PT973921E - Sequencias de dna de 2-desoxiglucose-6-fosfato (2-dog-6-p) fosfatase como marcadores de seleccao em plantas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

SEQUÊNCIAS DE DNA DE 2-DESOXIGLUCOSE-6-FOSFATO (2-DOG-6-P) FOSFATASE COMO MARCADORES DE SELECÇÃO EM PLANTAS” A presente invenção diz respeito à utilização de sequências de DNA que codificam uma proteína com a actividade biológica de uma 2-desoxi-gIucose-6--fosfato (2-DOG-6-P) fosfatase como marcador de selecção em células de plantas para seleccionar plantas transformadas. Além disso, a invenção refere-se a moléculas de DNA recombinante que contêm essas sequências de DNA, estando as últimas operavelmente ligadas a sequências de regulação de um promotor activo em plantas e sinais de terminação de transcrição e/ou de poliadenilação. Também se descrevem vectores, células hospedeiras e estojos (“kits”) que contêm essas moléculas de DNA recombinante, assim como células de plantas e plantas transformadas com as moléculas de DNA recombinante. A presente invenção refere-se ainda a processos para a produção de plantas transgénicas que, devido à introdução das moléculas de DNA recombinante descritas antes, podem ser seleccionadas em meios que contêm 2-desoxiglucose. Finalmente, a presente invenção refere-se a plantas transgénicas, células de plantas e tecidos que contêm a molécula de DNA de acordo com a presente invenção ou são obtidos pelo processo acima descrito, assim como produtos de colheita e material de propagação das plantas transgénicas descritas.

É possível integrar especificamente genes estranhos no genoma de plantas por engenharia genética. Este processo é referido como transformação e as plantas resultantes como plantas transgénicas. Os objectivos principais são a protecção de plantas e o aumento da qualidade dos produtos colhidos. Exemplos de medidas de protecção de plantas são (i) plantas que toleram herbicidas (DE-A-3701623; Stalker (1988) Science 242, 419), (ii) plantas resistentes a insectos (Vaek (1987) Plant Cell 5, 159-169), (iii) plantas resistentes a vírus (Powell (1986) Science 232, 738-743) e (vi) plantas resistentes a ozono (Van Camp (1994) BioTech. 12, 165-168). São exemplos de aumento de qualidade : (i) diminuição de deteriorabilidade de frutos (Oeller (1991) Science 254, 437-439), (ii) aumento da produção de amido nas túbaras de batata (Stark (1992) Science 242, 419), (iii) modificação do amido (Visser (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 289-296) e da composição dos lípidos (Voelker (1992) Science 257, 72-74) e (iv) produção de polímeros estranhos à planta (Poirer (1992) Science 256, 520-523). Um pré-requisito para a produção de plantas transgénicas é a disponibilidade de sistemas de transformação apropriados e existência de marcadores seleccionáveis que permitem a identificação de células de plantas transformadas com êxito.

Para a transformação há presentemente diversos métodos disponíveis. O método mais ffequentemente utilizado para transformar plantas dicotiledóneas é a transferência de genes mediada por Agrobacterium. Neste caso, utiliza-se a capacidade natural da bactéria do solo para se integrar no material genético fazendo parte do genoma da planta. Outros métodos apropriados são, por exemplo, transformação do protoplasta por transferência de DNA provocada por polietilenoglicol, eiectroporação, acção de ultra-sons ou microinjecção assim como a transformação de células intactas ou tecidos por microinjecção ou macroinjecção em tecidos ou embriões, eiectroporação de tecidos, incubação de embriões secos em solução que contém DNA, infiltração em vácuo de sementes e a transferência genética biolística.

Visto que de maneira independente do método de transformação só algumas células possuem as propriedades pretendidas, além do gene alvo integra-se no genoma da planta um marcador seleccionável por métodos convencionais que permite a identificação de células transgénicas. Presentemente, utilizam-se principalmente genes para escolher células de plantas transformadas que mediam uma tolerância a herbicidas ou a antibióticos. Os genes de resistência apropriados são por exemplo o gene bar de Streptomyces hygroscopicus, que media a resistência à fosfinotricina herbicida total (De Block (1987) EMBO J. 6, 2513-2518) ou o gene nptll do transposão Tn5 de Escherichia coli, que confere resistência ao antibiótico canamicina (Herrera-Estrella (1983) EMBO J. 2, 987-995). Dependendo da espécie de planta, os métodos mencionados não são sempre eficazes e ffequentemente afectam negativamente a regeneração da planta. Igualmente, o uso de genes que mediam resistências a antibióticos é indesejado no sector alimentar. Além disso, -é necessário manipular várias fases operacionais enzimáticas para controlar processos metabólicos complexos, isto é, é essencialmente necessário na área da “engenharia metabólica” permitir a possibilidade de múltiplas transformações de plantas transgénicas. As razões mencionadas antes impeliram à realização de investigação intensiva para obtenção de outros marcadores seleccionáveis. A despeito dos

Zfef intensos esforços, sá alguns novos marcadores tiveram êxito quando utilizados para seleccionar células vegetais transformadas. Com base na expressão de uma manose-6-fosfato isomerase foi possível realizar uma selecção positiva de meios de cultura que contêm manose para células vegetais transformadas (WO 94/20637). Outro processo utiliza a capacidade de a desaminase de Aspergillus terreus desintoxicar o insecticida Blasticidina S (Tamura (1995) Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 2336-2338). O problema que está na base da presente invenção é portanto proporcionar moléculas de DNA recombmante que contêm uma sequência de DNA útil para a selecção de células vegetais ou de plantas transformadas. O problema é resolvido pela obtenção das formas de realização caracterizadas nas reivindicações da patente.

Assim, a presente invenção refere-se a uma molécula de DNA recombinante que compreende (a) sequências reguladoras de um promotor activo em plantas; (b) uma sequência de DNA operavelmente ligada com elas que codifica uma proteína com a actividade biológica de uma 2-desoxiglucose-6-fosfato (2-DOG-6-P.) fosfatase; e · . , (c) operativamente ligadas com elas sequências reguladoras que podem servir como sinais de terminação de transcrição e/ou poliadenilação em plantas.

No contexto da presente invenção, uma proteína com a actividade biológica de uma 2-DOG-6-P fosfatase é entendida como sendo uma proteína que é capaz de converter compostos análogos à glucose não metabolizávets tais como

2-DOG em produtos não tóxicos. 2-DOG toma-se tóxica depois da fosforilação com obtenção de 2-DOG-6-P, isto é, a fosfatase compensa o efeito de 2-DOG-6-P por desfosforilação. Um mecanismo alternativo de resistência que também pode ser utilizado dentro do conceito da invenção consiste em evitar a fosforilação ou a absorção de 2-DOG. Descrevem-se mutantes correspondentes em levedura, por exemplo, um mutante de transporte (Novak (1990) FEBS Lett. 269, 202-204) e um mutante de fosforilação (Lobo (1977) Mol. Gen. Genet. 157, 297-300).

Foi surpreendentemente descoberto pela requerente que a expressão de uma 2-DOG-6-P fosfatase de levedura pode conferir resistência a 2-DOG e pode ser utilizada para seleccionar plantas transformadas que são por outro lado fenotipicamente normais e férteis. Por meio da investigação feita sobre a levedura, soube-se que a adição de 2-DOG, um análogo não metabolizável da glucose, tem como resultado a inibição da respiração e do crescimento de células (Heredia (1964) Biochem. Biophys. Acta 86, 216). Em células de levedura, a inibição do crescimento está correlacionada com uma síntese reduzida de polissacáridos estruturais (Kratky (1975) Eur. J. Biochem. 54, 459) e um bloqueio da glicosilação de proteínas (Datema & Schwarz (1978) Eur. J. Biochem. 90, 505), que presumivelmente são provocados por alterações das concentrações de nucleótidos de açúcares. Além das modificações bioquímicas, a adição de 2-DOG frequentemente resulta numa repressão de muitos genes (resumido em Gancedo (1992) Eur. J. Biochem. 206, 297). Em analogia com o modo de acção de açúcares metabolizáveis (tais como glucose), este processo é referido como uma repressão por catabólítos.

As investigações realizadas com células de levedura mostraram que um

modo de acção de 2-DOG depende da concentração de 2-DOG-6-P intracelular. Uma caracterização molecular de mutantes de levedura que são resistentes a 2-DOG mostrou que a resistência adquirida se pode atribuir à sobreexpressão de uma 2-DOG-6-P fosfatase específica (Sanz (1994) Yeast, 10, 1195). Um modo de acção hipotético e um modo de acção da 2-DOG-6-P fosfatase são representados na Figura 1.

