. Klinički ishod nakon tretmana sa matičnim ćelijama CD 133+

Tabela 2: Dužina ciklusa i količina i trajanje menstruacije u danima nakon autologne transplantacije CD133+BMDCC

[0052] Ovo je prvo ispitivanje serije slučajeva primenom ovog specifičnog tretmana matičnim ćelijama primenjenog intravaskularno u AS. Učestalost AS varira između 2-22% neplodnih žena.

[0053] G-CSF je najčešće korišćen citokin za mobilizaciju BMSC kako kod autolognih tako i kod alogenih donora. Ovaj proizvod se generalno dobro podnosi. Međutim, pokazalo se da davanje doze veće od 5 mcg/kg/dan dovodi do osteomuskularnog bola u više od 50% slučajeva. Ako se to dogodi, paracetamol treba primenjivati kao analgetik (500 mg/8 sati), uz održavanje G-CSF. Druge manje uočene komplikacije su: mučnina i povraćanje, migrena i nesanica. U svakom slučaju treba primeniti simptomatsko lečenje. Generalno, simptomi nestaju 3-4 dana nakon prestanka primene G-CSF-a, iako osećaj astenije može trajati do 2 nedelje od poslednje doze. Konačno, ruptura slezine kod zdravih donora je povezana sa primenom G-SCF. Zbog toga treba obaviti abdominalno skeniranje kod svih pacijenata sa bolovima u levom hipohondijumu. Splenomegalija otkrivena u tim slučajevima treba da bude praćena trenutnom suspenzijom G-CSF. Često se otkrivaju visoki nivoi alkalne fosfataze i LDH bez ikakvih srodnih simptoma. Leukocitoza je česta pojava, a vrednosti su obično manje od 70 X 10<9>/L.

Primer 2

Učesnici ispitivanja

[0054] Šesnaest pacijenata (u rasponu od 30-45 godina starosti) sa dijagnozom ili sa refraktornim Ašermanovim sindromom (AS) na osnovu klasifikacije Američkog društva za plodnost (N=11) ili atrofije endometrija (N=5) su pozvani da učestvuju u ispitivanju. Potvrđena je ranija dijagnoza teškog Ašermanovog sindroma ili atrofije endometrijuma, i histeroskopije su izvedene u proliferativnoj fazi. Pacijenti sa dijagnozom AS klasifikovani su prema klasifikaciji AFS klasifikacije, i dobijene su biopsije endometrija. Svi pacijenti su imali malo ili nimalo menstrualnog krvarenja tokom prirodnih ciklusa ili nakon hormonske substitucione terapije (HRT). Zahtevi za učešće u ispitivanju uključivali su sledeće: normalna funkcija jetre, srca i bubrega, odsustvo HIV-a, hepatitisa B ili C, sifilisa i psihijatrijska patologija, i spremnost da se završi ispitivanje. Pacijenti su isključeni u slučajevima kada nije bilo pristupa perifernoj veni ili splenomegalije.

Mobilizacija i izolacija BMDSCs

[0055] Mobilizacija BMDSCs je pokrenuta farmakološkom primenom faktora stimulacije granulocitne kolonije (G-CSF) (10 ug/kg/dan u danima -4, -3, -2 i -1). G-CSF je citokin koji se u velikoj meri koristi za ovu svrhu kod autolognih i alogenih donora. Pet dana nakon injekcije, izolacija CD133+ ćelija je izolovana kroz aferezu preko perifernih vena pomoću CobeSpectra separatora (Terumo BCT, Lakewood, CO). Dva do tri uzorka su obrađena po pacijentu i pozitivna selekcija CD 133+ ćelija je dobijena prema utvrđenom protokolu koristeći CliniMACS® sistem (Miltenii Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Nemačka). Selekcija je izvedena u roku od tri sata od prikupljanja dok se ne dobije 50 miliona ćelija. Izolovane CD133+ ćelije su razblažene u 15 do 30 cc slanog rastvora i transportovane u sterilnom špricu u radiološkom odeljenju za isporuku u spiralne arteriole.

