PT96298A

PT96298A - Processo para a preparacao de derivados de marcfortina ou de para-herquamida

Info

Publication number: PT96298A
Application number: PT96298A
Authority: PT
Inventors: Rhona Mary Banks; Simon Edward Blanchflower; Christopher Reading
Original assignee: Beecham Group Plc
Priority date: 1989-12-21
Filing date: 1990-12-20
Publication date: 1991-09-30
Also published as: IE904606A1; WO1991009961A2; EP0506814A1; JPH05502163A; WO1991009961A3; CA2071982A1

Description

0 presente inventa relaciona—se com um novo microorga™ nismc ® com compostos parasitlcidas que se podem obter a partir dele e sintéticamente«

Compostos conhecidos como marfoctinas são apresentados por Folonsky et ai em J . Coem. Soc» Cheia. Comia. <1980) pp 6fti--ó©2 (marfoctina A> e Tet. Letters C1981> Vai 22 pp 1977-1980 (atarfoc-tina B e C). Os compostos são metabolitos do fungo Penicillium

Estruturalmente relacionado com as marcfortinas SKiste um composto conhecido cosa parahsrquamida. apresentado por Yamazaki et al em Tet. Letters C1981) Vol 22 pp 135-136. A parahsrguamida é um mstabolito da fungo Penici11ium parahsrquei. é também apresentado o seu derivado dihidro. obtido por hidroge-naçlo catalítica. A Patente dos E.U.fi. Mo. A-4.866.Θ6© descreve a utilização das marcfortinas As B, C como agentes anti-parasitários. A Patente dos E.U.A. No. A-4.923 * 867 apresenta derivados das marcfortinas s a sua utilizaçõ como agentes anti-parasitários. A Patente Europeia No. A-0.301.742 descreve a utilização da paraherquafflida e da dihidroparaherquamida coso agentes anti-parasitários. As Patentes Europeia No. A-6.322.937,, Europeia No» A-0.354.615 e Europeia Να. Α-0.39Θ.532 apresentam derivados de psraherquamida e sua utilização como agentes anti-parasité-rios.

Descobrimos actua1mente um novo fungo produtor de paraherquaraida» Os compostos produzidos como metabolitos para além da paraherquamida também apresentam propriedades parasiti-cidas? sendo assim utilizáveis no tratamento de infestações parasitárias em seres humanos e animais»

Também descobrimos uma nova modificação em relação à estrutura básica de marcfortina/paraherquamida eme proporciona compostos com propriedadas paraslticidas»

Um'primeiro aspecto da inventa proporciona Penicillium sp "Ml 332» 995 s ou um seu mutanto» ma is particularmente sob uma forma biológica,mente pura»

Um segunde aspecto do invento proporciona compostos da fórmula <I)g

s® eme3 X ê onigénio ou uma ligação» Y é uma ligação simples ou uma ligaçõ dupla» R~ é hidrogénio ou metilo» ê hidrogénio ou hidroíiÍK e n »e @ ou 1 p mas excluindo paraherquamida e dihidropa- rshsrcaamida»

Um terceiro aspecto da invento proporciona um composto da fórmula (II);

(II) em quso ρ é Θ ou 1= rsnsa-se que esta composto è um bio-precursor da psraherquaraida e que pode ser usado como um intermediário na síntese da paraherquamida ou dos seus derivados.

Um quarto aspecto do invento proporciona um derivado da marefortina ou áa paraherquaaiida da fórmula parcial (IIl)i;

(III)

è ssb que Z ê CH^ s íí! ê 8 oo !s e R7 são seleccionados d© sntrs hidrogénio, hidroKi, alquilo, alcoKi, C,^ alquenilo, slquenil-C*^ sIcokí, alquinil~C1_j£, alcoKi, 0^__^ alcanoiloKi, poli C, alcoxi-C^^ alcoxi9 fenila, fenil--C>? alquilo, iri-C., , alquilsililoxi * fifenilfosforiloxi © halogénio, ^ & C· ou R" e h ' sai conjunto formam s du - CrU = s R’"' é hidrogénio ou u„ , alquilo.

Λ. ' ' i ““O

Com ©feito, este aspecto do invento proporciona um H( 12) óxido de uma roarcfortina ou paraherquamida ou um seu derivado (quando è usada a numeração usual para estes compostos). A substituição noutras posições é facultativa, mas na fórmula areia1 ocorre ds preferlncia no átomo de carbono na posição 14, ou no átomo da azoto da amida» 0 derivado da marcfariina pode ser qualquer um dos apresentados na Patente dos E-U.A. No = ft~4.923.867? cuja apresentação è aqui incorporada como referfncia» 0 derivado da paraher-qua/nida pode ser qualquer um dos apresentados na Patente Europeia No. A~O»30i »742, Patente Europeia No. A-©.354«615 du Patente Europeia No. Α--Θ = 39Θ = 532, cujas apresentações são aqui incorporadas como referencia» 0 NC 12>óxido preferido ê VH55596, d próprio MCI2)óxido de paraherquamida*

Compostos da fórmula (I) em que Y é uma dupla ligação que se pode obter como me taba li tos ds ΣΜΙ 332 = 995 são indicados no Ouadro 1 a seguira Í:lLlg5lJ I Ο í...................... j Composta ? MASS X R1 R2 ........... i N-> ! r ' ................................... i.......................... i \ 1 " 1 j VM 29919 | 493 -0“ | CH3 j OH I usente 1 jíPãr&h&rqu&mida) 3 í \ 1 1 I 1 í 1 I VM 55596 I 1 509 1 -0- j CH3 í OH i ! f presente j |C Paraherquamida) 1 ! I 1 j N< 12)“ ώ ;< .1 d o ϊ s í i 1 i ! í s í j VM 54159 j 1 477 | ! ~o- | i CH,. | w * H I 1 j ausente j ? ? 1 } VM 54158 ? \ I 477 % I f s o-w f - OH i f i ausente j | \ 1 j VM 55594 1 [ 461 í “ 1 CHT I H ! 1 1 ausente j i J I f i j VM 50095 l__________________________________________ I 447 . *................. “ 1 : ____ .... !— H | i H ! ausente J 1............. ... s 0 composto da fórmula (11) em que pé® (VM o5o99> pode também ser obtido coma um me taba li ta de ΙΜΣ 332,.995 =

