HUT54025A

HUT54025A - Herbicide composition containing imidazo-diazepine derivative as active component and process for producing the active components

Info

Publication number: HUT54025A
Application number: HU903015A
Authority: HU
Inventors: Drian David Bush; Duncan Alistair Gates; David Langley
Original assignee: Schering Agrochemicals Ltd
Priority date: 1989-05-13
Filing date: 1990-05-11
Publication date: 1991-01-28
Also published as: EP0398514A1; ZA903609B; AU5486290A; IL94351A0; CN1047188A; HU903015D0; PT94010A; GB8911029D0; FI902357A0; BR9002236A; US5089045A; YU89890A; JPH0347184A; CA2016229A1; DD296109A5

Description

A találmány herbicid hatású vegyületekre vonatkozik, amelyek közül néhány vegyület uj; vonatkozik továb c

• · · · bá ezek előállítási eljárására, valamint az ezeket tartalmazó készítményekre.

Azt találtuk, hogy az (I) képletű 3,6,7,8-tetrahidro-imidazo [4,5-d](1,3)diazepin-8-ol-származékok és ezek cukrokkal képzett vegyületei herbicid hatásúak.

Mint általában) a képletben levő szaggatott vonal azt jelzi, hogy a két szénatom közötti kötés lehet egyszeres vagy kettős kötés. Azok a vegyületek újak, amelyekben a releváns szénatomok közötti kötés egyszeres, és egy szempontból a találmány ezekre az uj vegyületekre vonatkozik.

Az (I) képletű vegyületek cukrokkal képzett vegyületei azok, amelyeknél az (I) képletű vegyületben lévő

I egy vagy több -OH csoport vagy az -NH csoport helyettesitI ve van egy -0R vagy -NR csoporttal, ezekben R cukorrészt, különösen hexózrészt vagy glukózrészt jelent.

A cukorszármazékban előnyösen egyetlen cukorrész az -OR csoport az (I) képlet -CHgOH csoportjában lévő -OH csoportot helyettesíti.

Az „(I) képletű vegyületek kifejezés a továbbiakban magába foglalja a cukorszármazákokat is.

Az (I) képletű vegyületek hatékony herbicidek egy sor széleslevelü és füszerü gyom ellen. így herbicidként használhatók, mind totálherbicidként, mind szelektív herbicidként, különösen egy sor gyomnövény ellen gabonafélékben, pl. búzában, rizsben, árpában, kukoricában, szó• · « · • · · * • · · • · · · · · · jababban, repcében, gyapotban vagy cukorrépában.

Egy másik szempontból a találmány egy vagy több (I) képletű vegyület herbicidként való használatára, valamint olyan herbicid készítményekre is vonatkozik, amelyek egy vagy több (I) általános képletű vegyületeket tartalmaznak megfelelő hordozó- és/vagy felületaktív anyaggal együtt.

Az (I) képletű vegyületek mindegyikének sok optikai centruma van és igy számos optikai izomerjeik is vannak. A találmány nem korlátozódik egyetlen speciális optikai izomerre sem, de mint általában az ilyen vegyületek/ néhány optikai izomernek jóval nagyobb az aktivitása, mint a többinek.

A találmány szerinti előnyös vegyületek az alábbiak:

- 3- [2,3-dihidroxi-4-(hidroxi-metil)-ciklopentill-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo (4,5-dl(1,3)diazepin-8-ol (a továbbiakban „A vegyület)

- 3- l2,3-dihidroxi-4-(fi-D-glükozil-oxi-metil)-ciklopentil]-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo[4,5-dl (1,3)diazepin-8-ol (az „A vegyület” glükózszármazéka), és

- 5-l4,5-dihidroxi-3-(hidroxi-metil)-ciklopent-2-en-1-il]-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo[4,5-D](1,3)diazepin-8-ol (a továbbiakban „B vegyület).

A fenti vegyületek előnyös hatású optikai izomer jei :

- 8R-3- [1R,2S,3R,4R)-2,3-dihidroxi-4-(hidroxi-metil)-ciklopentil]-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo [4,5-d](1,3)diazepin-8-01 (a továbbiakban „A1 vegyület),

- az előző vegyület 4-(fi-D-glükozil-oxi-metil)-származéka (a továbbiakban „A2 vegyület),

- 8R-3 l(1R,2S,3R,4S)-2,3-dihidroxi-4-(hidroxi-metil)-ciklopentil]-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo Í4,5-d]( 1,3)diazepin-8-ol (a továbbiakban „A3 vegyület), és

- 8R-3- [(1R,4R,5S)-4,5-dihidroxi-3-(hidroxi-metil)-ciklopent-2-en-1-il]-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo[4,5-d](1,3)diazepin-8-ol (a továbbiakban „B1 vegyület).