Em contraste com numerosos artigos sobre o modo de acção de 2-DOG em tecidos animais, em leveduras e em bactérias, há apenas um pequeno números de estudos análogos relativos ao metabolismo desses açúcares em plantas. Até aqui só foi possível mostrar nalguns estudos que a adição de 2-DOG inibe o desenvolvimento da raízes de muitas plantas (entre outras linho, ervilhaca, trevo, centeio, cevada, milho e aveia (Stenlid (1959) Physiol. Plant. 12, 218; Farrar (1995) J. Exp. Bot. 46, 1859)). Igualmente, o crescimento de células de Nicotiana tabacum e de Picea excelsa (abeto vermelho) em cultura de tecidos é fortemente inibido por 2-DOG (Zemek (1975) Z. Pflanzenphysiol. 76, 114; Zemek (1976) Z. Pflanzenphysiol. 77, 95). Como produtos da reacção de 2-DOG em plantas superiores pôde detectar-se 2-DOG-1-P, 2-DOG-6-P, UDP-2-DOG assim como 2-DOG que contém dissacáridos e oligossacáridos (Kocourek (1963) Biochem. Biophys. Acta 71, 497; Zemek (1975) Z. Pflanzenphysiol. 76, 114). A formação destes metabólitos acredita-se provocar o efeito inibitório de 2-DOG. Para outros compostos tóxicos que são utilizados como marcadores de selecção na transformação de plantas foram também relatados os efeitos de cópia (“mamifold”) sobre o metabolismo da planta. Por exemplo, a adição de certos antibióticos

frequentemente resultam na regeneração de plantas transgénicas que apresentam modificações fisiológicas e morfológicas em relação ao fenótipo do tipo selvagem e/ou são estéreis.

Embora, como se explicou antes, 2-DOG provoque um certo número de alterações bioquímicas parcialmente ainda desconhecidas nas células, plantas transgénicas fenotipicamente normais e férteis são regeneradas quando as moléculas de DNA recombinante de acordo com a invenção são utilizadas em combinação com a selecção sobre meios que contêm 2-DOG. A sequência de DNA que codifica uma proteína com a actividade biológica de uma 2-DOG-6-P fosfatase pode ser isolada de fontes naturais, preferivelmente levedura ou pode ser sintetizada de acordo com métodos conhecidos.

Utilizando técnicas de biologia molecular convencionais, é possível (veja-se, por exemplo, Sambrook, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) introduzir várias mutações na sequência de DNA que codifica uma proteína com a actividade biológica de uma 2-DOG-6-P fosfatase nas moléculas de DNA recombinante de acordo com a invenção, tendo como resultado a síntese de proteínas com propriedades biológicas que são possivelmente modificadas. Em primeiro lugar, é possível produzir mutantes de anulação em que se pode conseguir a síntese de proteínas correspondentemente truncadas por meio de anulações progressivas na extremidade 5’ ou na extremidade 3’ da sequência de DNA codificante. Em segundo lugar, é possível produzir especificamente enzimas que estão localizadas em certos

compartimentos das células das plantas devido à adição de correspondentes sequências de sinal. Essas sequências são conhecidas (veja-se, por exemplo, Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106). E também concebível a introdução de mutações pontuais em posições em que uma modificação da sequência dos aminoácidos pode ter influência sobre, por exemplo, a actividade das enzimas ou a regulação das enzimas. Desta forma, por exemplo, podem produzir-se mutantes com um valor de Km modificado ou mutantes que deixam de estar submetidos aos mecanismos regulatórios por regulação alostérica ou modificação covalente, que usualmente ocorre em células.

Podem-se também produzir mutantes que apresentam um substrato modificado ou especificidade do produto. Podem-se produzir mutantes que possuem um perfil de actividade-temperatura modificado.

Para a manipulação genética em células procarióticas, as moléculas de DNA recombinante de acordo com a presente invenção ou partes destas moléculas podem ser integradas em plasmidios que permitem uma mutagénese ou uma modificação da sequência por recombinação de sequências de DNA. Por meio de métodos pormalizados (vide Sambrook,^1989, molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EUA), é possível realizar modificações de base ou podem-se adicionar sequências naturais ou sintéticas. Com o fim de interligar os fragmentos de DNA, podem-se ligar adaptadores ou ligadores aos fragmentos. Além disso, pode fazer-se a utilização de manipulações que oferecem sítios de restrição apropriados ou que removem DNA

ou sítios de restrição supérfluos. Sempre que se utilizem insertos, anulações ou substituições, pode usar-se mutagenese in vitro, “reparação do primário”, restrição ou ligação. Para a finalidade da análise utiliza-se geralmente uma análise da sequência, uma análise de restrição ou outros métodos bioquímico-molecular--biológico.

Numa forma de realização preferida, a sequência de DNA que codifica uma proteína com a actividade biológica de uma 2-DOG-6-P fosfatase é escolhida do grupo que consiste em (a) sequências de DNA que compreendem uma sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos indicada em SEQ ID N° 2; (b) sequências de DNA que compreendem a sequência de nucleótidos indicada em SEQ IDN° 1; (c) sequências de DNA que compreendem uma sequência de nucleótido que hibridiza um conjunto complementar da sequência de nucleótidos de (a) ou (b), (d) sequências de DNA que compreendem uma sequência de nucleótidos que é degenerada em relação à sequência de nucleótidos de (c); e (e) sequências de DNA que são um derivado, análogo ou fragmento de qualquer sequência de nucleótidos de (a), (b), (c) ou (d). e codificam uma proteína que tem actividade de 2-DOG-6-P fosfatase.

No contexto da presente invenção, o termo “hibridização” significa hibridização sob condições convencionais de hibridização, preferivelmente sob condições apertadas como se descreve por exemplo em Sambrook (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Cold Spring Harbor, NY).

Sequências de DNA que hibridizam para obtenção de sequências de DNA que codificam uma proteína com a actividade biológica de uma 2-DOG-6-P fosfatase podem ser isoladas a partir de, por exemplo, bibliotecas genómicas ou de cDNA preparadas a partir de levedura. Essas sequências de DNA podem ser identificadas e isoladas, por exemplo por hibridização de acordo com técnicas normalizadas (veja-se, por exemplo, Sambrook, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spnng Harbor, NY) utilizando por exemplo as sequências de DNA que têm exactamente ou substancialmente a sequência de nucleótidos indicada sob SEQ ID N° 1 ou partes destas sequências ou os complementos reversos destas sequências de DNA. Os fragmentos utilizados como amostras de hibridização podem também ser fragmentos sintéticos que se preparam de acordo com as técnicas de síntese convencionais e a sequência de que é substancialmente a mesma que a representada em SEQ ID N° 2. As sequências de DNA que codificam uma proteína com a actividade biológica de uma 2-DOG-6-P fosfatase incluem sequências de DNA cujas sequências de nucleótidos são degeneradas de modo a obter-se uma das sequências de DNA descritas antes. A degenerescência do código genético permite aos* especialistas no assunto a possibilidade de, entre outras adaptar as sequências de nucleótidos da sequência de DNA à preferência do codão do respectivo hospedeiro, preferivelmente plantas.

As sequências de DNA descritas antes incluem também fragmentos, variantes derivadas e alélicas das sequências de DNA descritas antes que codificam uma proteína com a actividade biológica de uma 2-DOG-6-P fosfatase. O termo “fragmentos” designa partes da sequência de DNA suficientemente compridas para codificar uma das proteínas descritas. O termo “derivado” neste contexto significa que a sequência difere das sequências de DNA descritas antes numa ou mais posições mas são fortemente homólogas em relação às referidas sequências. Homologia pretende-se que se refira a uma identidade de sequências de pelo menos 40 %, particularmente uma identidade de pelo menos 60 %, preferivelmente de mais de 80 % e ainda mais preferivelmente de mais de 90 %. As proteínas codificadas por estas sequências de DNA têm uma identidade da sequência em relação à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N° 2 de pelo menos 80 %, preferivelmente 85 % e ainda mais preferivelmente maior que 90 %, 95 %, 97 % e 99 %. Os desvios em relação às sequências de DNA descritas antes podem ser o resultado de anulação, substituição, inserção, adição ou recombinação.

As sequências de DNA que são homólogas com as sequências descritas antes e que são derivadas das mencionadas sequências são regularmente variações das citadas sequências que representam modificações que têm a mesma função biológica. Elas podem ser variações que ocorrem naturalmente, tais como sequências de outras organismos ou mutações. Estas mutações podem ocorrer naturalmente ou podem ser conseguidas por mutagénese especifica. Além disso, estas variações podem ser sequências sinteticamente produzidas. As variantes alélicas podem ser não só variantes que ocorrem naturalmente mas também variantes produzidas sinteticamente ou por técnicas de DNA recombinante.

As proteínas codificadas pelas várias variantes das sequências de DNA contidas nas moléculas de DNA recombinante com a actividade biológica de uma 2-DOG-6-P fosfatase compartilham características comuns específicas tais como actividade enzimática, peso molecular, reactividade imunológica ou conformação, assim como propriedades físicas tais como mobilidade electroforética, comportamento cromatográfico, coeficientes de sedimentação, solubilidade, propriedades espectroscópicas, estabilidade, pH óptimo, temperatura óptima.