Isporuka BMDSCs

[0056] Nakon uspešne izolacije CD 133<+>, pacijenti su upućeni na radiološko odeljenje HCU, gde je sprovedena intraarterijska kateterizacija da bi se ćelije dovele do niše endometrijskih matičnih ćelija koristeći tehniku koja se koristi za embolizaciju fibroida. Običnoj femoralnoj arteriji pristupilo se Seldingerovom tehnikom, u kojoj je 4F uvodnik omogućio kateterizaciju obe hipogastrične arterije sa krivom angiografskog katetera i vodičem Terumo (0.035 in). Kroz poslednji kateter uveden je mikrokateter od 2.5 F sa vodičem (0.014 in) da se kateterizira arterija materice do najdužih spiralnih arteriola do kojih mikrokateter može da dođe (Slika 9). Kada se položaj katetera stabilizuje i

1

verifikuje, 15 cc slane suspenzije odabranih CD133+ ćelija (koje sadrže 42 do 200 X 10<6>ćelija, srednja vrednost 123.56 ×10<6>+ 57.64) se ubrizgava kroz svaku arteriju uterusa u spiralne arteriole.

Nastavak

[0057] Svi pacijenti su primili hormonsku substitucionu terapiju (Progiluton ™, Bayer, Berlin, Njemačka) nakon primanja ćelijske terapije. Status endometrijalne šupljine je procenjen dijagnostičkom histeroskopijom, vaginalnim ultrazvukom i histologijom da bi se odredila debljina endometrija i prisustvo ili odsustvo adhezije endometrija pre, 2, 3 i 6 meseci nakon ćelijske terapije. Pacijenti su zatim pozvani da se podvrgnu ART-u kako bi pokušali začeće (Slika 9).

Endometrijalna imunohistohemija

[0058] Formiranje krvnih sudova je procenjeno pomoću CD31 & a-sma-Cy3 imunohistohemije u parafinskim sekcijama uz upotrebu anti-humanog CD31 (Dako, Glostrup, Danska) sa sekundarnim Aleksa kozjim anti-mišjim 488 i mišjim anti-humanim a- sma-Cy3 Sigma-Aldrich, MO, EEUU). Slajdovi su kontrastirani sa DAPI (Invitrogen, CA, EEUU). Pozitivne kontrole su uključivale humane krajnike za CD31 i miometrijum za a-sma. Slajdovi su ispitivani pod fluorescentnim Nikon Eclipse 80i mikroskopom. Za analizu ukupne formacije krvnih sudova po površini pomoću softvera ImageJ korišćena su tri odvojena polja od 20x. Podaci su predstavljeni kao specifične vrednosti za svakog pacijenta pre i 3 meseca i 6 meseci posle ćelijske terapije.

Statistička analiza

[0059] Statistička analiza izvršena je korišćenjem softvera SPSS 17.0 (IBM, MD, USA). Za analizu razlike u brojanju ukupnih zrelih krvnih sudova korišćen je t-test uparenog uzorka. P- vrednost dobijena u 2-krakom testu < 0.05 smatrana je statistički značajnom.

Rezultati

[0060] Dva pacijenta su u početku isključena iz ispitivanja zbog slabe mobilizacije CD 133+ ćelija (< 40 miliona) u jednom slučaju i nedostatka perifernog venskog pristupa u drugom. Ukupno 16 pacijenata završilo je protokol. Nisu prijavljene veće komplikacije.

[0061] Pacijenti su upuc ́eni u studiju sa dijagnozom refraktornog AS (N=11) (Tabela 3). Menstrualne istorije pacijenata otkrile su amenoreju kod dve pacijentkinje i oskudne mrlje kod devet. Uzroci AS su bili traumatska dilatacija i kiretaža (D&C) (N=9), histeroskopska miomektomija (N=1) i neobjašnjiva (N=1). Prosečan broj prethodno pokušanih reparativnih operativnih histeroskopija bio je dva. Nijedan pacijent nije prijavio značajno poboljšanje statusa endometrijuma uprkos hirurškom lečenju. Tri pacijenta su klasifikovana kao stepen III AS, četiri pacijenta su ocenjena kao stepen II EA, dva pacijenta su klasifikovana kao stepen II, i jedan pacijent je klasifikovan kao AS stepen I (Slika 7A). Maksimalna debljina endometrijuma sa visokim dozama HST postignuta pre c ́elijske terapije iznosila je 4,3 mm 0,74 (u rasponu od 2,7-5 mm) (Tabela 3).