A készítmények rendszerint 0,01-99 tömeg% találmány szerinti hatóanyagot tartalmaznak, és általában elsőként koncentrátumként állítjuk elő a készítményeket, a koncentrátumok 0,5-99, előnyösen 0,5-85, különösen előnyösen 10-50 tömeg% hatóanyagot tartalmaznak. Az ilyen koncén t rátumokat , ha szükséges, akkor a kezelés helyén, az alkalmazás előtt hígítjuk, ebben az esetben az alkalmazott készítmény hatóanyagtartalma 0,01-5 tömeg%.

A hordozó lehet viz, ebben az esetben a készítményben szerves oldószer is lehet, ez utóbbiakat azonban általában nem alkalmazzuk.

A hordozóanyag lehet vízzel nem elegyedő szerves oldószer, amelyben a vegyületek oldva vagy szuszpendálva

- 5 vannak. A vízzel nem elegyedő oldószert tartalmazó emulgeálható koncentrátumot felületaktív anyaggal készíthetünk, így a koncentrátum vízzel elegyítve önemulgeálódó olajként viselkedik.

A hordozóanyag lehet vízzel elegyedő szerves oldószer, például 2-metoxi-etanol, metanol, propilénglikol, dietilénglikol, dietilénglikol-monoetil-éter, metil-formamid vagy dimetil-formamid.

A hordozóanyag lehet szilárd anyag, amely lehet finomeloszlásu vagy granulált. Alkalmazható szilárd anyag a mészkő, agyagok, homok, csillám, kréta, attapulgit, diatomit, perlit, szepiolit, kovasavak, szilikátok, lignoszulfonátok és szilárd trágyák. A hordozóanyag lehet természetes vagy szintetikus eredetű vagy módosított természetes anyag.

A vízben oldódó vagy diszpergáljiató nedvesíthető porkészitmények úgy állíthatók elő, hogy a szemcsézett vegyületet szemcsés hordozóanyaggal keverjük össze vagy a megolvasztott vegyületet rászórjuk a szemcsés hordozóanyagra, majd összekeverjük nedvesítő és diszpergáló anyaggal és finoman megőröljük az egész porkeveréket.

Aeroszol készítményt állíthatunk elő a vegyületek hajtóanyaggal, például polihalogénezett alkánnal, így diklór-fluor-metánnal és megfelelő oldószerrel történő összekeverésével.

• c • · · · · · · * * ·· ···· «·· · ··

- 6 A felületaktív anyag kifejezést széles értelemben használjuk, beleértve a különféle emulgeáló szereknek, diszpergáló szereknek és nedvesítő szereknek nevezett anyagokat. Az ilyen anyagok jól ismertek a technika állásából.

A felületaktív anyagok lehetnek anionos felület— aktív anyagok, például foszforsav zsiralkohol-etoxiláttal képzett mono- vagy diészterei, vagy ilyen észterek sói, zsiralkohol-szulfátok, igy nátrium-dodecil-szulfát, etoxilezett zsiralkohol-szulfétok, etoxilezett alkil-fenil-szulfátok, ligninszulfátok, petróleumszulfonátok, alkil-aril-szulfonátok, igy alkil-benzolszulfonátok, vagy (rövidszénláncu alkil)-naftalinszulfonátok, (szulfonált naftalin) -formaldehid-kondenzátumok sói, (szulfonált fenol)-forma<ldehid-kondenzátumok sói, vagy komplex-szulfonátok, igy amid-szulfonátok, például oleinsav és N-metil-taurin szulfonált kondenzációs terméke vagy dialkil-szulfo-szukcinátok, például dioktil-szukcinát nátrium-szulfonátja,

A felületaktív anyagok lehetnek nemionos anyagok, például zsírsav-észterek, zsiralkoholok, zsirsavamidok vagy alkilszubsztituált fenolok etilénoxiddal képzett kondenzációs termékei, polialkohol-éterek zsírsav-észterei, pl. szorbitán-zsirsav-észterek, ilyen észterek etilén-oxiddal képzett kondenzációs termékei, pl. poli(,oxi-etilén)-szorbitán-zsirsav-észterek, etilén-oxid- és propilén-oxid blokk-kopolimerjei, acetilén-glikolok, igy 2,4,7,9-tetra metil-5-decin-4,7-diol vagy etoxilezett ácetilén-glikolok.

A felületaktív anyagok lehetnek kationos anyagok, pl. alkil- és/vagy aril-szubsztituált kvaterner ammóniumvegyületek, igy cetil-trimetil-ammónium-bromid vagy etoxilezett tercier zsiraminok.

Az előnyös felületaktív anyagok az etoxilezett zsiralkohol-szulfátok, ligninszulfonátok, alkil-aril-szulfonátok, szulfonált naftalin-formaldehid-kondenzátumok sói, szulfonált fenol-formaldehid-kondenzátumok sói, nátrium-oleoil-N-metil-taurid, dialkil-szulfo-szukcinátok, alkil-fenol-etoxilátok és zsiralkil-etoxilátok.