Num aspecto particularmente preferido, a sequência de DNA descrita deriva de levedura. A fim de exprimir a sequência de DNA contida nas moléculas de DNA recombinante em células vegetais, liga-se a sequências de regulação que garantem a transcrição em células vegetais. Essas sequências de regulação são particularmente promotores. Basicamente, é útil para a expressão qualquer promotor activo em células vegetais. O promotor pode ser escolhido de tal maneira que a expressão se realiza constitutivamente ou num curto tecido, num certo momento do desenvolvimento da planta ou num momento determinado por circunstâncias externas. Em relação à planta, o promotor pode ser homólogo ou heterólogo. Promotores apropriados para uma expressão constitutiva são, por exemplo, o promotor 35S RNA do Vírus do Mosaico da Couve Flor (Cauliflower Mosaic Virus) e o promotor ubiquitina de milho, assegurando um promotor particularmente preferido uma expressão apenas em tecidos fotossinteticamente activos, por exemplo, o promotor ST-LS1 (Stockhaus, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947; Stoclchaus, EMBO J. 8 (1989), 245-2451) ou um promotor que é activo durante a transformação de plantas, a regeneração de plantas ou certas fases desses processos, por exemplo, promotores específicos da divisão das células tais como o promotor Histon H-3 (Kapros (1993), In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 29, 27-32) ou o sistema Tet quimicamente indutível (Gatz (1991), Mol. Gen. Genet. 227, 229-237). Pode encontrar-se uma revisão global de outros possíveis promotores, por exemplo, em Ward (1993) Plant Mol. Biol. 22, 361-366). São também preferidos promotores indutíveis ou específicos das células (por exemplo, meristema).

Além disso, pode existir uma sequência de terminação de transcrição que serve para terminar correctamente a transcrição e para adicionar uma cauda poli-A ao transcrito que se acredita estabilizar os transcritos. Esses elementos, por exemplo, o terminador do gene da octopina sintase de Agrobactérias são descritos na literatura (ver Gielen, EMBO J. 8 (1989), 23-29) e podem ser trocados como se pretenda.

Numa forma de realização preferida, o promotor é o promotor 35S CAMV. A invenção além disso, refere-se a vectores que contêm moléculas de DNA recombinante de acordo com a invenção. Preferivelmente, estes vectores são plasmídios, cosmídios, vírus, bacteriófagos e outros vectores comunsrna engenharia genética. Para a preparação de introdução de genes estranhos em plantas taxonomicamente superiores há uma larga escolha de vectores de clonagem que contêm um sinal de replicação para E. coli e um gene marcador para a selecção de células de bactérias transformadas. São exemplos desses vectores pBR322, série pUC, série M13mp, pACYC184, etc. A sequência pretendida pode ser introduzida

no vector num sítio de restrição apropriado. O plasmídio obtido é utilizado para transformar células de E. coli. Células de E. coli transformadas são cultivadas num meio apropriado, recolhidas e lisadas. O plasmidio é recuperado. Como métodos para a análise de caracterização do plasmídeo obtido são geralmente usadas análises de restrição de DNA, electroforeses em gel e outros métodos bioquímicos molecular-biológicos. Depois de cada manipulação, o DNA plasmídio pode ser clivado e os fragmentos de DNA resultantes podem ser ligados a outras sequências de DNA. Qualquer sequência de DNA do plasmídio pode ser clonada nos mesmos ou outros plasmídios.

Numa forma de realização preferida, o vector de acordo com a invenção contém pelo menos uma outra molécula de DNA recombinante. O fornecimento de moléculas de DNA e de vectores de acordo com a invenção permite a transferência de qualquer informação contida noutra molécula de DNA recombinante para plantas ou células de plantas e a escolha da informação pretendida por escolha dos meios que contêm 2-DOG. Naturalmente, os especialistas no assunto sabem que a molécula de DNA recombinante que contém a informação adicional não precisa necessariamente de estar presente no vector que transporta um marcador de selecção mas também_pode ser co-transformado com ele (Lyznik (1989) Plant Mol. BioL 13, 151-161; Peng (1995) Plant Nol. Biol. 27, 91-104). Isso é uma opção se não se pretender o acoplamento físico do gene marcador e a informação a ser transferida. Neste caso, o gene marcador e a informação pretendida podem ser segregados independentemente um do outro nas subsequentes culturas cruzadas depois da selecção da planta transgémca primária.

Numa forma de realização particularmente preferida, a outra molécula de DNA recombinante contém uma sequência de DNA que codifica um péptido, DNA de sentido contrário ou do mesmo sentido, DNA virai ou uma ribózima. Alguns exemplos de (sobre)expressão heteróloga e de inibição do sentido contrário com a finalidade de manipular o fluxo metabólico em plantas transgénicas são resumidos em Herbers & Sonnewald (1996) TIBTECH 14, 198-205. Um exemplo de nbózimas foi publicado por Feyter (1996) Mol. Gen. Genet. 250, 329-338. Por expressão de uma ribózima “cabeça de martelo”, os autores conseguiram produzir resistência a TMV em plantas de tabaco transgénicas. Várias aplicações possíveis de plantas transgénicas que podem ser produzidas usando as moléculas de DNA recombinante e vectores de acordo com a invenção são descritos em TIPTEC Plant Product & Corp Biotechnology, 13 (1995), 312-397.

Os vectores de acordo com a presente invenção podem possuir outras unidades funcionais que estabilizam o vector no organismo hospedeiro tais como uma origem de replicação bacteriana ou o DNA de 2-micron para a estabilização em Saccharomyces cerevisiae. Também sequências da “margem esquerda” e “margem direita” de T-DNA agrobacteriano podem estar presentes permitindo uma integração estável no genorria de plantas. Outra estratégia de .produzir plantas transgénicas isentas de marcador é utilizar recombinases específicas da sequência. Para esta finalidade, por exemplo, são possíveis duas estratégias : (i) retransformação de uma linha de partida que expressa recombinase e saída da recombinase depois da remoção do marcador de selecção que foi associado com o gene pretendido, (ii) co-transformação com saída subsequente. Os requisitos prévios para esta estratégia

de recombinase são (i) flanqueamento do marcador de selecção com sequências de reconhecimento para a recombinase e (ii) uma recombinase que é activa em plantas e não utiliza as sequências próprias da planta para a recombinação. Esses processos são disponíveis na técnica para as pessoas especializadas na matéria, por exemplo, RecA (Reiss (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 3094-3098), Cre/Iox (1992) Plant Mol. Biol. 18, 353-361), FLP/FRT (Lloyd (1994) Mol. Gen. Genet. 242, 653-657), Gin (Maeser (1991) Mol. Gen. Genet. 230, 170-176) e R/RS (Onouchu (1991) Nucl. AcidsRes. 19,6373-6378).

Noutra forma de realização, a invenção refere-se a células hospedeiras que transiente ou estavelmente contêm as moléculas de DNA recombinante ou vectores de acordo com a presente invenção. Uma célula hospedeira entende-se como sendo um organismo que é capaz de absorver DNA que foi recombinado in vitro e opcionalmente exprimir a sequência de DNA contida na molécula de DNA recombinante de acordo com a invenção. Preferivelmente, estas células são células procariótidas ou eucarióticas. Particularmente, a invenção refere-se a células vegetais que contêm os sistemas vectores de acordo com a invenção ou os seus derivados ou partes deles. As células - devido ao apoio dos sistemas de vector de acordo com a invenção ou os seus derivados, ou partes - são preferivelmente capazes de sintetizar enzimas que possuem a actividade biológica de 2-DOG-6-P fosfatase. Preferivelmente, as células de acordo com a invenção caractenzam-se pelo facto de a molécula de DNA recombinante introduzida de acordo com a invenção ser ou heteróloga em relação à célula transformada, isto é, não ocorre naturalmente nestas células, ou estar localizada no genoma num local diferente daquele em que a correspondente sequência ocorre naturalmente.

Numa outra forma de realização, a invenção refere-se a estojos (“kits”) que contêm uma molécula de DNA recombinante de acordo com a invenção ou um vector de acordo com a invenção e opcionalmente 2-DOG ou um composto químico equivalente a 2-DOG. Por exemplo, Shmidt (1978) (Eur. J. Biochem. 87, 55-68) descreveru 2-desoxi-2-fluoro-D-glucose ou manose como análogos etiquetados. A utilização das moléculas de DNA recombinante e dos vectores de acordo com a invenção permite a utilização de 2-DOG como meio de selecção para a transformação de plantas, e preferivelmente para a selecção de plantas transformadas derivadas de variedades de elevado rendimento para as quais o estado da técnica dos marcadores de selecção ffequentemente é apenas restrita utilidade.

Assim, a presente invenção também se refere a um processo para a selecção de células vegetais transformadas que compreende as seguintes operações : (a) a obtenção de células de plantas; (b) a introdução de uma molécula de DNA recombinante ou vector de acordo com a presente invenção nestas células de plantas; e (c) a selecção das células de plantas transformadas com êxito em meios que contêm 2-DOG ou em meios que contêm um composto químico funcional mente .· equivalente a 2-DOG. Há um grande número de técnicas disponíveis para a introdução de DNA numa célula hospedeira vegetal. Estas técnicas incluem a transformação de células vegetais com T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como transformante, a fusão de protoplastas, injecção, electroporação de

DNA, a introdução de DNA por meio da técnica biolística e outras técnicas possíveis.