Tabela 3: Karakteristike i ishodi pacijenata sa Ašermanovim sindromom

[0062] Pacijenti sa EA i neuspehom implantacije (N=5) (Tabela 4) koji su uključeni u ovo ispitivanje imali su prethodnu menstrualnu amenoreju (N=3) ili oskudne mrlje (N=2). Etiologija je prethodni D&C (N=1), neobjašnjen (N=1), upotreba levonorgestrela IUD-a (N=1), prevremeni neuspeh jajnika (N=1) i prethodna histeroskopska miomektomija (N=1). Prosečan broj pokušaja prethodnih reparativnih operativnih histeroskopija bio je dva. U svim slučajevima je uočena teška atrofija endometrijuma (Slika 7B). Maksimalna debljina endometrijuma sa visokim dozama HRT koja je postignuta pre ćelijske terapije bila je 4.2 mm 0.8 (u rasponu od 2.75 mm) (Tabela 4).

Tabela 4: Karakteristike i ishodi pacijenata sa atrofijom endometrijuma

1

Rekonstrukcija endometrijuma nakon terapije matičnim ćelijama

[0063] Nakon autologne CD133+ BMDSC terapije, menstrualni ciklusi su nastavljeni sa HRT-om u svih 16 pacijenata, osim jednog sa EA. Međutim, trajanje i intenzitet menstruacije, procenjeni prema broju upotrebljenih jastučića, progresivno se smanjivala od prosečne vrednosti od 5.06 dana (raspon, 3-7 dana) u prvom mesecu do 2.12 (raspon, 1-3 dana) u šesti mesec nakon ćelijske terapije (Supplemental Sl 1A). Zapremina menstruacije se takođe smanjio sa srednjih vrednosti od 2.68 (raspon, 1-5) na 1.5 (raspon, 1-4) jastučića dnevno u šestom mesecu.

[0064] Posmatranja materice koja su izvršena 2, 3 i 6 meseci nakon ćelijske terapije otkrila su poboljšanja u endometrijumu i šupljini materice (Tabele 3 i 4; Slika 7). Naime, svi pacijenti sa dijagnozom III stadijuma su se poboljšali do stadijuma I, dok je jedan od dva pacijenta koji su oboleli od stadijuma II pokazao potpuno normalizovanu endometrijalnu šupljinu, a drugi poboljšanje do stadijuma I. Preostali pacijent, inicijalno dijagnostikovan kao stadijum I, poboljšao se u odnosu na kvalifikacioni rezultat kao što je prikazano u Tabeli 3. Dobijena maksimalna postoperativna debljina endometrija je bila 6,7 mm (raspon 3,1-12 mm) (Tabela 3, Slika 7A). U EA grupi, normalni endometrijum je primećen nakon ćelijske terapije kod četiri od pet pacijenata (Tabela 4; Slika 7B). Maksimalna debljina endometrija dobijena nakon ćelijske terapije bila je 5.7 mm (opseg 512 mm) (Tabela 4).

[0065] Ukupan broj formiranih zrelih krvnih sudova procenjen je kod 8 pacijenata ko- lokalizacijom CD31 i a-sma izvedenih pre i 3 i 6 meseci nakon terapije stanica (Slika 8). Postepeno povećanje formiranja krvnih sudova zabeleženo je posle 3 meseca lečenja (pacijenti 4, 5, 7, 12 i 13), dok je u drugima pronađen konstantan broj zrelih krvnih sudova (pacijenti 6, 9 i 10) ( Slika 8H). Da bi se uporedili rezultati između početne tačke eksperimenta (koji se naziva kontrola) i 3 meseca nakon specifičnog tretmana sa CD 133+ ćelijama, ispitivani su odgovarajući proseci i SEM-ovi podataka. Povećan broj ukupnih zrelih krvnih sudova (CD31+/a-sma+) je primećen kod pacijenata nakon tri meseca lečenja (p=0.021). Ovi rezultati ukazuju na karakterističnu neoangiogenezu nakon autologne injekcije CD 133+ ćelija kod pacijenata sa AS i EA koja se progresivno smanjuje nakon 6 meseci (Slika 81).

