DD296109A5 - Diazepinherbizide - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft herbizide Zusammensetzungen auf Basis von * der Formel (I) sowie Zuckerkonjugaten davon. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zu deren Herstellung ueber mikrobiologische Fermentierung von Amycolatopsis-Spezies. Formel (I){Herbizide; Imidazodiazepinol-Derivate; Zuckerkonjugate; Totalherbizid; Selektivherbizid; Mikroorganismuskultivierung; Amycolaptosis spp; Fermentierung}

Description

HOCH, OH y

wobei die punktierte Linie angibt, daß die Bindung zwischen den zwei Kohlenstoffatomen entweder eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung sein kann, oder Zuckerkonjugate davon in Verbindung mit einem geeigneten Träger und/oder oberflächenaktivem Stoff enthält.

2. Anwendung von einer oder mehreren Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 oder von Zuckerkonjugaten davon, dadurch gekennzeichnet, daß diese als ein Herbizid eingesetzt werden.

3. S-ta^-Dihydroxy-^ihydroxymethyDcyclopentyn-S^^e-tetrahydroimidazoK.S-dlU.Sldiazepin-S-ol.

4. 8R-3-l(1R,2S,3R,4R)-2,3-Dihydroxy-4-(hydroxymethyl)-cyclopentyl]-3,6,7,8-tetrahydroimidazo(4,5-d][1,3]-diazepin-8-ol.

5. Zuckerkonjugat einer Verbindung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4.

6. Zuckerkonjugat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Glucosekonjugat ist.

7. Zuckerkonjugat nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die OH-Gruppe der CH₂OH-Gruppe in der Verbindung der Formel I durch eine OR-Gruppe ersetzt wird, wo R die Zuckerkomponente ist.

8. SR-S-UiR^S^R^R^S-Dihydroxy^ß-D-glucosyloxymethyO-cyclopentyll-S.ej.etetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]-diazepin-8-ol.

9. Im wesentlichen reine Kultur eines Mikroorganismusstammes der Gattung Actinomyzet, dadurch gekennzeichnet, daß sie Verbindungen der Formel I oder Zuckerkonjugate davon gemäß der Definition in Anspruch 1 erzeugen kann.

10. Kultur nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Mikroorganismus der Gattung Amycolatopsis ist.

11. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus NCIMB 40131 oder einer Mutanten davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie Verbindungen der Formel I oder Zuckerkonjugate davon gemäß der Definition in Anspruch 1 erzeugen kann.

12. Kulturnach Anspruch 9 oder Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie NCIMB 40131 darstellt.

13. Genetisches Material einer Kultur gemäß der Definition in einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es an der Synthese von Verbindungen der Formel I oder Zuckerkonjugaten davon gemäß der Definition in Anspruch 1 beteiligt ist.

Diese Erfindung betrifft herbizide Verbindungen, von denen einige neu sind, ein Verfahren zu deren Herstellung und sie

enthaltende Zusammensetzungen.

Wir haben gefunden, daß die3,6,7,8-Tetrahydroimidazo[4,5-d]-l1,3|diazepin-8-olderivate der Formel

OH

•Ν 11

HN

XJ

IT N

JL OH »Ι

HOCH₂ ^0Η

und Zuckerkonjugate davon herbizid wirksam sind.

Die punktierte Linie in der Formel zeigt auf herkömmliche Weise an, daß die Bindung zwischen den zwei Kohlenstoffatomen entweder eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung sein kann. Oie Verbindungen, wo zwischen den relevanten Kohlenstoffatomen eine Einfachbindung besteht, sind neu; sie werden nach einem Aspekt der Erfindung per se zur Verfugung gestellt.

Die Zuckerkonjugate der Verbindungen von Formel I sind nach der hier angewendeten Bedeutung des Begriffes jene, wo eine oder mehrere der ÖH-Gruppen oder der NH-Gruppen in dem Molekül durch eine OR-Gruppe bzw. NR-Gruppe ersetzt sind, wo R eine Zuckerkomponente, speziell eine Hexosekomponente und insbesondere eine Glucosekomponente ist. Es wird bevorzugt, daß lediglich eine einzelne Zuckergruppe in den Zuckerkonjugaten vorhanden ist. Es wird auch bevorzugt, daß dies dort der Fall ist, wo die OR-Gruppe die OH-Gruppe in der Gruppe-CH₂OH in Formel I ersetzt.

Der Begriff „Verbindungen der Formel Γ schließt in der hierangewendeten Bedeutung Zuckerkonjugate mit ein.

Die Verbindungen der Formel I sind gegenüber einer Reihe von breitblättrigen und grasigen Unkräutern herbizid wirksam. Sie können somit als Herbizide von Nutzen sein, entweder als Ganzherbizide oder möglicherweise auch als selektive Herbizide, insbesondere bei der Bekämpfung einer ganzen Palette von Unkräutern in Getreide oder anderen Feldfrüchten, z. B. Weizen, Reis,

Gerste, Mais, Sojabohnen, Ölsamenraps, Baumwolle oder Zuckerrübe.

