PT96945B

PT96945B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais

Info

Publication number: PT96945B
Application number: PT96945A
Authority: PT
Inventors: Klaus Bosslet; Gerhard Seemann; Peter Hermentin
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1990-03-07
Filing date: 1991-03-06
Publication date: 1998-07-31
Also published as: AU7264491A; DK0446730T3; US5908790A; ES2077700T3; IE68044B1; DE4007079A1; EP0446730B1; CA2037664A1; EP0446730A1; IE910750A1; JPH04218390A; GR3017741T3; PT96945A; CA2037664C; US5907034A; KR100210720B1; AU651962B2; ATE127848T1; DE59106448D1; KR910016341A

Description

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã (inventores: Dr.

Klaus Bosslet, Dr. Peter Hermentin e Dr. Gerhard Seemann, residentes na República Federal Alemã) para PROCESSO PARAA A PREPARAÇAO DE ANTICORPOS M0NOCLONAIS»,

Descrição

A invenção refere-se a ianticorpos monoclonais (MAK) que se ligam com alta especificidade e avidez a complexonas solúveis em água, como por exemplo etilenodiaminotetraacetato (EDTA) ou a dietilenotriaminopentaacetato (EDTA) e que após complexação do EDTA ou do DTPA com iões metálicos mantêm a sua alta avidez e especificidade a estas complexonas.

Estes MAK podem pois ser utilizados, por exemplo acoplados sobre filtros ou outros suportes, para a eliminação de metais pesados tóxicos que são complexados com EDTA. Para além disso estes MAK são apropriados como componentes de imunoensaios (RIA, ELISA, etc.) para a determinação quantitativa de EDTA ou respectivamente DTPA em soluções aquosas.

Os metais pesados que são ligados com complexonas, como por exemplo EDTA, representam no campo do traJ.M.

tamento de águas potáveis um grave risco. Por consequência a determinação rápida, exacta e quantitativa da concentração de ADTA é tão importante como a eliminação de complexos EDTA-metal das águas residuais ou da água potável.

No nosso trabalho para obtenção de MAK contra complexonas hidrófilas no âmbito da terapia de tumores aconteceu-nos surpreendentemente, produzir MAk que possuem uma elevada avidez tanto contra EDTA ou DTPA não complexados, bem como também contra estas substâncias complexadas com metais.

Os MAk foram preparados do seguinte modo. Complexou-se como heptano isotiocianato-benzil-DTPA acoplado sobre albumina de soro humano e acolado com iões de ítrio.

Com estes complexos hapteno- Carrier imunizaram-se em segui da ratos apropriados e os baços dos ratos com os mais altos títulos de anticorpo anti-DTPA foram fundidos com uma linha de células de mieioma apropriada. Os hibridomas resultantes foram ensaiados no Enzyme-linked Immunoassay (ELISA)” específico descrito adiante.

ensaio ELISA consistiu numa fase sólida que foi carregada com uma solução contendo albumina de soro humano (HSA)-benzil-DTPA. 0 sobrenadante a ensaiar, contendo o MAk, foi pré-incubado com a complexona livre ou com o seu complexo de ião metálico e mediu-se a sua ligação à fase sóli da específica. Para isso utilizou-seu um sistema de amplificação de enzima que estava acoplado a um anticorpo anti-imuno globulina de rato. Os pormenores desta metodologia estão des critos nos exemplos 2 e 3·

Por meio deste sistema de ensaio obtiveram-se MAk que possuem as propriedades descritas no quadro I.

Estes MAk, ao contrário de muitos outros MAk anti-DTPA/EDTA, não se ligam ao tecido humano normal, como foi determinado por meio da técnica APAAP (Cordell et al, J. Histochem. Cytochem. 32:219, 1984) sobre tecidos conservados criogenicamente. É por conseguinte possível uma utilização in vivo destes MAK no campo do diagnostico e da terapia.