No caso da injecção e electroporação de DNA para dentro das células vegetais não se fazem exigências específicas em relação aos plasmidios utilizados. Podem ser utilizados plasmidios simples tais como pUC. Se, no entanto, se pretende regenerar plantas inteiras a partir das células respectivamente transformadas, é necessário que esteja presente um gene marcador seleccionável.

Dependendo do método de introdução dos genes pretendidos na célula da planta, podem ser necessárias outras sequências de DNA. Se por exemplo é utilizado o plasmídio Ti ou Ri para transformar a célula das plantas, pelo menos o rebordo da direita e muitas vezes no entanto os rebordos da direita e da esquerda do T-DNA do plasmídio Ti e Ri tem de ser ligado como região de flanqueamento aos genes a serem introduzidos.

Se para a transformação se utilizarem Agrobactérias, o DNA a ser introduzido tem de ser clonado em plasmidios especiais, ou num vector intermediário ou num vector binário. Os vectores intermediários podem ser integrados por recombinação homóloga no plasmídeo Ti ou Ri das Agrobactérias * devido a sequências que são homólogas a sequências no T-DNA. O mencionada plasmídio contém a região vir necessária para a transferência do T-DNA. Vectores intermediários não são capazes de replicação em Agrobactérias. O vector intermediário pode ser transferido para Agrobacterium tumefaciens utilizando um palsmídeo auxiliador (conjugação). Vectores binários são capazes de replicação tanto em E. coli como em Agrobactérias. Eles contêm um gene marcador de selecção e um ligador ou poliligador franqueado pelas regiões dos rebordos direito e esquerdo de T-DNA. Eles podem ser directamente transformados dentro de Agrobactérias (Holsters, Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). A Agrobacténa que serve como célula hospedeira devem conter um plasmídio que possui uma região vir. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula da planta. Pode estar presente T-DNa adicional. A Agrobactéria transformada desta maneira é utilizada para transformar células de plantas. Efectuou-se um intenso trabalho de investigação sobre a utilização de T-DNA para a transformação de células de plantas e que é descrito em EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraley, Crit. Ver. Plant. Sei., 4, 1-46 e An, EMBO J. 4 (1985), 277-287.

Numa forma de realização preferida, o vector de acordo com a presente invenção é transferido para células vegetais pelo processo de acordo com a invenção usando Agrobacterium tumefaciens.

Para a transferência do DNA para dentro da célula da planta, é apropriado co-cultivar explantes vegetais com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. A partir do material vegetal infectado (por exemplo, explantesde folhas, segmentos de caules, raízes mas também protoplastas(ou células vegetais cultivadas em suspensão) podem ser regeneradas plantas completas num meio apropriado que contém 2-DOG ou um agente químico funcionalmente equivalente para a selecção de células transformadas. As plantas obtidas desta maneira podem então ser examinadas relativamente à presença do DNA introduzido. Outras possibilidades de introduzir DNA estranho usando um método biolístico ou

por transformação do protoplasta são conhecidas (ver, por exemplo, Christou (1996) Trends in Plant Science 1, 423-431; Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants, em : Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J Rehm, G. Reed, A. Piihler, P. Stadler, eds.) Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim - Nova Iorque - Basileia -Cambridge).

Sistemas alternativos para a transformação de plantas monocotiledóneas são a transformação por meio do processo biolístico, a incorporação de DNA em protoplastas provocada eléctrica ou quimicamente, a electroporação de células parcialmente permeabilizadas, a macroinjecção de DNA em inflorescências, a microinjecção de DNA em microporos e pró-embriões, a integração de DNA por polén de germinação e a integração de DNA em embriões por inchamento (para uma distinção geral ver Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273).

Enquanto a transformação de plantas dicotiledóneas por intermédio dos sistemas vectores de plasmídeo Ti utilizando Agrobactenum tumefaciens é um método bem estabelecido, a investigação mais recente mostrou que plantas monocotiledóneas também podem ser transformadas por meio de vectores baseados em Agrobactérias (Chan, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei, Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987),,.5345 - 5349; Rainen, Bio/Technology 8 (1990), 33 - 38; Gould, Plant Physiol. 95 (1991), 426 - 434, Mooney, Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (191), 209 - 218; Li, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037 - 1048).

No passado, foi possível estabelecer três dos sistemas de transformação mencionados antes para vários cereais : a electroporação do tecido, a transformação 7Ú de protoplastas e a transferência de DNA por bombardeamento com partículas em tecidos e células regenerativos (para uma visão global : Jáhne, Euphytica 85 (1995), 35 - 44). A transformação de trigo é frequentemente descrita na literatura (para uma vista global : Maheshwari, Criticai Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149 -178).

Noutra forma de realização preferida, a molécula de DNA recombinante de acordo com a presente invenção ou o vector de acordo com a presente invenção é transferida no processo de acordo com a presente invenção por bombardeamento de partículas (método biolistico). A presente invenção também se refere a células de plantas transgénicas que contêm uma molécula de DNA de acordo com a invenção ou um vector de acordo com a invenção e que foram obtidas pelo processo de acordo com a invenção assim como células de plantas transgénicas derivadas dessas células de plantas transformadas. Essas células podem distiriguir-se das células de plantas que ocorrem naturalmente pelo facto de conterem pelo menos uma molécula de DNA recombinante de acordo com a invenção que não ocorre naturalmente nestas células ou pelo facto de essa molécula ser integrada num local do genoma diferente do da correspondente molécula que ocorre naturalmente, isto é, numa vizinhança genómica diferente.

Numa forma de realização preferida, a célula das plantas de acordo com a invenção contém pelo menos um outro gene estranho. Como já se mencionou na introdução do presente pedido de patente, a possibilidade de controlar processos metabólicos complexos necessita a manipulação de diversas fases operatórias r? 2S-enzimáticas e a possibilidade de as plantas transgénicas sofrerem múltiplas transformações é por consequência essencial. Pelo uso das moléculas de DNA recombinante e vectores de acordo com a presente invenção, o especialista na matéria pode agora confiar em novos marcadores para a selecção de células de plantas que foram submetidas a transformações múltiplas.

As células de plantas transgénicas podem ser regeneradas de modo a obter-se plantas completas de acordo com as técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria. As plantas que se podem obter por regeneração das células de plantas transgénicas de acordo com a presente invenção são também uma matéria assunto da invenção. Outra matéria que é assunto da presente invenção são plantas e tecidos vegetais que contêm as células de plantas transgénicas descritas antes. Dependendo do promotor escolhido (por exemplo, 35S CaMV), as plantas adultas são também resistentes a 2-DOG e podem ser seleccionadas adicionando este composto. Quando por exemplo se utilizam promotores específicos dos tecidos, isto não é possível e os especialistas na matéria podem confiar, por exemplo, em métodos moleculares biológicos tais como PCR para identificar estas plantas. Os especialistas na matéria podem também colocar sementes dessas plantas em meios que contêm 2-DOG, isto é, efectuar a auto-fertilização òu.o contra-cruzamento contra o produto aparentado e podem tirar conclusões sobre a capacidade de geminação destas sementes ou sobre a sobrevivência das plantas a um estádio de desenvolvimento ulterior (dependendo do promotor escolhido) quer as plantas sejam transgénicas quer não. As plantas transgénicas podem geralmente ser plantas de qualquer espécie vegetal, isto é, não só plantas monocotiledóneas mas também plantas dicotiledóneas Preferivelmente, as plantas são plantas úteis tais como trigo, cevada, arroz, colza, ervilha, milho, beterraba de açúcar, cana de açúcar ou batata. A invenção também se refere ao material de propagação e aos produtos de colheita das plantas de acordo com a invenção, por exemplo, fruta, sementes, túberas, materiais das raízes, plantículas germinadas, partes cortadas, etc.

Como já se explicou antes, a presente invenção proporciona moléculas de DNA recombinante e vectores que são apropriados como marcadores de selecção em células vegetais para a selecção de células de plantas transformadas assim como plantas transgénicas, células de plantas e/ou tecidos de acordo com a invenção delas derivados. Assim, a presente invenção também se refere à utilização de uma molécula de DNA recombinante de acordo com a presente invenção ou de um vector de acordo com a invenção para a produção de plantas transgénicas, células de plantas e/ou tecidos assim como à sua utilização como marcadores seleccionáveis em cultura de células vegetais e tecidos e/ou cultura de plantas.

As figuras mostram :

Figura 1 . ·

Possíveis mecanismos de inibição do crescimento por 2-desoxiglucose (2-DOG) e eliminação do efeito tóxico por expressão de uma 2-DOG-6-P fosfatase.

