PT94010A - Processo para a preparacao de derivados de 3,6,7,8-tetra-hidro-imidazo{4,5-d}-{1,3} diazepin-8-ol - Google Patents

Description

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Descrição referente à patente de in venção de SCHERING AGROCHEMICALS LI MITED, britânica, industrial e comercial, com sede em Hauxton, Cam-bridge CB2 5HU, Inglaterra, (inventores: Brian David Bush, Dunean Alistair Gates e David Langley, residentes na Inglaterra), para: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO PE DERIVADOS DB 3.6.7.8-TETRA-HIDRO-IMIDA-Z0/“4,5-d7~C1» 27l>IAZEPIN-8-OL* ,

Descrição A presente invenção refere-se a compostos herbicidas, alguns dos quais são novos, a um processo para a sua preparação, e a composiçães que os contem.

Verificou-se que os derivados 3,6,7j8-tetra-hidro-imi dazo-/_4,5-d7-/"~l,<27rdiazepin-8-ol da fórmula J.M.

r e seus conjugados de açúcar são activos herbicidicamente.

Como é convencional, a linha a tracejado na fórmula indica que a ligação entre os dois átomos de carbono pode ser quer uma ligação simples quer uma ligação dupla. Aqueles compos, tos onde existe uma ligação simples entre os átomos de carbono relevantes são novos, e num aspecto, a presente invenção propor ciona-os per se.

Os conjugados de açúcar dos compostos da fórmula 1, como o termo ó aqui utilizado são aqueles onde um ou vários dos grupos -OH ou do grupo -NH na molécula é substituído com um gru po -0R ou -NR respectivamente, onde R representa uma porção açú car, especialmente uma porção hexose, e particularmente uma por Ção glucose. Ê preferencial que apenas um grupo açúcar simples esteja presente nos conjugados de açúcar. É também preferencial que isto se verifique onde o grupo -QR substitui o grupo -OH no grupo -CHgOH na fórmula I. 0 termo "compostos da fórmula I" é utilizado em segui da para incluir conjugados de açúcar.

Os compostos da fórmula I são activos herbicidicamente contra uma gama de ervas daninhas de folha larga e gramíneos. Eles podem assim ser utilizados como herbicidas, como herbicidas totais, ou possivelmente como herbicidas selectivos, particularmente no controlo de uma gama de ervas daninhas nos cereais ou outras culturas, por exemplo trigo, arroz, cevada, milho, soja, colza, algodão ou beterraba sacarina.

Num outro aspecto, a invenção proporciona a utilizaçãc de um ou mais compostos da fórmula I como um herbicida, e também uma composição herbicida que inclui um ou mais dos compostos da fórmula I em associação com um veículo e/ou agente tensio-acti-vo adequado.

Os compostos da fórmula I possuem, cada um, vários núcleos ópticos e por isso vários isómeros ópticos. A presente invenção não se limita de qualquer forma a isómeros ópticos específicos, mas como é usual em tais compostos, alguns isómeros óp-' ticos podem apresentar maior actividade em certos aspectos do

« 2 B f h

que outros.

Os compostos preferenciais desta invenção incluem 3-2»3-di-hidroxi-4-(hidroxi-metil)ciclo-pentil7-3, 5»7»8-tetra--hidro-imidazo/"*4,5-d7/"l,27dias5ePÍn-8-ol (a seguir referido co mo HComposto A"), 3-/"*2,3-di-hidroxi-4-(j^D-glucosiloxi-metil) ciclo-penti^-3, 5 · 7»8-tetra-hidro-imidazo_/~^ y 5-d7Z"~1 f$á.±ax&v±n -8-ol (isto é, um conjugado glicose do Composto A)f e 3 -di-hidroxi-3-(h±droxi-metil)ciclo-pent-2-en-l- ij7-3t5,7,8-te-tra-hidro-imidazo/"%,5-d7Z"*1,37“diazepin-8-ol (a seguir referido como "Composto B"), Os isómeros ópticos preferenciais destes compostos julga-se serem o 8R-3-/""(lR, 2S, 3R, 4R) -2,3-di-hidro xi-4-(hidroxi-metil) ciclo-pentil7”3· 5»7»8-tetra-hidro-imidazo ,5-dJ/7 1127diazepin-8-ol (a seguir referido como "Composto Al"), o seu derivado correspondente k-{ (5-D-glucosiloxi-metil) (a seguir referido como "Composto A2"), 8R-3-^f*(^» 2S, 3R» ks)---2,3-di-hidroxi-4-(hidroxi-metil) ciclo-pentil/-3,5»7,8-tetra--hidro-imidazo j£“h,1»37diazepin-8-ol (a seguir referido como «Composto A3"), e 8R-3-/“(lR, ^R, 5S)-4,5-di-hidroxi-3--( hidroxi-metil)ciclo-pent-2-en-l-il7-3*6»7»8-tetra-hidroximi-dazo/”4,5-d7Z~l*.27-diazepin-8-ol (a seguir referido como "Composto 81")*

