RO112643B1 - Procedeu de preparare a aminoacidului-d sau a derivaţilor aminoacidului-d - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de preparare a aminoacizilor-D sau a derivaţilor aminoacidului-D, şi anume, a D-p-hidroxifenilglicina, din amestecul racemic al hidantoinei relevante, utilizând celule de Agrobacterium radium imobilizate, care au activitatea enzimatică a hidantoinazei şi carbamilazei; aceste celule sunt introduse în polimeri naturali, cum ar fi alginat sau caragenat în stare degel.

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu pentru prepararea aminoacidulul· D sau a derivaților aminoacidului-D din amestec racemic de hidantoină, aminoacizii-D sau derivați ai aminoacizilor-D obținuți, sunt de interes pentru industria farmaceutică, de exemplu p-hidroxifenilglicina.

Utilizarea sistemului enzimatic cu hidantoinază și/sau carbamilază pentru transformarea hidantoinelor este foarte bine cunoscut (Biotechnologi: A Compreshive Treatise. Voi 5a. H. - J. Rehm, G. Reed Eds., Verlag Chemie, Weinheim, 1984).

Un mare număr de microorganisme au fost propuse ca agenți ai sistemului mai sus menționat, printre ei: Pseudomonas, Agrobacterium, Candida, Hansenula, Arthrobacter, Agrobacterium radiobacter, fiind de interes special datorită faptului că el prezintă un sistem enzimatic complet, având ambele activități.

Printre descrierile brevetelor legate de acest subiect, trebuie evidențiate cele referitoare la utilizarea Agrobacterium radiobacter pentru a obține feniglicina-D sau a derivaților acestuia (Ger. Offen. 2.621.076; 2920963) ca și următoarele articole : R. Olivieri et al., Enzimatic conversions ofN Carbamil-D-aminoacîdes to D-amino acida Enzime Microb. Technol. 1, 201...204(1979) și R. Olivieri etal., Microbii transformation or racemic hidantoins to D-amino acids Biotechnol. Bioeng. 23, 2173...83 (1981). Aceste articole descriu procesul microbian în care se utilizează biomasa liberă.

In legătură cu utilizarea sistemelor enzimatice ale altor microorganisme, trebuie menționate următoarele descrieri de brevete: Agrobacterium tumefaciens (EP O 309 3*10), Pseudomonas (Ger. Offen 3.018 581) Candida (JP 61,177,992). Hansenula[JP 61,177, 992)

In timp ce utilizarea celulelor de Agrobacterium radiobacter imobilizate în polimeri în stare de gel, a fost prezentată în descrierea de brevet de invenție (ES 523.360), acest biocatalizator a fost utilizat în agricultură, lăsând la o parte retenția activităților enzimatice ale hidantoinei și carbamilazei.

Pe de altă parte, utilizarea altor microorganisme pentru bioconversia hidantoinelor - ca în cazul EP 0261936 care se referă la imobilizarea Bacilus brevis - a fost descrisă. Mai mult, trebuie menționat descrierea de brevet US 4 094 741. Revendicările unei asemenea descrieri includ, în termeni generali, imobilizarea activităților enzimatice a unui număr mare de microorganisme printre care nu sunt menționate Agrobacterium radiobacter și nici metode specifice de imobilizare.

Problema, pe care o rezolvă invenția, este un nou procedeu de preparare a aminoacidului-D sau a derivaților aminoacidului-D prin transformare specifică stereoselectivă a unei hidantoine-D.

Procedeu de preparare a aminoacidului-D sau a derivaților aminoacidului-D, conform invenției, rezolvă o serie de dezavantaje a altor procedee de preparare prin aceea că, microorganismul utilizat conține activitatea enzimatică a hidantoinei și a carbamilazei, este imobilizat prin introducerea lui în gel de polimeri naturali, reacția enzimatică având loc prin introducerea hidantoinei peste microorganismele imobilizate, în prezența unui mediu reducător, fie în prezență de atmosferă de N_P, sau fie în prezența unor reducători chimici de Na₂S.

Stereospecificitatea enzimelor implicate, acționând asupra formei D a hidantoinei acționează prin deplasarea echilibrului D-L a amestecului racemic, făcând posibilă conversia cantitativă a unui asemenea amestec racemic în aminoacidulD sau în derivatul aminoacidului-D.