[0066] Funkcionalnost rekonstruisanog endometrijuma procenjena je po reproduktivnom

1

ishodu pacijenata koji su želeli da zatrudne posle autologne CD133+BMDSC terapije (Tabele 3 i 4). Dva pacijenta su spontano zatrudnela, dva ili četiri meseca nakon ćelijske terapije, što je rezultiralo trudnoćom (pacijent 15) i pobačajem tokom 17. nedelje zbog prevremene rupture membrana (pacijent 7). Šest pozitivnih trudnoća dobijeno je nakon 13 transfera embriona, što je rezultiralo sa tri biohemijske trudnoće, jednim pobačajem u devetoj nedelji usled hromozomskog abnormalnog embriona nakon pobačaja, jedne vanmaterične trudnoće i jedne tekuće trudnoće (pacijent 12). U jednom slučaju, transfer embriona je otkazan zbog hromozomskih abnormalnosti kod svih embriona (pacijent 8), a u drugom slučaju prenos nije izvršen zbog neuspeha ćelijske terapije (pacijent 14).

Diskusija

[0067] Sa histološke tačke gledišta, AS odgovara supstituciji strome endometrijuma fibroznim tkivom koji utiče na matične ćelije endometrijuma i, prema tome, na funkciju tkiva. Žlezde se obično zamenjuju neaktivnim kubolikarnim epitelom, koji uglavnom ne reagira na hormonsku stimulaciju i uzrokuje potpuni nestanak endometrijalne strukture koja zahvata nišu matičnih stanica endometrija i, stoga, funkciju tkiva. Tokom prvih 50 do 60 godina nakon otkrića AS-a, istraživači su se fokusirali na prevalenciju, etiologiju i patologiju stanja. Pojavom endoskopije razvijene su nove metode za dijagnozu i lečenje stanja; međutim, uprkos tehnološkom napretku, oko 50% slučajeva AS danas nemaju sveobuhvatan lek.

[0068] Ovde je opisan prvi slučaj terapije matičnim ćelijama, koji je posebno usmeren na nišu endometrijskih matičnih ćelija. U uslovima stabilnog stanja, cirkulirajući EPC (cEPs) predstavljaju samo 0.01% ćelija u cirkulaciji. Stoga je planirana mobilizacija cEP-ova u kombinaciji sa direktnom infuzijom u pogođenom organu. Autologne CD133+ BMDSC su izolovane nakon mobilizacije sa G-CSF i zatim ponovo uvedene u spiralne arteriole uterusa pacijenta korišćenjem neinvazivnih radioloških procedura. CD133+BMDSC regenerišu vaskularizaciju i indukuju proliferaciju endometrija, što dovodi do stvaranja autolognog rekonstruisanog endometrijuma. CD133+ BMDSCs su nedavno istraženi u kliničkim ispitivanjima regenerativne medicine u nehematološkim aplikacijama.

[0069] Primarni cilj je bio rekonstrukcija endometrijuma, procenjena prvo obnovom menstruacije, koja se javila kod 15 od 16 naših pacijenata. Iako su trajanje i intenzitet

1

menstruacije postepeno opadali šest meseci nakon terapije ćelijama, terapija matičnim ćelijama je

odmah uticala na morfologiju endometrija. Histeroskopska vizualizacija šupljine materice, debljina

endometrijuma merena vaginalnim ultrazvukom i neoangiogeneza putem imunohistohemije bila je u

skladu sa efikasnom, iako prolaznom rekonstrukcijom endometrijuma. Sekundarni cilj je bio da se

testira funkcionalnost rekonstruisanog endometrijuma pokušajem začeća. Nekoliko spontanih trudnoća,

sa upotrebom ART, postignuto je nakon ćelijske terapije, a dva pobačaja zabeležena u ovom ispitivanju

nisu se odnosila na funkcionalnost endometrijuma.