As composições contêm usualmente de 0,01 a 99$ em peso dos compostos presentes, e são normalmente produzidos inicial mente como concentrados contendo de 0,5 a 99$· de preferência de 0,5 a 85$, e especialmente de 10 a 50$ do seu peso· Tais con centrados são diluídos se necessário antes da aplicação ao locaL a ser tratado de forma que os ingredientes activos incluam de 0,01 a 5$ em peso da formulação aplicada. 0 veículo pode ser água, e nesses casos pode também estar presente um solvente orgânico, ainda que este não seja normalmente empregue· 0 veículo pode ser altemativamente um solvente orgânico não miscível na água no qual são dissolvidos ou suspensos os compostos. Um concentrado emulsionável contendo um solvente não miscível na água pode ser formado com um agente tensio acti * vo de forma que o concentrado actue como um óleo auto-emulsioná \ \

r vel por mistura com a água. 0 veículo pode ser, alternativamente, um solvente orgânico miscível na água, por exemplo 2-metoxi-etanol, metanol, propileno-glicol, di-etileno-glicol, mono-etil-éter de di-etile no-glicol, metil-formamida ou di-metilformamida. 0 veículo pode ser alternativamente um solido, que po de ser finamente dividido ou granular* São exemplos de sólidos adequados a pedra calcária, argilas, areia, mica, giz, atapulgi te, diatomite, perlite, sepiolite, sílicas, silicatos, ligneo--sulfonatos e fertilizantes sólidos. 0 veículo pode ser de origem natural ou sintética ou pode ser um material natural modifi cado.

Os pós humedecíveis solúveis ou dispersáveis na água podem ser formados misturando o composto na forma particulada com um veículo particulado ou aspergindo o composto fundido sobre o veículo particulado, misturando um agente de humedecimento e um agente dispersante e moendo finamente a mistura em pó total·

Pode ser formada uma composição de aerossol misturando os compostos presentes com um propulsor, por exemplo um al-cano poli-halogenado tal como di-cloro-fluoro-metano e também adequadamente com um solvente. 0 termo wagente tensio activo” utiliza-se no sentido lacto para incluir materiais variados, chamados agentes emulsiç» nantes, agentes dispersantes e agentes de humedecimento. Tais agentes são bem conhecidos na especialidade.

Os agentes tensio activos utilizados podem incluir agentes tensio activos aniónicos, por exemplo mono- ou di-éste-res do ácido fosfórico com um álcool gordo etoxilado ou sais de tais ésteres, sulfatos de álcool gordo tais como dodecil-sulfa-to de sódio, sulfatos de álcool gordo etoxilado, sulfatos de al quil-fenol etoxilado, sulfatos de lignina, sulfonatos de petróleo, sulfonatos de alquil-arilo tais como sulfonatos de alquil--benzeno ou sulfonatos de alquil-naftaleno inferior, sais de ca. * densados de naftaleno-formaldeído sulfonados, sais de condensa- = 4 = dos de fenol-formaldeído sulfonados, ou sulfonatos mais complexos tais como sulfonatos de amidaf por exemplo o produto de con densação sulfonado do ácido oleíco e N-metil-taurino ou os sul-fo-succinatos de di-alquilo, por exemplo, o sulfonato de sódio do di-octil-succinato·

Os agentes tensio activos podem incluir também agentes não iónicos, por exemplo produtos de condensação ou ésteres do ácido gordo, álcoois gordos, amidas do ácido gordo ou fenóis substituídos com alquilo com óxido de etileno, ésteres gordos de éteres do álcool poli-hídrico por exemplo ésteres do ácido gordo sorbitano, produtos de condensação de tais ésteres com óxido de etileno, por exemplo ésteres do ácido gordo de poli--oxi-etileno sorbitano, copolímeros de bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilénicos tais como 2,4,7*2 -tetra-metil-5-decin-4,7-diol, ou glicóis acetilénicos etoxila-dos.