A hatóanyagok összekeverhetők szervetlen vegyületekkel, pl. ammónium-szulfáttal, olajjal, vagy más peszticiddel, pl. herbiciddel, fungiciddel, vagy növénynövekedést szabályozóval, előnyösen egy másik herbiciddel. További herbicidként megemlítjük a trietazint, linuront, MCPA-t, diklórpropot, izoxabent, diflufenikánt, metolaklórt, fluometuront, oxifluorfént, fomezafent, bentazont, prometrint, norflurazont, klomazont, EPTC-t, imazaquint, különösen előnyös a glifozát, metszulforon-metil, szulfometuron, izoproturon, metabenztiazuron, trifluralin, ioxinil, bromoxinil, benazolin, mekoprop, fluroxipir, alaklór, acifluorfen, laktofen, metribuzin, pendimetalin, etofumezát, benfurezát és fenmedifam.

A hatóanyagok alkalmazhatók a növényekre, a talajra, a szárazföldi és vizes területekre és elsősorban

- 8 arra a helyre, ahol a gabona fejlődik. A vegyületek elsősorban posztemergens módon hatékonyak. 0,02-2 kg/ha, előnyösen 0,1-1 kg/ha mennyiségben alkalmazhatók.

A találmány szerinti vegyületek az alábbi eljárásokkal állíthatók elő: így a találmány tárgya tox/ábbá eljárás (I) általános képletö vegyület előállítására; az eljárás (I) általános képletü vegyületet termelni képes mikroorganizmus tenyésztéséből és kívánt esetben az adott vegyület abból való izolálásából áll.

A találmány szerinti vegyületek termelésére képes mikroorganizmusok könnyen azonosíthatók egy kis mérési teszttel és a mikroorganizmus fermentációjából vett tesztminta HPLC-vel való analízisével.

A találmány szerinti eljárásban használt mikroorganizmus egy korábban nem leirt mikroorganizmus törzs, amelyet 1989. április 13.-án deponáltak a Torry Research Stabion, Ipari és Tengeri Baktériumok Nemzeti Gyűjteményének állandó tenyészet-gyűjteményében (135 Abbey Road, Aberdeen, Scotland), az NCIMB 40131 sz. megjelölés alatt.

Az NCIMB 40131 sz. mikroorganizmus Amycolatopsis spp. .sugárgomba (Lechevier és mts-a, Int. □. Syst. Bacteriol 36. 29-37 11986]), amely a következő rendszertani jegyekkel jellemezhető:

• · « · * ·

- IV-es fal-kemotipus, amely mezo~diamino-pímelinsavat, jellemző cukorként arabinózt és galaktózt tartalmaz (teljes sejtcukor minta A);

- nincs jelen mikolinsav,

- ΙΙ-es foszfolipid minta, amely jellemző lipidként fosz- fatidil-etanol-amint tartalmaz.

A mikroorganizmusok eredeti állapotát Amycolatopsis törzsekre (Prauser W2, V74, W7, W11 ) specifikus aktinofág alkalmazásával bizonyítottuk.

A NCIMB 4031 jellemzőit alább, a 6, példában adtuk meg.

A találmány tárgya továbbá az NCIMB 40131 mikroorganizmus önmagában, valamint annak mutánsai.

A fenti törzs mutánsai spontán keletkezhetnek, vagy különböző módszerekkel állíthatók elő, beleértve azokat is, amelyek H. □. Adler Radiation and Radioisotopes fór Industrial Microorganizmus és Szimpóziumi Közlemények, Bécs, 1973 241.o.. Nemzetközi Atomenergia Ügynökség, Mikroorganizmusok Fejlesztési Technikája című publikációjából ismertek.

Ezek a módszerek az ionizációs besugárzás, kémiai módszerek, például N-metil-N'-nitro-N-nitrozó-guanidinnel (NTG) történő kezelés, hevítés, géntechnikák, igy rekombináció, transzdukció, transzformáció, lizogenizáció, lizogén konverzió, spontán mutánsokhoz vezető szelektív módszerek.

• · • ·*· • « · · · · · ·· ·«&·*«· · ··

- 10 A találmány további tárgya az NCIMB 40131 és mutánsainak genetikai anyaga, amelyek az (I) általános képletű vegyületek szintézisében vesznek részt. Ilyen anyag nyerhető hagyományos géntechnikával, amely D. A. Hopwood alábbi közleményében: „Cloning Genes fór Antibiotics Synthesis in Streptomyces ‘Spp. : Production of a Hybrid Antibiotics, Mikrobiology, 1985, 409-413. old., szerk. L. Lieve, American Society of Mycrobiology, Washington D.C, 1985. Ilyen technológiák használhatók a korábban már az antibiotikus hatású bioszintetikus gének klónozására leírtakhoz hasonló módon, például bioszintetikus gének az aktinorhodinhoz (Malpartida, F. és Hopwood, 1984, Natúré 309, 462-464. old.), az érit romicinhez (Stanzák, R. és mtsa, 1986 Biotechnology, 4, 229-232. old.) és egy fontos enzimhez, amellyel Acremonium crisoaenum-ban penicillint és cephalosporint állíthatunk elő (Sansom, S. M. és mtsa, 1985, Natúré, 318, 191-194. old.), Az igy kapott genetikai anyagot például törzsfejlesztésre, in vitro alkalmazáshoz bioszintetikus enzimek termelésére, vagy uj herbicidek kifejlesztésére használhatjuk az anyagoknak NCIMB 40131-től eltérő mikroorganizmusokba történő bevezetésével.