Figura 2 A. Cultivação de discos de folhas de tabaco e de batata em meio MS que contém 2-DOG. TOB, Nicotiana tabacum Var. Samsun NN; POT, Solanum tuberosum var. Solara, A, E: meio MS de controlo sem adição de 2-desoxiglucose; B, F. meio MS com 0,05 % de 2-DOG; C, G : meio MS com 0,1 % de 2-DOG; D, H : meio MS com 0,5 % de 2-DOG. B. Cultura de discos de folhas de ervilha, colza e trigo em meio MS que contém 2-DOG. R, colza; P, ervilha; W, trigo. 0,0, 0,1 e 0,5 : concentração de 2-DOG adicionado em %.

Figura 3

Representação esquemática da amplificação PCR da 2-DOG-6-P fosfatase de Saccharomyces cerevisiae estirpe 288C.

Figura 4

Cassete de expressão de plantas para a sobreexpressão do gene DOGRl de levedura (Saccharomyces cerevisiae estirpe S288C) em plantas transgénicas Fragmento A (529 bp) : contém o promotor 35S do Vírus do Mosaico de Couve Flor (Cauliflower Mosaic Virus) (CaMV). Contém um fragmento que inclui nucleótidos 6909 a 7437 do CaMV. ,

Fragmento B : gene DOGRl de levedura que foi isolado como fragmento BamHl/Sall do plasmídio pGEMT-DOGRl (ver Figura 3).

Fragmento C (192 bp) : contém o sinal de poliadenilação do gene 3 do T-DNA do plasmídio Ti pTiACHS

Os Fragmentos A a C foram clonados por meio de EcoRI/HindMI para dentro do vector binário BIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acid. Res. 12, 8711).

Figura 5

Detecção do gene DOGRl por amplificação PCR em DNA genómico das plantas de tabaco transgénicas.

Pistas 1 e 14, comprimentos de DNA normal; pistas 2 - 10, transformantes independentes; pista 11, planta de controlo não transformada, pista 12, controlo positivo (plasmídio pGEMT DOGRl); pista 13, controlo de água.

Figura 6

Detecção do gene quimérico DOGRl em plantas de tabaco resistentes a 2-DOG por análise de RNA.

Análise de Northern de plantas de tabaco transgénicas da linha 35S-DOG. Isolou-se RNA completo de folhas de tabaco, separou-se por electroforese em gel e transferiu-se para uma membrana de nylon. Realizou-se a hibridização com uma região de codificação radioactivamente etiquetada do gene DOGr1. Aplicaram-se 20 pg de RNA por pista. Pistas 1-9, plantas transformadas 'independentemente da linha 35S-DOG; pista 10, controlo não transformado. .

Figura 7

Detecção da resistência mediada pelo gene DOGRl na progénie de plantas de batata transgénicas.

Esterilizaram-se sementes de Nicotiana tabacum Var. Samsun NN e colocaram-se em meio MS contendo 0,05 % de 2-DOG. A : plantículas germinadas com a idade de 4 semanas de uma planta não transformada; B . plantículas germinadas com a idade de 4 semanas de uma planta que expressa o gene DOGRl sob o controlo do promotor 35S.

Figura 8

Detecção da resistência mediada pelo gene DOGRl em rebentos de plantas de batata transgénicas.

Colocaram-se rebentos de plantas de batata Solanum tuberosum var. Solara em meio MS que contém 0,05 % de 2-DOG. A : rebento com a idade de 5 semanas de uma planta não transformada; B : rebento com a idade de 5 semanas de uma planta que expressa o gene DOGRl sob o controlo do promotor 35S.

Figura 9

Cassete de expressão de plantas relativamente à sobreexpressão do gene DOGr1 de levedura (Saccharomyces cerevisiae estirpe 288C) em plantas de ervilha transgénicas.

Fragmento A (529 bp) : contém o promotor 35S do Vírus do Mosaico de^ Couve Flor (CaMV). Ele contém um fragmento que compreende nucleótidos 6909 a 7437 do CaMV.

Fragmento B (73 bp) : reforçador de translação não modificado de Vírus de Mosaico de Tabaco UI (Gallie (1987) Nucl. Acids Res. 15, 8693)

Fragmento C : gene DOGR1 de levedura

Fragmento D (192 bp) : contém o sinal de poliadenilação do gene 3 do T-DNA do plasmídio Ti pTiaCH5

Fragmentos A a 4 foram clonados no vector binário pGPTV (Becker (1992) PMB 20, 1195) por meio de EcoRI/HindIII.

Figura 10

Detecção da resistência mediada pelo gene DOGRl em plantas de ervilha.

Colocaram-se calos de planats de ervilha Pisum sativum em meio B5 que contém 0,075 % de 2-DOG. A : calo de planta não transformada em 0,075 % de 2-DOG; B : calo uma planta que expressa o gene DOGRl sob o controlo do promotor 35S em 0,075 % de 2-DOG.

Nos exemplos utilizaram-se os seguintes métodos . 1. Métodos gerais de clonagem

Realizaram-se os métodos de clonagem tais como clivagem de restrição, isolamento de DNA, electroforese em gel de agarose, purificação dos fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos para membranas.de nitrocelulose e nylon, ligação de fragmentos de DNA, transformação de células E. coli, culturas de bactérias, análise de sequência do DNA recombmante como se descreve em Sambrook (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); ISBN 0-87969-309-6). Transformou-se Agrobacterium tumefaciens de acordo com o método descrito por Hòfgen e Willmitzer (Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877). As Agrobactérias foram desenvolvidas em meio YEB (Vervliet, Gen. Virol. (1975) 26, 33). 2. Estirpes de bactérias

Bactérias de E. coli (XL-1 Azul) foram obtidas de Stratagene. A estirpe de Agrobacterium (C58C1 com o plasmídeo pGV 3850kan) utilizada para a transformação de plantas foi descrita por Deblaere (1985, Nucl. Acid Res. 13, 4777). 3. Análise de RNA completo de tecidos vegetais

Isolou-se RNA completo de plantas de acordo com o método de Logemann (1987, Analytical Biochem. 163, 16) e separou-se em geles de formaldeído-agarose (Lehrach (1977) Biochem. 16, 4743). Realizou-se uma transferência capilar para membranas de nylon (Gene Screen, NEN) em 20 x SSC (NaCl 1,5 M, citrato de sódio 150 mM) durante a noite. Depois de pré-hibridização durante 2 horas em tampão de hibridização (fosfato de sódio 500 mM (pH 7,2), SDS 7 %, albumina de soro bovino 1 %, DNA de esperma de arenque 200 pg, EDTA 1 mM), realizou-se a hibridização a 55°C durante 16 horas com a amostra de DOGRl ràdioactivamente etiquetado. Como amostra, isolou-se a região de codificação de DOGRl de um plasmídio pGEMT e etiquetou-se radioactivamente na presença de a-32P-dCTP utilizando um High Prime Kit (Boehringer). Os tecidos foram então lavados sob as seguintes condições : 20 minutos a 55°C em 6 x SSC, SDS 0,1 % e 20 minutos a 55°C em 4 x SSC, SDS 0,1 %.

4. Deteccão de DOG-6-P em extractos de plantas

Para a detecção da actividade de 2-DOG-6-P fosfatase nas plantas transgénicas incubaram-se discos de folhas (cerca de 10 mg de peso fresco) em solução de 2-DOG 300 mM durante 24 horas no escuro. Em seguida lavaram-se os discos da folha com água durante 1 minuto e congelaram-se em azoto líquido. Para efectuar a extracção dos metabólitos, homogeneizou-se o material vegetal de maneira a obter-se um pó fino num almofariz que tinha sido pré-arrefecido em gelo seco e misturou-se com 1,5 ml de ácido tricloroacético (TCA) a 16 % (peso/volume) em éter dietílico (pré-arrefecido a 4°C). Incubaram-se então os homogeneizados em gelo seco durante 15 minutos. Dissolveram-se os metabólitos adicionando 0,8 ml de TCA a 16 % (peso/volume), EGTA 5 nruM. Depois de os homogeneizados serem transferidos para vasos da reacção de Eppendorf incubaram-se a 4°C durante 3 horas. As amostras foram então centrifugadas a 15 000 rpm a 4°C durante 5 minutos numa centrífuga Biofiige 15R (Heraeus). Transferiu-se a fase aquosa para frascos da reacção de Eppendorf e foi lavada quatro vezes com éter que estava saturado com água. As amostras foram em seguida neutralizadas com mistura KOH 5 M/trietanolamma 1 M e gasadas com azoto durante 1 minuto. Realizaram-se as amostras preparadas dessa maneira por HPLC. Para a análise, utilizou-se. um sistema Dionex de HPLC que estava equipado com uma coluna PA-1 (4 x 250 mm) e um detector electroquímico pulsado. Antes da injecção, as amostras foram centrifugadas a 13 000 rpm durante 2 minutos. Eluiram-se então os metabólitos durante 50 minutos com um gradiente côncavo (curva 9) de 1 mM a 500 mM de acetato de sódio depois de 40 minutos a NaOH 10 mM e um caudal de 1 ml/min. Efectuou-se a eluição isocrática durante mais 5 minutos. Para a identificação e a quantificação de 2-DOG-6-P, utilizou-se 2-DOG-6-P de Sigma como padrão.