Os agentes tensio-activos podem incluir também agente* catiónicos, por exemplo, compostos de amónio quaternário substituídos com alquilo e/ou arilo tais como brometo de cetil--tri-metil-aniínio, ou aminas gordas terciárias etoxiladas· 0* agentes tensio-activos preferenciais incluem sulfatos de álcool gordo etoxilado, sulfonatos de lisina, sulfonatos de alquil-arilo, sais de condensados de fenol-formaldeído sulfonados, oleo N-metil-taurido de sódio, sulfo-succinatos de di-alquilo, etoxilatos de alquil-fenol e etoxilados de alquilo gordos.

Os compostos activos presentes podem ser misturados com compostos inorgânicos, por exemplo, (NH^)2S0^, um óleo, ou outro pesticida, por exemplo um herbicida, fungicida ou insecti cida,ou um regulador do crescimento da planta, particularmente outro herbicida. Os herbicidas adicionais adequados incluem tri -etazina, linurono, MCPA, diclorprope, isoxabeno, diflufenica-no, metolacloro, fluometurono, oxifluorfeno, fomescefeno, benta zono, prornetrina, norflurazono, clomazona, EPTC, imazaquino, e especialmente glifosato, metil naetsulfurono, sulfometurono, isoproturono, metabenztiazurono, trifuralino, ioxinilo, bromo- “ 5 * CV Γ.-Τ- -s xinilo, benazolino, mecoprope, fluroxipiro, alacloro, acifluor-feno, hactofeno, metribuzino, pendimetalino, etofumesato, benfu resato e fenmedifamo*

Os compostos presentes podem aplicar-se a plantas, ao Sdo e a áreas de terra ou aquáticas, e particularmente a iam local no qual esteja em crescimento uma cultura. Os compostos são particularmente activos pás-emergência. Eles podem ser aplicados numa proporção de 0,02 a 2 kg/ha, especialmente de 0,1 a 1 kg/ /ha.

Os compostos desta invenção podem ser preparados pelos processos discutidos em seguida. Âssim, de acordo com um aspecto adicional desta invenção, proporciona-se um processo para a produção de um composto da fórmula I que inclui a fase de cultura dum microrganismo capaz de produzir o composto da fórmula I e, se desejado, o isola mento do referido composto.

Os microrganismos capazes de produzir os compostos des ta invenção podem ser rapidamente identificados utilizando um ensaio de pequena escala e analisando uma amostra de ensaio obtida da fermentação do microrganismo, por cromatografia líquida de elevada capacidade.

Em particular o microrganismo a ser utilizado no processo de acordo com esta invenção e uma espécie, não descrita previamente, do microorganismo depositada em 13 de Abril de 198$ na colecção de cultura permanente da National Collection of Industrial and Marine Bactéria, Torry Research Station, 133 Abbey Road, Aberdeen, Escócia, sob consentimento nS, NCIMB 40131. O NCIMB 40131 é um actinomiceto caracterizado como Amycolatopsis spp (Lechevier et al Int. J* Syst, Bacteriol 36, 29-37 (1986) com base nas marcadores taxonómicos seguintess - quimio-tipo IV de parede, contendo ácido meso-di-ami-no-pimélico, arabinose e galactose como açúcares de diagnóstico (configuração de açúcar de célula global A) - nenhum ácido micólico presente = 6 =

- configuração fosfolípida II, contendo assim fosopa-tidil-etanol-amina como lípido de diagnóstico, 0 estado genérico dos organismos confirmou-se também utilizando actinofagio específico para as espécies Amycolatopais (Prauser W2, W4, ¥7» ¥ll).

As características do NCIMB 40131 apresentam-se no Exemplo 6 a seguir.

Esta invenção proporciona, num aspecto adicional, o microrganismo NCIMB 40131 per se e seus mutantes.

Os mutantes da espécie anterior podem aumentar espontaneamente ou podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo os apresentados em Techniques for the Development of Microorganisms por Η I Adler em "Radiation and Radioisotopes fox Industrial Microorganismsn, Proceedings of the Symposium, Vienna 1973» p 24l, International Atomic Energy Authority, Tais métodos incluem radiação ionizante, métodos químicos, por exemplo tratamento com N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), calor, técnicas genéticas tais como recombinação, transducção, transformação, lisogenização e conversão lisogénica e técnicas selectivas para mutantes espontâneos.

