PT96048B

PT96048B - Processo para a inactivacao biologica de acidos nucleicos

Info

Publication number: PT96048B
Application number: PT96048A
Authority: PT
Inventors: Mathias Fibi; Michael Broeker
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1998-01-30
Also published as: ES2084637T3; IE71193B1; DE3939771A1; US5369029A; GR3019086T3; JPH03191777A; JP3327469B2; CA2031286A1; PT96048A; CA2031286C; KR100260472B1; AU6708390A; EP0430270B1; AU648281B2; DK0430270T3; KR910012226A; DE59010101D1; ATE133705T1; IE904327A1; EP0430270A1

Description

Descrição referente à patente de inde BEBRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-355o Marburg,Republica Federal Alemã, (inventores: Dr. Michael Bróker e Dr. Mathias Fibi, residentes na República Federal Alemã), para PROCESSO PARA A INACTIVACAO BIOLÓGICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

DESCRI CÃO

A invenção refere-se a um processo para a inactivação biológica de ácidos nucleicos. O material contaminado com microorganismos manipulados com a tecnologia genética utilizada, proveniente de processos de produção bioteenologicos (restos de caídas de fermentação, águas de lavagens, etc) é recolhido em recipientes e ê degradado por autólise e/ou por contaminação intencional com bactérias, leveduras ou bolores de ocorrência natural.

Os processos de produção biotecnológica são utilizados cada vez mais para a obtenção de substâncias biológicas esubstâncias activas (proteínas, polissacarídeos, antibióticos, aminoácidos, vitaminas, álcoois, etc). Por técnicas da biologia molecular é possível actualmente produzir proteínas em organismos de natureza diferente. Nestes casos genes microbianos, vegetais, animais e humanos podem ser expressos em células hospedeiras que são estranhas a cada um destes tipos. Actual

mente recorre-se, para a síntese de proteínas, predominantemente a bactérias tais como Escherichia colí, Bacillus subtilis e Streptomyces lividans e a levedura tais como o Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Kluyveromyces lactis. Mas também se utilizam para a expressão de genes heterólogos células animais (porexemplo, células de ovários do hamster chinês [células CHO], células de rato [células C 127i] e células humanas. A pro dução das substâncias activas realiza-se de preferência em fermentadores/ visto que neste caso a síntese pode ser controlada por modernas técnicas de regulação. Os produtos ou são obtidos a partir das células, ou são libertados para as caídas de cultura.

Todos os processos de produção têm em men te, em última análise, a obtenção de grandes quantidades de material celularque contêm, entre outras, grandes quantidades principalmente de ácidos nucleicos naturais e homólogos (DNA e RNA mas também DNA de plasmídeo recombinante ou DNA estranho in tegrado no génomo da célula hospedeira. Até ao presente a avaliação dos possíveis riscos, no caso de libertação deste DNA re combinante para o ambiente, só muito dificilmente poderá ser feita. De harmonia com os princípios da prevenção foram pois criadas, na maioria dos estados, determinações e prescrições legais por parte de serviços públicos e instituições [como por exemplo, no caso da Alemanha (República Federal) a Comissão Cen trai para a Segurança Biológica (ZKBS) do Ministério Federal Saúde em Berlim] que prescrevem, depois do processo de produção, como protecção contra uma possível contaminação do ambiente, uma inactivação dos materiais e efluentes, em regra líquidos, e consequentemente da quantidade de ácidos nucleicos existentes .

A inactivação dos ácidos nucleicos pode ser conseguida por métodos físicos, por exemplo por aquecimento. Trata-se de um processo que exige muita energia e que representa, por conseguinte, um processo de alto custo. Por outro lado podem-se inactivar os ácidos nucleicos por via quimica ~ 2 -

Assim, por exemplo, no Pedido de Patente WQ 89/03226 propeo-se um processo com base no qual o DNA ê inacfcivado quimicamente por tratamento por calor na presença de ácido percarbónico, de peróxidos alcalinos ou de peroxo-monossulfatos alcalinos.

Um processo de inactivação semelhante baseia-se na utilização de ácidoacítrico. Este, assim como também outros processos quír micos, têm a desvantagem de representarem um perigo potencial para a saúde dos trabalhadores, e/ou de os produtos finais residuais serem prejudiciais ao ambiente. Em ambos os processos, por adição dos correspondentes produtos químicos, pode também conseguir-se uma inactivação total dos ácidos nucleicos com temperaturas reduzidas (por exemplo 80^sC).