Nach einem anderen Aspekt sieht die Erfindung die Anwendung von einer oder mehreren Verbindungen der Formel I als ein Herbizid sowie einer herbiziden Zusammensetzung vor, die eine oder mehr Verbindungen der Formel I in Verbindung mit einer geeigneten Trägersubstanz und/oder oberflächenaktiven Substanz enthält.

Die Verbindungen der Formel I haben jeweils eine Reihe von optischen Zentren und somit eine Reihe von optischen Isomeren.

Die Erfindung ist in keiner Weise auf spezifische optische Isomere begrenzt, sondern, wie bei solchen Verbindungen üblich, können durchaus einige optische Isomere in gewisser Hinsicht eine größere Wirksamkeit aufweisen als andere.

Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindunngen sind 3-I2,3-Dihydroxy-4-(hydroxymethyl)cyclopentyl]-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol (nachfolgend als .Verbindung A" bezeichnet), 3-[2,3-Dihydroxy-4-(ß-D-glucosyloxymethyl)cyclopentyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d]|1,3]diazepin-8-ol (d.h. ein Glucosekonjugat von Verbindung

(nachfolgend als „Verbindung B" bezeichnet). Die bevorzugten optischen Isomere dieser Verbindungen dürften 8R-3-1(1 R,2S,3R,4R)-2,3-Dihydroxy-4-(hydroxymethyl)cyclopentyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-dl[1,3]diazepin-8-ol (nachfolgend als „Verbindung A1" bezeichnet), die entsprechenden4-(ß-D-Glucosyloxymethyl)derivate davon (nachfolgend als „Verbindung A2" bezeichnet), 8R.3-[(1R,2S,3R,4S)-2,3-Dihydroxy-4-(hydroxymethyl)cyclopentyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3)-diazepin-8-ol (nachfolgend als „Verbindung A3" bezeichnet) und eR-S-UiR^R^SM.S-Dihydroxy-S-thydroxymethyOcyclopent-2-en-1-yl]-3,6,7,8-tetrahydroimidazo(4,5-d][1,3]-diazepin-8-ol (nachfolgend als „Verbindung B1" bezeichnet) sein.

Die Zusammensetzungen enthalten gewöhnlich 0,01 bis 99Ma.-% an diesen Verbindungen und werden normalerweise anfangs als Konzentrate hergestellt, die 0,5 bis 99Ma.-%, vorzugsweise 0,5 bis 85Ma.-% und insbesondere 10 bis 50Ma.-% davon enthalten. Diese Konzentrate werden vor dem Aufbringen auf die zu behandelnde Fläche erforderlichenfalls so verdünnt, daß die Wirkstoffe 0,01 bis 5 Ma.-% der angewendeten Rezeptur ausmachen.

Der Trägerstoff kann Wasser sein; in diesem Fall kann auch ein organiscches Lösungsmittel vorhanden sein, obwohl dieses gewöhnlich nicht angewendet wird.

Der Trägerstoff kann aber auch ein in Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel sein, in dem die Verbindungen aufgelöst oder aufgeschwemmt werden. Ein emulgierbares Konzentrat, das ein in Wasser nicht mischbares Lösungsmittel

enthält, kann mit einem oberflächenaktiven Stoff gebildet werden, so daß das Konzentrat als ein selbstemulgierbares Öl beim Mischen mit Wasser wirkt.

Der Trägerstoff kann aber auch ein wassermischbares organisches Lösungsmittel sein, z.B. 2-Methoxyethanol, Methanol, Propylenglycol, Diethylenglycol, Diethylenglycolmonoethylether, Methylformamid oder Dimethylformamid.

Der Trägerstoff kann auch ein Feststoff sein, der feinzerteilt oder granular sein kann. Beispiele für geeignete Feststoffe sind Kalkstein, Tonarten, Sand, Glimmer, Kreide, Attapulgit, Diatomit, Perlit, Sepiolit, Silika, Silikate, Lignosulfonate und feste Düngemittel. Der Trägerstoff kann natürlicher oder synthetischer Herkunft sein, er kann auch modifiziertes natürliches Material sein.

In Wasser lösliche oder dispergierbare oberflächenaktive Pulver können gebildet werden, indem die Verbindung in Partikulatform mit einem partikulierten Träger gemischt wird oder geschmolzene Verbindung auf den partikulierten Träger aufgesprüht wird, ein Benetzungsmittel und ein Dispergiermittel zugemischt werden und das ganze Pulvergemisch fein 9emahlenwird.

Eine Aerosolzusammensetzung kann dadurch gebildet werden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem Treibgas,

z. B. einem polyhalogenierten Alkan wie Dichlorfluormethan, und zweckmäßigerweise auch mit einem Lösungsmittel gemischtwerden.

Der Begriff „oberflächenaktiver Stoff" beinhaltet im weiten Sinne Stoffe, die verschiedentlich als Emulgatoren, Dispersionsmittel

und Benetzungsmittel bezeichnet werden. Solche Stoffe sind in der Branche gut bekannt.