De acordo com um aspecto ainda adicional desta invenção proporciona-se o material genético do NCIMB 40131 e seus mutantes que participam na síntese do composto da fórmula I. Tal material pode ser obtido utilizando técnicas de engenharia genética convencionais incluindo os apresentados por D A Hopwood em "Cloning Genes for Antibiotic Biosynthesis in Streptomyces Sppi Production of a Hybrid Antibiotic” p 409-413 em Microbio-logy 1985» Ed L. Lieve, American Society of Microbiology, Yashin gton DC 1985. Tais técnicas podem ser utilizadas duma maneira se melhante à previamente descrita para a clonagem de genes de anti bióticos bio-sintéticos, incluindo os genes bio-sintéticos para a a actinorhodina (Malpartida, F e Hopwood, D A 1984, Nature 309» p 462-464), eritromicina (stanzak, R et al, 1986, Biotech-nology, 4, p 229-232) e uma enzima importante envolvida na produção da penicilina e cefalosporina em Acremonium chrvsogenum K 7 St

(Sansom, S M et al, 1985) Nature, 318, p 191-19*0· 0 material genético assim obtido pode ser utilizado, por exemplo, para melhoramento da espécie, para produção de enzimas bio-sintéticas para aplicações in vitro. ou para geração de herbicidas novos por introdução de tal material nos organismos diferentes do NCIMB 40131. A produção dos compostos desta invenção por fermentação de um organismo adequado pode ser efectuada por meios convencionais, isto é por cultura do organismo na presença de fontes de carbono, azoto e sais minerais assimiláveis.

As fontes de carbono, azoto e sais minerais assimiláveis podem ser proporcionadas por nutrientes simples ou complexos. As fontes de carbono incluem geralmente glicose, maltose, amido, glicerol, melaço, dextrina, lactose, sacarose, fructose, ácidos carboxílicos, amino-ácidos, glicéridos, álcoois, alcanos e óleos vegetais. As fontes de carbono constituem geralmente de 0,5 a 10$ em peso do meio de fermentação.

As fontes de azoto incluem geralmente farinha de soja, licores de infusão de milho, destilados solúveis, extractos de levedura, farinha de semente de algodão, petonas, farinha de amendoim, extractos de malte, melaço, caseína, misturas de amino-ácidos, amónia (gás ou solução), sais ou nitratos de amónio. Podem também ser utilizadas ureia e outras amidas. As fontes de azoto constituem geralmente de 0,1 a 10$ em peso do meio de fer mentação.

Os sais minerais nutrientes que podem ser incorporados no meio de cultura incluem os sais geralmente utilizados ca pazes de produzirem iões sódio, potássio, amónio, ferro, magnésio, zinco, níquel, cobalto, manganês, vanádio, crómio, cálcio, cobre, molibdénio, borato, fosfato, sulfato, cloro e carbonato. A cultura de organismo pode geralmente ser efectuada a uma temperatura de 20 a 40° C, de preferência de 25 a 35° C» especialmente próxima dos 28° C, e pode realizar-se desejávelmente com arejamento e agitação. 0 meio pode inicialmente ser inoculado com uma peque- = 8 =

na quantidade de uma suspensão de microrganismos esporolados mas de modo a evitar uma retardação do crescimento pode ser pre parado um inoculo vegetativo do organismo inoculando uma pequena quantidade do meio de cultura com o esporo doorganismo e o inoculo vegetativo obtido pode ser transferido para o meio de fermentação ou mais preferencialmente para um ou mais etágios da semente onde se realiza o crescimento adicional antes da transferência para o meio de fermentação principal, A fermentação realiza-se geralmente em gamas de pH de 5*5 a 8,5» de prefe rência de 5,5 a 7,5. Pode ser necessário adicionar uma base ou um ácido ao meio de fermentação para manter o pH dentro da gama desejada* As bases adequadas que podem ser adicionadas incluem hidróxidos de metal alcalino tais como hidróxido de sódio aquoso, Os ácidos adequados incluem ácidos minerais tais como ácido clorídrico ou sulfárico, A fermentação pode realizar-se por um período de 2--10 dias, por exemplo, aproximadamente 5 dias. Um agente anti--espumante pode estar presente para controlar a formação excessiva de espuma e pode ser adicionado em intervalos quando neces_ sário,

Os compostos de acordo com esta invenção estão predominantemente contidos no caldo de fermentação, A micólia pode ser removida convenientemente do caldo por filtração ou centrifugação .