A találmány_szerinti vegyületek alkalmas mikroorganizmus fermentációjával való előállítása hagyományos módszerrel történhet, a mikroorganizmus asszimilálható szén-, nitrogénforrás és ásványi sók jelenlétében lefolytatott tenyésztésével.

• 9 · · · • · ··· « • » · · » ·* «··· ··· · ··

- 11 Asszimilálható szén-, nitrogénforrásokat és ásványi anyagokat, vagy egyszerű vagy komplex tápanyagok biztosíthatnak. Szénforrások például glükóz, maltóz, keményítő, glicerin, melasz, dextrin, laktóz, szacharóz, fruktóz, karbonsavak, aminosavak, gliceridek, alkoholok, alkánok, növényolajok.

A szénforrások általában a fermentációs közeg 0,5-10 tömegszázalékai.

Nitrogénforrások pl. szójáliszt, gabonaáztató levek, lepárlási termékek, élesztő extraktumok, gyapotmagliszt, peptonok, földimogyoró liszt, maláta extraktum, melasz, kazein, aminosav elegyek, ammónia (gáz vagy oldat), ammóniumsók vagy nitrátok. Karbamid és más amidok is használhatók. A nitrogénforrások általában a fermentációs közeg 0,1-10 tömegszázalékai. Ásványi tápsók, amelyeket a fermentációs közegbe juttatunk, tartalmazzák az általában alkalmazott sókat, amelyek képesek kálium, nátrium, ammónium, vas, magnézium, cink, nikkel, kobalt, mangán, vanádium, króm, kálcium, réz, molibdén, borát, foszfát, szulfát, klorid és karbonát ionok képzésére.

A mikroorganizmusok tenyésztése általában 20-40°C, előnyösen 25-35°C, különösen 28°C hőmérsékleten hatásos, és kívánt esetben a tenyészetet levegőztetjük és például i

rázással vagy keveréssel kezeljük. A közeget kezdésként a mikroorganizmus spóraszuszpenziójának kis mennyiségével beolthatjuk, de azért, hogy a növekedési zavart elkerüljük, a mikroorganizmusok vegetatív oltóanyagát elkészíthetjük úgy, hogy a tenyészet egy kisebb mennyiségét a mikroorganizmus spóráival beoltjuk és az igy kapott vegetatív oltóanyagot a fermentációs közegbe visszük, vagy még mielőtt az oltóanyag a fő fermentációs közegbe kerülne előnyösebben egy vagy több kultúrába visszük, ahol további növekedés megy végbe.

A fermentáció általában 5,5 - 8,5, előnyösen

5,5 - 7,5 pH értékhatárok között megy végbe. A pH-érték kívánt határok között tartása érdekében időnként valamilyen bázist vagy savat adunk a fermentációs elegyhez.

Megfelelő bázisok, amelyeket alkalmazhatunk, az alkálifém-hidroxidok, igy például vizes nátrium-hidroxid. Megfelelő savak lehetnek az ásványi savak, például sósav, vagy kénsav.

A fermentáció 2-10 nap között, például körülbelül 5 nap alatt megy végbe. A fokozott habzás megakadályozására ha szükséges, időnként valamilyen habzásgátló anyagot adhatunk a fermentációs rendszerbe.

A találmány szerinti vegyületek túlsúlyban vannak a fermentációs lében. A micéliumokat szűréssel vagy centrifugálással, hagyományos módon távolíthatjuk el a fermentléből.

Mezőgazdasági herbicidként történő felhasználás esetén a vegyületeket nem szükséges elválasztani a fermentációs közegtől, amelyben keletkeztek.

- 13 Amennyiben szükséges, a találmány szerinti vegyületeket elválasztjuk a fermentációs közegtől, az elválasztás hagyományos izolálási és elválasztási módszerekkel történhet, Az izolálási módszerek vonatkozhatnak a fermentációs közegre tisztítás előtt és tisztítás után is. Az elválasztási technikák nagymértékben változtathatók.

A találmány szerinti vegyületek izolálhatók és elválaszthatók különböző frakcionálási eljárásokkal, például adszorpció-elucióval, kicsapással, frakcionált kristályosítással, oldószeres extrakcióval és folyadék-folyadék megosztással, ezek a módszerek egymással különféleképpen kombinálhatok is.

A találmány szerinti vegyületek izolálására és elválasztására legalkalmasabb módszernek a kromatografálást találtuk, amelyet ágyformáju, előnyösebben kolonnában elhelyezett tölteten végeztük.