[0070] Presađivanje c ́elija bilo je glavna briga jer IRB ne bi dozvolio obeležavanje CD133+BMDSC sa superparamagnetne nanočestice gvožđe-oksida (SPIO) za prac ́enje ubrizganih c ́elija. Umesto toga, za ovu svrhu je korišc ́en eksperimentalni model mišjeg imunodeficijencije za Ašermanov sindrom. Alikvot od 1 milion CD 133+ BMDSC od pacijenata uključenih u studiju je korišc ́en za dalju karakterizaciju i analiziran na Lgr5+ c ́elije i aktivnost aldehid dehidrogenaze 1 (ALDH1), što je rezultiralo sa 75,72 8% Lgr5+ c ́elija i 77,45 7,81 ALDH1 aktivnosti, identifikujuc ́i status matičnih i progenitornih c ́elija, respektivno. Drugi alikvot od 1 milion c ́elija je inkubiran sa 50 µg/mL Molday ION Rhodamine B tokom 18 h, što je rezultiralo efikasnošc ́u obeležavanja vec ́om od 97 % u svim eksperimentima. Zatim su SPIO-obeležene c ́elije ubrizgane u imunodeficijentni mišji model Ašermanovog sindroma kroz repnu venu ili intrauterinu injekciju. Presađivanje c ́elija je detektovano identifikacijom intracelularnih depozita gvožđa korišc ́enjem pruskog plavog bojenja, otkrivajuc ́i da su CD133+BMDSC usađeni pretežno oko endometrijalnih krvnih sudova traumatizovanog endometrijuma.

[0071] Prethodni izveštaj slučaja pokazao je pozitivne rezultate u lečenju AS autolognom izolacijom CD9, CD40 i CD90 c ́elija iz koštane srži i njihovim stavljanjem u endometrijalnu šupljinu, dok je u drugom izveštaju o slučaju opisano direktno postavljanje nekarakterističnih mononuklearnih matičnih c ́elija u subendometrijalnu zonu iglom. Oba izveštaja o slučajevima razlikuju se po vrsti c ́elija koje se isporučuju i ciljanoj niši matičnih c ́elija.

[0072] Ova studija pokazuje da je terapija autolognim c ́elijama CD133+BMDSC korisna u lečenju pacijenata sa refraktornim AS i EA koji žele da zatrudne.

Reference

[0073]

1. Cha J, Vilella F, Dey SK and Simon C. "Molecular Interplay in Successful Implantation" in Ten Critical Topics in Reproductive Medicine, S. Sanders. Science/AAAS, Washington, DC, 2013, pp.44-48.

2.Cervello I, Gil-Sanchis C, Mas A, Delgado-Rosas F, Martinez-Conejero JA, Galan A, Martinez-Romero A, Martinez S, Navarro I, Ferro J, Horcajadas JA, Esteban FJ, et al. Human endometrial side population cells exhibit genotypic, phenotypic and functional features of somatic stem cells. PLoS ONE 2010; 5:el0964.

3.Cervello I, Mas A, Gil-Sanchis C, Peris L, Faus A, Saunders PT, Critchley HO, Simon C.

Reconstruction of endometrium from human endometrial side population cell lines. PLoS ONE 2011; 6:e21221.

4. Masuda H, Matsuzaki Y, Hiratsu E, Ono M, Nagashima T, et al. (2010) Stem cell-like properties of the endometrial side population: implication in endometrial regeneration. PLoS One. 5(4):el0387.

5. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, et al. (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284 (5411): 143-7.

6. Taylor HS. (2004) Endometrial cells derived from donor stem cells in bone marrow transplant recipients. JAMA. 292(1):81-5.

1

7. Du H, Taylor HS. (2007) Contribution of bone marrow-derived stem cells to endometrium and endometriosis. Stem Cells 25(8):2082-6.

8. Mints M, Jansson M, Sadeghi B, Westgren M, Uzunel M, et al. (2008) Endometrial endothelial cells are derived from donor stem cells in a bone marrow transplant recipient. Hum Reprod. 23(1): 139-43.

9. Ikoma T, Kyo S, Maida Y, Ozaki S, Takakura M, et al. (2009) Bone marrow-derived cells from male donors can compose endometrial glands in female transplant recipients. Am J Obstet Gynecol. 201(6):608.el-8.

10. Cervello I, Gil-Sanchis C, Mas A, Faus A, Sanz J, Moscardo F, Higueras G, Sanz MA, Pellicer A, Simon C. Bone marrow-derived cells from male donors do not contribute to the endometrial side population of the recipient. PLoS ONE 2012; 7:e30260.