A presente invenção revela agora um processo com o qual podem ser inaetivados biologicamente os ácidos nucleicos à temperatura ambiente. Estes processos são eficientes, têm custos favoráveis e são inócuos para o ambiente. Baseiam-se no facto de os ácidos nucleicos serem degradados por enzimas especiais /nucleases, isto é DNases e RNases) e de estes enzimas serem produzidos entre outros por microorganismos que existem nas caídas de culturas ou nas águas dos efluentes, ou que lhes podem ser adicionados.

Os passos do processo aqui propostos foram postos em prática com caídas de fermentação e efluentes nos quais, por lise de células animais, podem ser postos na forma livre DNases - inclusive DMA de recombinantes.

Descreve-se em especial um processo no qual o material a tratar, contaminado com os ácidos nucleicos (restos de caídas de fermentação, células águas de lavagens, etc) é recolhido em recipiente s é incubado voluntariamente por algum tempo à temperatura ambiente, sob agitação. As DNases libertadas no recipiente (por exemplo por libertação por lise das células ou por secreção microbiana) podem degradar completamente DMA em curto tempo, inclusive DMA de plasmídeo recombinante. Por esvaziamento incompleto do recipiente de recolha

dos efluentes as populações microbianas permanecem inalteradas na sua composição. Podem-se multiplicar por reenchimento do recipiente com água de efluentes e podem separar-se as DNases se as águas dos efluentes contiverem fontes de energia importantes, como por exemplo DNA.

Por conseguinte, os ácidos nucleicos recombinantes e também específicos do hospedeiro que se encontram nas águas residuais podem ser degradados completamente por nucleases e economiza-se uma inactivação térmica ou química das águas residuais. Descobriu-se ainda que os microorga nismos provenientes dos recipientes de recolha dos efluentes não acolhem DNA recombinante ou que o DNA recombinante, que na ausência de actividade de DNases nas águas residuais deveria permanecer estável, não é expresso nem replicado nos microorganismos acima referidos.

crescimento dos microorganisraos que degradam os ácidos nucleicos realiza-se mesmo à temperatura ambiente e sem às condições habituais das fermentações, como por exemplo fornecimento de oxigénio, agitação das caídas de cultura e outras medidas. Contudo, para um desenvolvimento mais rápido dos microorganismos e para o aumento das densidades celulares superiores, a ãgua de efluentes pode também ser fermentada, por exemplo a temperaturas que se situam acima das temperaturas ambientes correntes.

Os microorganisraos que foram isolados das águas residuais e identificados como segregadores de DNases podem também ser multiplicados fora daquelas águas residuais e ser depois adicionados a estas águas numa forma concentrada para aumentar a actividade de DNases antes do passo de incubação .

Além disso pode-se também clonar os genes quecodificam as DNases segregadas e exprimí-los adicionalmente ao produto pretendido de modo que se formem e sejam se«·

gregadas DNases mesmo durante o processo de produção# as quais degradam DNA livre na calda de cultura e desta para as águas residuais.

Podem também ser adicionais às águas residuais isoladas. Numa forma de realização especial as DNases podem ser aplicadas de forma imunologica sobre um material veicular, podendo o material veicular ser idêntico ao material veicular das células.

Por selecção da flora microbiana própria das águas de efluentes garante-se a existência de um largo aspectro de DNases com propriedades diversas no que se refere à actividade catalítica, períodos de semi-vida, especificidade do substrato, pH óptimo, etc, para a degradação dos ácidos nucleicos.

A degradação enzimática de DNA recomfoinante po<r meio deste novo processo aperfeiçoado possui vantagens relativamente aos processos de inactivação físicos ou químicos dos ácidos nucleicos. Estes processos prescindem de agentes que são prejudiciais tanto para o pessoal que neles trabalha como para o meio ambiente, são essencialmente favoráveis nos custos, não exigem trabalho intensivo, não são prejudiciais e na questão da protecção no trabalho são mais seguros do que por exemplo a inactivação dos ácidos nucleicos por aquecimento, especialmente por meio de autoclaves ou por meio de agentes químicos. Não se observou uma absorção de DNA recombinante por microorganismos de modo que este não se presta nem para a replicação nem para a expressão do DNA recombinante.