Como competidores utilizaram-se as complexonas DTPA e EDTA na forma não complexada (exemplo 4). Adicionalmente empregaram-se como inibidores os compostos estruturalmente análogos ácido trans-aconitico e 1,2-diaminoeta no (ver Quadro I). Os excessos de competidor, apresentados no quadro I, que conduzem a uma inibição de 50 % da ligação MAk-antigene, mostram que os MAk utilizados possuem uma forte ligação tanto a EDTA ou DTPA não complexados como também a EDTA ou DTPA complexados com iões metálicos. Estas características permitem uma utilização dos MAk, por exemplo aoopla dos sobre filtros ou outros suportes sólidos, para a eliminação tanto de EDTA n ou DTPA não complesados como também de complexos de EDTA ou DTPA com iões metálicos de líquidos.São igualmente apropriadas reacçôes de precipitação de complexos MAk/EDTA-ião metálico para a eliminação dos iões metálicos tóxicos.

É particularmente adequado para esta utili lização o MAk BW 2050/535, cuja interacção com EDTA e com os seus complexos é excepcionalmente forte.

A invenção refere-se por conseguinte a anticorpos monoclonais (MAk) de alta afinidade tanto contra EDTA ou DTPA complexados com iões metálicos, como também contra estas substâncias não complexadas, ao processo para a sua preparação bem como à sua utilização como constituintes de um agente de diagnóstico ou de um agente terapêutico, ou para a eliminação de iões metálicos tóxicos,

A invenção é ainda abordada com mais pormenor nos exemplos e está caracterizada nas reivindicações de patente.

Exemplo 1:

Preparação de anticorpos monoclonais específicos para

EDTA ou DTPA

Utilizou-se como hapteno isotiocianato-benzil-DTPA acoplado de forma covalente sobre albumina de = 3 =

I

soro humano (HSA) como veículo 8ⁿCarrier”, com um grau de de rivação de 19 moléculas de benzil-DTPA por molécula de HSA, correspondente à metodologia descrita por N. W. Brechbiel et al. ,Inorganic Chemistry 25: 2772-2781 (1986). 20 ug deste complexo hapteno-veículo, no qual foi complexado YCl^ ^nãomarcado, foram injectados por via subcutânea em ratos BALB/C no dia 0 com adjuvante de Freundschem, no dia 7 e 14 com adjuvante de Freundschem incompleto e no dia 21 com PBS. No dia 24 os braços dos ratos com os mais altos títulos de anticorpo anti-DTPA foram fundidos com a linha de células de mieloma SP210-Agl4 (Shulman et al. Nature 276:269 (1976)).

Os hibridomas formados foram ensaiados num ensaio ELISA especíioo (exemplo 2) quanto à produção de anticorpos monoclonais de alta afinidade.

Exemplo 2:

Ensaio ELISA de inibição quantitativa para MAk por meio de complexos de DTPA ou EDTA

Como material de suporte foram utilizadas placas de microtítulo divisíveis, de poliestireno, de 96 cavi_ % dades (forma U) tipo B, da Firma Nunc. 4-60 445. O ensaio foi realizado de acordo com o seguinte protocolo.

(1) pipetaram-se por cavidade 50/ug de conjugado Y-benzil-DTPA-HAS 19 com uma concentração de 1 /ig de conjugado por ml de PBS, pH 7,2 e incubou-se uma noite à temperatura ambiente (TA).

(2) 0 sobrenadante foi removido por aspiração e lavado 3 vezes com tampão tris-citrato 0,05 M, pH 7,4 (solução de lavagel 1) (1 x lavagem = enchimento de cada cavidade com cerca de.200 ul de solução de lavagem, deixar em repouso 2 minutos, aspirar).

(3) Se a placa de microtítulo não for necessária imediatamente, deixa-se uma noite sobre celulose à temperatura ambiente (aberturas para baixo). Em se= 4 =

Q .

x*'· fe,

Γί (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) guida a placa é encerrada em folhas com cartuchos desidratantes (Firma Gaplast, Apt^ 529, 8100 Germishe-Partenkirchen). Nestas condiçoes as placas podem conservar-se a +4°C durante pelo menos 8 semanas .

Colocam-se 250 ul da solução de bloeo por cavidade e deixa-se incubar 30 minutos a 37°C.

Durante a formação dos blocos realiza-se a pré-incubação de sobrenadante de hibridoma dluído com o competidor (ver exemplo 3 ou exemplo 6).

Tomam-se dos sobrenadantes de hibridomas a ensaiar, convenientemente diluídos previamente e incubados previamente, por cada cavidade, 50 ul e deixam-se incubar 30 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida lava-se 3 x com a solução de lavagem 2.