A találmány szerinti vegyületek tisztítása és/vagy a fermentléből való elválasztása történhet hagyományosan kromatográfiával (beleértve a nagynyomású folyadék-kromatográfiát) megfelelő töltetlen, például szilikagélen, nemfunkcionális makrohálós adszorpciós gyantán, például keresztkötésü sztirol-divinil-benzol polimer gyantán, ilyen például az Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-16 vagy XAD-1180 gyanták (Rohm et Haas Ltd) vagy Kastell S112 (Montedison); (helyettesített sztirol)-(divinil-benzol) polimer, például halogénezett (pl. brómozott) sztirol-divinil-benzol polimer, ilyen például a Daion SP 207 (Mitsubishi); szerves oldószerrel kompatibilis kereszt-kötésű dextrán, ilyen például a Sephadex LH 20 (Pharmacia UK LTD), vagy reverzfázisu töltetek, ilyen például a szénhidrogén-kötésű szilikagél, például C^_g-kötésü szilikagél.

A találmány szerinti vegyületek kromatográfiás tisztitására/elválasztására megfelelő oldószerek/eluensek jellege általában függ a kolonnatöltet természetétől. Ha kolonnatöltetként például Amberlite XAD-2-t és C^_g-kötésü szilikagélt használtunk, azt találtuk, hogy általában megfelelő oldószerek az alkoholok, mint pl. a metanol, különösen, ha poláros oldószerrel, például vízzel keverjük össze.

Az extrakciós/izolációs folyamatok során a találmány szerinti vegyületek jelenlétét hagyományos technikai módszerekkel, például nagynyomású folyadék-kromatográfiával, UV-spektroszkópiával, vagy az alábbiakban leirt vegyületek sajátosságainak felhasználásával követhetjük.

Amennyiben a találmány szerinti vegyületeket szerves oldószeres oldat formájában kapjuk meg, például kro matográfiás tisztítás után, akkor az oldószert hagyományos módon például bepárlással távolíthatjuk el a termék szilárd vagy kristályos formában való kinyeréséhez. Ha szükséges, a találmány szerinti vegyületeket a korábban említett kromatográfiás módszerek alkalmazásával és/vagy átkristályositással további tisztításnak vetjük alá.

A fent említett eljárások megfelelő kombinációja után a találmány szerinti vegyületeket szilárd formában kapjuk meg. Az előzőekben említett tisztítási lépések sorrendje, valamint azoknak kiválasztási módja nagymértékben változtatható.

A találmány a következő példák segítségével mutatjuk be.

Az NCIMB 40131 jelű sugárgomba spóráit az alábbi összetevőkből álló agar táptalajra inokuláltuk g/i Élesztő extraktum (Oxoid L 21) 0,5 Maláta extraktum (Oxoid L 39) 30,0 Mikológiái pepton (Oxoid L 40) _x 5,0 Agár 3 (Oxoid L 13) 15,0

Desztillált vízzel 1 literre hígítva pH közelítőleg 5,4 és 28 °C-on 10 napig inkubáltuk.

Az érett agart ezután 6 ml 10 %-os glicerinoldattal befedtük és steril eszközzel feldaraboltuk, hogy a spórák és micéliumok fellazuljanak.

Az igy nyert spóraszuszpenzióból 0,4 ml alikvót részt polipropilén-szálakra vittünk, amit lezártunk és folyékony nitrogén atmoszférában tároltuk a kivánt ideig.

Egyetlen szál tartalmát használtuk az alábbi összetevőkből álló táptalaj (A) két 50 ml-jének beoltására:

	g/i
D-glűkóz	15,0
Glicerin	15,0 r? *
Szója pepton	15,0
NaCl	3.0
CaC0₃	1.0
Desztillált vízzel 1	I literre hígítva.

A nem kezelt oldat pH-ja 6,7, amelyet vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,0-re állítottunk, majd az oldatot autoklávba helyeztük. Az autoklávozás után a közeg pH értéke 7,3 volt.

A beoltott tápoldat két 50 ml-nyi térfogatát

250 ml-es Erlenmeyer lombikban 28°C-on 3 napig inkubáltuk 250 percenkénti fordulatszámú 50 mm átmérőjű orbitális mozgatású rázóberendezésben.

Az inkubált tápoldatot összegyűjtöttük és az alábbi összetételű tápoldat (B) 50 ml-ét egyenként tartalmazó 20 x 250 ml-es Erlenmeyer lombikokba oltottuk:

	g/i
D-glükóz	2,5
Maltodextrin MD30E (Roquette (UK) Ltd)	25,0
Arkasoy 50 (British Arkady Co Ltd)	12,5
Répa melasz	1,5

♦ · ·

g/1

0,125

Kalcium-karbonét

1,25

MOPS (3-(N-morfolino)-propánszulfonsav 21,0

Desztillált vízzel 1 literre hígítva, a pH 5 N NaOH-oldattal 6,5-re állítva.

A tenyészeteket 28°C-on 5 napon át történő rázatással növesztettük.

A sejteket és a tápoldatot centrifugálással választottuk el.

2. példa

Nyolc 250 ml-es Erlenmeyer lombik mindegyikébe egyenként 50 ml (A) tápoldatot helyzetünk, amelynek pH értékét a kezdeti 6,7-ről 7,0-re állítottuk vizes nátrium-hidroxid oldattal. Autoklávozás után a pH-érték 7,3 volt. A lombikokat az 1. példa szerint előállított spóraszuszpenzió 0,2 ml-ével oltottuk be külön-külön (A spóraszuszpenziót a szálakról vettünk).