Um outro aspecto da invento proporciona um processo para a produção de compostos da fórmula (I) ou da fórmula ííl)3 ou um seu derivado» que compreende a cultura de Penicillium sp. INI 332=995= ou ds um seu muisnis5 s suhssqusntsmsnts o isolamento do composto ou de um seu derivado a partir da cultura. 0 presente invento também proporciona um processo para a produçlo de um composto do invento ou de um seu derivado* que

compreende £ cultura ds um microorganismo produtor, e subsequen-temente o isolamento do composto ou do seu derivado a partir da cuitura= 0 presente invento proporciona ainda um processo para a preparação ds um composto do invento ou de um seu derivado? que compreende a separação cromatográfica dO compasto ou dO seu derivado a partir de uma sua solução em mistura com outras substâncias numa fraeçãa compreendendo o composto PU um ssu derivado e outras fracções. A expressão 'cultura' <e derivados desta expressão) tal como é aqui usada significa o crescimento ssróhico deliberado d© tua organismo na presença de fontes assimiláveis de carbono, azoto, enxofre e sais minerais» Esse crescimento aerábico pode ter lugar num meio nutritivo sélido ou semí-sólido, um num meio líquido ©m que os nutrientes são dissolvidos ou suspensos» A cultura pode ter lugar sobre uma superfície aeróbica ou numa cultura submersa, 0 meio nutritivo pode ser composta por nutrientes complexos ou pode ser definido quimicamente»

Verificou—se que nsicroorganismos apropriados para utilicação no processo de cultura de acordo com o invento para a produção de vil 55595 e/ou VM 55596 e/ou VM 55599 incluem estirpes de fungos pertencendo ao género Penicilllum que são capazes de elaborar compostos de acorda com o inventa. Verificou-se ainda qus Panicillium sp» IMI 332»995, que foi isolado a partir do sole 5 e também seus mutantes e variantes naturais, é particular-mente apropriado para esta finalidade. A expressão "mufcante” tal coíbo é aqui usada inclui qualquer estirpe mutante que surja bkponttneamente ou através do efeito de um agente externo quer o agente seja aplicado 9

tíeliberadamerite ou de qualquer outro modo. Métados apropriados d© produção de estirpes mutanies incluem os indicados por H=I»fidisr em ,5Techniques for the Development of Micro-organisms" em "Radiation and Radioisotopes for Industrial Plicraorganisms” * Praceedings of a Symposium? Visnna 5 1.973., página 241 ?

International Atomic Energy Authority* e estes incluems (í) Radiação de ioniaaçSo Cpor exemplo raios-X a raios-gama)* luc ultravioletas luz ultravioleta mais um agente de foiosensibilicacSo (por exemplo., S-metoxipsaraien) * ácido nitrosoj hidroxilamina* análogos da base pirimidina <por exemplo S-broísouracilo) * acridinas, agentes de alquilação Cpor exemplo gás de mustarda, sulfonato de eiil-metano)5 peróxido de hidrogénio* feriais* farmaldeido* nitrosoguanidins* calor* e <ií) Técnicas genéticas* incluindo* por exemplo* r©combinação* transformação* transduçlo* lisogenisação5 convsrslo lisogéniea* fusão protoplásfcica* s técnicas sslsctivas para mutantes expontâneos»

Pensa-se que Psnicillxum so, IMI 332=995 compreende uma estirpe nlo referida préviamente no género Penicillium» Foi depositado no C = h = B= International llvcological Insiitute* Ferry Lane* Kew* Surrey* TW9 3AF* England* senda a depósito {IMI 332»995ρ data de registo 3i de Maio* 1989) feito obedecendo aos termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de tnicroorganismos para as Finalidades do Processo da Patente»

As características de Penicillium sp Ilil 332 = v9d eram as seguintess 1©

Depois ds se ter feita crescer durante sete dias num meio ds agsr Czapek Dox a 28°C? Penicillium sp» IMI 332=995 tinha produzida colónias que tinham 20-30 mm de diâmetro» As margens cias colónias eram baixas s aveludadas* cerido as zonas centrais fl ocasos;; o micélia era na sua maior parte branco nas sonas periféricas* s verde amarelado a verde acinzentado nas zonas centrais. Foi produzido um sssuaado amarela sabre a colónia § a cor do reverso da colónia era castanho amarelado»

Os ccmíclióforos apareceram nas superfícies inferiores ou A superfície das bifas* estipelas 100-300 < 2,2-350pm* de paredes macias* caracteristicamente terminandG am verticilos bem definidos c!e 3-5 metulae divergentes» Foram também produzidas matulas subterminais ou iniarcalares» As matulas apresentaram usual mente um comprimento uniforme <12-18 x 2s2~2?5pm> * phia lides aprasentavam-se em verfcicilos compactas de 8-12= amouliformes usualmenta com collula curtap as conidias eram esferoidais a subesferoidais9 2*2-3s0μ<η diam* com paredes macias ou finamente rugesas» tipicamente aparecendo em colunas bem definidas* uma por mstula = D meio de fermentação para a cultura do organismo produtor pode ser sólida* semisálida ou liquida e cantem spro-priadamente fontes de carbono assimilável e de azoto assimilável juntamente com sais inorgânicas» Fontes apropriadas de azoto incluem extracto de levedura* farinha de soja* ©xtracto de carne* farinha ds sementes de algodãos malte* produtos solúveis secos por destilação» amimo ácidos* hiorolisados ds proteína e azoto de amónio s de nitrato» Fontes apropriadas de carbono incluem glucose* sueross* lactose* maltoses amido e glicerol» Apropriada-menta α meio de cultura inclui ISes de metal alcalino (por exemple* sódio)* iSes de metal terroso alcalina <por exempla* magnésio) * ices de halogénio (por exemplo* cloreto)* e elementos

vsstigiais (por exemplo* ferro)» A cultura pode ser realizada apropriadamente a uma temperatura de cerca d© 20 a 35°C* vantajosamente 27 a 2S°C5 e a cultura pode ser apropriadament© recolhida após 2 a 35 dias, vantajosamente cerca de 5 a 20 dias* após o início da fermentação a fim de dar origem a um rendimento óptimo do composto desejado» 0 composto desejado ou o seu. derivada pode então ser isolado a partir do meio de cultura e manipulado e purificado usando técnicas convencionais» 0 produto desejado pode ser obtido a partir de, ou o crescimento micelial ou a partir do meio de cultura» Pode assim ser conveniente para o primeiro passo de isolamento envolver a separação do micêlio do meio de cultura por* por exemplo* filtra-cão ou centrifugação do caldo d® fermentação* para dar origem a um filtrado da cultura clarificado e a material sólido» Alterna-tivamente* a totalidade do meio incluindo o micélio podem ser extraídos directamente»

