PT96836B - Processo para a preparacao de peptideos inibidores da coagulacao sanguina - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a peptídeos que inibem a coagulaçao sanguínea, a um processo para a sua preparaçao e a sua utilização como anticoagulantes.
Os anticoagulantes sao de grande importância terapêutica para o tratamento de diferentes doenças que afectam a coagulaçao sanguínea, como a coagulaçao intravascular disseminada, o infarto do miocárdio e a trombose das veias profundas. Para a terapia destas doenças têm sido até agora utilizados anticoagulantes, como a antitrombina III obtida a partir de plasma humano.
Primitivamente foi experimentado como anticoagulante um polipeptídeo obtido da sanguessuga (Hirudo medicinalis) formado por 65 ácidos aminados. No entanto a utilização da hirudina, como é também conhecido este peptídeo, caracteriza-se por vários inconvenientes. Um inconveniente e a problemática da reduzida disponibilidade desta substância. 0 alto peso molecular relativo deste peptídeo pode também ser origem de dificuldades, devido ao potencial perigo de
SB formaçao de anticorpos.
Estes inconvenientes puderam ser ultrapassados por meio do desenvolvimento como anticoagulantes de peptideos de baixo peso molecular que apresentam um alto grau de homologia em relaçao ao dominio C-terminal da hirudina. Estes peptideos foram descritos no pedido EP-A 0 276 014, na Patente EP 0 333 356 e numa publicação de
J. M. Maraganore et al., J. Biol. Chem. 264, 8692-8698 (1989).
Como se conclui das referências citadas, e de especial interesse um peptídeo com a estrutura Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Foi possível detectar uma actividade especialmente elevada num peptídeo cuja tirosina (Tyr) se encontra sulfatada no grupo fenolico. Este peptídeo corresponde de resto à hirudina nativa, cuja tirosina na posição 63 se encontra sulfatada.
Sao igualmente de interesse peptideos cíclicos. Estes peptídeo contêm para além da sequência já referida o ácido aminado cisteína nas extremidades C — e N-terminais, o que permite uma ciclizaçao por meio de um dissulfureto. Em vez de uma ponte de dissulfureto é possível utilizar outras funções químicas, de preferência um acoplamento por meio de uma ligaçao de amida.
Segundo a sua natureza quimica, uma tirosina sulfatada é um éster do ácido sulfúrico, de tal modo que a ligaçao entre o átomo de enxofre e o átomo de oxigêno fenolico pode ser cindida por hidrólise. Estes peptideos têm a desvantagem de possuírem actividades anticoagulantes reduzidas.
De acordo com o estado da técnica, investigou-se por consequência a sulfataçao da tirosina por meio de uma reacçao química ulterior. Para este fim fizeram-se reagir os peptideos de hirudina nao sulfatados com diciclo-hexilcarbodiimida e ácido sulfúrico em solventes orgânicos. A sulfataçao pode também ser conseguida por meio de uma reacçao do peptídeo que contém por meio de trióxido de sulfato de trietilamónio em piridina ou em piridina ou ácido clorosulfónico.
Estas reacçoes caracterizam-se no entanto pela desvantagem de darem lugar a reacçoes secundárias na fenilalanina ou a uma sulfataçao nao selectiva da vários resíduos de tirosina que estejam presentes. Por esta razao podem também resultar elevadas perdas de redimento.
A presente invenção tem por conseguinte por objectivo evitar estes convenientes e proporcionar peptídeos com propriedades físicas, químicas e fisiológicas melhoradas.