A lombikokat 28°C-on inkubáltuk három napig

250 percenkénti fordulatszámú, 50 mm átmérőjű orbitális mozgású rázóberendezésen.

A nyolc lombik tartalmát összegyűjtöttük és egy literes fermentorban elhelyezett 12 liternyi (B) tápoldat beoltására használtuk, melynek pH-értékét 6,5-re állítottuk 5N nátrium-hidroxid oldattal, majd az elegyet autoklávoztuk.

A beoltott tápoldatot hagyományos keverőlapátokkal 800 percenkénti fordulattal kevertettük.

A kultúrát steril levegő átbuborékoltatásával levegőztettük, percenként a tenyészet térfogatára számított 0,5 térfogatú levegőmennyiség bejuttatásával.

A hőmérsékletet. 28°C-on tartottuk és a túlságos habzást szilikon habzásgátló hozzáadásával akadályoztuk meg. A tenyészetet 5 nap után összegyűjtött ütfTz 1. példa szerint dolgoztuk fel.

100 g Amberlite XAD-2 gyantát (Rohm és Haas Ltd) a fenti fermentációból nyert vizes felüluszó 2 liternyi mennyiségéhez adtuk és az elegyet húsz órán át szobahőmérsékleten kevertettük. A gyantát kiszűrtük és 250 ml-es részletekben 10 %-os vizes metanollal mostuk, a közelítőleg 250 ml térfogatú frakciókat külön-kűlön gyűjtöttük. Minden egyes frakcióból 5 pl-nyi aliquot részt a Polygonum lapathifolium növény csúcshajtására tettünk, amelyet ellenőrzött környezetű termekben növesztettünk 7 napon át, mely idő után megállapítottuk a növényeken a herbicid hatást.

A herbicid hatást mutató frakciókat összegyűjtöttük és C^g-kötésű szilikagél kolonnára (5 cm x 2 cm) vittük vizes oldatként. A kolonnát ezután 98:2 arányú viz-metanol eleggyel mostuk, közelítőleg 250 ml-nyi frakciót gyűjtöttünk össze. A fenti teszteket megismételve, a hei— bicid hatást mutató frakciókat összegyűjtöttük, bepároltuk, HPLC Dinamax C-18 töltetű kolonnára vittük (250 mm x 21 mm, • · ·'

- 19 Rainin Instruments) metanol-viz eluensseí mostuk. Az oszlopról lefolyt anyagot UV-spektroszkópiával 280 ntn-nél azonosítottuk. A biológiailag aktív frakciókat Dinamax C-18 töltetű HPLC kolonnán (250 mm x 4,6 mm, Rainin Instrument) analizáltuk, eluensként vizet alkalmaztunk 1 ml/perc átfolyási sebességgel és az azonos komponenseket tartalmazó frakciókat (B1, A3, A1 és A2 vegyületek retenciós ideje közelítőleg 10 perc, 17 perc, 21 perc és 23 perc) összegyűjtöttük, bepároltuk és tovább tisztítottuk Zorbax TMS (250 mm x 10 mm) tipusu HPLC kolonnán, az eluátumot 280 nm-nél azonosítottuk.

Az A és B vegyületeket és mindkettő glükózzal képzett konjugált vegyületeit (ahol a glükóz csoport'a -CHg-CH csoportban lévő -OH csoport hidrogénatomját helyettesíti) a biológiailag aktív frakciók bepárlásával, szilárd anyagokként kaptuk.

/

Szerkezetüket UV, NMR és tömegspektroszkópiával határoztuk meg, a fő vegyületek jellemző csúcsai a következők voltak:

B1 vegyület (retenciós idő közelítőleg 10 perc)

UV (metanol): 279 nm,

Tömegspektrum (Thermospray): 281 (Μ + H®)

NMR (300 MHz, DgO) : £ 7.25 (1H,s), 7.05 (1H,s), 5.80 (1H,d),
5.22		5.05	(1«,d),	4. 55	(1H,d),
4.20	(2H.S),	4.10	(1H,m),	3. 35	(1H,d),

3.20 (1H,d).

- 20 A1 vegyület (retenciós idő közelítőleg 21 perc): UV (metanol) 282 nm,

Tömegspektrum (Thermospray): 283 (Μ + H®)

NMR (300MHz, DgO) ; ζ 7,50 (1H,s), 7,05 (1H,s), 5,02 (1H,d),

4.50 (1H,m), 4,20 (1H,dd),

3,905.(1H,dd), 3,55 (2H,d),

3,40. (1H,dd), 3,30 (1H,d),

2,30 (1H,m), 2,10 (1H,m), 1,48 (1H,m)

A2 vegyület (retenciós idő közelítőleg 21 perc):

UV (metanol): 281 nm

Tömegspektrum (nagysebességű bombázás, tioglicerin) :

467 (M + Na®)

445 (Μ + H®)

NMR (300MHZ, DgO): Γ7,40 (1H,s), 7,05 (1H,s), 5,05 (1H,d),

4,55 (1H,m), 4,41 (1H,d),

4,20 (1H,dd), 4,05 (1H,m),

3,75 (1H,d), 3,60 (1H,dd),

3.50 (2H,ra), 3,2-3,4 (6H,m),

2,30 (2H,m), 1,45 (1H,m).

