JPH03191777A - 核酸の生物学的不活性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は核酸の生物学的不活性化法に関する。

生物工学的製造法で生成し、使用した遺伝子操作した微
生物により汚染されている物質（残留発酵液、水洗液な
ど）は容器に集められ天然の細菌、酵母又は腐生性カビ
による自己消化及び／又は計画的汚染により分解される
。

生物工学的製造法は生物学的物質及び活性化合物（特に
タンパク質、多糖類、抗生物質、アミノ酸、ビタミン、
アルコール）を得るため使用が増加している。現在では
異種生物中でタンパク質を生成させることが分子生物学
的技術により可能である。この関係で微生物、植物、動
物及びヒト遺伝子を各々の場合能の宿主細胞で発現する
ことが可能である。今日タンパク質合成のため圧倒的に
使用されているのはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）及びストレプトミセ
ス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｗ＋ｙｃｅｓ　１ｉｖ
ｉｄａｎｓ）のような細菌及びサツカロミセス・セレビ
シェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏ＋ａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）　、ピキア・パストリス（ｐｉｃｈｉＢ　ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ）及びクルイ７エロミセス・ラクチス（
Ｋ１ｕｙｖｅｒｏｏ＋ｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）のよう
な酵母である。しかしながら動物細胞、例えばモルモッ
ト卵細胞（ＣＨＯ細胞〕、マウス細胞例えば（Ｃ１２７
ｉ細胞〕及びヒト細胞も異種遺伝子発現に使用される。

活性化合物の生産は発酵槽で行うのが好ましく、何故な
らこれらにより近代的制御技術により合成を制御するこ
とができるからである。生成物は細胞から得られるか又
は培養液中に分泌される。

大量の細胞物質が発酵終期に生成し、それらは特に主と
して天然及び同種核酸（ＤＮＡとＲＮＡ）のみならず、
宿主細胞のゲノムに組み込まれた組換えプラスミドＤＮ
Ａ又は外来ＤＮＡを含むことがすべての製造法に共通し
ている。これまでこの組み換えＤＮＡの環境への放出の
可能な危険性を評価することは困難を伴ってのみ可能で
あった。

従って予防的方針に基づいて、法的な要求と規制が多く
の国の関係当局上施設（例えば、ドイツ連邦共和国、ベ
ルリン連邦保険局、生物学的安全性に関する中央委員会
（ＺＫＢＳ）　　（ＦｅｄｅｒａｌＲｅｐｕｂｌｉｃ　
　ｏｒ　　Ｇｅｒｍａｎｙ　　ｔｈｅ　　Ｃｅｎｔｒａ
ｌ　　Ｃｏ＋ｕａｉｔｔｅｅｆｏｒ　Ｂｌｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　５ａｆｅｔｙ（ＺＫＢＳ）ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｅｄ
ｅｒａｌＢｏａｒｄ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ｉｎ　Ｂｅ
ｒｌｉｎ））から発されており、それは環境への可能性
のある危険に対する予防措置として通常は液体である廃
棄物質、従って製造工程の後に存在する核酸のすべての
不活性化を求めている。

核酸は物理的に例えば加熱により不活性化することがで
きる。これは大量のエネルギーを必要とし、従って経費
的に厳しい方法である。

方接酸は化学的に不活性化することができる。

例えば、特許願ＷＯ第８９／　０３２２６号はＤＮＡを
パーカルボン酸、アルカリ金属過酸化物又はアルカリ金
属パーオキソモノスルフェートの存在下で加熱処理する
ことにより化学的に不活性化する方法を提言している。

同様な不活性化方法はクエン酸の使用に基づく。後の方
法も他の化学的方法もいずれも使用者の健康に潜在的な
危険を与え、及び／又は残留する最終生成物は環境に有
害であるという欠点を持つ。両方法において、適当な化
学物質の添加により比較的低い温度（例えば８０℃）で
核酸の完全な不活性化を達成することが可能である。

本発明は核酸を室温で生物学的に不活性化する方法を提
供する。これらの方法は有効であり、費用効率的であり
環境的に受諾可能である。それらは特異的酵素（ヌクレ
アーゼ、すなわちＤＮアーゼ及びＲＮアーゼ）による核
酸の分解、及びこれらの酵素の特に培養液又は廃水に存
在するか又は添加した微生物による形成に基づく。