Este objectivo foi atingido de forma surpreendente por meio da substituição nos peptídeos do acido aminado tirosina ou Tyr (SO^H) pelo acido aminado Phe(SOgH) ou PheCPOgH^) ou Pgl(SOgH) (Pgl significa fenilgligrupo sulfonato ou fosfato encontracina) ou PglíPOgl^)
-se de preferência situado da fenilalanina, sendo no ligaçao na posição meta.
na posição para do anel fenilico entanto igualmente possível uma
A presente invenção
-se por conseguinte a um peptideo da formula geral:
refereA1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15 em que
Al significa hidrogénio, cisteina, um ou dois grupos alquilo com 1 a 4 átomos de carbono, um grupo acilo com 2 a 10 átomos de carbono, um grupo acilo 2 a 10 átomos de carbono e adicionalmente um grupo carboxilo ou um grupo protector habitual da química dos peptídeos,
A2 significa uma ligaçao, Asn, Asp, Gin ou Glu,
A3 significa Glu ou Asp,
A5 significa Phe, Tyr, Trp, Pgl (fenilglicina) ou Nal (naftilalanina),
A6 significa Glu ou Asp,
Α7 significa Glu, Asp, Pro ou Ala,
A8 significa Ile, Leu, Vai, Nle ou Phe,
A9 significa Pro ou Hyp,
AIO significa Glu ou Asp,
All significa Glu ou Asp,
A12 significa PheCSO^H) ou Phe/PO^]^) (de preferência na posição p) ou significa PglCSO^H) ou ΡήθζΡΟ^Η^) (de preferência na posição p),
A13 significa uma ligaçao, Leu, Ile, Vai ou Ala,
A14 significa uma ligaçao, Gin, Asn, Glu, Asp ou Cys e
A15 significa Cys, Cys-amida, um grupo OH do grupo alfa-carboxilo, livre ou esterificado com um álcool inferior com um máximo de 4 átomos de carbono, que também se pode apresentar sob a forma de uma função carboxamida, cujo hidrogénio pode ser eventualmente substituído por grupos alquilo com um máximo de 4 átomos de carbono.
Se Al e o acido aminado cisteina, o grupo amina também pode ser acetilado.
A síntese dos peptídeos da presente invenção pode ser efectuada de acordo com métodos bem conhecidos em si (G. Barany e R. B. Merrifield em The Peptides (E. Gross e I. Meienhofer, Ed.)).
Os ácidos aminados Phe(S03H) ou Pgl(SO3H) podem ser obtidos por sulfonaçao de fenilalanina ou de feniglicina, respectívamente, podendo apresentar-se nas formas D, L ou DL, de preferência na forma L. Como agente de sulfonaçao pode usar-se ácido sulfurico, que de preferência deve conter ainda trióxido de enxofre.
Estes ácidos aminados sulfonados foram protegidos nos grupos amina com um grupo protector de acordo com o processo conhecido de C. D. Chang et al., Int. J. Peptide Protein Res. 15, 59 (1980), a fim de tornar possível a preparaçao dos peptídeos da presente invenção. Os grupos protectores usados podem ser, por exemplo: os grupos Boc, Z, Bpoc, Ddz e de preferência Fmoc.
A preparaçao dos peptídeos é efectuada por um método de síntese de peptídeos em solução mediante o emprego de metodologias conhecidas (E. Wunsch em Houben-Wey1, Synthese vom Peptiden I, G. Thieme Verlag, Estugarda (1974) ou por métodos em fase sólida igualmente conhecidos (ver acima), utilizando-se de preferência o grupo protector Fmoc.
Os grupos sulfonato ou fosfato sao utilizados na síntese sem protecçao
No método da síntese peptídica em fase sélida, a cadeia peptídica é construída num suporte de poliestireno (designado em seguida por resina) reticulado (1 7a de divinilbenzeno) . Para a síntese de peptídeos com grupos carboxilo livres utilizou-se uma ancoragem com base em álcool alcoxlbenzílico. Para amidas peptídicas utilizaram-se ancoragens de amida (Int. J. Peptide Protein Res. 34, 262-267, 1989) que produzem peptidamidas nao alquiladas. A incorporação de cada ácido aminado protegido é efectuada de acordo com a seguinte rotina repetitiva:
- Carga do ácido Fmoc-aminado-resina (ou âncora de amida-resina) num sintetizador de peptídeos automático
Lavagem da resina com DMF, diclorometano ou N-metilpirrolidona (cerca de 15 ml/mg)
Cisão dos grupos Fmoc com piperidina a 20 % em dimetilformamida ou N-metilpirrolidona (de preferência
1x3 min e 1 x 10 min)
Eliminação da piperdina por lavagem com DMF, diclorometano, N-metilpirrolidona ou um álcool, de preferência isopropanol — Acoplamento do acido aminado com uma carbodiimida, de preferência com diisopropilcarbodiimida, eventualmente
- 5 com adiçao de HOBt, HOSu ou com utilização de BOP ou TBTU eventualmente com adiçao de HOBt, de preferência em DMF ou em N-metilpirrolidona.