DNA recombinante, muito pelo contrário, é completamente me— tabolisado, isto é, o DNA recombinante por este processo é convertido em biomassa natural que não se distingue substancialmente, na sua composição, da população microbiana, da biomassa era biótopos naturais ou em instalações de clarificação»

A invenção refere-se por consequência ao processo para a inactivaçao de ácidos nucleicos, o qual ê caracterizado por fazer actuar RNases e/ou DNases libertadas autoiiticamente e/ou por secreção, são preferidos os processos com utilização de nucleases celulares naturais ou recombinantes libertadas durante a fermentação em condições estéreis, são especialmente preferidos os processos com adição de nucleses purificadas ou de microorganismos que libertem nucleases, e muito particularmente com o bolor AW13, depositado de harmonia com o Tratamento de Budapeste no Deutschen Sammlung von Mikroorganismen com o numero DSM 5650. A invenção refere-se ainda ao proprio bolor AW13 acima mencionado, identificado como Paecilomyces lilacinus, incluindo as outras estirpes desta espécie que segregam nucleases.

A invenção está ainda abrangida pelos exemplos e pelas reivindicações da patente.

EXEMPLOS

Os exemplos adiante referem-se âs instalações de produção tradicionais para eritropoetina humana recombinante (EPO). A instalação de produção de acordo com o princípio clássico” consls te num ferraentador, num recipiente de recepção de efluentes e numa instalação de extreminação. O conteúdo de células e o material de suporte da caída de fermentação são separados por. sedimentação. Seguidamente o sobrenadante é extraído e é clarificado por filtração. Neste caso o sobreenadante depois da fil tração é submetido a um processo de purificação para a obtenção da eritropoetina humana, enquanto que os componentes sólidos, por conseguinte os resíduos das células e do suporte conjuntamente cora o filtro, são descartados para queima. Os líquidos re siduais provenientes do processo de purificação são conduzidos para o recipiente de recolha dos efluentes. Depois da extracção da calda de cultura o sedimento das células e do suporte é lavado com água corrente e ê conduzido para o recipiente âe recolha de efluentes, seguidamente o ferraentador ê cheio com água

corrente e é aquecido a 120SC durante 20 minutos. Depois do arrefecimento a 80^eC esta água ê então igualmente conduzida para o recipiente de recolha de efluentes. Outras águas residuais que resultam da posterior limpeza do fermentador são igualmente encaminhadas para o recipiente de recolha de efluentes. A água residual neste recipiente de recolha de efluentes é pois composta por águas residuais provenientes do processo de purificação para EPO e da limpeza do fermentador. Toda esta mistura de águas residuais, devido à utilização de água corrente para a limpeza do fermentador, possui condições não fisiológicas para as células animais. Se o líquido no recipiente de recolha de efluentes alcançar uma determinada altura de enchimento, as águas residuais são agitadas durante 30 minutos e seguidamente são bombeadas para a instalação de exterminação. Resta instalação de exterminação o liquido é aquecido a 120^sC e ê mantido 20 minutos a esta temperatura. Seguidamente a água residual inactivada é arrefecida a 80^cC e em seguida, após mistura com uma quantidade dêcupla de água corrente, é encaminhada para a canalização.

BXSMPLO 1: Degradação de DNA por DNases no sobrenadante de culturas de células animais

Durante uma fermentação de células animais as células atrofiam-se continuamente, libertando-se deste modo ácidos nucleicos e proteínas. No processo de produção com DNA recombinante é importante, durante e depois da fermentação, acompanhar a permanência do DNA recombinante. Descobrimos que o teor de DNA no sobrenadante da cultura em fermentação da linha de células de rato 3T1, que contém DNA do plasmídeo pCES (ver o Pedido de Patente EP-A-267 678) e produz EPO é muito reduzido (<d 100 pg/ml). Outros ensaios provaram que nos sobrenadantes das culturas de fermentação destas células existe actividade de DNases A actividade de DNase natural é tão alta que após 6 horas de incubação à temperatura ambiente podem ser degradados completamente 10 pg de pCES DNS/ml no sobrenadante da cultura (figura ). Por conseguinte, em sobrenadantes de culturas, com au7

xílio do Southern Blot também não se pode comprovar a híbridação nem a molécula do plasmídeo pCES de dimensão 14,3 kb, nem outros pequenos fragmentos do plasmídeo.

