SK138893A3 - Method of the preparation of d-aminoacids or d-aminoacid derivatives - Google Patents

Description

Spôsob výroby D-aminokyselín alebo derivátov D-aminokyselín

Oblasť techniky

Vynález sa týka nového spôsobu výroby D-aminokyselín alebo derivátov D-aminokyselín z racemickej zmesi príslušného hydantoinu pri použití buniek Agrobacterium radiobacter imobilizovaných prídavkom želatínovaných prírodných polymérov.

Použitie biokatalyzátorov, na báze imobilizovaných mikroorganizmov poskytuje značné výhody pri kontinuálnej prevádzke. Vynález sa teda týka stereoselektívnej biochemickej transformácie D-hydantoinu, ktorej účelom je získať príslušnú D-aminokyselinu. Produkty, ktoré sa dajú týmto spôsobom získať, sú zaujímavé pre farmaceutický priemysel, ako v prípade p-hydroxyfenylglycínu.

Doterajší stav techniky

Použitie hydantoinázového a/alebo karbamylázového enzymatického systému pre transformáciu hydantoinov je velmi dobre známe (Biotechnology: A Comprehensive Treatise zv. 6a, H-J. Rehm, G. Reed Eds., Verlag Chemie, Weinheim, 1984).

Ako producenti hore uvedeného enzymatického systému bol navrhnutý celý rad mikroorganizmov, mj. Pseudomonas, Agbacterium, Candida, Hansenula, Arthrobacter. Osobitný záujem bol zameraný na Agrobacterium radiobacter, vďaka skutečnosti, že poskytuje celý enzymatický systém, ktorý vykazuje obidve aktivity.

Z patentov, ktoré majú vzťah k tomuto predmetu, je treba zdôrazniť tie, ktoré sa týkajú použitia Agrobacterium radiobacter na získanie D-fenylglycínu alebo jeho derivátov (DE-OS 2 621 076; DE-OS 2 920 963) a tiež nasledujúce články: R. Olivieri a ďalšie: Enzymatic Conversion of Ncarbamyl-D-amino acids to D-amino acids Enzýme Microb. Technol. 1, 201 až 204 (1979) a R. Olivieri a ďalšie Microbial Transformation of Racemic Hydantoins to D-amino acids Biotechnol. Bioeng. 23, 2173 až 2183 (1981). Tieto články opisujú mikrobiálny postup, pri ktorom sa používa voľná biomasa.

Z iných mikroorganizmov poskytujúcich enzymatické systémy je možné uviest Agrobacterium tumefaciens (EP 0 309 310), Pseudomonas (DE-OS 3 018 581), Candida (JP 61 177 992), Hansenula (JP 61 177 991).

Použitie imobilizovaných mikroorganizmov, poskytuje podstatné prevádzkové výhody ako pri výrobe, tak pri separácii, ktoré sú predmetom tohto vynálezu. Použitie buniek Agrobacterium radiobacter imobilizovaných v želatínovaných polyméroch už síce bolo patentované (ES 523 360), tento biokatalyzátor však bol používaný pre poľnohospodárske účely a zachovanie enzýmovej účinnosti hydantoinázy a karbamylázy bolo opomíjané.

Na druhej strane už bolo opísané použitie iných imobilizovaných mikroorganizmov pre biokonverziu hydantoinov, ako v prípade EP 0 Bacillus brevis. Ďalej 4 094 741. Nároky tohto

261 836, ktorý sa týka imobilizácie je potrebné uviest US pantent č. patentu zahŕňajú všeobecne imobilizáciu enzymatickej účinnosti radu mikroorganizmov. Nie je tu však konkrétne uvádzaný mikroorganizmus Agrobacterium radiobacter ani špecifické metódy imobilizácie.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je nový spôsob výroby D-aminokyselín a derivátov D-aminokyselín z racemickej zmesi zodpovedajúceho hydantoinu, pri ktorom sa používajú bunky Agrobacterium radiobacter, ktoré sú imobilizované prídavkom želatínovaných prírodných polymérov.

Použitie imobilizovaných mikroorganizmov umožňuje opakované použitie biokatalyzátoru. Tým sa dosiahne podstatných výhod, ako z hľadiska separácie, tak i z hľadiska prevádzky kontinuálneho postupu.

Použitie buniek Agrobacterium radiobacter prináša výhodu v tom, že poskytuje úplný potrebný enzymatický systém pre kvantitatívnu transformáciu D-hydantoinu na žiadúci produkt.

Stereošpecifita enzýmov, ktoré pôsobia na D-formu hydantoinu je založená na rušení D-L-rovnováhy racemickej zmesi, čo umožňuje kvantitatívnu konverziu takej racemickej zmesi na D-aminokyselinu alebo derivát D-aminokyseliny.