Die verwendeten oberflächenaktiven Stoffe können anionische oberflächenaktive Stoffe, z. B. Mono· oder Diester von .« Phosphorsäure mit einem Fettalkoholethoxylat oder Salze von solchen Estern, Fettalkoholsulfate wie Natriumdodecylsulfat, j I

ethoxylierte Fettalkoholsulfate, ethoxylierte Alkylphenolsulfate, Ligninsulfate, Petroleumsulfonate, Alkylarylsulfonate wie -I

Alkylbenzensulfonate oder niedere Alkylnaphthalensulfonate, Salze von sulfonierten Naphthalenformaldehydkondensaten, Salze von sulfonierten Phenolformaldehydkonsensaten oder komplexere Sulfonate wie die Amidsulfonate, z. B. das sulfonierte Kondensationsprodukt von Oleinsäure und N-Methyltaurin oder die Dialkylsulfosuccinate, z. B. das Natriumsulfonat von Dioctylsuccinat, einschließen. Die oberflächenaktiven Stoffe können keinesfalls nichtionische Stoffe, z. B. Kondensationsprodukte oder Fettsäureester, Fettalkohole, Fettsäureamide oder alkylsubstituierte Phenole mit Ethylenoxid, Fettsäureester von Polyolethern, z. B. Sorbitanfettsäureester, Kondensationsprodukte von solchen Estern mit Ethylenoxid, z. B. Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Blockkopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, Acetylenglycole wie 2,4,7,9-Tetramethyl-5-decyn-4,7-diol, oder

ethoxylierte Acetylenglycole umfassen.

Die oberflächenaktiven Stoffe können auch kationische Stoffe, z. B. alkyl· und/oder arylsubstituierte quatemäre Ammoniumverbindungen wie Cetyltrimethylammoniumbromid oder ethoxylierte tertiäre Fettsäureamine einschließen. Bevorzugte oberflächenaktive Stoffe sind ethoxylierte Fettalkoholsulfate, Ligninsulfonate, Alkylarylsulfonate. Salze von

sulfonierten Naphthalenformaldehydkondensaten, Salze von sulfonierten Phenolformaldehydkondensaten, Natriumoleoyl-N*methyltaurid, Dialkylsulfosuccinate, Alkylphenolethoxylate und Fettalkylethoxylate.

Die erfindungsgemäßen aktiven Verbindungen können mit anorganischen Verbindungen, z. B. (NH^SO* einem Öl oder einem

anderen Pestizid, z. 6. einem Herbizid, Fungizid oder Insektizid oder einem Pflanzenwachstumsregulator, insbesondere miteinem anderen Herbizid vermischt werden. Geeignete andere Herbizide sind Trietazin, Linuron, MCPA, Dichlorprop, Isoxaben,

Diflufenican, Metolachlor, Fluometuron, Oxyfluorfen, Fomesafen, Bentazon, Prometryn, Norflurazon, Chlomazon, EPTC, Imazaquin und insbesondere Glyphosat, Metasulfuronmethyl, Sulfometuron, Isoproturon, Methabenthiazuron, Trifluralin,

loxynil, Bromoxynil, Benazolin, Mecoprop, Fluroxypyr, Alychlor, Acifluorfen, Lactofen, Metribuzin, Pendimethalin, Ethofumesat,

Benfuresat und Phenmedipham. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf Pflanzen, den Boden, Land- oder Wasserflächen und insbesondere auf einen Ort, an dem eine Feldfrucht wächst, aufgebracht werden. Die Verbindungen sind besonders nachlaufwirksam. Sie können in Mengen von 0,02 bis 2kg/h, insbesondere von 0,1 bis 1 kg/ha aufgebracht werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den nachfolgend erörterten Verfahren hergestellt werden. Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir ein Verfahren für die Herstellung einer Verbindung der Formel I zur Verfügung, welches die Stufe des Züchtens eines Mikroorganismus, der die Verbindung der Formel I erzeugen kann, und, falls

erwünscht, des Isolierens dieser Verbindung einschließt.

Mikroorganismen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen erzeugen können, können durch Anwendung eines Vorversuches

mit kleinen Substanzmengen und Analysieren einer aus der Fermentation des Mikroorganismus gewonnenen Versuchsprobemit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie leicht identifiziert werden.

Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Mikroorganismus ist speziell ein noch unbeschriebener Stamm von Mikroorganismus, der am 13. April 1989 in der ständigen Kultursammlung der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen, Schottland, unter der Aufnahmenummer NCIMB 40131 hinterlegt

worden ist NCIMB 40131 ist ein Aktinomyzet, der als Amycolatopsis spp (Lechevier et al., Int. J. Syst. Bacteriol 36,29-37 [1986])auf der Grundlage der folgenden taxonomischen Marker charakterisiert ist:

- Wandchemotyp IV, enthält Mesodiaminpimelinsäure, Arabinose und Galactose als diagnostische Zucker (Ganzzeilzuckermuster A);

- keine Mykolsäuren vorhanden;

- Phospholipidmuster II, enthält somit Phosopatidylethanolamin als diagnostisches Lipid.