EXEMPLO 2s Degradação de DNA por DNases nas águas residuais

Todas as águas residuais provenientes da instalação de fermentação referida antes do exemplo 1 são aetualmente, por imposição legal e municipal, recolhidas num recipiente de recepção de efluentes e são depois aquecidas em autoclave na instalação de inactivação. Neste caso o recipiente de recepção cheio até cerca de 30% ou mais e em seguida, a intervalos de cerca de 6 horas, é bombeada para a autoclave na instalação de exterminação. 0 recipiente de recepção não é no entanto esvaziado completamente, mas apenas até um nível tal que permaneçam nele cerca de 10 a 20% das aguas residuais. Estas águas resíduai são então misturadas com as novas águas residuais que vão encher o recipiente. Ensaios de degradação do DNA idênticos aos realizados com sobrenadante das culturas de fermentação (ver exemplo 1} foram realizados também com amostras do recipiente de recolha das águas residuais. Também no presente caso pôde determinar-se, em cada caso, uma actividade de DNase de pelo menos 10 /ig de DNA/ml/6 horas.

A capacidade de transformação de 10 pg do DNA de plasmídeo em bactérias E. colx competentes (2 x 10θ clones/pg de DNA) que foram tratados deste modo é drasticamente reduzido e pode ser eliminado perfeitaraente em função da composição das águas residuais (quadro).

A actividade de DNases pode ser posta em liberdade experimentalmente a partir das células por tratamento com a água corrente. Isto corresponde sensivelmente às condições de trabalho quando o aparelho de fermentação é limpo com água corrente.

t.

A presença de EDTA 10 mM pode inibir a ae tividade de DNases nas águas residuais. 0 EDTA capta iões bivalentes do líquido com formação de quelatos, os quais são essenciais para a actividade biológica das DNases. Por este motivo deverá ter-se o necessário cuidado# caso esteja presente EDTA, para assegurar uma concentração suficiente de por exemplo Mg²⁺ e Zn²⁺.

Como nas águas residuais aparecem pequenas quantidades de resíduos celulares, isolou-se destes DNA que se analisou. Mesmo nos resíduos, onde o DNA está relativamente protegido pelas proteinas das células, pôde apenas ser verificada a presença ds fragmentos de moléculas do plasmídeo pCES mas não moléculas intactas.

EXEMPLO 3: Isolamento de microorganismos das águas residuais

Como as águas residuais no recipiente de recolha (ver exemplo 2)já não são esterilizadas investigou-se se nas águas residuais se podem acumular microorganismos. Verificou-se que o número de gérmens (unidades que formam colónias) por incubação a 30^BC sobre LB-agar se situava em 10⁵/ml; sobre YPD-agar o número de gérmens medido foi de 10^/ml e sobre YNB-agar foi de 10³.

Os valores de números de gérmens no reci piente depois do enchimento com novas águas residuais variam consideravelmente, no entanto os valores determinados acima mostram que a matéria orgânica nas águas residuais, mesmo com condições de cultura desfavoráveis (ausência de agitação, falta de arejamento adicional) e apesar da adição de detergentes, basta para garantir uma multiplicação apreciável de microorganismos.

Investigou-se se este ADN recombinante de microorganismos isolados das águas residuais pode crescer e multiplicar-se. Nem o plasmídeo pCES nem um seu fragmento

puderam ser revelados em qualquer dos organismos por hibri dização de colónias.

Como sao libertados ácidos nucleicos recombinantes por células de ratos lisadas, investigou-se então o isolamento de microorganismos das águas residuais que estão em condições de segregar DNases. Distribuiram-se partes allquotas de 0/01, 0,05 e 0,1 ml de águas residuais sobre LB-agar (preparado 1) e YPD-agar (preparado 2) e incubaram-se a 30®C. Além disso ensaiou-se, num meio que possuía quase exclusivamente ADN como fonte de energia e de carbono, a acumulação de microorganismos com actividade de DNases provenientes das águas residuais. Para o efeito utilizaram-se os seguintes meios:

Meio - DNAí	0,1 19 * 0	g ml	DNA de esperma da arenque
de água	corrente
	0,01	ml	de meio	LB
	0,1	ml	M9 10x	solução de cloreto sódio
	0,01	ml	1 m Cacl₂
	0,01	ml	1 M MgCl₂
	0,01	ml	1 M (NH₄)₂S0₄
Meio -ΙΟ χ M9	70	g	Na₂HP0₄ x H₂0
	30	g	kh₂po₄
	10	g	nh₄ci H₂O até	1000 ml
Meio -LB	10	g	Triptona
	5	g	extracto	de levedura
	5	g	NaCl
			H₂0 até	1000 ml
Meio - YPDí	20	g	Peptona
	10	g	©xtracto	de levedura
	20	g	Glucose
			B₂0 até	1000 ml

Este meio DNA foi misturado com 1 litro de águas residuais e foi incubado 4 dias a 30^QC. 0 meio estava turvo e por microscopia foi possível identificar diversos microorganismos. Deste preparado foram retiradas partes alíquotas de 0,01 e 0,05 ml que se aplicaram sobre LB-agar (preparado 3), Em todos os preparados foi possível isolar microorganisraos e realizar culturas puras.