Seguidamente aplicam-se por cada cavidade 50 ul de anticorpos de cabra I_gG^ anti-rato diluídos a 1:500 na solução de bloco, marcados com fosfatase alcalina, e deixa-se incubar 30 minutos à temperaturaa ambiente.

Seguidamente lava-se 3 x com solução de lavagem para p

Enzygnost (Behringwerke AG).

Em seguida adicionam-se 50 ul de NADP 0,1 mM.

Deixa-se depois incubar 30 minutos à temperatura ambiente.

Durante a incubação com NADP adiciona-se o sistema de reforço como se segue:

adicionam-se por placa 2 partes de violeta de p-iodo-nitrotetrazólio (INT) e uma parte de PBS, pH 7,2, adiciona-se depois 1 parte de diaforase e pipeta-se ainda 1 parte de ADH.

Adicionam-se 50 ul deste sistema de reforço por cavidade .

(13) = 5 =

'Χ „χ· (14)

Quando se dá uma nítida viragem de cor incolor para vermelho a reacção é parada com 100 ul de uma solução 0,1 N de ácido sulfúrico por va cavidade.

p (15) Medem-se as extinções a 492 nm em TITERTEK MULTISCAN. Como ensaio em branco utilizam-se 50 ul de NADP com 50 ul de solução de reforço e 100 ul de ácido sulfúrico 0,1 N.

Foram utilizados os seguintes reagentes:

NADP - Fa. Sigma Best. Nr. N-0505

INT	- Fa. Sigma Best. Nr.	1-8377
ADH	- Fa. Sigma Best. Nr.	A-3263
DIAPHORASE - Fa. Sigma Best. Nr	.D-2381
Solução	de
lavagem	2 - Fa. Behring, Best.	Nr. OSEW96, contém

Tween/PBS

Solução de bloco: PBS, pH 7,2, por adição de caseina e agitação de 30 minutos, é ajustada a 3 7 em caseina e também a pH 7,4. Seguidamente eliminam-se por centrifugação as partículas durante 10 minutos a 4.000 rpm.

Anticorpos de cabra IgG^ anti-rato diluído, marcado com fosfatase alcalina (Firma Southern Biothchnology Associates,

No. de catálogo 1080-04).

Preparação de NADP 0,1 mMs

Dissolvem-se 7,65 mg de NADP em 100 ml de tris 20 mM, MgSO^ 0,1 mM, pH 9,5; a solução pode ser conservada vários meses a -202C.

Preparação de INT (violeta de p-iodo-nitrotetrazólio):

Dissolvem-se 2,5 mg/ml em etanol a 30 $ ©m banho de ultrassons; utilizar sempre solução recem-preparada.

Preparação de diaforase/ml de PBS, pH 7,2, conservada em pequeas porções a -20°C.

Preparação de disegrogenase de álcool:

= 6 =

Ι β- , ^:ϊ%

Η'

0,5 mg de ADH/ml de PBS, pH 7,2, são conservados em porções a -20°C.

Exemplo 3

Pré-incubação do sobrenadante de hibridoma com o comptidor

A concentração de IgG de rato no sobrenadante de hidrogedoma pode ser determinada pormeio de sistemas ELISA quantitativos obtidos comeroialmente e constituem uma técnica corrente.

Com base na determinação da concentração em ELISA diluem-se os sobrenadantes de hibridoma a 1,25 /ig/ml em PBS isento de Ca⁺⁺ e de Mg⁺⁺ .

Calculo de gramas em mol: 150 000 g = 1 mol de MAk 1 ,25 /Ug = 8,33 x 10¹² mol

Para se ter uma ralçaõ 1+1 de MAk e inibidor adicionaram-se a 50 /ii de sobrenadante de hibridoma com uma concentração de -12

8,33 x 10 mol/ml 10 /jl de inibidor com uma concentração elevada de um factor 5 de 8,33 x 10 ¹² mol/200 ul.

sobrenadante de hibridoma é incubado 30 minutos à temperatura ambiente com um excesso de competidor de 100 000 vezes, de 50 ooo vezes, de 10 000 vezes, de 5 000 vezes e de 100 vezes. Destas soluções pipetam-se 50/Jl para os ensaios ELISA (ver exemplo 2, ponto 6).