As cadeias laterais dos ácidos aminados trifuncionais sao protegidos como se segue:
Asp e Glu sob a forma de ésteres de t-butilo Hyp e Tyr sob a forma de ésteres de t-butilo
Cys sob a forma de éter tritílico ou de dissulfureto de terc-butilo
Em vez da química de Fmoc anteriormente apresentada estes peptídeos podem também ser preparados com a estratégia de Boc (J. M. Stewart e J. D. Youg Solid Phase Peptids Synthesis Pierce Chemical Co., 1984, págs. 71-95), uma vez que o grupo sulfonato nao é influenciado pela utilização repetitiva de ácido trifluoroacético.
Os peptídeos sao separados da resina quando se utiliza a química de Fmoc por meio de acido trifluoroacético, de preferência com adiçao de um aceitador de ureia, e sao cristalizados com éter. Após purificação por meio de cromatografia de fase invertida confirma-se a sua composição por meio de análise de ácidos aminados e de espectrometria de massa FAB.
Quando se preparam peptídeos que contem cisteina, no caso de Cys(Trt) elimina-se o grupo protector tritilo simultaneamente com a separaçao do peptídeo da resina, contanto que a mistura de hidrólise contenha um tiol, de preferência etanoditiol, como aditivo.
Quando se utiliza Cys(StBu), de preferência elimina-se o grupo S-tBu após hidrólise do peptídeo. Para este fim torna-se necessária a utilização de processos conhecidos, como por exemplo o tratamento com tri-n-butilfosfina ou de ditiotreitol, De preferência utiliza-se a eliminação dos grupos protectores com ditiotreitol.
A ciclizaçao por meio de pontes
S-S pode ser efectuada por meio de processos oxidativos conhe6 eidos .
De preferência dissolve-se o peptideo que contém cisteína numa concentração de 0,1 a 0,001 mM em tampao de hidrogenocarbonato de amónio (0,01 M) e agita-se ao ar durante várias horas. A ciclizaçao é seguida por HPLC.
Sao para este fim também adequados outros processos de ciclizaçao, como por exemplo oxidaçoes como iodo, por exemplo em ácido acético, ou KgCFe(CN)g3.
Em alternativa é possível a preparaçao segundo um processo que decorre em solução, sendo neste caso em primeiro lugar preparados fragmentos simples do peptideo pretendido. A condensação de ácidos aminados protegidos isolados formando segmentos peptídicos é efectuada num solvente como DMF ou tetra-hidrofurano ou em misturas destes solventes. 0 acoplamento dos ácidos aminados e efectuado por meio de carbodiimidas, como no caso da síntese em fase sólida. Reunem-se os segmentos simples de modo a formar os peptideos pretendidos. Após eliminação dos grupos protectores purificam-se igualmente os peptideos e caracterizam-se.
A actividade dos peptideos e determinada por meio de um ensaio funcional.