Imobilizácia buniek Agrobacterium radiobacter (pričom tieto bunky sú neporušené alebo rozbité) sa uskutočňuje prídavkom želatínovaného alginátu alebo karageenátu, vytváraného v prítomnosti vápenatých iónov a/alebo vzniknutého tepelným spracovaním. Kulovité čiastice s regulovateľnou veľkosťou, ktoré sa takto získajú, sa dajú prípadne d'alej spevňovať:, aby sa zvýšila ich mechanická odolnosť.

V dôsledku tohto sa získa stabilný biokatalyzátor, ktorý je schopný vykonať plnú konverziu D-L-hydantoinu na zodpovedajúci derivát D-aminokyseliny, pričom tento biokatalyzátor sa dá používať počas najmenej 22 dní.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcom príklade. Tento príklad má výhradne ilustratívny charakter a v žiadnom ohlade neobmedzuje rozsah vynálezu. Príklad je ilustrovaný obrázkami, ktorých prehlad je uvedený ďalej.

Prehlad obr. na výkresoch

Na obr. 1 je znázornená závislosť aktivity hydantoinázy od hodnoty pH.

Na obr. 2 je znázornená závislosť aktivity karbamylázy od hodnoty pH.

Na obr. 3 a 4 je znázornená závislosť enzymatických účinností od teploty.

Na obr. 5 a 6 je znázornená stabilita voinej biomasy pri 45 a 50 °C.

Na obr. 7 je znázornená stabilita dvoch skúšaných enzymatických aktivít v priebehu 22 dní pri 40 °C.

Na obr. 8 je znázornená výkonnosť voinej biomasy, skúšenej v rovnakých podmienkach.

Príklady predvedenia

1. Bunky Agrobacterium radiobacter sa používajú na získanie D-p-hydroxyfenylglycínu zo zodpovedajúceho hydantoinu. Výsledný produkt sa získa podlá nasledujúcej schémy.

HO

H —c— nh hydantoináza ho — —ch—cooh o =C C=o

NH m — C — nhII ^z o

D,L-hydantoin karbamyláza

HO CH-COCW

NH 2

D-p-hvdroxyfenylglycín

2. Skúšky aktivity

2.1. Enzymatická aktivita biomasy Agrobacterium radiobacter sa stanoví týmto spôsobom: 1 ml suspenzie biokatalyzátoru sa pridá k 11 ml suspenzie hydantoinu v tlmiacom roztoku s pH 8, pričom koncová koncentrácia substrátu je 0,02M. Zmes sa inkubuje 20 minút pri 40 °C v atmosfére dusíka a získaný D-p-hydroxy-fenylglycín sa analýzuje vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC).

Na stanovenie karbamylázovej aktivity sa použijú rovnaké skúšky aktivity, len s tým rozdielom, že sa miesto hydantoinu použije karbamylderivát.

Aktivita imobilizovaného biokatalyzátoru sa stanoví rovnakým spôsobem, pričom sa robí s 5 ml biokatalyzátoru.

2.2. Na stanovenie najlepšej hodnoty pH pre každú enzymatickú aktivitu sa vyrobí lOmM roztoky každého zo substrátov (hydantoinu a karbamylderivátu) v tris-HCl tlmiacom roztoku alebo tlmiacom roztoku na báze uhličitan/kyselina uhličitá, v závislosti od žiaduceho pH. Suspenzia 1 ml biomasy sa pridá k roztoku substrátu s objemom 10 ml. Skúšanie sa uskutočňuje pri 40 °C spôsobom uvádzaným v odseku 2.1.

2.3. Na stanovenie najlepšej teploty pre každú enzymatickú aktivitu sa substráty (lOmM) rozpustia v tris- HCl tlmiacom roztoku pri optimálnom pH pre každý prípad (pH 8, v prípade hydantoinázovej aktivity a pH 8,5, v prípade karbamylázovej aktivity). Skúšky aktivity sa uskutočňujú pri rôznych teplotách.

2.4. Hydantoinázová aktivita sa vyjádri v jednotkách mmol/1 konvertovaného produktu v priebehu 20 minútovej reakcie (súčet produkt + karbamylderivát). Karbamylázová aktivita sa vyjádri v jednotkách mmol/1 p-hydroxyfenyl-glycínu, získaného po 20 minútovej reakcii z intermediárneho produktu .

3. Imobilizácia

Suspenzia buniek Agrobacterium radiobacter sa imobilizuje v želatínovanom alginátu pri použití nasledujúceho postupu:

Materiály: alginát sodný (Protanal LF 10/60) pri 40 % koncového objemu. Biomasa Agrobacterium radiobacter sa používa v koncentrácii 21 % koncového objemu, koncentrácia chloridu vápenatého je 1,5 %.

ml biomasy (s koncentráciou 0,7 g/ml) sa zmieša s roztokom alginátu sodného (2,6 g, 46,67 ml). Zmes sa magneticky trepe, až do úplnej homogenizácie. Pomocou peristaltického čerpadla sa gél zavádza do dutej ihly (priemer 0,5 mm) umiestnenej vo vzdialenosti 30 cm od mechanicky tre7 paného roztoku chloridu vápenatého. Pri styku gélu s vápenatými ióny dochádza k stuhnutí kvapiek. Všetky imobilizačné postupy sa uskutočňujú v dusíkovej atmosfére.