Os exemplos servem para ilustrar a invenção.

Exemplo 1 : Detecção da toxicidade de 2-desoxiglucose (2-DOG) para células vegetais

Para a detecção da toxicidade de 2-DOG cultivaram-se peças de folha (cerca de I cm2) de tabaco esterilizado e de batata durante duas semanas em meio de Murashige e Skoog (Murashige & Skoog (1962) Physiol. Plant. 15, 473), a que se tinha adicionado 0,01 a 0,5 % de 2-DOG. Como se mostra na Figura 2, a adição de 2-DOG (Fig. 2, B-D e F-H) causou a morte dos discos de folha.

Exemplo 2 : Amplificação PCR da 2-DOG-6-P fosfatase de Saccharomyces cerevisiae estirpe S288C A região de codificação de DOGRI foi clonada por Reacção de Cadeia de Polimerase (PCR). O material da matriz utilizado foi DNA genómico de levedura que se isolou de Saccharomyces cerevisiae estirpe S288C de acordo com protocolo normalizado. '· Realizou-se a amplificação utilizando os primários específicos DOGRM (5’-ATGGATCCCCATGGCAGAATTTTCAGCTGATCTATG-3’; SEQ 1D N° 3) e DOGr1-2 (5’ ATGTCGACTACTCAGGCCCTTGTCAAAGGGTTG-3’; SEQ ID N° 4), que derivaram de uma sequência publicada (Sanz (1994) Yeast 10, 1195-1202). O primário 1 inclui bases 1 a 26 e o primário 2 bases 720 a 741 da região de codificação do gene DOGri. Para a clonagem do DNA amplificado em

vectores de expressão de plantas os primários adicionalmente possuem os seguintes sítios de restrição . primário 1, BamHI e Ncol, primário 2, Sall. A estratégia da clonagem é resumida na Figura 3. A mistura reaccional de PCR (50 μΐ) continha DNA de levedura cromosómica (1 pg), os primários 1 e 2 (1 pg cada), Tris-HCl (pH 8,8 a 25°C) 10 mM, MgCl2 3,5 mM, KC1 50 mM, Tnton X-100 0,1 %, dNTPs (DATP, dCTP, dGTP, dTTP= 200 pM e 2 unidades de Polimerase DNA PrirneZyme (Biometra). Antes de a polimerase ter sido polimerizada, aqueceu-se a mistura a 94°C durante 10 minutos. As operações de polimerização (60 ciclos) realizaram-se num “Thermocycler” automatizado (Perkin Elmer) de acordo com o seguinte programa : desnaturação a 94°C (1 minuto), recozimento dos primários a 40°C (1 minuto), reacção de polimerase a 72°C (1 minuto). Clonou-se o fragmento obtido de maneira a obter-s o vector pGEMT (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711 5399, EUA) e obteve-se o plasmídio pGEMT - DOGR1. Verificou-se a identidade do DNA amplificado por análise da sequência.

Exemplo 3 : Preparação do plasmídeo p35S-DORR1

Isolou-se uma sequência de DNA que codifica 2-DOG-6-P fosfatase a partir do plasmídio pGEMT-DOGR1 e dotou-se com o promotor 35S do Virus de Mosaico da Couve Flor que efectua uma expressão constitutiva em plantas transgénicas assim como com um sinal de terminação de transcrição das plantas. O sinal de terminação de transcrição de plantas contém o terminal 3’ do sítio de poliadenilação do gene da octopin sintase. O plasmídio p35S-DOGR1 contém 3 fragmentos A, B e C que foram clonados nos sítios He clivagem para as enzimas de 9 /iô restrição do poliligador de pUC 18 (ver Figura 4). O Fragmento A contém o promotor 35S do Vírus do Mosaico de Couve Flor (CaMV). Contém um fragmento que compreende os nucleótidos 6909 a 7437 do CaMV (Franck (1980) Cell, 21,285) e foi isolado como o fragmento EcoRI-Kpnl do plasmídio pDH51 (Pietrzak (1986) Nucleic. Acid Res. 14, 5857) e clonado entre os sítios de clivagem EcoRI-Kpnl do plasmídeo pUC18. O Fragmento B contém a região de codificação DOGRl que foi isolada como fragmento BamHI-Sall do plasmídeio pGEMT-DOGRl (ver Figura 3) e clonado entre os sítios de clivagem BamHI-Sall de pUC18. O Fragmento C contém o sinal de poliadenilação do gene 3 do plasmídeo Ti T-DNA pTiACH5 (Gielen (1984) EMBO J. 3, 835), nucleótidos 11749 - 11939, que foi isolado como fragmento Pvull-HindlII do plasmídio pAGV 40 (Herrera Estrella (1983) Nature 303, 209) e clonado entre os sítios de clivagem SphL-HindIII do poliligador de pUC 18 depois de o ligador Sphl ter sido adicionado ao sítio de clivagem Pvull. O gene quimérico foi então clonado como fragmento EcoRI-HmdlII entre os sítios de clivagem EcoRI-HinflII do plasmídio pBIN19 (Bevan (1984) Nucleic! Acid Res. 12, 8711). .

Exemplo 4 : Selecçào de células de plantas transformadas com DOGRl e regeneração de plantas com meio contendo 2-DOG 10 ml de uma cultura de Agrobacterium tumefaciens selectivamente desenvolvida durante a noite foram centrifugados, o seu sobrenadante foi rejeitado e

e as bactérias foram ressuspensas em iguais volumes de meio isento de antibióticos. Numa cápsula de Petri esterilizada, discos de folhas de plantas Nicotiana tabacum Var. Samsun NN esterilizados (cerca de 1 cm2) de que a nervura média foi retirada foram banhadas nesta cultura de bactérias. Os discos de folha foram então densamente placados em cápsulas de Petri contendo meio MS que compreende 2 % de sacarose e 0,8 % de Bacto Agar. Depois de incubação durante 2 dias a 25°C no escuro foram transferidos para meio Ms contendo 0,05 % de 2-DOG, 400 mg/1 de β-bactilo, 1 mg/l de benzaminopurina (BAP), 0,2 mg/1 de ácido naftilacético (NAA), 1,6 % de glucose e 0,8 % de Bacto Agar. Depois da formação do calo, os discos das folhas foram transferidos até à indução de rebentos para meio MS contendo 0,02 % de 2-DOG, 400 mg/1 de β-Bactilo, 1 mg/1 de benzaminopurina (BAP), 0,2 mg/1 de ácido naftilacético (NAA), 1,6 % de glucose e 0,8 % de Bacto Agar. Rebentos em desenvolvimento foram transferidos para meio MS isento de hormona com 200 mg/1 de β-Bactilo e 2 % de sacarose para indução das raízes. Rebentos de raízes foram então transferidos para solo de cultura e foram cultivados numa estufa.

Exemplo 5 : Detecção do gene DOGR1 quimérico nas plantas transformadas por PCR

Para a detecção de uma transformação com êxito, DNA genómico de plantas de tabaco transgénicas foi isolado de acordo com o método de Rogers e Bendich (Plant Mol. Biol. !(985) 5, 69) e detectou-se a presença do gene quimérico DOGri por amplificação de PCR. A mistura de reacçào PCR (50 μΐ) continha DNA de tabaco genómico (1 pg), primários 1 e 2 (1 pg cada), 10 mM de Tris-HCl (pH 8,8 a 25°C), 3,5 mM de MgCL2, 50 mM de HC1, 0,1 % de Tnton X-100, 200 μΜ de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTp) e 2 unidades de polimerase DNA de PnmeZyme (Biometra). Antes de a polimerase ter sido adicionada, aqueceu-se as mistura a 94°C durante 10 minutos. As operações de polimerização (40 ciclos) realizaram-se num “Thermocycler” automatizado (Perkin Elmer) de acordo com o seguinte programa : desnaturação a 94°C (1 minuto), recozimento dos primários a 40°C (1 minuto), reacção de polimerase a 72°C (1 minuto). Então separou-se uma toma aliquota da reacção de PCR num gel de agarose. Como se mostra na Figura 5, amplifica-se um fragmento de DNA com um comprimento de 740 pares de base usando DNA genómico de plantas transgénicas como matriz, fragmento esse que não é detectável quando se usa DNA genómico de plantas de controlo não transformadas.

Exemplo 6 : Detecção da expressão do gene DOGR1 quimérico em plantas de tabaco resistentes a 2-DOG por análise de RNA A expressão da fosfatase 2-DOG-6-P nas plantas regeneradas foi verificada por análise de RNA. Para esta finalidade, colheram-se amostras de folhas das plantas transferidas para a estufa, extraiu-se RNA completo, separou-se por electroforese, transferiu-se para membranas de nylon e hibridizou-se com a região de codificação do gene DOGR1. Como se mostra na Figura 6, foi possível detectar o mRNA da 2-DOG-6-P fosfatase nas plantas de tabaco que tinham sido regeneradas em 2-DOG. Não se observou qualquer reacção cruzada com plantas de tabaco não transformadas.