ここに示す方法論的段階はＤＮアーゼ（組換えＤＮＡを
含む）を動物細胞の溶解により放出することができる発
酵液と廃水を用いて実施した。

特に、核酸で汚染された生成物質（残留発酵液、細胞、
水洗液など）を容器に集め、室温で撹拌しながらある時
間計画的にインキュベートする方法が記述されている。

容器に入り込んだＤＮアーゼ（例えば細胞溶解又は微生
物分泌による放出）は組換えプラスミドＤＮＡを含むＤ
ＮＡを短時間に完全に分解することができる。廃水捕集
容器を不完全にからにすることは微生物群がそれらの構
成を保持することを意味する。それらは容器を再び廃水
で満たした場合、廃水が利用可能なエネルギー源例えば
ＤＮＡを含んでいると更に増殖してＤＮアーゼを分泌す
ることができる。

従って、廃水中に存在する組換え並びに宿主特異的核酸
はヌクレアーゼにより完全に分解され、廃水の加熱又は
化学的不活性化を必要としない。又、微生物は廃水捕集
容器から組換えＤＮＡを取り込まず、従ってＤＮアーゼ
活性の不存在下では廃水中で必然的に安定な組換えＤＮ
Ａは上述の微生物中で発現も複製もしないことも認め　
ｔこ　。

核酸を分解する微生物の増殖は室温においても、及び酵
素導入、培養液の撹拌及び他の手段のような通常の発酵
条件を伴わなくても起こる。

それでも、微生物の発育速度を増加し、高い細胞密度を
実現するため、廃水を例えば通常の室温より高い温度で
発酵させることが可能である。

廃水から分離しＤＮアーゼ分泌菌と同定した微生物を廃
水外で増殖させ、濃縮した形で廃水に添加してインキュ
ベーション段階前にＤＮアーゼ活性を増加させることも
できる。

更に、分泌されるＤＮアーゼをコードする遺伝子をクロ
ーン化し、更に所望の生成物に発現させて、生産工程の
間にもＤＮアーゼを形成させ分泌させて、次いで培養液
法に廃水中の遊離ＤＮＡを分解することも可能である。

又、単離したＤＮアーゼを廃水に添加することも可能で
ある。この方法においては、ＤＮアーゼを遊離のタンパ
ク質分子として、又は別の担体物質もしくは微小担体の
いずれかに結合させた固定化酵素として適用することが
でき、それら自身を細胞発酵に使用することができる。

廃水に本来存在する微生物７０−ラの選択は触媒活性、
半減期、基質特異性、至適ｐＨなどの点で種々な性質を
持つ広範囲のスペクトルのＤＮアーゼが核酸分解のため
存在することを可能にする。

これらの新しく開発された方法による組換えＤＮＡの酵
素的分解は核酸不活性化の物理的又は化学的方法を上回
る利点を持つ。これらの方法は薬剤を使用する人と環境
に対して受入れられない薬剤を必要としない。これらの
方法はかなり経費効率がよく、労働集約的な点がより少
なく、妨害の影響をより受けにくく、また作業者の保護
の点で例えば加熱特に高圧加熱による核酸の不活性化よ
りかなり信頼性が高い。微生物は組換えＤＮＡを取り込
むことがなく、従って組換えＤＮＡの複製又は発現のい
ずれも起こることがない。反対に、組換えＤＮＡは完全
に代謝される。すなわち組換えＤＮＡはこの方法により
その微生物群組成が通常のバイオトープ又は浄化プラン
トのバイオマスと本質的に異ならない天然のバイオマス
に変換される。

従って本発明は自己消化及び／又は分泌により放出され
るＲＮアーゼ及び／又はＤＮアーゼに露出することから
なる核酸を不活性化する方法に関する。好ましい方法で
は無菌条件下で発酵中に放出されるヌクレアーゼ及び／
又は非無菌的条件下で発酵後に微生物により放出される
ヌクレアーゼを使用する。特に好ましい方法では精製し
たヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ放出微生物、特にブタ
ペスト条約により第ＤＳＭ　５６５０号としてジャーマ
ン・ミクロオルガニズム・コレクション（Ｇｅｒｍａｎ
　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
）に寄託されている腐生性カビＡＷ　１３の添加を伴う
。

更に本発明はペシロミセス　リラシヌス（Ｐａｅｃｉｌ
ｏ＋ｏｙｃｅｓ　ｌ１ｌａｃｉｎｕｓ）と同定された上
述の腐生性カビＡＷ　１３自身に関し、前記カビはその
種の他の核酸分泌株も含む。