Der artgemäße Status der Organismen wurde ebenfalls unter Anwendung von für Amycolatopsis spezifischem Aktinophage bestätigt (Prauser W2, W4, W7, W11).

Die Merkmale von NCIMB 40131 sind nachfolgend in Beispiel 6 angegeben.

Die Erfindung stellt nach einem weiteren Aspekt den Mikroorganismus NCIMB 40131 per se und Mutanten davon zur Verfugung. Mutanten des obigen Stamms können spontan entstehen oder durch eine Vielzahl von Methoden hergestellt werden, zu denen auch die gehören, die in Techniques for the Development of Microorganisms (Verfahren zur Entwicklung von Mikroorganismen) von H.I. Adler in „Radiation and Radioisotopes für Industrial Microorganisms" (Strahlung und Radioisotope für industrielle Mikroorganismen), Protokoll des Symposiums, Wien 1973, S.241, Internationale Atomenergiebehörde, umrissen sind. Zu solchen Methoden gehören ionisierende Strahlung, chemische Methoden, z. B. Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NGT), Hitze, genetische Verfahren wie Rekombination, Transduktion, Transformation, Lysogenisation und lysogene Umwandlung sowie selektive Verfahren für spontane Mutanten.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir genetisches Material von NCIMB 40131 und Mutanten davon, die an der Sythese der Verbindungen der Formel I beteiligt sind, zur Verfugung. Solches Material kann mit Hilfe von herkömmlichen gentechnischen Verfahren gewonnen werden, zu denen auch die gehören, die von D.A. Hopwood in „Cloning Genes for Antibiotic Biosynthesis in Streptomyces Spp: Production of a Hybrid Antibiotic" (Klonieren von Genen für die antibiotische Biosynthese in Streptomyces Spp: Herstellung eines Hybridantibiotikums), S.409-^113 in Microbiology 1985, Hg. L. Ueve, American Society of Microbiology, Washington DC 1985, beschrieben sind. Solche Verfahren können ähnlich wie das zuvor beschriebene für das Klonieren von antibiotischen biosynthetischen Genen, einschließlich der biosynthetischen Gene für Actinorhodin (Malpartida, F. und Hopwood, O.A., 1984, Nature 309, S.462-464), Erythromycin (Stanzak, R., et al., 1986, Biotechnology, 4, S. 229-232) und eines wichtigen Enzyms, das bei der Panicillin- und Cephalosporinherstellung in Acremonium chrysogenum eine Rolle spielt (Sansom, S. M., et al., 1985, Nature, 318, S. 191-194), angewendet werden. Das so gewonnene

genetische Material kann beispielsweise zur Stammverbesserung, zur Herstellung von biosynthetischen Enzymen für In-vitro-

Anwendungen oder zur Erzeugung von neuen Herbiziden durch Einführung dieses Materials in Organismen mit Ausnahme von NCIMB 40131 verwendet werden. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen durch Fermentation eines geeigneten Organismus kann durch

herkömmliche Mittel erfolgen, d. h. durch Züchten des Organismusd in Gegenwart von assimilierbaren Quellen von Kohlenstoff,

Stickstoff und Mineralsalzen. Assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen können durch einfache oder komplexe Nährstoffe zur Verfügung gestellt werden. Kohlenstoffquellen sind im allgemeinen Glucose, Maltose, Stärke, Glycerol, Melasse, Dextrin, Lactose, Saccharose, Fructose, Carbonsäuren, Aminosäuren, Glyceride, Alkohole, Alkane und Pflanzenöle. Kohlenstoffquellen

enthalten allgemein 0,5 bis 10Ma.-% Fermentationsmedium.

Stickstoffquellen sind im allgemeinen Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Brennereilösliches, Hefeextrakte, Baumwollsamenmehl, Peptone, Erdnußmehl, Malzextrakt, Melasse, Kasein, Aminosäuregemische, Ammoniak (Gas oder Lösung), Ammoniumsalze oder Nitrate. Harnstoff und andere Amide können ebenfalls verwendet werden. Stickstoffquellen

enthalten im allgemeinen 0,1 bis 10 Ma.-% Fermentationsmedium.

Nährmineralsalze, die in das Kulturmedium eingebaut werden können, schließen die allgemein verwendeten Salze ein, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Eisen-, Magnesium-, Zink-, Nickel-, Cobalt-, Mangan-, Vanadium-, Chrom-, Calcium-, Kupfer-, Molybdän-, Borat-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen liefern können. Die Züchtung des Organismus erfolgt im allgemeinen bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise von 25 bis 35*C,

speziell um 28°C herum, und findet am besten unter Lüften und Rühren, z, 8. durch Schütteln oder Umrühren, statt. Das Mediumkann anfangs mit einer kleinen Menge einer Suspension des sporulierten Mikroorganismus geimpft werden; doch zur

Vermeidung einer Wachstumsverzögerung kann ein vegetatives Inokulum des Organismus hergestellt werden, indem eine

keine Menge des Kulturmediums mit der Sporenform des Organismus geimpft wird, und das so gewonnene vegetative Inokulumkann auf das Fermentationsmedium, oder besser noch auf ein oder mehrere Impfstadien übertragen werden, wo ein weiteres