Para utilização como herbicidas agrícolas pode não ser necessário separar os compostos do meio de fermentação em que eles são produzidos,

Quando se deseja separar os compostos desta invenção da fermentação global, esta pode ser realizada por técnicas de isolamento e separação convencionais. As técnicas de isolamento podem também ser aplicadas ao caldo de fermentação antes ou depois da clarificação, Ê de notar que a escolha das técnicas de isolamento pode ser largamente variada.

Os compostos da presente invenção podem ser isolados e separados por uma variedade de técnicas de fraccionamento, por exemplo adsorção-eluição, precipitação, cristalização fracciona- = 9 = 1

[S da, extracção de solvente e separação líquido-líquido que podem ser combinadas de vários modos.

Verificou-se que a cromatografia sobre um suporte ad_e quado na forma de um leito ou, mais preferencialmente, numa coluna, era particularmente adequada para isolar e separar os com postos desta invenção. A purificação e/ou separação dos compostos desta invenção a partir do caldo de fermentação pode ser convenientemen te efectuada por cromatografia (incluindo cromatografia líquida de elevada capacidade) sobre um suporte adequado tal como sílica; uma resina de adsorção macro-reticular não funcional por exemplo resinas de polímero de estireno-divinil-benzeno reticuladas tais como resinas Amberlite XAD-2, XàD-k, XAD-lé ou XAD--1180 (Rohm & Haas Ltd) ou Kastell S112 (Montedison); um polímero de estireno-divinil-benzeno substituído, por exemplo um po_ límero de estireno-divinil-benzeno halogenado (por exemplo bromado) tal como Diaion SP207 (mitsubishi); um dextrano reticulado compatível com um solvente orgânioo tal como Sephadex LH 20 (Pharmacia UK Ltd), ou sobre suportes de fase inversa tais como sílica ligada a hidrocarbonetos, por exemplo sílica ligada a °18·

Os solventes/eluentes adequados para a purificação/sje paração cromatográfica dos compostos desta invenção dependem, naturalmente, da natureza do suporte de coluna. Quando se utili zam suportes de coluna tais como Amberlite XAD-2 e sílica ligada a C^g verificou-se que os álcoois tais como metanol são particularmente adequados, especialmente quando combinados com um solvente polar tal como água. A presença dos compostos desta invenção durante os pro cedimentos de extracção/isolamento pode ser controlada por técnicas convencionais tais como cromatografia líquida de elevada capacidade ou espectroscopia de UV ou por utilização das propriedades dos compostos anteriormente descritos.

Quando se obtém um composto desta invenção na forma de uma solução num solvente orgânico, por exemplo depois de purifi-• cação por cromatografia, o solvente pode ser removido por proce- 10 =

dimentos convencionais, por exemplo, por evaporação, para produzir o composto numa forma sólida ou cristalina. Se desejado, os compostos desta invenção podem ser purificados adicionalmente pelas técnicas cromatográficas anteriormente referidas e/ou recristalização.

Por uma combinação adequada dos procedimentos antecedentes os compostos desta invenção foram isolados como sólidos. ]£ de notar que a ordem pela qual se realizam as fases de purificação anteriores e a escolha das fases a utilizar pode ser largamente variada.

Esta invenção é ilustrada pelos Exemplos seguintes*

Exemplo 1

Inocularam-se esporos de actinomicete NCIMB 40131 ©m superfícies de agar feitas com os ingredientes seguintes. g/l Extracto de Levedura (Oxoid L2l) 0,5 Extracto de Malte (Oxoid L39) 30,0 Peptona micologica (Oxoid L4o) 5,0 Agar No 3 (Oxoid L13) água destilada até 1 litro pH aproximadamente 5»4 e incubaram-se a 28° C durante 10 dias. 15,0

Cobriu-se depois a superfície madura com 6 ml de uma solução de glicerol a 10$ e raspou-se com uma ferramenta estéril para perder os esporos e micélio. Transferiram-se aliquotas de 0,4 ml da suspensão de esporos resultantes para canudos de polipropileno esterilizados que foram depois vedados a quente e armazenados em vapor de azoto líquido até serem necessários.