実施例 次の実施例は組換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）の
通常の製造プラントに関する。「古典的」原理に基づく
製造プラントは発酵槽、廃水捕集槽及び殺菌プラントか
らなる。発酵液中の細胞成分と担体物質は沈降により分
離する。次いで上澄液を抜き出し、濾過して清澄にする
。

更にか過後上澄液をヒトエリスロポエチンを得るため精
製工程にかけ、一方面体成分、すなわちフィルターの細
胞と担体残渣を焼却により廃棄する。精製工程からの廃
液は廃液捕集槽に移送する。培養液を抜き出した後細胞
と担体沈降物は水道水と共に排出し、廃液捕集槽に移送
する。次いで発酵槽を水道水で満たし、１２０℃に２０
分間加熱する。８０℃に冷却後、この水を同様に廃液捕
集槽に移送する。発酵槽を更に洗浄することにより発生
する追加の廃液は同様に廃液捕集槽に移送する。このよ
うにして廃液捕集槽中の廃液はＥＰＯ精製工程及び発酵
槽の洗浄による廃液で構成される。発酵槽の洗浄に水道
水を使用しているのですべての廃水混合物は動物細胞に
とって非生理的な状態を示す。廃水捕集槽中の液体が特
定の水準まで到達すると廃水を３０分間撹拌し、次いで
殺菌槽にポンプ移送する。

殺菌槽中で液体を１２０℃に加熱し、２０分間この温度
に保つ。次いで不活性化しＩ；廃水を８０℃に冷却し、
次に１０倍量の水道水と混合し、下水道に廃棄する。

実施例　ｌ 培養した動物細胞の上澄液中におけるＤＮアーゼによる
ＤＮＡの分解 動物細胞の発酵中連続的な細胞の死があり、その結果核
酸とタンパク質が放出される。組換えＤＮＡを使用する
製造工程において、発酵中及び発酵後の組換えＤＮＡの
所在を監視することが重要である。本発明者等はｐＣＥ
ＳプラスミドＤＮＡ（欧州特許願第２６７６７８号参照
）を含み、ＥＰＯを生産するマウスセルライン３Ｔ１の
発酵の培養上澄液中のＤＮＡ含量は極めて低い（＜　１
１００ｐ／　ｌ１１２）ことを見出した。更に研究した
結果、これらの細胞の発酵の培養上澄液はＤＮアーゼ活
性を含むことが明らかになった。天然のＤＮアーゼ活性
は極めて高いので、培養上澄液中のｌθμ９・ｐＣＥＳ
ＤＮＡ／ｍ１２が室温で６時間のインキュベーション後
完全に分解されることが可能であった（図参照）。これ
がサザンプロットハイプリダイゼーションにより培養上
澄液中にさえ大きさが１４．３ｋｂのｐＣＥＳプラスミ
ド分子も他のより小さい断片も検出されなかった理由で
ある。

実施例　２ 廃水中のＤＮアーゼによるＤＮＡの分解実施例１で述べ
た発酵プラントから発生するすべての廃水は、現在法令
と当局の要求により廃水補集槽に集め、次いで不活性化
プラントで高圧加熱する。これには補集槽の約３０％又
はそれ以上が満たされた後、毎時最小の時間範囲で高圧
殺菌用殺菌プラントにポンプ輸送することが必要である
。しかしながら、補集槽は不完全にしかからにならず、
廃水の約ｌθ〜２０％が残留する。次いでこの廃水は導
入される新しい廃水と混合される。発酵の培養上澄液に
おける（実施例１参照）と同様なりＮＡ分解試験を廃水
補集槽の試料についても実施した。再び、各々の場合に
おいて少なくともｌＯμ９のＤＮＡ／ｒｔｒＱ／６時間
のＤＮアーゼ活性が認められた。

このように処理したｌＯμ９のプラスミドＤＮＡの受容
能のあるＥ、　　ｃｏｌｉ細菌中の形質転換能に激しい
減少が認められ（２ＸＩＯ″クロ一ン／μｇ・ＤＮＡ）
、廃水の組成により完全に除くことができる（表参照）
。

ＤＮＡアーゼ活性は実験的に水道水で処理することによ
り、細胞から放出することができる。

これはほぼ発酵装置を水道水で清浄にする場合の条件に
相当する。

廃水中のＤＮアーゼ活性はｌｏｍＭのＥＤＴＡの存在で
阻害することができる。ＥＤＴＡは液体のＤＮアーゼの
生物学的活性に必須の二価荷電イオンを捕獲してキレー
トを形成する。このことがＥＤＴＡが存在しても例えば
Ｍ　ｇ　２＋及びＺｎ”＋の濃度が十分であることに注
意しなければならない理由である。