Os peptideos preparados sao os apresentados em seguida, nao devendo no entanto eonsiderar-se o âmbito da presente invenção restrito a estes:
Abreviaturas:
Asn L-Asparagina
Asp Ácido L-aspártico
Cys L-Cisteína
Gin L-Glutamina
Glu Ácido L-glutâmico
Gly Glicina
Ala L-Alanina
Tyr L-Tirosina
Phe Fenilalanina
Trp L-Triptofano
Pgl L-Fenilglicina
Pro L-Prolina
Ile L-Isoleucina
Leu L-Leucina
Nle Norleucina
Vai L-Valina
Nal L-Naftilalanina
Hyp L-Hidroxiprolina
Boc t-Butiloxicarbonilo
Z Benziloxicarbonilo
Bpoc Bifenilildimetoxibenziloxicarbonil
Fmoc Fluorenilmetiloxicarbonilo
DMF Dimetilformamida
HOBt 1-Hidroxisuccinimida
Ac Acetilo
Suc Succinimidilo
BOP Hexafluorofosfato de benzotriazolil-l-oxi-tris-(dimetilamino) fosfónico
TBTU tetrafluorofosfato de 2(1H-Benzotriazolil-1)-I,l,3,3-tetrametil-urónico
Osn ester de succinimida
TFA Ácido trifluoroacético
DIC Diisopropilcarbodiimida
S-tBu terc-Butiltio
Trt Tritilo
FAB Fast Atom Bombardment
Exemplos
Exemplo 1
Preparaçao de Fmoc-Phe^OgH)
Dissolveram-se 20 gramas de L-fenilalanina numa mistura de 17 ml de oleum (ácido sulfúrico concentrado contendo trioxido de enxofre em excesso) a 30 % e 20 ml de ácido sulfúrico concentrado, Aqueceu-se a mistura reaccional durante 1 hora a 100°C e em seguida verteu-se sobre 200 ml de água gelada.
Neutralizou-se o ácido com hidróxido de bário e separou-se o sulfato de bário por filtração. Cromatografou-se o filtrado através de uma coluna (Dowex 50WX2, 50-100 mesh, dimensões 230 x 32 mm) usando água como eluente. Após evaporaçao do solvente obtiveram-se 18,5 gramas de L-para-sulfofenil-alanina.
Retomaram-se 7,35 gramas do ácido aminado em 150 ml de uma solução de carbonato de sodio a 10%. A esta solução adicionou-se uma solução de 10 gramas de Fmoc-OSu em 300 ml de dioxano com agitaçao. A mistura reaccional tornou-se imediatamente gelatinosa e foi agitada durante 2 horas a temperatura ambiente. Separou-se o precipitado por filtraçao e eliminou-se o dioxano por evaporaçao. Extraiu-se a solução aquosa 3 x com éster e acidificou-se com ácido clorídrico 1 N até pH 2.
Extraiu-se uma impureza residual com acetato de etilo. Evaporou-se a fase aquosa à secuta com um evaporador rotativo e secou-se a resíduo cristalino sob vácuo sobre Sicapent^.
Exemplo 2
Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-0H
Prepararam-se 0,83 gramas de resina-Fmoc-Leu (0,5 mmoi) num sintetizador de peptídeos da firma Advanced Chemtec (Louisville, Kentucky, EUA) de acordo com as instruções do fabricante para o acoplamento do próximo ácido aminado. Dissolveram-se Fmoc-PheíSO^H) (1,5 mmoi) e 2,25 mmoi em 15 ml de DMF e 15 ml de DMSO e trataram-se com
1,6 mmoi de DIC. Apos uma hora adicionou-se a mistura reaccional a resina-Leu e procedeu-se a operaçao de acoplamento durante duas horas. Em seguida comprovou-se a síntese de acordo com procedimento normais. Para o acoplamento utilizou-se TBTU com um excesso de 3 vezes do ácido aminado. 0 período de acop9 lamento foi de 35 minutos de cada vez. Tratou-se a resina-peptídeo com 27 ml de TFA, 1,5 ml de etanoditiol e 1 g de resorcina durante uma hora. Cristalizou-se a solução do peptideo em éter, separou-se por filtraçao e secou-se. 0 rendimento antes da purificação foi de 405 mg. Purificaram-se 110 mg deste peptídeo impuro numa coluna de HPLC (Shandon, RP-18, 250 x 20 mm) com um gradiente de 0,1 TFA/acetonitrilo. Isolou-se o peptídeo por liofilizaçao (rendimento 48 mg). Após hidrólise determinou-se um conteúdo em peptídeo de 87%.