Exemplo 4

Produção de complexo de DPTA ou EDTA

As constantes de complexos de DTPA ou de EDTA para os iões metálicos oonstantes do quadro I é extremamente alta, de modo que na mistura em proporção equimolecular de DPTA ou EDTA COcom estes iões metálicos é de esperar uma saturação completa. Os iões metálicos correspondentes foram incubados por essa razão num excesso molar triplo com o DTPA ou EDTA. Como exemplo incubaram-se 170/Jl de uma solução = 7 =

mM de sulfato de cálcio em água bidestilada (ver exemplo 5) com 30 yul de uma solução-mãe 0,028 de DTPA em água bidestilada durante 5 minutos à temperatura ambiente. A incorporação de 10 ul desta solução de competidor ocom o sobrenadante de hibridoma conduziu a um excesso de 100 000 vezes de competidor relativamente ao anticorpo monoclonal contio no sobrenadante de hibridoma. Foram obtidos menores relações de competidor para MAk diluindo-se a solução de competidor de harmonia com o exces so molar pretendido (ver exemplo 3) em cada uma das soluções de iões salinos.

Exemplo 5

Fontes e parâmetros fisico-químicos relevantes dos iões metálicos utilizados

Prepraram-se soluções 10 milimolar em água bidestilada dos seguintes iões metálicos:

cloreto de manganês PM 161,88

Fa. Merck Nr. 5934	Raio	iónico	Mn: 80 pm
sulfato de cálcio PM 256,5 Fa. Riedel de Haen Nr. 31145	Raio	iónico	Cd: 97 pm
Cloreto de zinco PM 136,28 Fa. Merck Nr. 8816	Raio	iónico	Zn: 74 pm
Sulfato de cobre PM 159,61 Fa. Riedel de Haen Nr. 31294	Raio	iónico	Cu: 96 pm
Cloreto de étrio PM 303,36 Fa. Aldrich Nr.20,491-9	Raio	iónico	Y: 92 pm
Nitrato de chumbo (II) PM 331 ,20 Fa. Riedel de Haen Nr. 31137	Raio	iónico	Pb: 120 pm

Exemplo 6

Imunoensaio enzimático competitivo para determinação da concentração de EDTA ou de DTPA em dissolventes aquosos No ensaio ELISA quantitativo de inibição, descrito no exemplO ibmilWffTeaatfBE:

^?^3222£aSBBea«we lí^·

2, em vez das quantidades de competidor definidas (linhas 15 - 17, passo 5) incorpora-se uma amostra aquosa (50 ul) com um teor desconhecido de EDTA, a determinar. A restante marchad do ensaio é realizada como foi descrito no exemplo 2, passo 6-15. A redução daextinção é proporcionar à concentração de EDTA ou DTPA nas amostras desconhecidas. Depois de ajustamento de uma recta de calibração por adição de concentrações definidas de EDTA ou DTPA e da correspondente diluição prévia das amostras desconhcidas a ensaiar, determina-se quantitativamente a concentração de EDTA ou DTPA nas amostras desconhecidas.

Exemplo 7

Descrição de MAk especialmente apropriado BW 2050/535

Os genes V„ Ee V_T de MAk BW 2050/535 foram clonados de acorh L do com o método descrito por Orlandi et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86, 3833 (1989)) θ em seguida foram sequenciados.

A sequência dos ácidos nucleicos do gene do MAk BW 2050/ /535 está representada no quadro 11 e a do gene V/ está representada no quadro III. A sequência do gene V_R compreende a sequência codificante para os aminoácidos 4 a 110 da proteína madura.

A sequência do gene compreende a sequência codificante dos aminoácidos 3a 106 da proteina madura.

Os aminoácidos estão indicados no código de três letras.

1=)

M quantitativ de MAk por complexos de DTPA ou o

ti

Ό (ti ti o

W •rl ,O •rl ti •rl

O

Ό

O +5 ti $

•H| ti

	*rí		•H'ti
	B
	(ti	0	ti ti
	•rl	ti	B
	«	(ti	ti o	s	c	c
	I	•P	rti !ti
	CM	ti	ti t»
		0	ti ·Η
	t—	ti	ti X!
		p
		Oh	m	cn	cn	cn
		1	o	o	o	o
		<i	X—	x—	x—	X—
		Ph		X	X	X
		Eh		LO	LG	LG
		Q
		ti
o		O
!ti		1	cn	cn	cn	cn
O>			o	o	o	o
ti		Oh	x—	X—	t—	\—
		Eh	X	X	X	X
•H		fi	m	in	LG	LG
i—I
ti
T3		ti
		N
O		1	cn	cn	cn	cn
!ti		«1	o	o	o	o
O		Oh	T—	r-	χ—	X—
•H		Eh	X	X	X	X
		Ω	LTl	ITi	LG	LG
•H
ti
•H
		Ό
ti		O
Ό		\|	Cd	cd	Cd
		«ã\|	O	o	O	Cd
		Oh	x—	χ—	V~	O
		H				X—
O		P