Utilizaram-se os conteúdos de um único canudo para inocular duas aliquotas de 50 ml de um meio semeado (a) como * se segue: 11 = 1 1

l\ dl D-Glicose 15,0 Glicerol 15,0 Peptona de soja 15,0 NaCl 3,0 CaCO^ 1,0 Água destilada até 1 litro O pH não ajustado do meio era 6,7 o qual foi ajustado para pH 7»0 com hidróxido de sódio aquoso antes de se fazer a autoclavagem. 0 pH do meio depois de se fazer a autoclavagem foi de 7»3.

Incubaram—se os dois volumes de 50 ml do meio semeado inoculado em frascos Erlenmeyer de 250 ml a 28° C durante 3 dias sobre um agitador rotativo a 250 rpm com um diâmetro do mo vimento orbital de 50 mm.

Recolheu-se o meio incubado e utilizou-se para inocular, a um nível de 320 frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml do meio (b) da composição seguinte: g/l 2.5 25,0 12,5 1.5 0,125 1,25 D-Glucose

Maltodextrina MD30E (Roquette (UK) Ltd)

Arkasoy 50 (British Arkady Co Ltd)

Melaço de Beterraba KH2P04

Carbonato de cálcio

MOPS (ácido 3“(N-morfolino)propano sulfónico) 21,0

Água destilada até 1 litro pH ajustado a 6,5 com NaOH 5N

0 conteúdo dos frascos cresceu, com agitação, a 28° C 12

durante 5 dias

Separaram-se as células e o fluído de cultura por cen trifugação.

Exemplo 2

Colocaram-se 50 ml do meio semeado (a) era cada um dos oito frascos Erlenmeyer de 250 ml e ajustou-se o pH de um valor inicial de 6,7 para 7»0 com hidróxido de sódio aquoso. Depois de se fazer a autoclavagem o pH era de 7»3· Inoculou-se cada um dos frascos com 0,2 ml da suspensão de esporos retirados dos ca nudos e preparados de acordo com o método descrito no Exemplo 1 anterior.

Incubaram-se os frascos a 28° C durante 3 dias sobre um agitador rotativo a 250 rpm com um diâmetro de movimento orbital de 50 mm.

Recolheram-se os conteúdos dos oito frascos e utilizaram-se para inocular um vaso de fermentação de 20 litros contendo 12 litros do meio (B), sendo o pH ajustado a 6,5 com NaOH 5^ antes de se fazer a autoclavagem.

Agitou-se o meio inoculado com um impulsor convencional rodando a 80 rpm. Conseguiu-se o arejamento da cultura por dispersão de ar esterilizado através do meio a uma velocidade de 0,5 volume de ar por volume do meio de cultura por minuto.

Controlou-se a temperatura a 28° C e evitou-se a formação de espuma excessiva por adição de silicone anti-espumante. Colheu-se a cultura depois de 5 dias de crescimento e processou--se como descrito no Exemplo 1.

Adicionaram-se 100 g de resina Amberlite XAD-2 (Rohm and Haas Limited) a 2 litros do sobrenadante aquoso da fermentação anterior e agitou-se a mistura durante 20 horas à temperatura ambiente. Filtrou-se a resina e depois lavou-se com porções de 250 ml de metanol aquoso a 10$, sendo recolhidas fracções de aproximadamente 250 ml. Aplicaram-se alxquotas de 5 ul cie cada fracção às extremidades de crescimento de um número de plantas Polygonum lapathif0lium. as quais cresceram depois num ambiente = 13 = J *

controlado durante 7 dias, e depois desse tempo avaliaram-se as plantas ao efeito herbicida. Combinaram-se e carregaram-se as fracções que apresentavem actividade herbicida numa coluna de sílica ligada a C^g (5 cm x 2 cm) embalada em água. Lavou-se então a coluna com 98:2 água:metanol, sendo recolhidas fracções de aproximadamente 250 ml. Combinaram-se as fracções que apresentavam actividade herbicida numa repetição do ensaio anterior, evaporaram-se e submeteram-se a hplc preparativa sobre Dynamax ^18 (^50 mm x 21 mm, Rainin Instruments) utilizando um sistema gradiente de água e metanol. Controlou-se o material eluente da coluna por espectroscopia UV a 280 nra. Analisaram-se as fracções biologicamente activas por hplc sobre Dynamax Clg (250 mmx x 4,6 mm, Rainin Instruments) utilizando água como fase eluente para uma velocidade de fluxo de 1 ml/min, combinaram-se aquelas fracções contendo componentes semelhantes (tempos de retenção dos compostos Bl, A3, AI e A2 são de aproximadamente 10 minutos 17 minutos, 21 minutos e 23 minutos respectivamente), evaporaram-se e submeteram-se a hplc preparativa adicional sobre uma coluna Zorbax TMS (250 mm x 10 mm), controlando o eluente de coluna a 280 nm. A evaporação das fracções biologicamente activas produziu os compostos A e B e os conjugados glicose de cada (onde a porção glicose substitui o átomo hidrogénio do grupo -OH no grupo -CH^OH) como sólidos.