Exemplo 7 : Detecção in vivo da actividade de 2-DOG-6-P fosfatase

Detectou-se a actividade in vivo da 2-DOG-6-P fosfatase da seguinte maneira : discos de folhas de plantas de tabaco não transformadas com 0,78 cm2 e os transformantes 35S-DOG-3, 4, 8, 9 e 11 foram incubados numa solução 300 mM de 2-DOG no escuro durante 24 horas. Para a detecção da 2-DOG-6-P produzida, isolaram-se os intermediários fosforilados e separaram-se por HPLC. Como se mostra no Quadro 1, a expressão da 2-DOG-6-P fosfatase tem como resultado uma diminuição da acumulação da 2-DOG-6-P.

Quadro 1 : Detecção de 2-DOG-6-P em discos de folhas de plantas de tabaco transgénicas e não transformadas

Genótipo 2-DOG-6-P [pmol m'2] 2-DOG-6-P [% de controlo] Controlo 576 ± 40 100 35S-DOG-3 170 ±26 31 ±6,0 35S-DOG-4 223 ± 18 40 ± 6,0 35S-DOG-8 103 ±11 18 ±3,0 35S-DOG-9 250 ± 24 - - 45 ± 7,0 1 35S-DOG-11 283 ± 12 50 ± 5,0

Legenda : Controlo, planta Nicotiana tabacum Var. Samsun NN não transformada; plantas transgénimas 35S-DOG; os dados são valores médios (n = 4) ± desvio padrão.

Exemplo 8 : Detecção da resistência mediada pelo gene DOGR1 na progénie de plantas de tabaco transgénicas

Com o fim de detectar a resistência de plantículas germinadas a exprimirem o gene DOGRI, sementes de plantas de tabaco descritas nos Exemplos 5 e 6 bem assim como sementes de plantas de tabaco não transformadas foram esterilizadas e colocadas em meio MS contendo 0,05 % de 2-DOG. Como se mostra na Figura 7, as plantículas germinadas que expressam o gene DOGR1 sob o controlo do promotor 35S mantêm-se vivas depois de 4 semanas enquanto as plantículas germinadas das plantas não transformadas morreram numa fase precoce do desenvolvimento.

Exemplo 9 : Detecção da resistência mediada pelo gene DOGR1 na progénie de plantas de batata

Transferiu-se o construto descrito no Exemplo 3 para plantas de batata Solanum tuberosum var. Solara por transformação mediada por Agrobactérias. Os rebentos regenerados foram cultivados em meio isento de selecção. Depois de 6 semanas, as pontas dos rebentos foram transferidas para meio MS contendo 0,05 % de 2-DOG. Como se mostra na Figura 8, o rebento de uma planta não transformada não se desenvolveu depois de 5 semanas enquanto o rebento que expressa o gene DOGR1 sob controlo do promotor 35S apresenta desenvolvimento da raiz e do caule.

Exemplo 10 : Produção do plasmídio p35S Omega-DOGR1 para a transformação de ervilhas

Com o fim de transformar ervilha Pisum sativum preparou-se um construto em pUC18 que contém o promotor 35S do Vírus do Mosaico de Couve Flor, um promotor não modificado da transcrição do Vírus do Mosaico de Tabaco UI (Sonnewald (1992) Plant Journal 2 (4) 571), o gene DOGR1 e um terminador de transcrição OCS. Este construto foi introduzido no vector binário pGPTV (Becker (1992) PMB 20 1195) como fragmento EcoRI/HindIII.

Exemplo 11 : Selecçào de células de ervilha transformadas com DOGR1 e regeneração de plantas em meio que contém 2-DOG

Pré-cultivaram-se durante 2-3 dias em meio líquido que contém auxma/citoquinina sementes imaturas esterilizadas de ervilha Pisum sativum. Então prepararam-se cortes longitudinais do eixo embriónico e incubaram-se durante 1 hora numa cultura durante a noite de Agrobacterium tumefaciens. Os explantes foram então transferidos para meio sólido para plantas. Depois de quatro dias de incubação em meio B5 modificado à luz difusa a 22°C, os explantes foram lavados e transferidos para meio sólido contendo auxina/citoquinina e 0,075 % de 2-DOG. Realizou-se a selecção com várias concentrações de hormona de crescimento com uma pressão de selecção permanente de 0,075 % de 2-DOG. Enxertaram-se rebentos regenerados em plantículas germinadas não transformadas, transferiu-se para o solo e cultivou-se em estufa.

Exemplo 12 : Detecçào da resistência mediada com o gene DOGK1 em folhas de plantas de ervilha

Transferiu-se o construto descrito no Exemplo 10 para plantas de ervilha de Pisum sativum por transformação mediada por Agrobactérias. Colocaram-se calos de plantas transformadas e não transformadas em meio contendo 0,075 % de 2-DOG. Como se mostra na Figura 10, o calo de plantas não transformadas não desenvolveu rebentos enquanto o calo desenvolvido depois da transformação com o gene DOGR1 sob o controlo do promotor 35S desenvolveu rebentos.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL .

(i) REQUERENTE (A) NOME : IPK Gatersleben (B) RUA : Corrensstr. 3 (C) CIDADE . Gatersleben (D) PAÍS . Alemanha (E) CÓDIGO POSTAL : 06466 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO : Sequências de DNA de 2-desoxiglucose-6-fosfato (2-DOG-6-P) como marcador de selecção em plantas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS : 4 (ív) FORMA DE COMPUTADOR LEGÍVEL : (A) TIPO MÉDIO : Disco Macio (B) COMPUTADOR : IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO : PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE : Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 758 pares de bases (B) TIPO . nucleótido (C) HÉLICE . única (D) TOPOLOGIA : linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA : cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) SENTIDO ANTI-HORÁRIO : NÃO (v) FONTE ORIGINAL : (A) ORGANISMO : Saccharomyces cerevisiae (ix) C ARACTERÍ STIC A :

(A) NOME/CARACTERÍSTICA : CDS (B) LOCALIZAÇÃO : 9 .746 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° 1 GGATCCCC ATG GCA GAA TTT TCA GCT GAT CTA TGT CTT ΓΓΤ GAC CTA GAT Met Ala Glu ?he Ser Ala Asp Leu Cys Leu Pfce Asp Leu Asp 10 l 5 GGT O n ATA GTG ACT ACA ACA GTG Gly Thr Jle Vai Ser Thr Thr Vai 15 20 TTG TGT TAC GAA TAC GGT GTÍ GAT Leu Cys Tyr Glu Tyr Gly Vai Asp 35 CAT GGT GCA AGA ACA CAA CAG GTT Ris Gly Aua Arg Thr Gin Glu Vai 50 GAT GAT ACA· GAC AAT AAA GGT GTT Asp Asp Thr Asp Asa Lys Gly Vai 70 65 GCC GCA GAG AAA GCA TGG ACC AAG Ala Ala Glu Lys Ala Trp Thr Lys 25 30 CCT TCC GAD TTA TTT AAG CAT TCT Pro Ser Glu Leu Fhe Lys His Ser 40 45 TTG AGA AGG TTT TTC CCT AAA TTG Leu Arg Arg ?he Phe Pro Lys Leu 55 60 CTT GCT CTA GAA AAA GAT ATT GCC Leu Ala Leu G'u Lys Asp He Ala 75

CAT AGT TAC TTG GAT ACA GTA AGC CTT ATT cct GGT GCA GAG . AAC TTA 290 Ris Ser _ V «. Leu Asp Thr Vai Ser Leu Ils Pro Gly Ala Glu Asn Leu 80 85 30 CTG TTA . TCG TTA GAT GTA GAT ACT GAG ACT CAA AAA AAG TTA CCT GAA 338 Leu Leu Ser Leu Asp Val Asp Thr Glu Thr Gin Lys Lys Leu Pro Glu 35 100 105 110 AGG AAA TGG GCT ATC GTT ACC TCT GGT TCT CCA TAT TTG GCA TTT TCA 386 Arg Lys Trp Ala Ile Val Thr Ser Gly Ser Prc Tyr Leu Ala Phe Ser 115 120 125 TGG TTC GAG ACA ATA TTG ΑΛΑ ΛΛΤ GTT GGA AAG CCC AAA CTT TTC ATT 434 Trp Phe Glu Thr Ile Leu Lys Asn Val Gly Lys Pro Lys Val Phe Xle 130 135 140 ACT GGG TTT GAC GTG AAG AAC GGT AAG CCT GAT CCC GÀG "GGT TAT TCA 432 Thr Gly Phe ADp val Lys Asn Gly Lys Pro Asp Pro Glu Gly Tyr Ser 145 150 155 AGA GCT CGT GAT TTA TTG CGT CAA GAT TTG CAA TTA ACT GGT AAA CA G 530 Arg Ala Arg Asp Leu Leu Arg Gin ASp Leu Gin Leu Thr Gly Lys Gin 160 165 170 GAT CTG' AAG TAT GTT GTC TTC GAA GAT GCA CCC GTG GGC ATA AAG C-CC 578 Asp Leu Lys Tyr Val Val Phe Glu Asp Ala Pro Val Gly Ile Lys Ala 1 75 ISO 185 130 GGC AAA GCA ATG GGC GCC ATT ACT GTG GCT ATA ACA TCC TCG TAT GAC 626 Gly Lys A.la Met Gly Ala I_e Thr Val Gly lie Thr Ser Ser Tyr Asp 295 200 205 AAG AGG GTT TTA TTT GAC GCA GGA GCA GAT TAT GTA GTC TGT GAT TTG Ó74 Lys Ser Vai Leu Phe Asp Ala Gly Ala Asp Tyr Val Val CVS Asp Lêu 210 215 220