Imobilizarea celulelor de Agrobacterium radiobacter (sau supuse unui proces de dezagregare) este obținută prin introducerea de alginatîn stare de gel sau caragenat format în prezența ionilor de Ca²⁺ și/sau a tratamentului termic. Particulele sferice de o mărime controlată obținute astfel pot fi sau nu supuse mai târziu unui tratament de durificare pentru a le crește duritatea mecanică. Ca rezultat, se obține un biocatalizator stabil, capabil

RO 112643 Β să realizeze conversia totală a hidantoinei D-L într-un derivat relevant al aminoaciduluiD ca și reutilizarea sa într-o perioadă de cel puțin 22 de zile.

Invenția prezintă următoarele avan- 5 taje :

-utilizarea microorganismelor imobilizate permite reutilizarea biocatalizatorului, obținându-se astfel avantaje importante din punct de vedere al separării, cât și al io utilizării unui proces continuu;

- utilizarea celulelor de Agrobacterium radiobacter, care conține sistemul enzimatic complet și necesar, face posibilă o transformare cantitativă a hidantoinei-D 15 în procesul dorit.

In continuare, se prezintă un exemplu de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1... 8, care reprezintă :

fig. 1 , variația activității hidantoinei în funcție de pH;

fig.2, variația activității carbamilazei;

fig.3 și 4, variația activităților enzimatice în funcție de temperatură;

fig.5 și 6, stabilitatea biomasei libere la 45 și 5O°C ;

fig.7, stabilitatea celor două activități enzimatice testate pe o durată de 22 de zile la 40’C ;

fig.8, performanța biomasei libere testate în aceleași condiții.

Exemplul 1. Se folosesc celule de Agrobacterium radiobacter pentru a obține D-p-hidroxifenilglicina din hidantoina relevantă. Produsul obținut urmează schema descrisă mai jos:

D.L-Hidantoină

Exemplul 2. Imobilizarea microorganismului. O suspensie de celule de Agrobacterium radiobacter se imobilizează în alginat gel, astfel:

- materiale: alginat sodic [Protanol LF 10/60) la 40 % din volumul final;

- biomasă de Agrobacterium radiobacter la 21% de asemenea din volumul final, CaCI₂ la 1,5 %;

ml de biomasă (0,7 g/ml) se amestecă cu soluție de alginat de sodiu [2,6 g/46,67 ml). Aceasta se agită magnetic până când se obține un amestec omogen. Printr-o pompă peristaltică gelul este dus la un ac (0,5 mm diametru) la 30 cm de □ soluție de CaCI₂ care se agită magnetic. Solidificarea picăturilor este produsă la contactul gelului cu Ca^e+. Toate etapele imobilizării s-au efectuat în atmosferă de N₂.

Teste de activitate

A. Activitatea enzimatică a biomasei. Activitatea enzimatîcă a biomasei de Agrobacterium radiobacter se determină

RO 112643 Β astfel: 1 ml de suspensie de biocatalizator este adăugată la 11 ml de soluție tampon pH=8 de hidantoină, concentrația finală a substratului fiind Ο,ΟΞ M. Aceasta este incubată la 40°C timp de 20 de min într-o atmosferă de N_a, iar D-p-hidroxifenilglicina obținută este analizată.

Pentru a determina activitatea carbamilazei, se utilizează același test de activitate, substituind hidantoina cu carbamil.

Activitatea biocatalizatorului imobilizat este determinată prin același procedeu lucrând cu 5 ml de biocatalizator.

EL Determinarea pH-ului optim al fiecărei activități enzimatice. Pentru a determina pH-ul optim al fiecărei activități enzimatice, se prepară câte 10 mM de soluție din fiecare substrat (hidantoina/carbonic conform pH-ului dorit. O suspensie de 1 ml biomasă se adaugă la 10 ml soluție a substratului și încercată la 40°C cum s-a indicat mai sus.

C. Determinarea temperaturii optime a fiecărei activități enzimatice. Pentru a determina temperatura optimă a fiecărei activități enzimatice, substratele (10 mM) se dizolvă în tampon tris-HCI, în fiecare caz la pH optim, (pH=8 pentru activitatea hidantoinazei și 8,5 pentru carbamilazei). Testele de activitate se efectuează la temperaturi diferite,

D. Exprimarea activității enzimatice. Activitatea hidantoinazei este exprimată în mmol/l transformați într-o reacție de 20 de min [adăugare de produs + derivat carbamil). Activitatea carbamilazei este exprimată în mmol/l de phidroxifenilglicina obținută după o reacție de 20 de min din produsul intermediar,