Confirmaram-se as suas estruturas por UV, RMN e espeç. troscopia de massa, sendo as características máximas dos composi tos principais as que se seguem:

Composto Bl (tempo de retenção aproximadamente 10 minutos) UV (metanol): 279 nm

Espectro de Massa (Thermospray): 281 (M+H*) RMN (300MHz, D20)í Ó7.25 (1H, s), 7,05 (1H, s), 5,80 (lH,d), 5,22 (lH,d), 5,05 (1H, d), 4,55 (1H, d), 4.20 (2H, s), 4,10 (lH,m), 3,35 (1H, d), 3.20 (1H, d). S 14 s :\ r *

Composto AI (tempo de retenção aproximadamente 21 minutos) UV (metanol): 282 nm

Espectro de Massa (Thermospray)s 283 (M+H+) RMN (300 MHz, D20)í <$7,50 (lH, s), 7,05 (lH, s), 5,02 (lH, d), 4,50 (lH, m), 4,20 (lH, dd), 3,90 (lH, dd), 3,55 (2H, d), 3,40 (1H, dd), 3,30 (lH, d), 2,30 (lH, m), 2,10 (lH, m), 1,48 (lH, m)

Composto A2 (tempo de retenção aproximadamente 23 minutos) UV (metanol): 281 nm

Espectro de Massa (Bombardeamento rápido de átomo, tioglicerol) 467 (M+Na+) 445 (M+H+) RMN (300MHz, D20): 67,40 (lH, s), 7,05 (lH, s), 5,05 (lH, d), 4,55 (lH,m), 4,4l (lH, d), 4,20 (lH, dd), 4,05 (lH, m), 3,75 (1H, d), 3,60 (lH, dd), 3,50 (2H, m), 3,2-3,4 (6H, m), 2,30 (2H, m), 1,45 (lH, m).

Composto A3 (tempo de retenção aproximadamente 17 minutos) UV (metanol)$ 280 nm

Espectro de Massa (Thermospray): 283 (M*H+) RMN (300MHz, D20)ϊ Í7,50 (lH, s), 7,oo (1H, s), 5,00 (1H, d), 4,6l (lH, m), 4,25 (lH, dd), 4,10 (1H, dd), 3,50 (2H, m), 3,3í 1 (lH, dd), 3,25 (lH, dd), 2,45 (1H, m), 2,00 (1H, m), 1,75 (1H, m)

Exemplos 3-4

Repetiram-se os procedimentos dos Exemplos 1 e 2 mas substituindo o meio (B) com o meio seguintes * 15 *

Glicerol 23,0 L-prolina MOPS 11,5 (ácido 3“(N-morfolino)propano sulfónico) 21,0 EDTA 0,25 NaCl 0,5 MgS04.7H20 o,49 CaCl2,2H20 0,029 k2hpo^ 0,52 Sais traço 0,5 ml pH Os sais traço contendo: 6,5 h2so4 (im) 10 ml ZnS0^.te20 8,6 g MnS0^.4H20 2,23g h3bo3 0,62g CuS04#5H20 l,25g Na2Mo0^.2H20 0,48g CoC12.6h2o 0,48g FeS04.7H20 18,0 g Kl água destilada até 1 litro 0,83g B±ssolveram-se os ingredientes em água destilada pela ordem apresentada. Exemplo 5