4. Stabilita

4.1. Stabilita volnej biomasy ml biomasy sa udržuje pri teplote skúšania a pod dusíkovou atmosférou po celý čas vykonávania tejto skúšky. Vo vopred určených časových intervaloch sa odoberajú jedenmililitrové vzorky, ktoré sa skúšajú na aktivitu.

4.2. Stabilita imobilizovanej biomasy

Na stanovenie stability vyrobeného biokatalyzátoru sa periodicky vykonávajú skúšky aktivity. Imobilizovaný biokatalyzátor sa uchováva v uzatvorených nádobách v žiadúcej teplote pod atmosférou dusíka, pričom koncentrácia hydantoinu je 30 g/1. Biokatalyzátor sa pred uskutočňovaním skúšok aktivity podrobí celkovomu praciemu postupu.

5. Výsledky

5.1. Stanovenie pracovných podmienok pre každú enzymatickú aktivitu

Závislosť aktivity hydantoinázy od hodnoty pH je zrejmá z obr. 1. Ne j väčšia odchýlka sa dosahuje pri pH 8. Podobne, obr. 8 uvádza závislosť aktivity karbamylázy od hodnoty pH, pričom je zrejmé, že optimálna hodnota pH je v tomto prípade 8,5.

Obr. 3 a 4 uvádzajú závislosť enzymatické aktivity od teploty. Maximálna aktivita hydantoinázy sa dosahuje pri 45 °C a maximálna aktivity karbamylázy sa dosahuje pri 50 °C.

Stabilita volnej biomasy pri 45 a 50 °C je zrejmá z obr. 5 a 6. Obidve enzymatické aktivity vykazujú vysokú stabilitu v priebehu 10 dní, i keď sa aktivita karbamylázy pri 50 °C zníži o približne 20 %.

Datá, ktoré boli získané pri skúškach aktivity a stability umožňujú doisť k záveru, že pracovná teplota by mala ležať v rozmedzí od 45 do 50 °C a optimálna hodnota pH v rozmedzí od 8 do 8,5. Ak je však v biomase prítomné menej karbamylázovej aktivity, v srovnaní s hydaňtoinázovou aktivitou, malo by sa robiť vo väčšej blízkosti optimálnych hodnôt pre karbamylázovú aktivitu, ktoré sú: pH = 8,5 a teplota = 50 °C.

5.2. Prevádzka pri použití imobilizovaného biokatalyzátoru.

Výsledky, ktoré boli získané s imobilizovaným biokatalyzátorom, ukazujú, že sa dosahuje retencia aktivity 50 až 80 % (je potreba vziať do úvahy, že meranie aktivity odráža nie len vlastnú enzymatickú aktivitu, ale i rôzne obmedzenia, ku ktorým dochádza v prípade imobilizovaného biokatalyzátoru).

Získané čiastice biokatalyzátoru vykazujú stabilitu 100 %, pokiaľ sa týka dvoch skúšaných enzymatických aktivít v priebehu 22 dní pri 40 °C (viz obr. 7).

Výkonnosť imobilizovaného biokatalyzátoru je rovnaká ako výkonnosť volnej biomasy, pri skúšaní v rovnakých podmienkach (viz obr. 8).

Imobilizovaný biokatalyzátor je preto schopný si udržiavať v prevádzkových podmienkach enzymatické aktivity buniek Agrobacterium radiobacter a uskutočňovať špecifickú transformáciu D-hydantoinu na D-p-hydroxyfenylglycín.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob výroby D-aminokyselín alebo derivátov D-aminokyselín zo zodpovedajúceho hydantoinu, vyznačujúci sa tým, že sa pri tejto výrobe používajú imobilizované mikroorganizmy obsahujúce hydantoinázovú a karbamylázovú enzymatickú aktivitu.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa mikroorganizmy imobilizujú prídavkom želatínovaných prírodných polymérov, napríklad alginátu alebo karageenátu.
3. 3. Spôsob pódia nároku 2, vyznačujúci sa tým, že sa ako mikroorganizmus používa mikroorganizmus Agrobacterium radiobacter.
4. 4. Spôsob podía nároku 3, vyznačujúci sa t ý m , že produkt, ktorý sa získa z racemické zmesi hydantoinu, je D-p-hydroxyfenylglycín.
5. 5. Spôsob pódia niektorého z nárokov 1, 2, 3 alebo 4,vyznačujúci sa tým, že sa robí y redukčnom prostredí, bud’ v atmosfére dusíka, alebo v prítomnosti chemických redukčných činidiel, ako je napr. sulfid sodný.