Pode ser conveniente incluir um passo de extracção do solvente orgânico* apropriadamente utilizando um solvente tal como acetona ou clorofórmio»

Um posterior isolamento do composto desejado pode ser convsnientemente efectuado por meie de técnicas de cromatografia „ 0 extracto pode conter substâncias adicionais* e assim a separação cromaiográfica pode dar origem a uma série de fracçSes* de anire as quais a fracçao ou fracçSss dsssjada(s) é ou são fracçSo {fracçSes) compreendendo o composto desejado ou um seu derivado» Aís) fracçlo (fracçSss) dessjadaCs) pods(m) 12

rápidamente identificadaís) por meia de um método de rotina fazendo usa teste quanto à actividade antihelmíntica e/ou monitorizando cada fracção c romatog ráficamen te» A(s) fracção (fracçBes) á/sSo a/as identifiçadaCs> por meio desses processos coma contendo a composta desejada ou um seu derivado»

Se necessário? pode realizar-se a separação cramatográ-fica por um processa de rotina» Em cada estádio do processo de separação5 as fraeçSes contendo o composto desejado ou um seu derivado podem ser combinadas e então submetidas a passos de purificação posteriores,, Nos passos d© separação iniciais, pode ser conveniente identificar as fracçSas desejadas meramente como as que apresentam actividade antiheimíniica e combinar todas essas fracçges» Em estádios mais tardios da separaçãos pode ser necsssário identificar as fracçSss desejadas ou mais precisamente írscçSas a fim ds separar o compasto desejada ou um seu derivado a partir ds quaisquer outras substâncias que possam estar presentes» A separação pode vantajosamente ser continuada a fim de dar origem a uma ou mais fracçSes consistindo essencialmente no composto desejado ou num seu derivado» A expressão "fracçlo consistindo essenc ia1men te no compasto desejado ou num seu derivado" significa uma fracçlo contendo o composto desejado ou um seu derivado como o único componente presente nessa fracçãos ou como o principal componente íquer outros componentes sejam activos ou sejam impurezas inacti-vas) presente nessa fracção. A expressão 'componente principal significa o componente que está presente na quantidade mais elevada a® relação a outros componentes individuais (excluindo o solvente)» Apropriadamen te * o principal componente está presente numa quantidade superior â da soma das quantidades de todos os outros componentes (excluindo o solvente)» liais apropr iadamen te * o componente principal está presente numa quantidade de pelo

menos 60% 5 vantajasamenfce pelo menos 7Θ%, de preferfncia a pela menos 80%, especiaImente de 90% a 100%, em peso, em relação è, quantidade total do material activo, ou em relação à quantidade total de material quer activo quer inactivo (excluindo o solvente), seja qual for a circunstância, presente na fracção« Tipicamente, os compostos da fórmula <1> são produzidos misturados uns com os outros, de modo a que possam ser obtidas fracçSes que consistam essencialmente numa mistura de dois ou mais compostos da fórmula <I)*

Verificou-se ser conveniente realizar separação croma— tográfica usando HPLC» Podem ser realizados sucessivamente dois ou mais passos de separação cromstográfics,

Wuai outro aspecto do invento VII 55596 pode sor preparado pela N-OKidaçlo da paraherquamida. é descrito um processo adequado em 3» Qrg * Chem. C19703 35, 172Í st seq = Pode ser usada o mesmo processo para preparar o composto da fórmula (II) em que P é 0 por M-o;-;idaçgk3 de VII 55599« De um modo semelhante compostos ccm a fórmula parcial í III > podem ser obtidos por Ν-oxidaçlo dos derivados apresentados nas patentes aqui incorporadas como referência»

Con sequen temen te o presente invento proporciona um método para a produção de um composto da fórmula parcial (ΙΪΙ) que compreende a rsacção de marcfortina ou de paraherquamida ou de um seu derivado da fórmula parcial {IV>

(IV) τ: =: em que i9 mv R"s K' e RT são tal como foras definidos para a fórmula (III)» com um agente de N-oxidação»

Processos- gerais para a preparação de N-óxidos hetero-aromáticos podem ser encontrados no Capítulo II de "Chemistry af the Hetrocyclic N-Oxides”s A=R»Katritzky e o= 11 =Lagoaski? publicado em 1971 em ftcademic Press <Vol. 19 de 0E8ANIC CHEMISTRY - A Series of Honogr-aphs)« Tipicamente o N-óxido é formado por re&cçSCo com um ácido percarbox£1ico num solvente apropriado» Mais apropriadamente é usado um perácido aromático num solvente não polar, visto que a reacçâo pode usualmente ser realizada à temperatura ambiente» Perácidos aromáticos apropriados incluem ácido perhenzcica, ácido c1oroperbenzoico e ácido perftálico»

De preferencia a reacçlo é realizada em cloroférmio usando ácida m-c 1 oroper ben zoico» Dos perácidos nSo-arc3máticos5 o ácido peracéiico é o reagente mais comum9 mas é menos apropriado tendo em vista condiçSes mais prejudiciais tais como aquecimento c’o composto heterocic 1 ico com ácido acético glacial e peréxido de hidrogénio a temperaturas variando entre 2@ e 9®°C„ 15 15