Wachstum stattfindet, bevor eine Übertragung auf das Hauptfermentationsmedium erfolgt. Die Fermentation wird im

allgemeinen im pH-Bereich von 5,5 bis 8,5, vorzugsweise von 5,5 bis 7,5, durchgeführt. Es kann erforderlich sein, das

Fermentationsmedium mit einer Base oder einer Säure zu versetzen, um den pH-Wert in dem gewünschten Bereich zu halten. Geeignete Basen, die hinzugegeben werden können, sind Alkalimetallhydroxide wie wäßriges Natriumhydroxid. Geeignete Säuren sind Mineralsäuren wie Salzsäure oder Schwefelsäure. Die Fermentation kann über einen Zeitraum von 2-10 Tagen, z.B. ca. 5 Tage, durchgeführt werden. Es kann ein Antischaummittel

zur Bekämpfung von übermäßigen Schäumen vorhanden sein, das in Abständen je nach Bedarf hinzugegeben wird.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind überwiegend in der Fermentationsflüssigkeit enthalten. Die Myzelien lassen sich

am besten durch Filtration oder Zentrifugieren aus der Flüssigkeit entfernen.

Bei der Verwendung als landwirtschaftliche Herbizide ist es möglich, daß die Verbindungen aus dem Fermentationsmedium, in

dem sie hergestellt worden sind, nicht entfernt werden müssen.

Wo eine Abtrennung der erfindungsgei oäßen Verbindungen aus der gesamten Fermentation wünschenswert ist, kann dies

durch herkömmliche Isolations- und Trennverfahren durchgeführt werden. Die Isolationsverfahren können auch vor oder nach

Klärung auf die Fermentationsflüssigkeit angewendet werden. Man wird erkennen, daß die Wahl der Isolationsverfahren stark

variiert werden kann.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch eine Vielzahl von Fraktionierungsverfahren isoliert und abgetrennt

werden, beispielsweise durch Adsorptions-Elution, Ausfällen, fraktionierte Kristallisierung, Lösungsmittelextraktion und

Flüssig-Flüssig-Trennen, die auf verschiedene Weise miteinander kombiniert werden können. Die Chromatographie auf einem geeigneten Träger in Form eines Bettes oder besser noch in eine Kolonne gefüllt, hat sich als

besonders geeignet zum Isolieren und Abtrennen der erfindungsgemäßen Verbindungen gezeigt.

Die Reinigung und/oder Abtrennung der erfindungsgemäßen Verbindungen aus der Fermentationsflüssigkeit erfolgt

zweckmäßigerweise durch Chromatographie (einschließlich Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatografie) auf einem geeigneten

Träger wie Kieselerde, einem nichtf unktionellen makrovernetzte Adsorptionsharz wie vernetzten Styrendivinylbenzenpolymerharzen, z.B. Amberlite XAD-2, XAD-4- XAD-16 oder XAD-1180 Harzen (Rohm & Haas Ltd.) oder Kastell S112 (Montedison), einem substituierten Styrendivinylbenzenpolymer, z. B. einem halogenierten (z.B. bromierten) Styrendivinylbenzenpolymer wie Diaion SP207 (Mitsubishi), einem mit organischem Lösungsmittel verträglichen, vernetzten Dextran wie Sephadex LH 20 (Pharmacia UK Ltd.) oder auf Trägern mit Phasenumkehr wie an Kohlenwasserstoffe gebundene Kieselerde, z.B. C,₈-gebundene Kieselerde. Geeignete Lösungsmittel/Eluenten für die chromatografische Reinigung/Abtrennung der erfindungsgemäßen Verbindungen

hängen natürlich von der Beschaffenheit des Säulenträgerstoffesab. Bei der Anwendung von Säulenträgerstorfen wie Amberlite

XAD-2 und eingebundener Kieselerde haben wir Alkohole wie Methanol als besonders geeignet ermitteln können,

insbesondere, wenn sie mit einem polaren Lösungsmittel wie Wasser kombiniert werden.

Das Vorhandensein der erfindungsgemäßen Verbindungen während der Extraktions-Zlsolationsverfahren kann durch

herkömmliche Verfahrensweisen wie Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatografie oder UV-Spektroskopie oder durch

Ausnutzung der Eigenschaften der nachfolgend beschriebenen Verbindungen überwacht werden. Wo eine erfindungsgemäße Verbindung in Form einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel, zum Beispiel nach Reinigung durch Chromatografie, gewonnen wird, kann das Lösungsmittel durch herkömmliche Verfahren wie Eindampfung

entfernt werden, um die Verbindung in einer festen oder kristallinen Form zu bekommen. Die erfindungsgemäßen Verbindungenkönnen durch die obengenannten chromatografischen Verfahren und/oder Rekristallisation weiter gereinigt werden, wenn diesgewünscht wird.

Durch eine geeignete Kombination der vorstehenden Verfahrensweisen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen als Feststoffe isoliert worden. Man wird erkennen, daß die Reihenfolge für die Durchführung der obigen Reinigungsstufen sowie die Wahl derselben in hohem Maß variiert werden kann. Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht.