A3 vegyület. (retenciós idő közelítőleg 17 perc):

UV (metanol) : 280 nm

Tömegspektrum (Thermospray): 283 (Μ + H )

NMR (300MHz, DgO): é 7,50 (1H,s), 7,00 (1H,s), 5,00 (1H,d),

4,61 (1H,m), 4,25 (1H,dd),

4,10 (1H,dd), 3,50 (2H,m),

3,35 (1H,dd), 3,25 (1H,dd),

2,45 (1H,m), 2,00 (1H,m), 1,75 (1H,m) * ·

- 21 3.-4. példa

Az 1. és 2. példában ismertetett eljárást megismételtük, a (B) tápközeg helyett az alábbi tápközeget alkalmaztuk:

g/i

Glicerin23,0

L-prolin11,5

MOPS

3-(N-morfolino)-propánszulfonsav21,0

EDTA0,25

Náci0,5

MgS0₄.7H₂00,49

CaCl₂.2H₂00,029

KgHP0₄0,52

Nyomelem-sók 0,5 ml pH

Nyomelem-sók tartalma:

H₂S0₄ (1M)10 ml

ZnS0₄.4H₂03,6 g

MnS0₄.4H₂0 2,23g

H₃B0₃ 0,62g

CuS0₄.5H₂0 1,25g

Na₂Mo0₄.2H₂0 0,48g

CoC1₂.6H₂0 0,48g

FeS0₄.7H₂0 18,0 g

KI 0,83g

Desztillált vízzel 1 literre hígítva.

A komponenseket desztillált vízben oldottuk a fenti sorrendben.

5, példa

Az alábbi táblázatban felsorolt gabonaféléket és gyomokat steril táptalajon, ellenőrzött környezetű helyiségekben 25 °C-on (virulens fajták) vagy 21 °C-on (nem virulens fajták) tenyésztettük. A növényeket korai növekedési szakaszukban bepermeteztük. A 2. példában előállított és az alábbiakban felsorolt vegyületeket 25 %-os metanol-desztillált viz elegyben formáltuk 0,5 % Tween 20 és 0,05 % Pluronic L61 nedvesitőszerek hozzáadásával.

Az alkalmazott permetezőszer térfogata hektáronként 2000 liter volt, amely 0,2 - 0,5 kg/ha hatóanyag-dózisnek felel meg. A kezelt növényeket vagy ellenőrzött környezetű helyiségekbe vittük vissza, vagy üvegházakba helyeztük és 2 hét múlva kiértékeltük a hatást olyan skálát alkalmazva, amelyen a 0 jelentése az, hogy nem volt hatása a kezelésnek, az 1 csekély károsodást, a 2 mérsékelt károsodást, a 3 jó védelmet jelent, a 4 pedig a teljes pusztulást jelenti. A következő táblázatban az Α1, A2, A3 és B1 vegyületek az előzőekben meghatározottak.

Az alábbi eredményeket kaptuk:

dózis (kg/ha)	V	e g y ü	let
SÍ 0,2	1 T—1 · <1 o	A2 0,2	A3 0,4
rizs (Oryzae sativa)	2	-	-	-
árpa (Hordeum vulgaro)	1	3	2	1
gyapot (Gossypium hirstutum)	2	-	-	-
disznóhunyor ('Polygonum	2	4	4	2
lapathifolium)
(Chrysanthemum segetum)	3	3	1	0
hajnalka (Pharbitis purpurea)	1	2	2	2
vadzab (Avena fatua)	0	2	1	2
tarackbuza (Agropyron repeus)	0	2	0	1
ecsetpázsit (Alopecurus	1	2	2 ^Z	2
myosuroides)

6. példa NCIMB 40131 jellemzői:
spóratömeg színe (ISP közeg 4)	fehér
szubsztrát színe (ISP közeg 4)	halvány narancs
spóralánc alak (ISP közeg 4)	rövid, csavarodó
diffundáló pigment termelés (ISP közeg 5)	-
melanin termelés (ISP közeg 6)	-
melanin termelés (ISP közeg 7)	-
xantin degradáció	-
elasztin degradáció	+
hippurát degradáció	+

» 4

A

pektin degradáció	+
kazein degradáció	+
tirozin degradáció	-
elasztin degradáció	+
hippurát degradáció _c	+
pektin degradáció	+
kazein degradáció	+
tirozin degradáció	-
növekedés az alábbiakon:
L-ramnóz	+
mezo-inozitol	+
D-melibioz	+
glukóz	+
szacharóz	+
mannitol	+
raffinóz	-
adonitol	+
dextrán	-
xilitol	-
Az alábbiak hasznosítása:
DL-cc-amino-vajsav	+
L-cisztein	-
L-valin	+
L-fenil-alanin	+
L-hisztidin	+
L-hidroxi-prolin	-
lipolizis