Compostos da fórmula Cl) que nSo se podem obter como metabolitos de IMI 332995,= ou por N-oxidação tal como foi descrita anteriormente* podei» ser preparados por modificação química de compostos que se podem obter como metabolitos* usando técnicas de substituição que são bem conhecidas na química orgânica* por exemplo* por meio de uma alquilaçao dos azotos da amida»

Os derivados dihidro dos compostos da fórmula (1) Conde Y ê uma ligação simples) podem ser preparados a partir dos co?npostos tís fórmula Cl) em qus Y é uma dupla ligação usando o processo descrito no Exemplo 11 da Patente Europeia Mo* A-0--301 = 742=. referida anteriormente» 0 composto ou mistura de compostos de acordo com o invento é proporcionado aprapriadamente sob uma forma substancial mente pura* por exemplo pelo menos com 5©% de pureza* apropriadamente pelo menos com 60¾ de pureza* vantajosamente com pelo menos 75% de pureza* de preferência com pelo menos 35% de pureza* espscialinsnis com pelo menos 98% de pureza, sendo todas as percentagens calculadas como peso/peso» Uma forma impura ou menos pura tís um composto da acordo com o invento pode* por exemplo* ser usada na preparação de utna forma ma is pura do mesmo composto ou de um composto afim (por exemplo um derivado correspondente) apropriado para utilização farmacêutica»

Os compostos do inventei apresentam propriedades parasiiicidas * por exemplo contra nemátodos tais como Trichostronqv 1 us colubriformis =, e slo dteis para o tratamento da helmintiases em animais tais como mamíferos* incluindo os seres humanos s animais domésticos (incluindo animais de lavoura)»

Consequentemente o presente invento também proporciona um composto de acordo com o invente* para utilização no 16

tratamento do organismo humano au animal, especia1mente para o tratamento · de infestações endo- e ectoparasitárias s particularmente para o tratamento da hslmintíasa dos animais domésticos s de lavoura,. A ®kpressão helmintiase abrange as doenças do homem e dos animais causadas por infestação com vermes parasitários tais como Strongyles, àscaris, anci 1 éstomos, pulmonárias, filárias, f 1 age 1 árias5 s fasci.ala hepática» 0 composto pode também ser usado contra neroétodos ocorrendo no solo ou plantas parasitárias»

Os compostos do invento são também activos contra Artrópodes» 0 filo Artrópodes compreende insectos - tais como mascas varejeiras, piolhos, percevejos» escaravelhos e pulgas ~ e araenídeos - tais como araenídeos e carrapatos.

Assim» um amplo aspecto do invento proporciona um método para erradicar infestações por artrópodes ou nemétodos, método esse que compreende a aplicação de um composto de acordo com o invento ou um seu derivado aos artrópodos ou nemátodos ou ao seu meio ambienta» 0 presente invento proporciona assim uma composição pesticida compreendendo um composto de acordo com o invento ou um seu derivado juniamente com um veiculo ou eKcipienie apropriado, tal como uma formulação seroso1. 0 presente invento proporciona também uma composição farmacfati.es .ou. veterinária compreendendo um composto de acordo com o invento ou um seu derivado farmaefutieamente aceitável juntamente com um veículo ou excipiente farmacfuticament® ou veierináriamente aceitável=

·, ί t - Q presente inventa proporciona também um método de tratamento ou profilaxia ds inísstaçSss endo- a ecto-parasi t»r ias* especialmente helmintíase* de animais* especial mente mamíferos humanos s domésticos* que compreende a administração de uma quantidade não tóxica eficaz de um composta de acordo com o invento ou ds um seu derivado farmactuticamente aceitável* ou de uma composição ds acordo com o invento* a um doente deis necessitado» A composição de acordo com o invento pode ser formulada para administração ds qualquer modo conveniente para utilização em medicina humana ou veterinária* por analogia com outros antihelmínt icos =

Em formulações apropriadas a droga pode ser administrada a animais oralmente Ccomo uma pasta * rega* bolus* cápsula ou comprimido)* paren iér ic amen te * percutãnesmente, como um aditivo alimentar <por exemplo grânulos* pílulas ou pó)* ou podem ser preparados sob a forma de uma formulação aerosol em spray»

Os compostos do invento podem ser formulados sob a forma ds uma mistura uns com os outros e/ou com outros antiheimintas* insecticidas* acaricidas ou outras substâncias f armacoXc-gicamente activas»

Aprapriadamente a composição consiste em material suficiente para proporcionar uma dose de 6s©i a 50 mg de ingrediente activo por kg ds peso corporal do animal por dose* sais apropr iadamente 0*1 a 10 mg/kg por dose»

Uma composição de acorda cora o invento pode conter apropriadamente de 0*ββ1 a 99% em peso do composto de acordo com q invento Ctsndo como hass o peso total da composição)*

dependendo do método de administração»

Em certas circunstâncias o caldo de fermentação crú pode ser administrado, por exemplo por incorporação do caldo de fermentação seco por congelação na ração do animal.

Será tomado em consideração que. em certos casos? será aconselhável repetir a dose ao ser humano ou animal infectado ou potencia 1 mente infectado cosi α composto do invento de acordo com regimes de dosagem convencionais usados com antihe1minticos

Os Exemplos cjue se seguem ilustram o invento. EXEMPLO í

Uma suspensão de conltilas de Penicilliuffl so= 1MI 332995 foi preparada sm soluçlo salina tamponada cas fosfate contendo 10% de glicerol s 1% de T^een 8© ÍPBSBT) a partir de uma placa de cultura osm crescida sm agar de dsKtross de batatal= 2-2 mis de suspensão foram espalhados em agar Ccapek _2

Dok em taças grandes para bioensaio C24d mm ') e incubadas a 2H°U. A cultura e α agar foram recolhidos após 2© dias de crescimento em provetas grandes de vidro. Aqar Czapsk Dok g/L Suc: ra se < Bi/H An alar) 3© W*MG..7 3 MgS0^n7H^0 ® 5 5 KOI 9,5 FeSCL .7H-0 0,01 k2hp°4 1,0 Agar técnico <0>;oid> 18 g Água dssionicada 1000 ml t Agar Dsxtross Batata íOnoití Ltd» Basingstoke3 UK)