tn cn o

cn o

Cd o

N ti Ό C O O (D ti cr ti o Ό •H

-O ω ό o. m

I «ai

Pm

Eh fi

C<1

Cd

Cd ti

Ό •H ι—I «i

Oh

Eh

O cn o

cn o

Cd ο ω ο M ti ti <ti Ό ti Ό (D ti ti WJ •H +3 ti ti ti ti ι—1 O ε

I «a!

Oh

Eh

O

X in

X

LO o w w ti o ti

I «ai at o

LO o

Cd cn

Lfl \

o

LO

O

Cd

Cd cn

LA \

o

Lti

O

Cd =r cn m

\ o

m o

cd in cn

Lfi \

o

LO

O

Cd ο

w õ>) d

d α

rl •P d

o o

U

I «I

Eh fi

W

N

I

Eh

Q

W

Ό

O

I

EH fi ω

£ <3

EH fi

M «s»

EH fi

W

EH fi

M

I w

Ci d

d +5

G O Ή d OM Ό -P •rl O O G *í d oo o

oo o

CM

I •rl tí •H'(D P> d d s

Λ c

CD d X3 o

w olo •rl O

CM

OO

O

OO

O oo o

oo o

X

LO oo o

C\J

C\l oo o

CM oo o

C\l o

CM oo o

oo o

C\J

CM

CM oo o

CM o

CM

H		•=0	Ç—		=t	LO
	•	l>	oo	OO	00	OO
0	d	V—	LO	LO	LO	LO
d	iz;	\	\	\	\	\
Ό		o	O	O	O	O
d		LO	LO	LO	LO	LO
3		O	O	O	O	O
σ	£	CM	CM	CM	CM	CM

f s ^r

í-l

ra	fl	bO	fl	bO	CQ	o	a	4-1
0	X	nS	X	cti	>3	X	φ	P	φ
CtS	X	o	bO	ra	X	o	I—1	O	X
o	W	ra	fl	bO	O	ra	c	44)	Φ
bO	•H	ra	ι—!	O	fl	ra	I—1	-P	χ
X	>	bO	bO	O	fl,	o	bO	44)	fl,
O	fl	X	O	O	o,	ra	fl	O	Φ
O	Φ	O	fl	ctí	ra	X	Φ	44>	X
X	ra	o	fl,	bO	ra	o	X	44)	44)
bO	3	bO	bO	X	fl	0	fl	bO	O,
X	Φ	bO	fl	ra	>>	ra	r*3	bO	fl
X	ι—1	ra	ra	X	X	X	X	44)	44)
bO	CQ	bO	fl	ra	ra	o	ra	ra	bO
ra	>3	cC	I—1	Ct)	i>3	o	X	bO	fl
ra	X	O	bO	Ctj	X	bO	ra	ra	ra
o	1—1	bO	ω	X	fl	ra	fl	ra	bO
X	ra	(tí	r*3	0	X!	0	X	bO	fl
bO	>	Ctj	i—I	ra	X	ra	X	ra	ra