"!! IMP I

Beispiel 1 Sporen von Actinomyzet NCIMB 40131 wurden auf Schrägagare geimpft, die aus den folgenden Bestandteilen zusammengesetzt

waren:

OH

Hefeextrakt (Oxoid 121) 0.5 Malzextrakt (OxoidL39) 30,0

mycologisches Pepton (Oxoid L 40) 5,0

Agar Nr. 3 (Oxoid L13) 15,0 destilliertes Wasser bis zu 11 pH-Wert ca. 5,4

Dies alles wurde bei 28°C 10 Tage lang inkubiert. Die reife Schrägkultur wurde dann mit 6ml einer 10%igen Glycerollösung bedeckt und mit einem sterilen Werkzeug gekratzt, um

die Sporen und Myzel zu lockern. Aliquote Mengen von 0,4ml der entstehenden Sporensuspension wurden in sterile

Polypropylenstrohhalme übertragen, die dann heißversiegelt und bis zur Verwendung in Flüssigstickstoffdampf gelagert

wurden.

Der Inhalt eines einzelnen Strohhalmes wurde zum Impfen von zwei aliquoten Mengen von 50 ml eines Saatmediums (A) wie

folgt verwendet:

g/l

D-Glucose 15,0

Glycerol 15,0

Sojapepton 15,0

NaCI 3,0

CaCO, 1,0 destilliertes Wasser bis auf 11

Der nichteingestellte pH-Wert des Mediums betrug 6,7, er wurde auf 7,0 mit wäßrigem Natriumhydroxid vorder Behandlung im Autoklaven eingestellt. Nach dem Autoklavieren lag der pH-Wert des Mediums bei 7,3.

Die zwei 50ml großen Mengen von beimpftem Saatmedium wurden bei 28°C 3 Tage lang in 250ml großen Erlenmeyer-Kolben auf einer Schüttelmaschine inkubiert, die sich mit 250U/min bei einem Durchmesser der Orbitalbewegung von 50mm drehte. Das inkubierte Medium wurde zusammengegeben undzum Beimpfen in einer Höhe von 3% von 20 χ 250ml Erlenmeyer-Kolben mit 50ml Medium '(B) der nachfolgenden Zusammensetzung verwendet:

1L

D-Glucose 2,5

Maltodextrin MD30E (Roquette |UK] Ltd.) 25,0 Arkasoy50 (British Arkady Co. Ltd.) 12,5 Rübenmelasse 1,5

KHjPO₄ 0,125

Calciumcarbonat 1,25

MOPS

(3-(N-Morpholin)propansulfonsäure) 21,0

destilliertes Wasser bis auf 11

pH-Wert mit 5NNaOH auf 6.5 eingestellt

Die Kolben wurden unter Schütteln bei 28⁰C 5 Tage lang gezüchtet. Die Zellen und Kulturflüssigkeit wurden durch Zentrifugieren getrennt.

Beispiel 2 SOmI Saatmedium (A) wurden jeweils in 8 Erlenmeyer-Kolben mit 250ml Fassungsvermögen gegeben, und der pH-Wert wurde

von einem Ausgangswert von 6,7 auf 7,0 mit wäßrigem Natriumhydroxid eingestellt. Nach Behandlung im Autoklaven lag derpH-Wert bei 7,3. Die Kolben wurden jeweils mit 0,2 ml der Sporensuspension aus den Strohhalmen geimpft, die nach der oben in

Beispiel 1 beschriebenen Methode hergestellt worden war. Die Kolben wurden bei 28°C 3 Tage lang auf einer Schüttelmaschine inkubiert, die sich mit 250 U/min bei einem Durchmesser der Orbitalbewegung von 50mm drehte. Der Inhalt der 8 Kolben wurde zusammengegossen und zum Beimpfen eines 20-l-Fermentorbehälters mit 121 von Medium (B)

verwendet, wobei der pH-Wert vor der Behandlung im Autoklav mit 5 N NaOH auf 6,5 eingestellt wurde.

Das beimpfte Medium wurde mit herkömmlichen Schnellrührern, die sich mit 800 U/min drehten, umgerührt. Eine Belüftung der Kultur wurde dadurch erreicht, daß sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Volumenteilen Luft pro Volumenteil Kulturmedium pro Minute durch das Medium verteilt wurde. Die Temperatur wurde bei 28°C gehalten und übermäßiges Schäumen durch den Zusatz von Silikonantischaummittel verhindert. Die Kultur wurde nach 5 Tagen Wachstum geerntet und nach der Beschreibung in Beispiel 1 verarbeitet.