11. Du H, Taylor HS. Contribution of bone marrow-derived stem cells to endometrium and endometriosis. Stem Cells 2007; 25:2082-2086.

12. Brantincsak A, Brownstein MJ, Cassiani-Ingoni R, Pastorino S, Szalayoval, Toth ZE, Key S, Nemeth K, Pickel J, Mezey E. CD45-positive blood cells give rise to uterine epithelial cells in mice. Stem Cells 2007; 25: 2820-2826.

13. Zhou Y, Gan Y, Taylor HS. Cigarette smoke inhibits recruitment of bone marrow- derived stem cells to the uterus. Reprod Toxicol 2011; 31: 123-127.

14. Du H, Naqvi H, Taylor HS. Ischemia/reperfusion injury promotes and granulocyte- colony stimulating factor inhibits migration of bone marrow derived stem cells to endometrium. Stem Cells Dev 2012; 21:3324-3331.

15. Morelli S, Rameshwar P and Goldsmith LT. Experimental Evidence for Bone Marrow as a Source of Nonhemat- opoietic Endometrial Stromal and Epithelial Compartment Cells in a Murine Model. Biol Reprod 2013; 89:7, 1-7.

16. Aghajanova L, Horcajadas JA, Esteban FJ, Giudice LC. The bone marrow derived human mesenchymal stem cell: potential progenitor of the endometrial stromal fibroblast. Biol Reprod 2010; 82: 1076-1087.

17. Urbich C and Dimmeler S. Endothelial Progenitor Cells: Characterization and Role in Vascular Biology. Circ Res. 2004;95:343-353

18. Yu D, Wong YM, Cheong Y, Xia E, Li TC. Asherman syndrome- one century later. Fertil Steril 2008;89:759-79.

19. Ravina JH, Herbreteau D, Ciraru-Vigneron N, et al. Arterial embolisation to treat uterine myomata. Lancet 1995;346(8976):671-2).

20. Chaitanya B Nagori, Sonal Y Panchal, and Himanshu Patel. Endometrial regeneration using autologous adult stem cells followed by conception by in vitro fertilization in a patient of severe Asherman’s syndrome. J Hum Reprod Sci; 4(1): 43-48 (2011)

21. Gargett CE, Healy DL. Generating receptive endometrium in Asherman’s syndrome. J Hum Reprod Sci, 4(1):49-52 (2011)

1

22. Bradley EA, Reidy JF, Forman RG, Jarosz J, Braude PR. Transcatheter uterine artery embolisation to treat large uterine fibroids. Br J Obstet Gynaecol 1998;105(2):235-4023. Dmowski WP, Greenblatt RB. Asherman’s syndrome and risk of placenta accreta. Obstet Gynecol 1969; 34: 288-299.

24. Ventolini G, Zhang M, Gruber J. Hysteroscopy in the evaluation of patients with recurrent pregnancy loss: a cohort study in a primary care population. Surg Endosc 2004; 18: 1782-1784. 25. Senturk LM, Erel CT. Thin endometrium in assisted reproductive technology. Curr Opin Obstet Gynecol. 2008; 20:221-228. 26. Sher G, Fisch JD. Effect of vaginal sildenafil on the outcome of in vitro fertilization (IVF) after multiple IVF failures attributed to poor endometrial development. Fertil Steril 2002; 78: 1073-6.

27. Okusami AA, Moore ME, Hurwitz JM, Richlin SS. A case series of patients with endometrial insufficiency treatment with pentoxifylline and alphatocopherol. Fertil Steril 2007; 88: S200. 28. Brantincsak A, Brownstein MJ, Cassiani-Ingoni R, et al. CD45-positive blood cells give rise to uterine epithelial cells in mice. Stem Cells 2007; 25: 2820-2826.

29. Rafii S, Lyden D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med. 2003; 9: 702-12.

30. Uchida N, Buck DW, He D, et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc Natl Acad Sci 2000; 97: 14720-14725.

31. Sagrinati C, Netti GS, Mazzinghi B, et al. Isolation and characterization of multipotent progenitor cells from the Bowman’s capsule of adult human kidneys. J Am Soc Nephrol 2006;17: 2443- 2456.