Quadro IIs

	ra	fl		bO	rd		44	fl
	o	Φ		44>	ra		ra	ta
	4-)	ta		bO	>		ra	ra
				bO	fl,'	τ—	44	i>3
τ—	o	ra	r-	bO	fl	LO	bO	I—1
s—	o	I—1	on	44	44		bO	bfl
	bO	ra		o	fl		44	fl
	bO	>3		ra	ta	\	ra	ta
\	bO	X	\	ra	ra		ra	ra
	bO	bO
v-	ra	O		ra	φ	v-	bO	ra
cn	o	fl	Cn	44>	ι—1	Ld	O	ι—1
	o	fl,		ra	•rd	V	bO	ra
	bO	ta		44	fl		44	0
	ra	>3		ra	>>		o	a
	ra	ι—1		44>	44		o	o,
	bO	rd		0	fl		44	i>3
	44>	ra		o	X		bO	i—1
	bO	i>		ra	44		bO	bfl
	44)	fl		o	fl,		44	Φ
	44)	φ		ra	ta		44	1—1
	O	rd		bO	ra		ra	•rd
	bO	fl		ra	ca		bO	bfl
	ra	rd		ra	i>3		bO	fl
	bO	bO		ra	rd		ra	ra
	ra	ra		44>	Φ		ra	>3
	o	rd		44»	ι—I		bO	ι—1
	bO	ra		ra	•rd		bO	bO
	bO	>3		o	Ci		44	Φ
	bO	I—1		ra	ta		44	1—1
	bO	bO		ra	ra		ra	•rd
	44)	fl		ra	fl		bO	fl.
	O	Φ		44)	φ		bO	fl
	44)	ca		X	rd		44	44
	bO	fl		o	>3	ί—	bO	fl
	ra	rd	Cd	bO	rd	-=t	ra	rd
	o	bO		bO	bO		bfl	bfl
	bO	fl		44	fl		bO	fl
	ra	ι—1		O	Φ		44	Φ
	o	bO		44	ta		O	rd
	bO	fl		44	ra		O	i>3
	44)	Φ	3—	Φ	rd	Cd	bfl	i—1
	O	1—I	CO	bO	ra	r~	bfl	bfl

	o ra ra	fl ca ra	44 o 44	a φ w
	o	a	5—	44	ra
t-	o	φ	cn	bfl	>3
	44	ta		44	0
	o	fl		O	A
\	o	φ	\	ra	>3
	44	ca		44	44
τ—	ra	fl	V-	44	fl
v—	o	x	t-	ra	>3
<\]	ra	44	c\l	44	44
	0	fl,		o	rd
	ra	ta		44	ra
	bfl	ra		bfl	í>
	ra	ra		O	ra		0	fl
	o	1—1		o	H		o	X
	bfl	ra		bfl	ra		ra	X
	ra	a		I—1	α		0	I—1
	o	x		o	x		X	ra
	ra	44		ra	X		bO	>
	ra	fl		o	α,		bfl	a
	44	Φ		ra	ra		0	X
	44	i—1		bfl	ra		ra	X
	44	fl		bfl	ra		0	fl
	o	X		ra	r^-1		o	X
	ra	44		bO	bO		ra	X
	o	ra		rd	fl		bfl	>3
	o	rd		O	Φ		X
	bfl	ra		1—1	m		bO	bfl
						bfl
	bfl	ra		ra	A		ra	fl
	ra	i>3		o	X		ra	1—1
	ra	I—1		ra	X		0	bfl
	O	>3	\—	bfl	ra	V”	o	l>3
<o	bfl	rd	cn	44	φ	0	bfl	X
	bfl	bO		o	X		bfl	bfl
	bfl	fl		0	A		bfl	fl,
	ra	l—1		bfl	φ		bfl	fl
	o	bO		ra	ra		X	X
	o	Φ	\—	o	A	ΐ—	O	fl
00	44	xi	x·	bfl	φ	o	ra	>3
	44	fl,	Cd	ra	ra	on	X	X

<5 pZ

	3	O	o	3	X	3	3
X	3	O	3	o	I—1	O	X	bO	rd
o	to	O	a	bO	3	3	X	bO	bO
3	o
o	3	3	3	X	O	bO	3	X
X	X	3	to	o	3	3	1—1	bO
o	X	3	ι—1	o	a	O	bO	bO	rd
									bO
X	3	3	3	X	ι—1	3	3	o
bO	Φ	3	1—1	X	3	O	t—1	X	Φ
X	X	bO	bO	bO	>	bO	&0	X	X
									3
X	3	3	3	X	to	bO	ctí	bO
o	X	3	ι—1	bO	ι—1	bO	ι—1	X	ι—1
3	X	O	bO	bO	bO	bO	3	bO	Cti
									>
o	1—I	O	1—I	bO	O	3	to
X	ni	X	3	O	3	O	X	bO	3
íàfl	t>	bO	!>	O	3	3	bO	bO	3
								X	X
nj	3	bO	a	X	3	O	3
o	X!	bO	3	o	ι—1	X	X	O	ω
cú	X	X	X	bO	3	3	X	3	•rl
								O	X
ni	3	O
ni	1-1	o	3	3	bO	O	Φ	O	3
bO	bO	3	XI	bO	3	O	X	3	3
			X	Φ	3	3,	•rl	3	3
-P	>5 *“	O
bO	X CO	O	3	v- O	3	O	3	Φ	3
bO	bO	bO	1—1	LO 3	3	Ε- X	X	bO	ω
			(ΰ	3	3	O	X	3	m