ACA CAG GTT TCC GTG GTT AAG AAC AAT GAA AAC GGT ATT CTC ATC CAG 722 Thr Gin Val Ser Val val Lyia Asn. Asn Olu Asn Cly Ile Val Ile Gin 225 23C 235 GTA AAC AAC CCT TTC- ACA AGG GCC TGAGTAGTCG AC 758 val Asn Asn Frc Leu Thr Arg Ala 240 245 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 246 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : proteina (iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° 2 :

Met Ala Glu Phe Ser Ala Asp Leu Cys Leu Phe Asp Leu Asp Gly Thr 5 10 15

Ile Vai Ser Thr Thr Vai Ala Ala Glu Lys Ala Trp Thr Lys Leu Cys 20 25 30

Tyr Glu Tyr Cly Vai Asp Pro Ser Glu Leu Phe Lys His Ser Bis Gly 35 40 45

Ala Arg Thr Gin Glu Vai Leu Arg Arg phe Phe Pro Lys Leu Asp Asp 50 55 60

Thr Asp Asn Lys Gly Vai Leu Ala Leu Glu Lys Asp Ile Ala His Ser 65 70 75 80

Tyr Leu Asp Thr Vai Ser Leu lie ft!?

Ser Leu Asp Vai Asp Thr Glu Thr 100

Trp Ala Ile Vai Thr Ser Gly Ser 115 120

Glu Thr ile Leu Lvs Asn Vai Gly 130 135

Phe Asp Vai Lys Asn Gly Lys Pro 145 ' 150

Pro Gly Ala Glu Asn Leu Leu Leu 90 95

Gin Lys Lys Leu Pro Glu Arg Lys 105 310

Pro Tyr Leu Ala Phe Ser Trp Phe 125

Lys Pro Lys Vai Phe Ile Thr Gly 140

Asp Pro Glu Gly Tyr Ser Arg Ala 155 160

Arg Asp Leu Leu Arg Gin Asp Leu 165

Lys Tyr Vai Vai Phe Glu Asp Ala 180

Ala Met Gly Ala Ile Thr Vai Gly 195 200

Vai Leu Phe Asp Ala Gly Ala Asp 210 215

Vai Ser Vai Vai Lys Asn Asn Glu 225 230

Asn Prc Leu Thr Arg Ala

Gin Leu Thr Gly Lys Gin Asp Leu 170 175

Pro Vai Gly Ile Lys Ala Gly Lys 185 190

Ile Thr Ser Ser Tyr Asp Lys Ser *205'

Tyr Vai Vai Cvs Asp Leu Thr Gin 220

Asn Gly Ile Vai Ile Gin Vai Asn 235 240 245

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° 3 : (i) C ARACTERÍ STIC AS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 36 pares de bases (B) TIPO : nucleótido (C) HÉLICE : única (D) TOPOLOGIA : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : outro ácido nucleico

(iii) HIPOTÉTICO : SIM

(iv) SENTI ANTI-HORÁRIO : NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA . SEQ ID N° 3 : ATGGATCCCC ATGGCAGAAT TTTCAGCTGA TCTATG 36 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N° 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO : 33 pares de bases (B) TIPO : nucleótido (C) HÉLICE : única (D) TOPOLOGIA : linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : outro ácido nucleico

(iii) HIPOTÉTICO : SIM

(iv) SENTI ANTI-HORÁRIO : NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N° 4 : ATGTCGACTA CTCAGGCCCT TGTC AAAGGG TTG 33

Lisboa, 5 ée Novembro de 2001

ijX ó lusiria!.

ííxsf. de Sampaio A.O.RL 'Rua do Salitre, r/c-Dri. 1269-()63 LISBOA

Claims (19)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de DNA recombinante compreendendo (a) sequências de regulação de um promotor activo em plantas; (b) operavelmente ligada a elas, uma sequência de DNA que codifica uma proteína com a actividade biológica de uma 2-desoxiglucose-6-fosfato (2-DOG-6-P) fosfatase; e (c) operavelmente ligados a elas sequências de regulação que servem como terminação da transcrição e/ou sinais de poliadenilação em plantas.
2. 2. A molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de DNA que codifica uma proteína com a actividade biológica de uma 3-DOG-6-P fosfatase é escolhida do grupo que consiste em (a) sequências de DNA que compreendem uma sequência de nucleótidos que codifica a sequência de aminoácidos indicados em SEQ ID N° 2; (b) sequências de DNA que compreendem a sequência de nucleótidos indicada em SEQ ID N° 1; (c) sequências de DNA que compreendem uma sequência de nucleótidos que se hibridiza com um troço complementar da sequência de nucleótidos de (a) ou (b); (d) sequências de DNA que compreendem uma sequência de nucleótidos que é degenerada para uma sequência de nucleótidos de (c), e (e) sequências de DNA que são um derivado, análogo ou fragmento de uma sequência de nucleótidos de (a), (b), (c) ou (d) e que codifica uma proteína que possui a actividade de 2-DOG-6-P fosfatase.
3. 3. A molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a sequência de DNA deriva de levedura.
4. 4. A molécula de DNA recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o promotor é o promotor 35S CaMV.
5. 5. Vector que compreende uma molécula de DNA recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4.
6. 6. O vector de acordo com a reivindicação 5 que contém pelo menos uma outra molécula de DNA recombinante.
7. 7. O vector de acordo com a reivindicação 6, em que a outra molécula de DNA recombinante contém uma sequência de DNA que codifica um péptido, proteína, RNA no sentido anti-horàrio e no sentido horário, RNA virai ou nbózima.
8. 8. Célula hospedeira que contém uma molécula de DNA recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 ou um vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 7.
9. 9. Estojo compreendendo uma molécula de DNA recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 ou um vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 7 e opcionalmente 2-desoxiglucose ou um composto químico funcionalmente equivalente a 2-desoxiglucose.
10. 10. Processo para a selecção de células de plantas transformadas, compreendendo as seguintes operações : (a) obtenção de células de plantas; (b) a introdução de uma molécula de DNA recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 ou um vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 7 nestas células de plantas; e (c) a selecção das células de plantas transformadas com êxito em meios que contêm 2-desoxiglucose ou em meios que contêm um composto químico que é funcionalmente equivalente a 2-desoxiglucose. 11.0 processo de acordo com a reivindicação 10, em que o vector de acordo com uma qualquer das reivindicações· 5 a 7 é transferido para as células da planta por meio de Agrobacterium tumefaciens.
11. 12. O processo de acordo com a reivindicação 10, em que a molécula de DNA recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações l a 4 ou o vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 7 é transferida(o) para as células das plantas por bombardeamento de partículas.
12. 13. Célula de plantas transgénicas que contém uma molécula de DNA recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 ou um vector de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 7 ou produzido de acordo com o processo de uma qualquer das reivindicações 10 a 12.
13. 14. Célula de plantas de acordo com a reivindicação 13, que contém pelo menos um outro gene estranho.
14. 15. Tecido de plantas que compreende células de plantas de acordo com a reivindicação 13 ou 14 ou produzidas de acordo com o processo de uma qualquer das reivindicações 10 a 12.
15. 16. Planta transgénica contendo uma célula de plantas da reivindicação 13 ou 14 ou produzida de acordo com o processo de uma qualquer das reivindicações 10 a 12.
16. 17. Produtos de colheita da planta de acordo com a reivindicação 16 que compreende células de plantas de acordo com a reivindicação 13 ou 14.
17. 18. Material de propagação das plantas de acordo com a reivindicação 16 que compreende células de plantas de acordo com a reivindicação 13 ou 14. 49
18. 19. Utilização de uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA como definida em uma qualquer das reivindicações 1 a 3, de uma molécula de DNA recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 ou de um vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 7 para produzir plantas transgénicas, células de plantas ou tecido.
19. 20. Utilização de uma molécula de DNA que compreende uma sequência de DNA como definida em uma qualquer das reivindicações 1 a 3, de uma molécula de DNA recombinante de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 ou de um vector de acordo com uma qualquer das reivindicações 5 a 7 como marcador seleccionável em células de plantas e cultura de tecidos e/ou cultivo de plantas.

    !269-063 LISBOA