A composição em ácidos aminados é apresentada no Quadro seguinte e corresponde aos valores esperados.
Analise de ácidos aminados: Phe(S03H) 0,95 (1)
Asp 1,95 (2)
Glu 4,18 (4)
Pr o 1,10 (1)
Gly 1,00 (1)
Ile 0,90 (1)
Leu 0,90 (1)
Phe 0,99 (1)
Ensaio;
Dissolveram-se 10 mg do peptídeo
em 1 ml de tampao (tris 20 mM e NaCl 150 mM a pH 7,5). Ensaiou-
-se o peptídeo no tempo de tromboplastina parcial (TTP) em
comparaçao com um peptídeo com a mesma sequência, que continha no entanto Tyr no lugar de Phe(SOgH).
Ensaio de TTP:
100 microlitros de plasma humano normal
100 de tampao (ver acima)
100 -- de reagente de caolina/patromtina (BEHRINGWERKE
AG) minutos a 37°C
100 microlitros de solução de CaCl2
Resultados:
Diluição Tempo de coagulaçao em segundos
Peptídeo segundo o Exemplo Peptídeo com Tyr
1:4 147.2 105.2
1:8 111.8 80.5
1:16 89.2 71.0
1:32 81.5 65.0
1:64 72.8 57.7
1:128 63.0 52.8
1:256 56.3 47.3
1:512 52.2 44.7
1:1024 46.8 41.7
Valor do branco (sem peptídeo) 38,8
As análises de ácidos aminados e de espectro de massa por FAB correspondente estão em concordância com os resultados esperados.
Do mesmo modo foram preparados os seguintes peptídeos:
H-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu~Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-OH H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(SO3H)-Leu-Gln-OH Ac-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-(SOgH)-Leu-OH Sar-Glu-Tyr-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Ile-OH Ac-Asn-Ala-Asp-Pgl-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-OH H-Asp-Trp-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-Gln-OH H-Asn-Gly-Asp-Pgl-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-(S03H)-Leu-OH H-Asp-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Asp-OH Suc-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-OH Suc-Asp-Pgl-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-0H Ac-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Nle-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Ile-Asn-NH2 Ac-Gly-Asp-Tyr-Glu-Glu-Val-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-NH2 Suc-Glu-Ala-Asp-Tyr-Glu-Pro-Leu-Pro-Glu-Glu-Phe(SOgH)-Leu-OH Ac-Gln~Ala-Asp-Phe-Asp-Asp-Phe-Asp-Asp-Phe(SO3H)-Ala-NH2 Ac-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(SOgH)-D-Leu-OH Ac-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-D-Phe(SO3h)-Leu-Gln-QH H-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Pgl(S03H)-Leu-OH Ac-Asp-Pgl-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Pgl(S03H)-Leu-OH
Ac-Asp-Nal-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(SOgH)-Leu-OH Cys-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(SO^H)-Leu-Cys-OH
Cys-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-Gln-Cys-Oh
Cys-Asn-Gly-Asp-Tyr-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-Cys-OH

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - lâ Processo para a preparaçao de um peptídeo da fórmula I
    A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15em que
    Al significa hidrogénio, cisteina, acetilcisteina, um ou dois grupos alquilo com 1 á 4 átomos de carbono, um grupo acilo com 2 a 10 átomos de carbono, um grupo acilo 2 a 10 átomos de carbono e adicionalmente um grupo carboxilo ou um grupo protector habitual da química dos peptídeos.