2050/535 VI. ' Quadro III:

X o o 3 O X 3 O 3

O 3 3 3 Φ 3 3 X X

CTi

X 3 X Φ 3 3 X bO 3

3 X 3 3 3 3 Φ 3

V” LO

bO 3 3 Φ Φ 3 X X bO

3 !>> X 3 X X to 1—1 bO

τ— *C“ C\1

o Φ bO X o bO bO 3 3

3 Φ rd 3 1—1 3 3 ÍO 1—1

Φ 3 X bO bO X 3 X Φ

3 to X a 3 X 3 Φ X

O

3

X

3

X

to

Φ

3.

X

3

O

X

O

X

1—1

3

o

ι—1

3

X

3

X

bO

3

bO

3

O

3

Φ

3

ÍO

X

3

X

Φ

X

I—1

bO

I—1

bO

to

O

X

3

X

3

•rl

bO

X

o

3 O bO	3 I—1 3	X X bO	i—l eti >	3 X O	3 Φ X	X X 3	o I—1 X	O X X	Φ X ft
X	3		3	X	to	bO	3	X	3	Φ	Φ
c	Φ	X	I—1	bO	I—1	X	Φ	3		X	rd
X	3	O bO		bO	bO	O	X	X	43	3	•rl
3	3	bO	>5	X	3	O	3	3	ω	X	CO
3	X	bO	rd	Φ	X	o	Φ	X	rd	3	to
bO	bO	bO	hO	3	X	X	3	3	•rd	3	I—I

bO

3

X

3

Φ

o

to

3

bO

ÍO

3

X

Φ

X

bO

X

Φ

1—1

X

Φ

X

bO

3

X

(3

bO

3

Φ

I-1

X

3

X

3

V“

3

bO

3

Έ— o

bO

m

O

X

C\1

bO

Φ

X

Φ

MD

O

Φ

OO'

3

ι—1

«—

3

í>^

3

X

3

X

3

bO

3

rd

bO

3

X

3

Φ

X

a

Φ

3

X

Φ

O

Φ

3

•rl

X

3

O

X

O

1—1

X

3

Φ

X

a

bO

3

X

bO

3

o

bO

T—

X

3.

3

bO

3

bO

to

3

i—1

\—

bO

3

C\J

3

OO

bO

3

-ΓΓ

3

I—1

O

bO

rd

O

bO

x>

O

3

r~

bO

3

V“

3

Cd

bO

co

bO

Claims

-REIVINDICAÇÕES_ 1a _

Processo para a preparação de anticorpos mono clonais de alta afinidade (MAK) que reagem no estado complexa do e no estado não complexado com aproximadamente a mesma especificidade e avidez contra EDTA ou DTPA, caracterizado por se utilizar isotiocianato-benzil-DTPA ou isocianato-benzil-EDTA como hapteno acoplado e albumina de soro humano (HSA) oomo veículo (carrier) para imunização e por se isolar o anticorpo monoclonal referido dos hibridomas produzidos.

- 25 Processo de acordo com a reivndicação 1, caracterizado por se isolarem os anticorpos monoclonais referidos dos hibridomas resultantes por meio de um ensaio ELISA de competição com HSA-benzil-DTPA ou, HSA-benzil-EDTA como fase sólida.

- 3 -5 Processo para a preparação de líquidos aquosos contaminados com iões pesados, caracterizado por se utilizarem materiais filtrantes contendo anticorpos monoclonais preparados pelos processos das reivindicações 1 ou 2, ou por se adicionarem anticorpos monoclonais preparados segundo o processo das reivindicações 1 ou 2, e em seguida se separarem

- 45 Processo para a determinação quantitativa de EDTA ou DTPA em soluções aquosas, caracterizado por se utilizarem anticorpos monoclonais preparados pelos processos das reivindicações 1 ou 2, de preferência na forma de um imunoensaio apropriado.

A requerente reivindica a prioridade do i, ^J» pedido de patente alemão apresentado em 7 de Março de 1990, sob o No. P 40 07 079.4.