Preparado 1 (LB-Agar): ·· 2 (YPD-Agar) 5 « 3 (Meio-DNA)

AW1, AW2, AW3, AW4, AW8, AWÔ,AW9 AW1Q, AW11, AW12, AW13

AN5, AW7

EXEMPLO 4>

Caracterizaçao de sete microorganismos tomados em culturas puras

Trese microorganismos com diversas morfologias de colónias e cores foram tomadas era culturas puras. Cresceram todos em placas de agar com meio YPD ou LE. 0 isolado AW10, um bolor com micélio aéreo preto, nao foi investigado mais rainuciosamente porque não cresceu em culturas líquidas com YPD e LB. Os isolados AW1, AW2, AW4, &N6, e AW12, foram rejeitados visto que depois dos primeiros ensaios de cerscimento em diversos meios aparentemente não segregaram DHases. 0 isolado AW3 em culturas líquidas também não segregou DWases, mas foi utilizado noutros ensaios como controle negativo.

Descrição das colónias cios isolados no crescimento sobre LB-agar:

AW3: coloração amarelada

AW5 í incolor

AW6: quadro sintomático de tipo fungo, margem franjada, colónias erguidas cor beige

AW7j branco, brilhante

AW8: côr alaranjada

AW11: côr beige

AW13; micélio aéreo branco, tornando-se cinzento passada uma semana, crescendo sobre toda a placa (aqui aná lise sobre meio YPD).

Descrição ao microscópio óptico dos isolados no caso do crescimento em meio YPD a 30²Gí

AW3t bactéria, cocoide, as células agregam-se era pilhas

AW5: bactéria, cocoide, as células crescera como diplococos ou estreptococos,

AW6: células tipo levedura, circulares a laveraente ovais, formando em parte pequenas cadeias, tam bém formas ramificadas

AW7í bactéria, cocoide, crescendo em associações, maior do que os AW3 e AW5

AW8: bactéria, células cocoides a ovais, crescimento em associações

AWllí grandes células tipo levedura, redondas, isoladas ou aos pares, nenhuraa ramificação

AW13í bolor com micélio aéreo branco sobre placas de agar, micélio ramificado, crescimento muito denso em YPD.

EXEMPLO 5: Comprovação de DNases segregadas

Inocularam-se 30 ml de meio LB ou de meio YPD em balões de Erlenmeyer de 300 ml com oito dos isolados e incubaram-se a 30²C a 120 rpm. Depois de 70 horas de incubação as células foram separadas por centrifugaçãoeo§_Gbrenadante foi ensaiado quanto à actividade de DNases.

Ensaio At

Ensaio B:

0.08 ml de sobrenadante da cultura 0.01 ml tampão (500 mM Tris-HCl, pH 7,5;

mM MgCl2)

0.01 ml solução plasmídeo (1.74 mg/ml)

0.08 ml de sobrenadante da cultura 0.01 ml tampão (500 mM Tris-HCl, pH 7,5 mM MgCl2)

0.015 ml lambda DNA (0,5 mg/ml)

Após Ο, δ, 10 e 15 horas tomaram-se em cada caso 0,03 ml, misturaram-se com 0,005 ml de STOP-mix (100 mM EDTA, 20% de sacarose, azul de bromofenol como marcador), refrigeraram-se a -20^sC e em seguida separaram-se num gel de agarose a 0,8% a 90 V em 3 horas (ensaio A). Mo ensaio B tomaram-se para análise partes alíquotas após 0,8 e 24 horas.

A actividade de DNases extraeelular foi comprovada em sobrenadantes de culturas dos isolados AN5, AW6, AW7, AW8, ANll e AN13. A actividade de DNases distingue-se em parte nas culturas em meio LB ou em meio YPD. Assim, por exemplo, o isolado AN6 segrega mais DNases na cultura em meio YPD do que na cultura em meio LS. O isolado ΆΝ8, pelo contrário, segrega mais DNases na cultura em meio LB. No caso do isolado an3 por outro lado, não foi verificada actividade de DNases nem no crescimento em meio LB nem em meio YPD nas condições de ensaio indicadas: a actividade de DNases mais elevada foi verificada, nas condições de ensaio indicadas, para o isolado AW13. Este organismo, em meio LB e meio YPD segregou DNases puras que puderam degradar totalmente, em pouco tempo tanto o DMA do plasmídeo circular como também o DNA lambda linear.