Extracção a Purificação.....de.VM 22919. ,.VH _aAi4bí.._Vri_a41agA m^ÍiS5_^WLili21

Cultura ΪΜΪ 332955* feita crescer durante 2Θ dias em aqar Czapsk Dox <5L) foi macerada sm acetona (é>L) (misturador comerciai Waring* Dynamics Corporation of America) centrifugada e os sólidos foram posteriormente extraidos com 2 lavagens de acetona CéL por lavagem* sendo os sólidos separados por centrifugação) = A acetona foi evaporada sob vácuo proporcionando um resíduo aquoso o qual foi então extraído tris vezes com 2 volumes de CHC1._, A fase orgânica foi evaporada sob vácuo deixando 4523 g de extracto sólido,, A purificação primária foi realizada por HPLC de fase reversa preparativa (Dynamax - 6®A C--18 coluna 4i?4 x 25$nm* Rainin Instrument Co„ * USA) fazendo—se a eluiçlo com metanol -água (75¾25) a 2® mls/min» A totalidade do extracto foi suspenso em metanol * depois de deixar repousar a porção solúvel foi injsctada na coluna por meio de uma curva com amostra de 5 ml (4 injecções consecutivas)= (Pesagem subsequente do resíduo insolúvel revelou que 3*34 g do extracto eram aplicados à coluna neste estádio)« 0 fluxo a partir da coluna foi contínuamente recolhido para um colector de fracçoes em fracções de ©,,8 min, <16 ml) *

Foram retiradas porçSss alíquotas de fracçoes alternadas* que foram secas sob vácuo, retíissolvidas em 0,5 ml de CHCI-, e exami- o nadas por TLC íPlastic backed Silicra — 6Θ ρlates? E= Merck5 Darmstadt* FRB (ΤΥΡΕ 5735) desenvolvida com CHC1-* s metanol § ácido acética glacial 89s10s í)= As manchas foram visualizadas pulverizando com reagente Ehrlichs <1% 4-Dimetilaminobenzaldsido em HC1 concentrados Metanol i »3) seguindo-se aquecimento« A TLC do material de partida revelou trfs manchas principais dando origem 21

a uma cSr rosa com reagente de thrlichs. A maior a Kf 0S55 e duas manchas ma is pequenas a Rf & 0P5»

As fracçSes de coluna de TLC revelaram que a mancha Rf 0,,55 aluia a partir da primeira coluna (fracçSes 10-27) seguindo--•se as outras duas manchas juntamsnte em fracçães 23-56,, Estas fracçSes foram assim armazenadas separadamente para dar origem a fracçSes de massa Ά' (Fracçaes 10-27) e 'B' (FracçSes 28-56)« 0 material insolúvel nlo carregado na coluna inicial foi. seco e pesado C@?89 g> „ Apresentou-se quase comp 1 etamente solúvel num maior volume <200 ml) de metanol. 0 material foi filtrado e reconcentrado sob vácuo atá 20 mls? sendo cromatogra-íado em condições essencialments idênticas ás práviamente descritas e foram obtidas fracçoes A e B de massa semelhantes» CAs fracções A e B de cada coluna foram reunidas e pesadas (Ate,93 gj, Bs0518 g>.

Posterior purificação de ambas·as fracções A e B foi realizada por HPLC em Sílica preparativa (coluna Dynamax - 60A Si 21,4 x 25© mm» Rainin Instrument Co USA) fazsndo-se a eluiçlo com gradientes CH^Cl^smetanol a 8 ml/min» As fracções foram examinadas d i rec tamen te por TLC desenvolvida com CHCl-yS metanol 90 s10» Os metabolitos foram visualizados como manchas côr de rosa após pulverização com reagente de Ehrlichs» A amostra A foi dissolvida em CrUCI^ a injectada na coluna de sílica qus foi eluida com um gradiente linear eis CH„Cl«smetanol5 10020 a 90210 durante 120 minutos» As fracções foram sendo recolhidas» Tendo como refertncia os resultados da TL.C verificou-se que o material de interesse (a mancha cSr de rosa positiva de Ehrlich mais abundante) foi eluida num período entre 6® e 71 minutos CCH^Cl^smetanol 97=3)= FracçSes contendo este material foram reunidas e secas para dar origem a 353 mg de sói ide amarelo claro»

Esta amostra foi dividida em duas partes a cada porção foi c roais tog rafada por HPLC em sílica como anteriormente exeep-iuando o facto de além disso o eluente da coluna ser monitorizado por Uv a 235 e 29©nm (i@0@S Diode ftrray Detector, Applied Biosystems Ltd» Warrington, UK>« Verificou-se qus em cada croma-tografia, o material foi eluido como anteriormente eaceptuando o facto da serem aparentes dois picos distintos por monitorização com UV» Cada um foi recolhido separadamente e o material correspondente de cada coluna de cromatografia foi reunido s separado por secagem num evaparador rotativo» Q pico com sluiçSo mais rápida proporcionou 117 mg de VM 29919»

Pados.....de.Caracterização para ¥M 29919 UV 5fína;= 225nm (em Μ®0Η) 13o,4, 71,4, 29,94,

Massa (FAB, NOBA/Na) CMH^I = 494 513C ÍCDC1F3R) 183,1, 171,6= 146,2, 139,1, 132=7, 125,1, 120,3, 117,3, 115,0, 79,8, 78,1, 65,3, 63,2, 59,2, 51,8, 51,6, 46,4, 38,2, 37,í, 29,85, 25,9, 23,7, 22,2, 2®,4, 19,2

Estes dsdos revelaram ser idênticos para Paraharcfuamida (Vamazaki and Okuyama 1981, Tetrahedron letters 22 135-136)

FracçSes contendo o pico mais lento proporcionaram 34 mg ds VM 54158=

Dados de Caracterisacio .para VII S4158 UV 7-maK 244mm. ísíh MauH)