少量の細胞断片が廃水中に入り込むので、それからＤＮ
Ａを単離し分析した。ＤＮＡが細胞タンパク質により比
較的保護される断片中においても、断片のみが検出され
、完全なｐｃＥｓプラスミド分子を検出することはでき
なかった。

実施例　３ 廃水からの微生物の分離 捕集槽（実施例２参照）中の廃水はもはや無菌的ではな
いので、廃水中の微生物の蓄積の可能性を研究した。３
０℃でＬＢ寒天でインキュベーションした場合微生物数
（コロニー形成単位）は１０ｓ／ｒｔｒＱであり、測定
可能な微生物数はＹＰＤ寒天でｌ　Ｏ’　／　ｒａ　（
ｌ及びＹＮＢ寒天で１０”であることが認められた。

捕集槽中の微生物数は新たな廃水を導入した後確かに変
動するが、先きに測定した値は廃水中の有機物質が貧弱
な培養条件下（無撹拌、無通気）でかつ洗浄剤添加の場
合においてもかなりの微生物が確実に増殖するために十
分であることを示した。

廃水から分離した微生物が組換えＤＮＡを取り込み、複
製することが可能か否かを研究した。

いかなる微生物のコロニーハイブリダイゼーシコンによ
ってもｐＣＥＳプラスミド又はその断片が検出されなか
った。

組換え核酸は溶解したマウス細胞から放出されるので、
次にＤＮアーゼを分泌することができる微生物の廃水か
らの分離を試みた。廃水の０．０１．０．０５及び０．
１ｔｉＱをへらでＬＢ寒天（混合物１）とＹＰＤ寒天（
混合物２）に塗り広げ、３０℃にインキュベートした。

　ＤＮＡをほぼ唯一のエネルギー及び炭素源として含む
培地中で廃水からＤＮアーゼ活性を持つ微生物を蓄積す
る試みも行った。

次の培地はこの目的のために作った。

ＤＮＡ培地　　　　ニシン精液のＤＮＡ水道水 ＬＢ培地 Ｍ！ＪＩＯＸ塩類溶液 ｌ　Ｍ　ＣａＣＱｘ ｌ　Ｍ　ＭｇＣＬ １　Ｍ　（ＮＨａ）ｔｓＯ４ ０，１ｇ １９．０＋＊α ０．０１ｍＱ Ｏ，１ｍ１２ ０．０１ｍ１２ ０、Ｏ１誼ａ Ｑ、Ｑｌ＋＋（２ １０ＸＭ９培地 Ｎａ、ＨＰＯ，Ｘ　Ｈ，０７０ｙ ＫＨ＊ＰＯｔ　　　　　　　　　　３ｈＮＨ，Ｃ１２１
ｈ Ｈ，０を添加してｌｏｏＯｍＱにする ＬＢ培地 トリプトン　　　　　１０ｇ 酵母エキス　　　　　５ｇ ＮａＣａ　　　　　　　　５ｇ Ｈｌｏを添加して１０００鱈にする ＹＰＤ培地 ペプトン　　　　　　２０９ 酵母エキス　　　　　１０９ グルコース　　　　　２ｈ Ｈ，Ｏを添加して１０１００Ｏにする このＤＮＡ培地を１ｒａＱの廃水と混合し、３０℃で４
日間インキュベートした。培地は混濁し、顕微鏡下で種
々の微生物が確認された。この混合物から０．Ｏｌ及び
０．０５ｍ＜２の試料を除き、ＬＢ寒天にへらで塗り広
げた（混合物３）。すべての混合物で微生物を分離し、
それを純粋培養とすることができた。

Ｒ合物１　（ＬＢ寒天）　：　　ＡＷＩ％ＡＷ２、ＡＷ
３、ＡＷ４、ＡＷ５、ＡＷ８、ＡＷ９混合物２　（ＹＰ
Ｄ寒天）：ＡＷｌｏ、ＡＷＩＩ％ＡＷ１２、ＡＷ１３混
合物３　（ＤＮＡ培地）：ＡＷ６、ＡＷ７実施例　４ 純粋培養にした７つの微生物の確認 風なるコロニーモルフオオロジーと色を持つ１３の微生
物を純粋培養にした。それらのすべてはＹＰＤ又はＬＢ
培地の寒天平板上で発育した。分離株ＡＷＩＯは黒い気
菌糸のカビであり、ＹＰＤ及びＬＢ液体培養で発育せず
、それ以上研究しなかった。分離株ＡＶｌＳＡＷ２、Ａ
Ｗ４、ＡＷ６及びＡＷ　１２は最初に研究した後、それ
らが明らかに種々な培地で発育する際ＤＮアーゼを分泌
しなかったので廃棄した。分離株ＡＷ３は同様に液体培
養でＤＮアーゼを分泌しなかったが、ネガチブ対照とし
て以後の実験に含めた。