32. Richardson GD, Robson CN, Lang SH, Neal DE, Maitland NJ, Collins AT. CD 133, a novel marker for human prostatic epithelial stem cells. J Cell Sci 2004; 117: 3539-3545.

33. Kordes C, Sawitza I, Miiller-Marbach A, et al. CD 133+ hepatic stellate cells are progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun 2007; 352: 410-417.

34. The American Fertility Society classifications of adnexal adhesions, distal tubal occlusion, tubal occlusion sec- ondary to tubal ligation, tubal pregnancies, Mullerian anomalies and intrauterine adhesions. Fertil Steril 1988; 49: 944-55.

35. Gordon PR, Leimig T, Babarin-Domer A, et al. Large-scale isolation of CD133+ progenitor cells from G-CSF mobilized peripheral blood stem cells. Bone Marrow Transpl 2003; 31: 17-22.

36. Goodwin SC, Spies JB, Worthington-Kirsch R, et al. Uterine artery embolization for treatment of leiomyomata: long-term outcomes from the FIBROID Registry. Obstet Gynecol. 2008;111(1):22-33.

37. Cervello I, Gil-Sanchis C, Santamarfa X, Cabanillas S, Diaz A, Faus A, Pellicer A, Simon C. Human bone marrow- derived stem cells improve endometrial regeneration in a murine experimental Asherman’s syndrome model. Human Reprod 2015, in press.

38. Asherman JG. Amenorrhoea traumatica (atretica). J Obstet Gynaecol Br Emp 1948; 55: 23-30

1

39. Donnez J, Nisolle M. Hysteroscopic lysis of intrauterine adhesions (Asherman’ syndrome). In Donnez J (ed): Atlas of laser operative laparoscopy and hysteroscopy. New York: Press-Parthemon Publishers 1994:3-12.

40. March CM, management of Ashermans Syndrome. Reprod Biomed Online 2011 (1):63- 76

41. Singh N, Mohanty S, Seth T, Shankar M, Bhaskaran S, Dharmendra S. Autologous stem cell transplantation in refractory Asherman’s syndrome: A novel cell based therapy. / Hum Reprod Sci 2014; 7: 93-8.

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovane autologne CD133+ matične c ́elije dobijene iz koštane srži (BMDSC) za upotrebu u izazivanju regeneracije endometrijuma kod subjekta kome je to potrebno, pri čemu se izolovani CD133+ BMDSC daje u uteralne arterije subjekta i pri čemu subjekt ima atrofiju endometrijuma koja je otporna na hormonsko lečenje.

2. Izolovane autologne CD133+ matične c ́elije dobijene iz koštane srži (BMDSC) za upotrebu u lečenju Ašermanovog sindroma ili atrofije endometrijuma kod subjekta kome je to potrebno, pri č emu se izolovani CD133+ BMDSC primenjuje u arterije materice subjekta i pri čemu subjekt ima atrofiju endometrijuma koja je otporna na hormonsko lečenje.

3. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu subjekt ima debljinu endometrijuma u vreme implantacije manju od 5 mm.

4. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu subjekt ima amenoreju, hipomenoreju ili oligomenoreju.

5. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4, pri čemu je subjekt imao periodične gubitke trudnoc ́e.

6. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu je subjekt imao jedan ili više prethodnih neuspeha implantacije embriona.

7. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu je izolovani autologni CD133+ BMDSC izolovan iz periferne krvi subjekta nakon davanja subjektu agensa za mobilizaciju BMDSC iz koštane srži u perifernu krv subjekta.

8. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je agens za mobilizaciju BMDSC faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF).

9. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema patentnim zahtevima 7 ili 8, pri čemu je autologni CD133+ BMDSC izolovan iz periferne cirkulacije subjekta aferezom korišc ́enjem anti-CD133 antitela.

10. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9, pri čemu su CD133+ BMDSC uneti u arterije materice kroz kateter.

11. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 10, pri čemu se CD133+ BMDSC primenjuje u spiralne arteriole materice subjekta.

12. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 11, pri čemu se subjektu daje najmanje 45 miliona CD133+ BMDSC.

13. Izolovani CD133+ BMDSC za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 12, pri čemu su c ́elije obezbeđene kao kombinacija matriks-c ́elija.