Massa (FAB, NGBA/Na) CMH^I = 478 £ J3C (CDCl,. 184,3, 153, 1, 137,1, 131,3, 125,6, 121,3 116,1 , 169,6, 105,3, 78,6, 76,4, 71,4, 65,3, 62,6 59,2, 51,9, 51,7, 46,4, 38,1, 37, 1, 27,9, 27,8, 25,9 22,2, 22,,2,, 2®,4, 19,1 A amestra B Cda fase de separaçlo reversa) foi. dissolvida sa 4 mis de CH„C1„ s injectada numa coluna de sílica sluida com uiT; gradiente de CR-Xi^smetanol de i@0s0 a 97§3 durante 36 4Í* A. minutos Clinear) seguindo-se eluiçSo isocrática a 97s3» A coluna foi. monitorizada por 7LC e UV (235, 244 e 326nm) fasendo-se a mor»itorisaçfo com seanning espectral (19@~375nsn> com intervalos ds 6,5 mín (Deiecfcor de fila de diodo ABI 1666S)= As fraeçoes foram recolhidas ao longo do processo» VM 54159 e VM 55594 eluidos como picos adjacentes (43-44 mins e 45-49 mins respectivamente) sendo distinguidos por meio de UV >maK dos scans espectrais CVM 54159 ^maK 226nm, VM 55594 'kmBH 244nm)« VM 55595 sluido como um pico discreto a 59-é5 mins (Ssise;·? 244nm) obtido após eyaporsçSo do solvente»

Os rendimentos do material essancialmsnts pura a partir das fracções apropriadas forams VM 54159, 10,7 mgg VM 55594, lá,3 mgí VM 555953 9,6 mg. 24

Sjdgs _de J^racter i zaçgQ UV s-ffiaK 225 nm (em ilsOH> 132,3, 62,9, 29,8,

Massa (FAB? NQBA/Na) EMH+3s 478 ÔÍ3C (CDCl^) 182,5, 172,2, 146,θ, 139,®, 135,2, w 125,4, í2®,5, 1i753s 115,1, 79,8, 67,7, 65,2, é&stp 53,4, 52,1, 46,3, 40,3, 37,5, 3@,2, 3@,β, 27.7, 25,5, 24,Θ, 20,8, 13,1 UV maK 245nm (em HeOH)

Massa (FAB, MOBA/Ma) rM!-T3 = #62 5' 13C ÍCDCI,J 185,7, 172,4, 153,0, 137,5, 131,2, 125,5, 121,6, 116,3, 109,5, 105,6, 76,4, 67,7, 65,2, 62,8, 60,0, 53,3, 52,4, 46,2, 4©,3, 37,3, 3©,3, 27,9, 27,8, 27.7, 25,5, 23,9, 20,6, 13,2, mjiim UV àínax 245nm (em MeOH)

Massa (FAB, MOBA/Na) = #48 *13C (CDC1^> 184,9, 174,3, 153,0, 137,5, 131,2, 125,6, 121,8, 116,3, 109,4, 105,4, 76,3, 68,2, 62,5, 61,8, 60,2, 53,4, 52,8, 46,2, 40,0, 39,9, 3Φ,3, 28,0, 27,8, 27,6, 24,1, 20,6, 13,1 EXTRftÇçaO E......PUBIFlCftggQ, PE.VM...55596,

Cultura íMI 332995, feita crescer durante 24 dias em I0L. de agsr Czapek Dox <Exemplo 1) , foi armazenada em acetona e smtraída para clorofórmio,, tal como foi descrito no Exemplo 1 , para produzir 5==1 g de extracto.

Este extracto foi dividido em duas porções alíquotas, I s 11 (contendo aproximadamente 4 e 1 g respectivamente)« Cada uma foi cromatografad por meio de HPLC de fase reversa preparativa (DynamaK - C-1B 41 ,4 x 250 nm, Rainin Instruments Co, , USA), fazendo-se a sluiçSo com metanolságua < 75 s 25 > a 15 ml/min» Foram recolhidas fracções de 15 ml ao longo da cromstografia e uma parçSo aliquota de cada foi examinada par TLV (6Θ placas de de gel de sílica apoiado em vidro Merck, 2® x 2® cm, desenvolvidas com c lorof órmio s metanol 9®si®, visualizadas pulverizando com reagente de Ehrlichs, e aquecimento)» As fracções contendo o componente positivo de Ehrlichs principal em cada cromatografia (correspondendo à fracçao A no Exemplo 1) foram combinadas (fracções 9-~24 na cromatograf ia I ε 7-14 na cromatograf ia II) s concentradas até à secura sob vácuo para dar origem a 1,93 g„

Esta material foi dividida em 2 porções alíquotas iguais e cada uma delas foi cromatografada por HPLC em Sílica (Dynanax-à@A Si 21,4 x 250 nm, Rainin Instrument Ca» USA) com gr&aisnte as eluiçso CH^cl ,,3 metanol (8 ml/min) « Muma cromatogrs-fia, o gradiente foi o seguintes

Tempo

CH^Cl^sileOH 0-2® minutos gradiente linear i€>0g© a 9723 20--4Θ minutas isocrático 97 s 3 40-S0 minutos gradiente linear 97|3 a 90s1© 80 minutos para diante isocrático 9®si®

Foram recolhidas ao longo do processo fracçSes de 8 ml <> A coluna foi monitorizada por absorvincia UV <235 a 244 n«ns 1 ;;0003 Diods Array Detector„ Applied Biosystsms Limited5 Warrinçton= 1110 = e cada fracçMo foi examinada por TLC como ant ar iormente« 0 material rico em paraherquamida foi eluido nas fracçSes 34-37= As fracçoes Ii0-ii5s correspondendo a um pico na abssrvfncia UV e a uma mancha positiva de Ehrlichs em TLC CRf 0=19/ foram reunidas a combinadas cam as fracçSes correspondentes (por TLC) a partir da outra coluna de cromãtografia Cque foi idêntica exceptuando a eluiçSo isocrática 97 s 3 que foi continuada durante 6Θ minutos)» Após a evaporação do solvente foram recuperados i? mg tie material que foram purificados por uma coluna de si.lica final CDynamax - 60AS IS x 25® mm) fazendo-se a eluição com um qratíiente linear de CH^Cl__= s metanol, 9882 a 885 12 durante 90 minutos a 4 ml/miru A monitorizaçSo foi feita par sbsarvência UV 233 s 244 nm com seanning espectral cada 0=5 minutos íABI í®00tí Ui ode Array Deiscio r)= Forais recolhidas fracções de 4 ml ao longo de processo» Ocorreu um pico principal as absorvincia UV entre as frscçSes 28—47= Espectros UV indicaram que as frscçSes precoces eram impuras» Assim fracções 37-47 foram reunidas e secas sob vácuo» isto proporcionou í®?® mg de VM 55596 = ' ; V· ^ /