ＬＢ寒天に発育した分離株コロニーの記述：ＡＷ３　：
　　黄色 ＡＷ５　：　　無色 ＡＷ７　：　　白色、光沢あり ＡＷ８　：　　オレンジ色 ＡＷＩＩ：　　ベージュ色 ＹＰＤ培地に３０℃で発育した一分離株の光学顕微鏡Ａ
Ｗ３　：細菌、球菌様、細胞は凝集してクラスターとな
る 実験Ａ：　　培養上澄液 ０−Ｏｈ（２ により中鎖を形成、分岐形態もとる ＡＷ７　：細菌、球菌様、生育してクラスターになり、
ＡＷ３とＡＷ５より大 ＡＷ８　：細菌、球形ないし卵形細胞、増殖してクラス
ター形成 ＡＷＩＩ：大きい酵母状細胞、円形、単一又は二連、分
岐せず 実施例　５ 分泌したＤＮアーゼの検出 ３００瀧（＋のエルレンマイヤーフラスコ中で３０肩ａ
のＬＢ培地又はＹＰＤ培地に８つの分離株を植菌し、３
０℃、１２０ｒｐｎ＋でインキュベートした。７０時間
インキュベーション後、細胞を遠心沈殿し、上澄液のＤ
ＮＡ活性を測定した。

プラスミド溶液（１，７４＋ｗｇ／ｍ（２）　　０．０
１ｍ１２実験Ｂ：　　培養上澄液　　　　　　　　　０
−０８ｍ１２ラムダＤＮＡ（０，５ｉｔ９／ｍ（２）　
　　　　０．０１５ｍ＜２０．０３ｉｔｉ２の試料を０
，６．１０及び１６時間後採取し、０．００５ｍ（ｌの
５ＴＯＰ混液（１００■Ｍ　ＥＤＴＡ、　２０％シュク
ロース、指示１ｃ七してブロモフェノールブルー）と混
合し、−２０℃で凍結し、次いで０．８％アガロースゲ
ルで９０Ｖで３時間分画した（実験Ａ）、実験Ｂでは分
析用試料を０．８及び２４時間後に採取した。

細胞外ＤＮアーゼ活性は分離株ＡＷ５、ＡＷ６、ＡＷ７
、ＡＷ８、Ａｌｌ　ｌ及びＡｌ１１３の培養上澄液で検
出された。ある場合、ＤＮアーゼ活性はＬＢ培地又はＹ
ＰＤ培地で培養した場合具なった。例えば、分離株ＡＷ
６はＹＰＤ培地で培養した場合ＬＢ培地で培養した場合
より多量のＤＮアーゼを分泌した。これとは反対に、分
離株８はＬＢ培地で培養した場合の方がより多量のＤＮ
アーゼを分泌した。一方、分離株ＡＷ３は上述の実験条
件でＬＢ培地又はＹＰＤ培地のいずれで発育した場合も
ＤＮアーゼ活性は検出されなかった。最高のＤＮアーゼ
活性は与えられた条件下で分離株ＡＷ１３で検出された
。ＬＢ及びＹＰＤ培地でこの微生物は環状プラスミドＤ
ＮＡ及び線状ラムダＤＮＡを短時間に完全に分解するこ
とができるＤＮアーゼ（一つ又は複数）を多量に分泌し
た。

実施例　６ 廃水中における分離株ＡＷ１３のＤＮアーゼの分泌分離
株ＡＷ１３はＤＮアーゼをＹＰＤ及びＬＢ培地で発育す
る場合のみならず、ＥＰＯの生産で生成する廃水中でも
生産する。

３００ｍ＋２の廃水を１２１　’Ｃで２０分間オートク
レーブ殺菌し、５０μＱの２日培養のＡＷ１３培養（Ｙ
ＰＤで発育）を植菌した。２４時間後と９６時間後に１
ｍ（２の培養液を除き、遠心分離し、上澄液のＤＮアー
ゼ活性をプラスミドＤＮＡとラムダＤＮＡを基質として
試験した。実験計画は実施例５に記述した通りである。