E. Stabilitate, a]. Stabilitatea biomasei libere. 25 ml de biomasă sunt menținute într-o biomasă de azot la temperatura de testare, pe întreaga durată de efectuare a experimentului. La intervale de timp predeterminate, se ia 1 ml de suspensie pentru efectuarea testului de activitate,

B) . Stabilitatea biomasei stabilizate. Pentru determinarea stabilității biocatalizatorului obținut, se efectuează periodic testul de activitate, Biocatalizatorul imobilizat se menține în containere etanșe la temperatura dorită într-o atmosferă de N₂, cu o concentrație a hidantoinei de 3 % (p/V). Biocatalizatorul este apoi supus unui procedeu de spălare completă, înainte de efectuarea testului de activitate.

In urma efectuării testelor, s-a ajuns la următoarele rezultate:

a) . Determinarea condițiilor de lucru e fiecărei activități enzimatice. Variația activității hidantoinazei ca funcție de pH, este arătată în fig. 1, obținându-se variația maximă pentru pH=8. In același fel, fig.2, prezintă variația activității carbamilazei la un pH optim de 8,5.

Fig.3 și 4 arată variația activităților enzimatice în funcție de temperatură. Maximul activității este obținut la 45°C pentru hidantoinază și la 50°C pentru carbamilază.

Stabilitatea biomasei libere la 45 și 50°C este arătată în fig. 5 și 6. Ambele activități enzimatice arată o stabilitate ridicată pe o durată de 1 □ zile considerată, deși activitatea carbamilazei la 50°C suferă □ încetinire de aproximativ 20 %.

Datele obținute în legătură cu activitatea și stabilitatea, permit să se ajungă la concluzia că temperatura de lucru trebuie să fie între 45 și 50°C, iar pH-ul optim între 8 și 8,5, Totuși, activitatea mai slabă a carbamilazei prezentată în biomasă - comparativ cu hidantoinaza - face recomandabilă propunerea de a se folosi valori mai apropiate de cel optime pentru această activitate (pH=8,5 și o temperatură de 50°C).

b) . Lucrul cu un biocatalizator imobilizat. Rezultatele obținute prin imobilizare arată o retenție între 50 și 80% a activității catalizatorului imobilizat (trebuie luat în considerare faptul că măsurarea activității reflectă nu numai activitatea enzimatică intrinsecă ci și limitele difuziei în cazul biocatalizatorului imobilizat).

Particulele biocatalizatorului obținute au o stabilitate de 100 %în ce privește activitatea enzimatică testată pe durata unei perioade de 22 de zile la 40°C, așa cum arată și fig.7.

Această performanță este identică cu cea a biomasei libere testată în același

RO 112643 B condiții, cum arată fig.8.

Biocatalizatorul imobilizat este prin urmare capabil, în condiții de lucru, să mențină activitatea enzimatică a celulelor de Agrobacterium radiobacter și să realizeze transformarea specifică a hidantoinei □ în D-p-hidroxifenilglicina.

Claims (4)

1. Revendicări

   1. Procedeu de preparare a aminoacizilorO și a sărurilor aminoacizilor-D, din hidantoină, utilizând ca biocatalizatori microorganisme cu activitate enzimatică, imobilizate, caracterizat prin aceea că, microorganismul utilizat conține activitatea enzimatică a hidantoinazei și a carbamilazei și este imobilizat prin introducerea lui în gel de polimeri naturali, reacția enzimatică având loc prin introducerea hidantoinei peste microorganismele imobilizate, în prezența unui mediu reducător, fie în prezență de atmosferă de N₂, sau fie în prezența unor reducători chimici de Na₂S.
2. 2. Procedeu de preparare a aminoacizilorO și a sărurilor aminoacizilorD, din hidantoină, utilizând ca biocatalizatori microorganisme cu activitate enzimatică imobilizate, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, microorganismul este Agrobacterium radiobacter.
3. 3. Procedeu de preparare a aminoacizilor-D și a sărurilor aminoacizilor□, din hidantoină, utilizând ca biocatalizatori microorganisme cu activitate enzimatică imobilizate, caracterizat prin aceea că, produsul obținut din amestecul racemic de hidantoină este D-p-hidroxifenilglicină.
4. 4. Procedeu de preparare a aminoacizilorO și a sărurilor aminoacizilorD, din hidantoină, utilizând ca biocatalizatori microorganisme cu activitate enzimatică imobilizate, caracterizat prin aceea că, polimerii naturali utilizați pentru imobilizare, sunt alginat sau caragenat.