Caracterização de VM 55596

Uv isax» 22a nm ísm MeOH) Massa ítAtí, fioglicerol) ΪΜΗ 3 ~ 51# coflt um ião principal a 494 = CMH~163n. SÍ3C CCDCl^) 182,2, 167,7, 146,4, 138,9, 135,4, 132,4, 124.1, 12#,5, 117,7, 115,2, 83,8, 79,9, 77,9, 76,2, 69,4, 62,9, 62,8, 51,©, 46,8, 39,1, 36,#, 29,9, 29,7, 27.1, 23,3, 22,2, 21,1, 14,5

Posterior svidfncis de que VII 55596 era um derivado N-óxido de paraherquamida veio da demonstração de que a des-οκΐ-genaçSo com trifenilfosfeno CTPP) produzia paraherquamida C#,5 mg VM 55596 em 0,5 ml de dionano foi misturado com 3 mg TPP em 0,5 ml. dioxano)* Após aquecimento a 6#°C durante uma hora, o produto foi examinado por ILC (como anterior-mente) e HLPC (coluna Micrssorb C--18 4,2 x 25# mm, metanol § água 90 g 10 a 1 ml/min, Waters 99# Diorfs Array Detsctor) s revelou não ser distinguível da paraherquamida). Λχ

EXE

Uma suspensão conidial de PenicllIium sp ΧΜΣ 332995 foi preparada em solução salina tamponada com fosfato contendo 1Φ1 de gliosrol s 1% de Twssn 8Φ CPBSST) a partir de uma cultura bem desenvolvida em placa de agar de dextros© de batata CQxcid Ltds B-ssin.gstoke? UK> * 2“3 mis de suspensão foram espalhados em placas d© agar Caapsk Do;·; de agar e incubadas a 28*0==

Agar Czapsk Βακ Agar g/L

Sucrose íBDH Analar) 3Φ

NaMO, 3 •ú

MgSO^H^O Φs 5

FeS04«7H?0 0*0:1 k2hpo4 1,0

Agar técnico Cuxoid) 18 g

Agua desionisacia 1000 ml

Foram feitas crescer dais lates em 1Θ s 2§ L de agar durante 27 e 26 dias respectivamente. Cada lote foi extraído saparadamsnte para acetona macerando o agar com 1-2 volumes da solvente e removendo os sólidos por centrifugação e filtração sendo em seguida o agar extraído mais duas vezes com acetona* 29 29

A acetona foi evaporada sota vácuo proporcionando um resíduo aquoso que foi entlo eKtraido, quatro vezes, de cada vez com 2,5 volumes da clorofórmio. A fase orgânica foi separada e evaporada sota vácuo para dar origem a 3,64 g e 11=15 g de óleo amarelo a partir dos dois lotes, que foram entlo combinados. 0 SKtracto combinado foi suspenso em aproKimadaments ΞΦΘ ml de metanol o que levou à formaçaa de um precipitado branco. Este foi separado por filtração s lavado com 5® ml de metanol., 0 material precipitado foi re-suspenso em aproaimadameo-te 2θβ ml de metanol quente <3©°C> s filtrado de novo. 0 precipitado foi eliminado e as soluções matanólieas foram reunidas e o solvente foi evaporado para dar origem a 9=44 g de material.

Uma coluna com 10 cm de diâmetro κ 25 cm foi embalada com HP20-S3 (Mitsubishi Chemicals, Japan), bem lavada com acetona e equilibrada em metanol/água 7s3« A amostra foi suspensa em 5® ml de metanol/água 7s3 e aplicada ao topo da coluna que foi entlo eluida como se segue, sendo recolhidas fracções de 5®0 ml ao longo tío processo. 6.5 L metanolsâgua /0 κ 3®, FracçSes 1.-Í3 3,5 L 55 ?5 75 s 25 ti 14-2© 3,5 L ii Π 8©s20 55 21-27 6,5 L SS U 85 s 15 :: 28-4® 8,® L sí 55 9®sl© · 41-56

Uma porção alíquota ds cada fracçSo foi seca sob vácuo s r©dissolvida em ©,5 ml de clorofórmio s ©Maminada por TLC <placas HPTLC í® s 1® cm, gel de Sílica 6® F 254 <E. Merck) dssenvs1vida com CHCl^/fieOH 9s 1, sendo as manchas visualizadas sob luz UV (254 nm> s por pulverização com reagente de Ehrlich 3® 3®

(1% de 4-dimeiilaminafoenzaldeido eia Hui concentradosmeLano 1 1 §3) seguindo-se aquecimento)»

Tendo como base estas dados as fracçSes individuais revelando manchas semelhantes em TLC foram reunidas» Assim fracçSes 40-46 foram combinadas a designadas como grupo 'G:

Quando reunidos s o solvente evaporado sob vácuo o grupo :S' proporcionou Θ?297 g do material » TLC revelou qus este continha um certo número de componentes positivos de Ehrlich» 0 material foi ainda purificado par HPLC de fase normal usando uma coluna de DynamsK 6®A Si 4:1«4 κ 250 nm <Rainin Instrument Co = USA) facenda-se a eluiçSo com CH_Cio/í¥le0H durante 6® minutos) s em seguida isocráticamente a 9ès4 <CH0Clo/Me0H)? todas a 2® ml/min=Foram recolhidas fracçSes de 18 ml a partir do início da fase isccrâtica» Cada fracção foi examinada por TLC (placas de TLC 2® > 2® cms gel da sílica 6® <E = Merck) desenvolvido s visualizado como anteriormsnts)» Verificou-se5que os tubos 29-31 revelando um® única mancha positiva de Ebrlichs de Rí ®s7 foram assim combinados,» A pés evaporaçSa da solvente esta amostra (designada ’B1'> pesava 15?1 mg» A amostra '81' fax ainda cramatografada por HH..C de fase normal usando coluna Dynamax 6®A Si 10 κ 250 mm fazendo-se a eluiçlo cam hexana/prapan-2-ο1 bombeado a 4 mi/min« A composição tío solvente era a seguintes Isocrático 0-18 min? hexano/propan-2--ol 98;;2s gradiente linear 18-88 min hexana/propan-2-ol 98s2 a 90s Í0p durante 6® minutes mas mantendo-se a 95s5 durante 1® minutos à medida que se eluia o pico principal« Foram recolhidas fracçSes de 4 ml ao longo do processo» A coluna foi monitorizada por áetecçâo UV a 226 s 2®5 nm3 e por TLC» 0 pico principal defcectado por UV foi eluido em fracçSes 45-53« TLC indicou qus cada uma tíestas fracçSes continha α mesmo material5 pura»