試料採取は０時間、３．５時間及び７時間後に行った。

対照としてＤＮＡをオートクレーブ殺菌した廃水中でイ
ンキュベートした。ＡＷ１３が発育した廃水は高いＤＮ
アーゼ活性を含んでいた。

プラスミド及びラムダＤＮＡの両方が分解されＩこ　。

表 から採取した１ｍＱの廃水中でインキュベートし動物細
胞の発酵プラントからの廃水中で室温で１０μ９のｐＣ
ＥＳ　ＤＮＡをインキュベーションした後の１１００ｐ
と同等のＤＮＡの形質転換 ＥＤＴＡ無添加で１分間　　　６１００　　１３３００
　　１０８００ＥＤＴＡ添加で１分間　　　　６７４２
　　１００２０　　９６００ＥＤＴＡ無添加で６時間　
　　　１０　　　　２　　　１３４ＥＤＴＡ添加で６時
間　　　　６１００　　６０００　　　９０００６００ ２００ １００ ｐＣＥＳプラスミドＤＮＡのｌＯμ９の試料を１１１１
２の廃水に添加し、ＥＤＴＡ　（２ｍＭ）添加又は無添
加で室温で１分間又は６時間インキュベートした。次い
でｌＯμＱを除き、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ５株の受容能
のある細菌中に形質転換した。種々な試料（１−４）は
異なる組成の廃水を異なる水準に満たした捕集槽から採
取した廃水に相当する。

ｐｃＥｓ　ＤＮＡのｌＯμｇの試料を種々な時間に捕集
槽た。次いで１ＯｕＱを除き、アガロースゲル上で分画
した。ゲルをニトロセルローズへプロットし、ｐＣＥＳ
プラスミドの８００塩基対（ｂｐ）の放射能ラベルした
断片をハイブリダイズし、次いで露出した。Ｘ線フィル
ムのシグナルを定量的に評価し、インキュベージタン時
間に対してプロットした。

結果を図面で示す。

【図面の簡単な説明】

添付図面は１０　ｕ　ｙ　／　ｒｘ　ＱのｐｃＥｓプラ
スミドＤＮＡを室温で捕集槽からの廃水中でインキュベ
ートした場合のｐＣＥＳプラスミドＤＮＡの経時的変化
を表すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）自己消化及び／又は分泌により放出されるＲＮアー
   ゼ及び／又はＤＮアーゼに露出することからなる核酸特
   に組換え核酸の不活性化法。 ２）無菌条件下で発酵中に放出されるＲＮアーゼ及び／
   又はＤＮアーゼを使用する請求項１記載の方法。 ３）非無菌条件下で発酵後微生物により放出されるＲＮ
   アーゼ及び／又はＤＮアーゼを使用する請求項１記載の
   方法。 ４）精製したＲＮアーゼ及び／又はＤＮアーゼを添加す
   る請求項１記載の方法。 ５）担体物質に固定化した精製したＲＮアーゼ及び／又
   はＤＮアーゼを添加する請求項１記載の方法。 ６）活性ヌクレアーゼは細胞培養に使用する微小担体に
   固定化された酵素として含まれる請求項５記載の方法。 ７）使用する遺伝的に変更した宿主細胞は発酵前ヌクレ
   アーゼをコードする遺伝子で形質変換又はトランスフェ
   クションされる請求項２記載の方法。 ８）予め純粋培養し、外部で増殖したＲＮアーゼ及び／
   又はＤＮアーゼ放出微生物を添加する請求項１記載の方
   法。 ９）寄託番号第ＤＳＭ５６５０号の微生物ＡＷ１３をＤ
   Ｎアーゼ分泌のために使用する請求項８記載の方法。 １０）ジャーマン・ミクロオルガニズム・コレクション
   （ＧｅｒｍａｎＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＣｏｌｌｅ
   ｃｔｉｏｎ）に第ＤＳＭ５６５０号で寄託されている微
   生物ＡＷ１３。 １１）核酸分解のためヌクレアーゼを分泌するペシロミ
   セス・リラシヌス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｌｉｌａ
   ｃｉｎｕｓ）株の使用。 １２）核酸分解のためペシロミセス・リラシヌス株、特
   にＤＳＭ５６５０株が分泌するヌクレアーゼの使用。