(gyenge) (gyenge)

- 25 * · AB · · · · • · · · >« »*·» *·« lecitináz aktivitás növekedés

28°C-on

37°C-on

45°C-on +

gyenge növekedés az alábbiakkal:

NaCl (7 tömeg/térfogat %)

NaN₃ (0,01 tömeg/térfogat %) fenol (0,1 tömeg/térfogat %) kálium-tellurit (0,001 tömeg/térfogat %) + tallium-acetát (0,01 tömeg/térfogat %) +

A mikroorganizmus kiválóan növekszik maláta-élesztő agaron, zabliszt agaron és Bennet-agaron 28°C-on 7-14 napon át, A sejtfal mezo-diamino-pimelinsavat tartalmaz.

Savtermelés az alábbiakból:

adonitol	-
arabinóz	+
cellobióz	+
galaktóz	+
inozitol	+
laktóz	+
mait óz	+

mannitol

melibióz
raffinóz	-
ramnóz	+
szalicin	-
szorbitol	-
szaharóz	ΐ +
trehalóz	+
xilóz	+
fruktóz	+
glicerin	+
mannóz	+

• i

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Herbicid készítmény, azzal jellemez- v e , hogy hatóanyagként 0,01-99 tömeg% mennyiségben egy vagy több (I) általános képletű 3,6,7,8-tetrahidro-iraidazo (4,5-dl 11,3]diazepin-8-ol-származékot - a képletben a szaggatott vonal azt jelzi, hogy a két szénatom között vagy egyszeres vagy kettőskötés van - vagy ezek^cukrok kai képzett vegyületét tartalmazza megfelelő hordozóés/vagy felületaktív anyaggal együtt.
2. Az 1. igénypont szerinti heribid készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 3- [2,3-rdihidroxi-4-(hidroxi-metil)-ciklopentil]-3,6,7,S-tétrahidro-imidazo [4,5-d] M ,3]diazepin-8-olt tartalmaz.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti herbicid készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 8R-3- [(1R,2S,3R,4R)-2,3-dihidroxi-4-(hidroxi-metil)-ciklopentill-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo [4,5-dl (1,31-diazepirt-8-olt tartalmaz.
4. Az 1. igénypont szerinti herbicid készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 2. vagy a 3. igénypontban meghatározott vegyület cukorral képzett származékát tartalmazza.

• · · ·
5. A 4. igénypont szerinti herbicid készítmény, azzal jellemezve, hogy a cukor glükóz.
6. A 4. vagy az 5. igénypont szerinti herbicid készítmény, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyületben a -CHgOH csoport hidroxilcsoportja van helyettesítve egy olyan -0R csoporttal, ahol R a cukorrész.
7. A 6. igénypont szerinti herbicid készítmény.

azzal jellemezve, hogy hatóanyaga 8R-3-[(1R,2S,3R,4R)-2,3-dihidroxi-4-(β-D-glükozil-oxi-metil)-ciklopentil3-3,6,7,8-tetrahidro-imidazo [4,5-d] (1,3]-diazepin-8-ol.
8. Az 1.-7. igénypontok bármelyike szerinti herbicid készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként

0,5 - 85 tömeg% mennyiségben (I) képletű vegyületet vagy annak cukorszármazékát tartalmazza.
9. Eljárás az 1. igénypontban meghatározott (I) képletű vegyület vagy cukorszármazékának előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben megadot letet termelni képes mikroorganizmust fermentálunk és kívánt esetben abból az adott vegyületet izoláljuk.
10, Eljárás gyomok elleni védekezésre, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, az 1. igénypontban meghatáct Vozott (I) képletű vegyület vagy cukorszármazékának hatá sós mennyiségét alkalmazzuk.

• · · · • · ··· • · · · ·· ···· ··· • · ··
11. Az 1. igénypontban meghatározott (I) képletei vegyületeket és azok cukorszármazékait előállítani képes sugárgomba nemzetsége tartozó mikroorganizmus törzs lényegében tiszta tenyészete,
12. A 9. igénypont szerinti tenyészet, azzal

......... _f ' jellemezve, hogy a mikroorganizmus Amycolatopsis faj-t^-j-u,
13. Az 1. igénypontban meghatározott (I) képletü vegyületek és azok cukorszármazékait előállítani képes NCIMB 40131 mikroorganizmus vagy mutánsának biológiailag tiszta tenyészete.
14. A 9. vagy 10. igénypont szerinti tenyészet, azzal jellemezve, hogy a tenyészet NCIMB 40131.
15. A 9.-12. igénypontok bármelyikében meghatározott fermentációs genetikai anyag, amely részt vesz az 1. igénypontban meghatározott (I) képletű vegyűleteknek és cukorszármazékainak a szintézisében.