correspondendo à mancha positiva de fchrlichs observada na mancha ' BI' » Assim fracçSss 42-53 foram reunidas e o solvente foi evaporado para proporcionar 5,Θ mg ds produto CVM 555995= 0 produto vM 5559v foi caracisricadc como se segues- UV m&y, íneOH) 226 9 232 nia

Massa sspectrometris CE1 s FA«) indicou um peso molecular de 349= 121,3, 119,0, 117,7, 46,7, 34,2, 33,0, CCDCl^) 174f.3, 141?2S 126S5S 126,8, 1:10 = 0= 104.:0, 66,3, 58,8, 55,6, 53,5 30,3, 30,2, 30,0, 26,8, 23,9, 17,4= al[ii^se_deJjz^KÍdo_de......Para_he.rquamida (VM 55596) A uma solução de paraherquamida (25 mg) em clorofórmio i 155 ml) à temperatura ambiente adicionou~se uma solução cie ácido iii-c 1 oroperbenzoica (l%?4 mh S5%) em clorofórmio (1 ml) e a mistura foi agitada durante 2 horas» 0 solvente foi evaporado s d produto foi purificada por TL.C preparativa (sílica eluitía com 5% de metanol sm diclorometano)»

Claims

X' REIVINDICAÇÕES ί®« - Processo para a produção do um composto da formula <I)s

em cus X õ oKigênio ou uma ligação.* Y ê uma ligação simples ou _ ·i o uma ligação duplas R~ é meti lo ou hidrogénio» R é hidrogénio ou hidro>íi3 e n é ® ou i; ou de um composto da fórmula (IIJ s H

(II) sê que p é β ou 1s ou de um seu derivado que compreende a cultura de um organismo produtor=s o isolamento do composto ou da derivado da cultura;! s «- < quando necessário a conversão de um consposto da fórmula (!) ou (II) num outro composto da fórmula ÍI) ou íII>„ 2i = - Prcscssso da acordo com a reivindicação ícarac-terisado por o composto da fórmula (1) é seleccionado de entre d grupo consistindo ©n?s VM 35596 ÍX = 0, R1 = CH^? = 0HS n = í) 1 o VII 54159 ÍX = 05 R" ~ CR, 5 R“ = HP η = Θ) - i V víl 54158 ÍX ê uma ligação, R~ = CH^ R*" = OH, η = Θ) VM 55594 CX é uma ligação * R^ = CH^S R““ = Hs n = ΘΪ VM 55595 (X ê uma ligação, R* » H? = Hs n = 0}» 31= ~ Processo de acordo com a reivindicação 1? carac-tericado par o composto da fórmula <II) sers Vil 55599 íp = 0). 41= - Processo de acordo com a reivindicação i5 2 ou 3= carac ter i zado por compreender a cultura de Penicilliura sp= Ιπϊ 332=995 ou de um seu mutante capas de produzir o composto desejado ou usí composto canverfcível no composto desejada» 51= - Processo para a produção de um derivado de marcfortina ou de para-fterquamida da fórmula parcial í III) s

(III) ·-; ..a sm qus Z é CH0? m é % ou 1, R“ e R‘ sSo seleccionadcs a partir da hidrogénio, hidroKi? C., alquilo, sIcokí 9 C1_i alqusnilc, C|,_{i alqusnil“C.s ___A alcoKi, ' Ct alquinil~Ci alcoxi, C1 alcanoiloxi, poli alcoxi-C^^ alcoxi, ien.il o, fenil~C1_/ alquilo, tri-C,^ alquil-sil iloxi , difsnilfosforiloxi e halogé-nio, ou R'"· a R% em conjunta, formam ou «CH„, o R'J è hidrogénio ou C, alquilo? uí. J, *~Ò csrsctsrisado por compreender a reacçSo d© uma marcfortina ou para-nerquamida ou de um seu dsrivadc? da fórmula parcial <ÍV>5

Ί

Ο (IV) Ν1 < C Rd ?, Μ. S onde Ζ, m, R"s R * e R~ são como definidos relativamente à fórmula < III >, com um agente de N-oridação* óã. - Processo de acordo coei a reivindicação 5, carac-terisada por o composto da fórmula parcial CHI) ser feito reagir es solução com ácido percarbos-iilico» 7§ = ·· Processo tie acordo com a reivindicação 5, carac-ierizado por o composto da fórmula parcial (III) ser feito reagir com um psrácido aromático num solvente não polar* 8ã» - Método para combater infestações por ecto- e endo-parasi tas, caracfcerisado por se administrar um composto da fórmula CIK CU) ou CII!) ? de acordo com as reivindicaçõs i a 7S amcluindo para-herquamida, sendo a geena de dosagem os ingrediente activo de ®3ãl a 5© mg por quilograma de peso corporal por dose. 9-ã, ~ Processo para a preparação ds uma composição pesticida, farmacfutica ou veterinária, caracterisado por compreender a mistura de um composto da fórmula Cl)s (II) ou (III) tal como foram aqui definidas excluindo para-herquamida, com um 37 37 £31.1 veicula au SMcipienie pasticidamsntss farmacsuiicamen te vatarinaríamsnta aceitável= Lisboa 5 20 de Dezembro de 1990

J, PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3,<> 1200 LISBOA