EXEMPLO 6: Secreção de DNases pelo isolado AW13 nas águas residuais

O isolado AW13 não forma apenas no caso do crescimento em meio LB e meio YPD, mas também nas águas residuais como ocorre no caso da produção de EPD.

300 ml de águas residuais foram aquecidas em autoclave a 121^C durante 20 minutos e inocularam-se com 50 ul de uma cultura de AW13 cora 2 dias (cultivada em YPD) Passadas 24 horas e também após 96 horas foram retirado 1 ml da calda de cultura, centrifugaram-se e os sobrenadantes foram ensaiados quanto à actividade de DNases com DNA de plasmídeo eDNA lambda como substrato. O preparado de ensaio foi

realizado como é descrito no exemplo 5. A tomada de amostras realizou-se ao fim de 0 horas, 3,5 horas e 7 horas. Como controle icubou-se DNA em águas residuais submetidas a autoclave. As águas residuais nas quais se cultivou o AW13 continham alta actividade de DNases. Tanto o DNA de plasmídeo como também o DNA lambda foram degradados.

QUADRO

Transformação de 100 pg de DNA equivalentes após a incuba-

ção de 10 /ig de ADN de pCES à temperatura ambiente em águas
residuais provenientes células animais.	de uma instalação	de fermentação para
Condições de		Colónias	contadas	sobre placas
incubação		de	ampicilina
1 Minuto	1	2	3	4
sem EDTA	S100	13300	10800	9600
J Minuto
com EDTA	6742	10020	9600	7200
6 horas
sem EDTA	10	2	134	0
6 horas
com EDTA	6100	6000	9000	6100

Em cada caso 10 de DNA do plasmídeo pCES foram incubados, após serem adicionados a 1 ml de águas residuais, durante 1 minuto ou durante 6 horas, â temperatura ambiente, com ou sem EDTA (2 mM). Seguidamente tomaram-se 10 jií e trasformaram-se em bactérias competentes da estirpe E. coli DH5. As diversas amostras (1-4) correspondem a tomas de águas residuais do recipiente de recolha de efluentes e com diversas alturas de enchimento e com diversas composições de águas

residuais.

LEGENDA À FIG.:

Em cada caso 10 ug de DNA de pCSS foram incubados em 1 ml de águas residuais provenientes do recipiente de recolha de efluentes a diversas alturas. Seguidamente tomaram-se 10 ul e separaram-se sobre um gei sobre um gel de agarose. 0 gel em seguida aplicado sobre nitrocelulose e foi depois hibridizado contra um fragmento, marcado radioactivamente, de 800 pares-base (bp) do plasmídeo pCES,· e foi exposto. Os sinais sobre a película de raios X foram avaliados quantitativamente e foram registados contra o tempo de incubação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 13 Processo para a inactivação de ácidos nucleicos, especialmente de ácidos nucleicos recombinantes, caracterizado por se fazerem actuar DNases e/ou DNases libertadas por via autolítica e/ou secretórica.

- ?3 _

Processo cie acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se utilizarem DNases e/ou DNases que são libertadas durante a fermentação em condições estéreis.

- 33 Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se utilizarem Rfeses e/ou DNases que são libertadas por microorganismos depois da fermentação sa condições não estéreis.

Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se adicionarem RNases e/ou DNases purificadas.

- 55 Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por as RNases e/ou DNases purificadas estarem imobilizadas de forma imune sobre ara material de suporte.

- 6S Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por as nucleases activas estarem imobilizadas de forma imune em material microveicular celular.

- 7ã Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por as células hospedeiras modificadas genetica mente utilizadas serem transformadas ou modificadas antes da fermentação com genes que transportam nucleases.

- 8a Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se adicionarem aicroorganismos que libertem RNases e/ou DNases que previamente tinham sido tomados de cul turas puras e multiplicados externamente.

- 93 Processo de acordo, com a reivindicação 8 caracterizado por ser utilizado o «sicroorganisno ΆΤΤ13 com o número de deposito DSM 5650 para a secreção de DNases

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 1 de Dezembro de 1080, sob o n^QP 3930771.8*

Lisboa, 30 de Novembro de 1090