    A2 significa uma ligaçao, Asn, Asp, Gin, ou Glu,
    A3 significa uma ligaçao, Gly ou Ala,
    A4 significa Glu ou Asp,
    A5 significa Phe, Tyr, Trp, Pgl (f enilglicina) ou Nal (naftilalanina)
    A6 significa Glu ou Asp, A7 significa Glu, Asp, Pro ou Ala, A8 significa Ile, Leu, Vai, Nle ou Phe, A9 significa Pro ou Hyp,
    - 12 AIO significa Glu ou Asp,
    All significa Glu ou Asp,
    A12 significa PheíSC^H) ou ΡίΐθζΡΟ^Η^) (de preferência na posição p) ou significa Pgl(SOgH) ou PhetPOg]^) (de preferência p), A13 significa uma ligação, Leu, Ile, Vai ou Ala,
    A14 significa uma ligaçao, Gin, Asn, Glu, Asp ou Cys e
    A15 significa Cys, Cys-amida, um grupo OH do grupo alfa-carbonilo, livre ou esterificado com um álcool inferior com um máximo de 4 átomos de carbono, que também se pode apresentar sob a forma de uma função carboxamida, cujo hidrogénio pode ser eventualmente substituído por grupos alquilo com um máximo de 4 átomos de carbono, caracterizado por a síntese ser efectuada por meio de sintese no estado sólido ou de síntese em solução.
    - 2ã Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a cadeia peptídica ser construída num suporte polimérico por meio de acoplamento repetitivo de ácidos aminados ou de oligopeptí deos e por em seguida se cindirem estes.
    - 3ã Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a cadeia peptidica ser construída em solução utilizando ácidos aminados protegidos ou oligopeptídeos protegidos e o peptideo ser recuperado por eliminação dos grupos protectores.
    _ 4ã _
    Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por os derivados dos ácidos aminados ou os segmentos peptídicos serem acoplados uns aos outros em solução ou sobre uma fase sólida e o peptídeo ser obtido por eliminação dos grupos protectores bem como, no caso de síntese em fase solida, por cisão a partir da resina de suporte, poden13 do seguir-se no caso de peptídeos que contém cisteína uma operaçao de fecho de anel oxidativa.
    - 5® Processo de acordo com a reivindicações 1 a 4 caracterizado por no peptideo obtido o residuo A12 ser sulfonilfenilalanina na forma D ou L.
    - 6ã Processo de acordo com a reivindicações 1 a 4 caracterizado por no peptideo obtido o resíduo A12 ser sulfonilfenilglicina na forma D ou L.
    - 7ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por no peptideo obtido o residuo Al ser hidrogénio, metilo, acetilo, benzóilo ou succinilo.
    Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por o peptideo obtido ter a estrutura H-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Pro-Glu-Glu-Phe (SO3H)-Leu-OH.
    - 9â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por o peptideo obtido ter a estrutura H-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-0H,
    H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Leu-Gln-OH,
    Ac-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(SOoH)-LeuOH,
    Sar-Glu-Tyr-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(SO„H)-Ile-0H,
    Ac-Asn-Ala-Asp-Pgl-Glu-Glu-Ile-ProGlu-Glu-Phe(SO3H)-Leu-OH,
    H-Asp-Trp-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(SOgH)-LeuGln-OH,
    H-Asn-Gly-Asp-Pgl-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(SO^H)
    Leu-OH,
    H-Asp-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Asp-OH,
    S uc-As p-Phe-Gl u-Glu-11 e-Pr o-Glu-Glu-Phe-(SOgíí) -Leu-OH, Suc-Asp-Pgl-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-PheíSO^H)-Leu-OH, Ac-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Nle-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-Ile-Asn-NH2, Ac-Gly-Asp-Tyr-Glu^Glu-Val-Pro-Glu-Glu-Phe(S03H)-LeuNH2, Suc-Glu-Ala-Asp-Tyr-Glu-Pro-Leu-Pr o-Glu-Glu—Phe(SO3H)-Leu-0H,
    Ac-Gln-Ala-Asp-Phe-Asp-Asp-Phe-Asp-Asp-Phe(S03H)-Ala-NH2, Ac-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-GLu-Phe(S03H)-D-Leu-OH, Ac-Gly-Asp-Ph-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-D-Phe(S03H)-Leu-Gln-0H,
    H-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Pgl(S03H)-Leu-OH, Ac-Asp-Pgl-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Pgl(S03H)-Leu-OH ou
    Ac-Asp-Nal-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-G!u-Phe(S03H)-Leu-OH.
    A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemao apresentado em 22 de Fevereiro de 1990, sob o n*. P 40 05 591.4.
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