As culturas e ervas daninhas listadas na Tabela a se- \ guir cresceram em marga esterilizada em ambiente controlado a 25o C (espécies não delicadas) ou 21° C (espécies delicadas). Aspergiram-se as plantas numa fase inicial do crescimento. Os compostos produzidos como no Exemplo 2 e como listados a seguir formularam-se cada um em metanol a 25$ em água destilada, com 0,5$ de Tween 20 e 0,05$ de Pluronic Lól como agentes de humede cimento* 0 volume da aspersão aplicada foi de 2000 litros por hectare, proporcionando uma razão de aplicação do ingrediente activo compreendida entre 0,2 e 0,5 kg/ha. As plantas tratadas regressaram ao ambiente controlado ou colocaram-se em estufas e avaliaram-se 2 semanas depois, numa escala onde o O indica sem efeito, 1 indica prejuízo ligeiro, 2 indica prejuízo moderado, 3 indica bom controlo, e b indica morte total. Na tabela a seguir os compostos Al, A2, A3 e BI são como aqui anteriormente identificado s. Os resultados obtidos foram os seguintes? BI Composto Al A2 èã Razão (kg/ha) 0,2 0,5 0,2 0Λ Arroz (Oryzae sativa) 2 - - - Cevada (Hordeum vulgare) 1 3 2 1 Algodão (Gossypium hirsutum) 2 mm - - Pessicaria (Polygonum lapathifolium) 2 b b 2 Estrela de ouro (Chrysanthemum segetum) 3 3 1 0 Ipomeia (Pharbitis purpurea) 1 2 2 2 Aveia selvagem (Avena fatua) 0 2 1 2 Trigo selvagem (Agropyron repens) 0 2 0 1 Gramíneas miosuroides (Alopecurus myosoroides) 1 2 2 2 = 17 =

Exemplo 6

Características de NCIMB 40131

Cor da massa de esporos (iSP meio 4) branco Cor do substrato (iSP meio 4) laranja pálido Forma da cadeia de esporos (iSP médium 4) Produção de pigmentos dispersáveis (XSP meio 5) Produção de melanina (iSP meio 6) Produção da melanina (iSP meio 7) Degradação da xantina curta, flexível Degradação da elastina Degradação do hipurato Degradação da pectina + (máximo) Degradação da caseína Degradação da tirosina Crescimento sobre + mm L-Ramno se + Me so-Ino sitol + D-Melibiose + Glicose Sacarose + Manitol Rafinose + Adonitol Dextrano

Xilitol h

Utilização de:-ácido DL-QÍ-Aminobutxrico = 18 = ' · -........ .. L-Cisteína - L-Yalina •h L-Fenilalanina L-Histidina + L-Hidroxiprolina - Lipolises - Actividade da lecitinase - Crescimento a:- 28° C + VjO o o fraco 45° C - Crescimento comi- NaCl (756, p/v) - M3 (0,01$, p/v) - Fenol (0,1$, p/v) - Telurite de potássio (0,001$, p/v) jt- Acetato taloso (0,001$, p/v) Os organismos cresceram bem sobre agar de levedura de malte, agar de farinha de aveia e agar de Bennett ,a25° C duran- te + - 14 dias. A célula parede continha ácido meso-di- amino -p imé li c o. Produção do ácido a partir des Adonitol - Arabinose Celobiose + Galactose Hr Inositol + Lactose = 19 =

Claims (1)

1. Maltose + Manitol - Melibiose 4* Rafinose - Ramnose 4* Salicina - Sorbitol - Sacarose b Trealose 4r Xilose 4* Fructose 4- Glicerol 4* Manose 4r REIVINDICAÇÕES - lã - Processo para a preparação de derivados 3»6,7>8-te-tra-hidro-imidazo^/ l».2Zdiazepin-8-ol da fórmula geral (I)

   20 I ** $ em que a linha tracejada indica que a ligação entre os dois áto mos de carbono pode ser ou uma ligação simples ou uma ligação dupla, ou o seu conjugado de açúcar, caracterizado por se cultivar um microrganismo susceptxvel de produzir o composto, e se desejado se isolar o referido composto. - 25 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por o microrganismo utilizado ser do géneo actinomycete. - 3* - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por o microrganismo utilizado ser da espécie Amycolatopsis. - Íj.5 — Processo de acordo oom a reivindicação 3» caracteriza do por o microrganismo utilizado ser NCIMB U0131 ou um seu mu-tante. A requerente reivindica a prioridade do pedido britânico apresentado em 13 de Maio de 1989» sob ο N8 8911029.0. Lisboa, 11 de Maio de 1990

   S 21 S