100g Amberlite XAD-2 Harz (Rohm and Haas Limited) wurden zu 21 wäßriger überstehender Flüssigkeit aus der obigen

Fermentation hinzugegeben, und das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur umgerührt. Das Harz wurde

abgefiltert und danach mit 250ml Mengen von 10%igem wäßrigen Methanol gewaschen, wobei Fraktionen von 250mlaufgefangen wurden. Aliquote Mengen von 5μΙ einer jeden Fraktion wurden auf die wachsenden Spitzen einer Reihe von

Polygonum lapathifolium Pflanzen aufgetragen, die anschließend 7 Tage lang in einem Raum mit unkontrollierter Umgebung weiterwuchsen. Danach wurden die Pflanzen auf die herbizide Wirkung hin eingeschätzt. Fraktionen, die eine herbizide Wirksamkeit reigten, wurden kombiniert und in eine Säule mit C₁₈-gebundener Kieselerde (Scm x 2cm) in Wasserfüllung gegeben. Die Säule wurde dann mit 98:2 WasserMethanol gewaschen, wobei Fraktionen von ca. 250ml aufgefangen wurden. Fraktionen, die in Wiederholung des obigen Tests eine herbizide Wirksamkeit zeigten, wurden kombiniert, eingedampft und einer präparativen Hochleistungs-Flüssig-Chromatografie mit Dynamax C-18 (250mm x 21 mir». Rainin Instruments) unter Anwendung eines Gradientensystems von Wasser und Methanol unterzogen. Die aus der Säule etuierende Substanz wurde mittels UV-Spektroskopie bei 280nm überwacht. Die biologisch aktiven Fraktionen wurden durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatografie auf Dynamax C-18 (250mm χ 4,6mm, Rainin Instruments) unter Anwendung von Wasser als der eluierenden Phase bei einem Durchsatz von 1 ml/min analysiert, und all die Fraktionen, die ähnliche Bestandteile enthielten (Verweilzeiten der Verbindungen B1, A3, A1 und A2 bei ca. 10Minuten, 17 Minuten, 21 Minuten und 23Minuten), wurden kombiniert, eingedampft und einer weiteren präparativen Hochleistungs-Flüssig-Chromatografie mit einer Zorbax TMS Säule (250mm χ 10mm) unterzogen, wobei das Säuleneluationsmittel bei 280mm überwachtwurde. DieEindampfungderbiologisch wirksamen Fraktionen ergab die Verbindungen A und B und die Glucosekonjugate derselben als Feststoffe (bei letzteren ersetzt die Glucosekomponente das Wasserstoffatom der OH-Gruppe in der CH₂OH-G ruppe).

Ihre Strukturen wurden durch UV, NMR und Massenspektroskopie bestätigt, wobei die charakteristischen Spitzen der Hauptverbindungen wie folgt waren:

Verbindung BI (Verweilzeitca. 10min) UV(Methanol):279nm

Massenspektrum (Thermospray): 281 (M + H*)

NMR(300MHz,D₂O): δ 7,25(1 H,s),7,05(1 H,s),5,80(1 H,d),5,22(1 H,d),5,05(1 H,d),4,55(1 H,d),4,20(2H,s),4,10(1 H,m),3,35 (1H,d),3,20(1H,d).

Verbindung Al (Verweilzeit ca. 21 min) UV (Methanol): 282nm

Massenspektrum (Thermospray): 283 (M + H⁺)

NMR (300MHz, D₂O): δ 7,50 (1H, s), 7,05 (1 H, s), 5,02 (1 H, d),4,50 (1 H, m), 4,20 (1H, dd), 3,90 (1 H,dd),3,55 (2H, d), 3,40 (1H, dd), 3,30 (1H, d), 2,30 (1H, m), 2,10 (1H, m), 1,48 (1H, m)

Verbindung A2 (Verweilzeit ca. 23min) UV (Methanol): 281 nm

Massenspektrum (Schnellatombeschuß,Thioglycerol):

467 (M + Na⁺)

445(M+ Η*)

NMR(300MHz,D₂O) δ 7,40 (1H,s), 7,05 (1 H,s),5,05 (1H, d),4,55(1H, m),4,41 (1 H, d),4,20 (1H,dd),4,05 (1H, m), 3,75 (1 H, d), 3,60 (1H, dd), 3,50 (2H, m), 3,2-3,4 |6H, m), 2,30 (2H, m), 1,45 (1H, m).

Verbindung A3 (Verweilzeit ca. 17 min) UV (Methanol): 280nm

Massenspektrum (Thermospray): 283 (M + HT

NMR (300 MHz, D₂O) δ 7,50 (1H, s), 7,00 (1H, s), 5,00 (1H, d),4,61 (1 H, m), 4,25 (1H, dd), 4,10 (1H, dd), 3,50 (2H₁ m), 3,35 (1 H, dd), 3,25 (1 H, dd), 2,45 (1H, m), 2,00 (1H, m), 1,75 (1 H, m)

Beispiele 3-4

Die Verfahrensweisen der Beispiele 1 und Z wurden wiederholt, allerdings wurde Medium (B) durch das folgende Medium ersetzt:

Glycerol 23,0

L-Prolin 11,5 MOPS

(3-(N-Morpholin)propansulfonsäure) 21,0 EDTA 0,25

NaCI 0,5

MgSO₄ 7H₂O 0,49

CaCI₂ · 2 H₂O 0,029

K₂HPO₄ 0,52

Spurensalze 0,SmI

pH 6,5

Die Spurensalze enthielten:

	g/l
H2SO4(IM)	10ml
ZnSO4 -4H2O	8,5 g
MnSO4 4H2O	2,23 g
H3BO3	0.62 g
CuSO4 5H2O	1.25 g
Na2MoO4-2 H2O	0,48 g
CoCI2 - 6H2O	0,48 g
FeSO4 · 7H2O	18,0 g
Kl	0,83 g
destilliertes Wasser bis auf 11

Die Bestandteile wurden in der angegebenen Reihenfolge in dem destillierten Wasser aufgelöst. Beispiel5 Die in der nachfolgenden Tabelle angeführten Feldfrüchte und Unkräuter wurden in sterilisiertem Lehm in Räumen mit

kontrollierter Umgebung bei 25⁰C (nichttemperierte Arten) oder 21 "C (temperierte Arten) gezüchtet. Die Pflanzen wurden in einerfrühen Wachstumsphase besprüht. Die wie in Beispiel 2 und wie nachfolgend aufgeführt hergestellten Verbindungen wurdenjeweils in 25% Methanol in destilliertem Wasser, mit 0,5% Tween 20 unde 0,05% Pluronic L61 als Benetzungsmittel formuliert.

Die aufgebrachte Sprühmenge betrug 2000 l/ha, was eine Auftragmenge von Wirkstoff von 0,2 bis 0,5 kg/ha ergab. Behandelte Pflanzen wurden entweder in die Räume mit kontrollierter Umgebung zurückgebracht oder in Gewächshäuser gegeben und

nach 2 Wochen nach einer Skala beurteilt, auf der 0 für keine Wirkung, 1 für geringe Schädigung, 2 für mäßige Schädigung, 3 fürgute Bekämpfung und 4 für vollständige Abtötung stehen. In der nachfolgenden Tabelle entsprechen die Verbindungen A1, A 2,

A3 und B1 der obigen Beschreibung. Die gewonnenen Ergebnisse sind folgende: Verbindung

B1 A1 A2 A3

Menge (kg/ha)	Beispiel 6	0,2	0,5	0,2	weiß	0,4
Reis (Oryzae sativa)	Kennwerte von NCIMB 40131	2	-	-	zartkremorange	-
Gerste (Hordeum vulgäre)	Sporenmassefarbe (ISP Medium 4)	1	3	2	kurz, gebeugt	1
Baumwolle (Gossypium hirsutum)	Substratfarbe (ISP Medium 4)	2	-	-	-
Ampferknöterich (Polygonum	Sporenkettenform (ISP Medium 4)
lapathifolium)	2	4	4	2
Chrysantemum segetum (Wucherblume)	3	3	1	0
Winde (Pharbitis purpurea)	1	2	2	2
Windhafer (Avena fatua)	0	2	1	2
Quecke (Agropyron repens)	0	2	0	1
Fuchsschwanzgras
(Alopecurus myosuroides)	1	2	2	2

Erzeugung von diffusionsfähigem Pigment, (ISP Medium 5) - Erzeugung von Melanin (ISP Medium 6) -

Erzeugung von Melanin (ISP Medium 7) -Abbau von Xanthin

Abbau von Elastin + Abbau von Hippurat + Abbau von Pektin + (schwach) Abbau von Casein +

Abbau von Tyrosin -Wachstum auf:

L-Rhamnose +

Meso-Inositol + D-Melibiose +

Glucose +

Saccharose +

Mannitol +

Raffinose -

Adonitol +

Dextran -Xylitol

Nutzung von:	+
DL-a-Aminobuttersäure	_
L-Cystein	+
L-VaMn	+
L-Phenylalanin	+
L-Histidin	-
L-Hydroxypyrolin	—
Lipolyse	—
Lezithinasewirksamkeit
Wachstum bei:	+
28 "C	schlecht
37 °C	-
45 'C
Wachstum mit:	-
NaCI (7 %, Masse in Volumenkonzentration)	-
NaN3 (0,01 %, Masse in Volumenkonz.)	—
Phenol (0,1 %, Masse in Votumenkonz.)	+
Kaliumtellurit (0,001%, Masse in Volumenkon2.)	+
Thalliumacetat (0,001 %, Masse in Volumenkonz.)	Der Organismus wächst gut auf Malzhefeagar, Hafermehlagar und Bennetts Agar bei 28 0C über 7-14 Tage
	Die Zellwand enthält Mesodiaminpimelinsäure.
Herstellung der Säureform:
Adonitol —
Arabinose +
Cellobiose +
Galactose +
Inositol +
Lactose +
Maltose +
Mannitol -
Melibiose +
Raffinose -
Rhamnose ' +
Salicin —
Sorbitol -
Saccharose +
Threhalose +
Xylose +
Fructose +
Glycerol +
Mannose +

Claims (1)

1. Herbizide Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,01 bis 99 Ma.-% eines oder mehrerer 3,6,7,8-Tetrahydroirnidazo(4,5-dM1,3]diazepin-8-olderivate der Formel

OH

Il ^N

(I) OH ^: