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Organisch-chemische Verbindung, mikrobiologische
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Verfahren zur Herstellung sowie ihre Verwendung Die vorliegende Erfindung
betrifft 1R;3S;5S; cUR; 3-t2-(3,5-Trimethyl-2-oxocyclohexyl)-2-hydroxyethylS-2,6-piperidindion,
mikrobiologische Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung als Pflanzenschutzmittel,
insbesondere als Herbizid und Pflanzenwachstumsregulator.
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Die eingangs genannte Verbindung ist bekannt (s. Chemical Abstracts
Vol. 55, 21476f) und läßt sich durch das in Figur 1 wiedergegebene IR-KBr-Absorptionssprektrum
(Abszisse: Wellenzahl in cm 1, Ordinate: Extinktion), das charakteristische Banden
bei den Wellenzahlen 825 cm 1 aufweist, charakterisieren.
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Des weiteren kann die Verbindung durch die folgenden Eigenschaften
und Parameter beschrieben werden: (1) Elementaranalyse C: 63,2 % H: 8,0 % N: 4,7
% 0+: 24,1 % +aus der Differenz berechnet (2) Zersetzungspunkt Die Substanz bildet
ein weißes amorphes Pulver mit einem Zersetzungspunkt von 120 - 125 C.
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(3) ORD-Spektrum (Fig. 5) Das ORD-Spektrum der Substanz zeigt ein
Maximum bei 297 nm (+ 3800C, c = 3 mg in 10 ml Chloroform) Ordinate: Drehzahl in
g °57 Abzisse: Wellenlänge in nm Kurve 1 4,2 mg/ml Chloroform Kurve 2 0,42 mg/ml
Chloroform Kurve 3 0,84 mg/ml Chloroform (4) Ultraviolettabsorptionsspektrum Im
Bereich von 350 nm bis 200 nm zeigt die Verbindung keine Absorption.
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(5) aH-100 MHz-Kernresonanzspektrum Das charakteristische 1H-NMR-Spektrum
ist in Figur 2 wiedergegeben.
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(6) Massenspektrum (gemäß Figur D) Im Massenspektrum wird ein Molekülion
nicht beobachtet. Es treten charakteristische Fragmentionen bei 263, 205, 204, 155,
152, 126, 112, 84, 69, 55 und 41 aur.
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(7) Die Verbindung ist löslich in Methanol, Ethanol, Ethylacetat,
Butylacetat, Benzol, Aceton und Chloroform, schwerlöslich in Wasser.
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(8) Die Verbindung läßt sich sauer hydrolysieren. So können beispielsweise
nach 14 Stunden langer Behandlung mit 6 N Salzsäure bei 1100C im Hydrolysat Ammoniumionen
nachgewiesen werden.
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(9) Die Verbindung ist ein amorpher farbloser Stoff. Es ist leicht
möglich, die Verbindung bei der Dünnschichtchromatographie auf einer Kieselgelplatte
anzufärben. Einige Reaktionen, die zur Indentifikation dienen, sind in Tabelle 1
aufgeführt.
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(10) Die Rf-Werte der Verbindung auf neutralen Kieselplatten gibt
Tabelle 2 wieder.
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(11) Die antibiotische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung ist
in Tabelle 3 wiedergegeben.
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Tabelle 1: Versuche zur chemischen Anfärbung der Verbindung Nr. Reagenz
/ Reaktion nach ) Anfärbung 1 Ninhydrin 2 Morgan/Elson 3 4-Dimethylaminobenzaldehyd
4 KMnO4, alk. + 5 Thymol/H2SO4 + 6 Anisaldehyd/H2S04 + 7 Perjodat 8 2,7-Dichlorfiuorescein
9 Jod +
Tabelle 1 (Fortsetzung) Nr. Reagenz / Reaktion nach+ Anfärbung
10 Bromkresolgrün 11 Rhodamin B 12 Moybdatophosphorsäure + 13 Anilinphthalat 14
Tollen's Reagenz 15 Diphenylamin + 16 2,4-Dinitrophenylhydrazin 17 Eisen(III)-chlorid
-)Die Reagenzien wurden nach den üblichen Vorschriften (Vgl. E. Stahl, Dünnschichtchromatographie,
2. Auflage, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1967) angesetzt.
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Tabelle 2: Dünnschichtchromatographische Charakterisierung der Verbindung
auf Kieselgel 60, F 254, Schichtdicke 0,25 mm (Merck) Fließmittelsystem (Volumenteile)
Rf-Werte n-Butanol/Eisessig/H20 = 50/25/25 0,60 Chloroform/Methanol/Eisessig = 90/8/2
0,63 Chloroform/Methanol/H20 = 80/20/2,5 0,66 Aceton 0,55 Chloroform/Methanol =
80/20 0,65
Tabelle 2 (Fortsetzung) Fließmittelsystem (Volumenteile)
Rf-Werte Chloroform/Methanol = 90/10 0,37 Chloroform 0,05 Diethylether 0,06 Chloroform/Methanol/Ammoniak
= 20/3/0,5 0,62 n-Butylacetat/n-Butanol/Eisessig/Phosphatpuffer pH 7 = 50/10/25/15
0,62 i-Propanol/2 N Ammoniak/H20 = 7/1/2 0,71 Methanol 0,64 Tabelle 3: Antibiotische
Wirkung der Verbindung Organismus minimale Hemmkonzentration /ug/ml Hefe HT - 21
L0,5 Hefe HT - 10 L0,5 Sacharomyces cerevisiae 1,0 Pyricularia oryzae £ 0,5 Pellicularia
sasakii o1,0 1 0 Sclerotinia sclerotiorum Botrytis cinerea z8,0 Xanthomonas oryzae
>1000 E. coli >1000
1R;3S;5S; , R; 3-/2-(3,5-Trimethyl-2-oxocyclohexyl)-2-hydroxyethyl/-2,6-piperidindion
hat die Formel
Diese Verbindung erhält man überraschenderweise, wenn man Mikroorganismen der Ordnung
Actinomycetales in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquellen
sowie Mineralsalze enthält unter aeroben Bindungen kultiviert und die Verbinding
isoliert.
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Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von
1R;3S;5S;CtR; 3-/2-(3,5-Trimethyl-2-oxocyclohexyl) -2-hydroxyethyl/-2 , 6-piperidindion,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetaales
in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie
Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die Verbindung isoliert,
sowie die Verwendung der so hergestellten Verbindung als Pflanzenschutzmittel, insbesondere
als Herbizid und Pflanzenwachstumsregulator.
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Zur Gewinndung der Verbindung eignen sich innerhalb der Ordnung Actinomycetales
besonders Vertreter der Familie Streptomycetaceae und hier hauptsächlich solche
aus der Gattung Streptomyces. Das erfindungsgemäße Ver-
fahren
kann besonders gut mit Mikroorganismen der Art Streptomyces griseus durchgeführt
werden. Als Beispiel sei Streptomyces griseus Stamm 587 genannt.
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Dieser Stamm wurde unter der Nummer DSM 1471 am 23.
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Februar 1979 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen Göttingen
hinterlegt. Bakterienstämme, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
geeignet sind, können aus Bodenproben terrestrischen oder marinen Ursprungs durch
die üblicherweise zu diesem Zweck angewandten Methoden isoliert werden.
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Streptomyces griseus Stamm 587 beispielsweise konnte aus einer marinen
Sedimentprobe angereichert werden, die mit einem Greifer im Januar 1968 in der Nordsee
vor der schottischen Küste aus einer Tiefe von 63 m genommen wurde. Der Stamm wurde
seit dieser Zeit auf geeigneten festen Nährböden (z.B. auf HPG-Agar: 3 g Hefeextrakt,
6 g Pepton, 10 g Glucose, 8 g NaCl, 20 g Agar, 1000 ml entmineralisiertes Wasser,
pH-Wert auf 7,0 eingestellt) in Kultur gehalten.
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Streptomyces griseus-Stamm 587 hat folgende Merkmale: a) Stamm 587
bildet das für Streptomyceten typische Luftmyzel mit deutlich ausgeprägten Sporenketten.
Die Sporen sind oval bis zylindrisch.
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Abmessungen: 0,4 - 0,8/um x 0,8 - 1,8/um. Die Sporenoberfläche ist
glatt oder geringfügig strukturiert.
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b) Die Farbe des jungen Luftmyzels ist weiß. Das ausgereifte Luftmyzel
ist gelb bis sandfarben ("griseus").
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c) Die Sporophoren sind sympodial verzweigt und in Büschel angeordnet.
Die Sporenketten sind gerade oder gewellt ("rectus flexibilis") und tragen bis zu
etwa 60 Sporen.
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d) Auf peptonhaltigen Nährböden wird kein dunkles Pigment gebildet.
Der Stamm ist daher nicht chromogen.
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Diese Merkmale weisen Stamm 587 (DSM 1471) als zur Art Streptomyces
griseus Waksman et Henricigehörig aus (auf der Grundlage von Butter, R.: Systematik
der Streptomyceten, Basel-New York, Karger 1967).
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Die erfindungsgemäße Verbindung erhält man, wenn san Mikroorganismen
der Ordnung Actinomycetales in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält unter aeroben Bindungen kultiviert
und die Verbindung isoliert.
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Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Verbindung eignen sich innerhalb
der Ordnung Actinomycetales besonders Vertreter der Familie Streptomycetaceae und
hier hauptsächlich solche aus der Gattung Streptomyces. Das erfindungsgemäße Verfahren
kann besonders gut mit Mikroorganismen der Art Streptomyces griseus durchgeführt
werden. Als Beispiel sei Streptomyces griseus Stamm 587 genannt. Dieser Stamm wurde
unter der Nummer DSM 1471 am 23. Februar 1979 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen
Göttingen hinterlegt. Bakterienstämme, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens geeignet sind, können aus Bodenproben terrestrischen oder marinen Ursprungs
durch die üblicherweise zu diesem Zweck angewandten Methoden isoliert werden. Streptomyces
griseus Stamm 587 beispielsweise konnte aus einer marinen Sedimentprobe
angereichert
werden, die mit einem Greifer im Januar 1968 in der Nordsee vor der schottischen
XUste aus einer Tiefe von 63 m genommen wurde. Der Stamm wurde seit dieser Zeit
auf geeigneten festen Nährböden (z.B. auf HPG-Agar: 3 g Hefeextrakt, 6 g Pepton,
10 g Glucose, 8 g NaCl, 20 g Agar, 1000 ml entmineralisiertes Wasser, pH-Wert auf
7,0 eingestellt) kommen alle üblichen Kohlenstoffquellen in Frage.
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Als Beispiel seien Stärke, Melasse, Molkepulver, Dextrin und Zucker,
wie Saccharose, Maltose, Glucose, Lactose, Sorbit und Glycerin genannt. Als Stickstoffquellen
kommen alle üblichen organischen und anorganischen Stickstoffquellen in Frage. Als
Beispiel seien Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, lösliche
und unlösliche pflanzliche Proteine, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Peptone und Fleischextrakt
sowie Ammoniumsalze und Nitrate, z.B. NH4Cl, (NH4)2S04, NaN03 und KNO3 aufgeführt.
Die Mineralsalze, welche im Nährmedium enthalten sein sollen, liefern z.B. folgende
Ionen: Mg++, Na+, K+, Ca++, NH4 , C1 , S04 , PO P04 und NO3-sowie Ionen der üblichen
Spurenelemente, wie Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co, Ni. Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen
bzw. das verwendete Wasser nicht ausreichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthalten,
ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen. Die Zusammensetzung
der Nährmedien kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammensetzung
der Nährmedien werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils
besonders günstig zur Verfügung stehen.
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Bei der Durchführung des Verfahrens kann es günstig sein, zu Beginn
der Kultivierung nur relativ geringe Konzentrationen der löslichen Nährlösungsbestandteile
zu verwenden und dann im Laufe der Kultivierung diese Bestandteile in Form steriler,
relativ konzentrierterL: q en dem Kulturansatz fraktioniert zuzufüttern.
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Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte zwischen etwa 5,5 und etwa
9,5 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusätze
einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaC03 vermieden werden.
Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung
durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säure, z.B. H2S04,
oder sterile Lauge, z.B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt wird.
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Es ist zweckmäßig, sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend
mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach
den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.
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Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa 10 und etwa 400C liegen.
Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z.B die Zus-ammensetzung
des Nä-hrmediums und die Züchtigungstemperatur eine Rolle spielen. Die jweili-
gen
optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiolgischen Gebiet
leicht festgelegt werden.
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Es hat sich herausgestellt, daß die Menge der sich in der Kulturbruhe
anreichernden Verbindung im allgemeinen ihr Maximum zwischen dem 1. und 12., vorzugsweise
zwischen dem 2. bis 5. Tage nach Zuchtungsbeginn erreicht.
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Wie allgemein bei mikrobiolgischen Verfahren sollten Fremdinfektionen
der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen,
wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen
Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen können z.B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation
verwendet werden.
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Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht,
können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z.B. flüssige Fette und Öle,
Ol-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octadecanol, Siliconöl, Polyoxyethylen-
bzw.
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Polyoxypropylenverbindungen zugesetzt werden. Schaum kann auch mit
Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z.B. Zentrifugalkräfte benutzen)
gedämpft oder beseitigt werden.
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Die Verbindung kann aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen
Methoden isoliert werden. Die Isolierung kann z.B. gemäß den üblichen Extraktionsverfahren,
Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren erfolgen. Das isolierte Herbizid
kann mit Hilfe der genannten Methoden auch feingereinigt werden. Für viele Fälle
ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da die gegebenenfalls vorhandenen
Verunreinigungen die Wirksamkeit der Verbindung als Herbizid nicht nachteilig beeinflussen.
Bei allen Isolierungs- und Reinigungsoperationen ist darauf zu achten, daß pH-Werte
oberhalb pH 2 eingehalten werden. Zur Erhöhung des pH-Wertes können anorganische
und organische Basen verwendet werden, z.B.
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Ammoniak, Alkali- und Erdalkalihydroxide, Alkali-und Erdalkalicarbonate
und Hydrogencarbonate, z.B.
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KOH, NaOH, Na2C03, NaHC03, CaC03, Trialkylamine wie Triethylamin,
Morpholin und Pyridin. Um bei den obengenannten Isolierungs- und Reinigungsmethoden
die Fraktionen herauszufinden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung in höchster
Konzentration bzw. Reinheit vorliegt, können die üblichen physikalisch-chemischen
Methoden, z.B. Messen der Rf-Werte, oder aber die Untersuchung der herbiziden Aktivität
und vorzugsweise die Bestimmung der antibiotischen Aktivität herangezogen werden.
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Die Isolierung der Verbindung kann z.B. im Falle, daß ein flüssiges
wäßriges
Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden: Nach seiner Anreicherung
im Kulturüberstand werden Kulturfiltrat und Mycel mit üblichen Methoden separiert
(z.B. Zentrifugation).
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Aus dem Kulturfiltrat kann die Verbindung mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren,
Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren isoliert und gegebenenfalls
gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchgeführt
werden. Als Adsorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder organischen
Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z.B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat,
Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, Derivate von
Polyamiden, z.B. acetyliertes Polyamid oder Dextrangele. Als Laufmittel können die
verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen
die erfindungsgemäße Verbindung löslich ist. Bevorzugt wird Methanol und Ethanol
eingesetzt.
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Bevorzugt werden zur Isolierung der Verbindung Chromatographie-Verfahren
verwendet, z.B.
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unspezifische Adsorption an hydrophobe Sorbentien.
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Dies sind die von der Reinigung schwer wasserlöslicher neutraler Naturstoffe
her bekannten Methoden.
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Für die kommerzielle Herstellung der als Herbizid oder Pflanzenwachstumsregulator
verwendeten Verbindung bevorzugt man die Gewinnung durch Absorption und anschließende
Desorption an einem hydrophoben Trägerharz (z.B. Lewapol; ein hydrophobes Trägerharz
der BAYER AG). Die Desorption kann z.B. mit kurzkettigen aliphatischen Alkoholen
durchgeführt werden, bevorzugt Methanol oder Ethanol.
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Ene derart vorgereinigte Fraktion kann wiederum mit den üblichen Methoden
gereinigt werden. Bevorzugt kann hier die Geldiffusionschromatographie eingesetzt
werden.. Die Chromatographie beispielsweise an Sephadex LH-20 verläuft erfolgreich.
Vorzugsweise wird hier in alkoholischer Lösung gearbeitet. Ein derartig gewonnenes
Produkt ist im allgemeinen reiner als 50 %.
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Die Verbindung kann aus einer solchen Fraktion mit den üblichen biochemischen
Methoden gewonnen werden. Von den bereits genannten Adsorptionsmitten kann neben
anderen vor allem Kieselgel erfolgreich eingesetzt werden. Als Fließmittel kommt
z.B. Chloroform-Methanol (so etwa 4/1 Volumenteile) mit Erfolg zur Anwendung.
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Aus seinen Lösungen kann die Verbindung nach den üblichen Methoden,
z.B. Verdampfen des Lösungsmittels, Gefriertrocknung usw. erhalten werden.
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Der erfindungsgemäß hergestellte Wirkstoff beeinflußt das Pflanzenwachstum
und kann deshalb als Defoliant,
Desiccant, Krautabtötungsmittel,
Keimhemmungsmittel und insbesondere als Unkrautvernichtungsmittel, jedoch auch bevorzugt
als Pflanzenwachstumsregulator verwendet werden.
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Unter Unkraut im weitesten Sinne sind alle Pflanzen zu verstehen,
die an Orten aufwachsen, wo sie unerwünscht sind. Ob die erfindungsgemäßen Stoffe
als totale oder selektive Herbizide wirken, hängt im wesentlichen von der angewendeten
Menge ab.
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Der erfindungsgemäß hergestellte Wirkstoff kann z.B.
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bei den folgenden Pflanzen verwendet werden: Dikotyle Unkräuter der
Gattungen: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, anthemis, Galinsoga,
Chenopoaium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea,
Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala,
Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver,
Centaurea.
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Dicotyle Kulturen der Gattunqen: Gossypium, Glycine, Beta, Daucus,
shaseolus, Pisum, Solanum, Linum, Ipomoea, Vicia, Nicotiana, Lycopersicon, Arachis,
Brassica, Lactuca, Cucumis, Cuburbita.
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Monokotyle Unkräuter der Gattungen: Echinochloa, Setaria, Panicum,
Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus,
Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monocharia, Fimbristylis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus,
Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.
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Monokotyle Kulturen der Gattungen: Oryza, Zea, Triticum, Hordeum,
Avena, Secale, Sorghum, Panicum, Saccharum, Ananas, Asparagus, Allium.
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Die Verwendung des Wirkstoffes ist jedoch keineswegs auf diese Gattungen
beschränkt, sondern erstreckt sich in gleicher Weise auch auf andere Pflanzen.
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Die Verbindung eignet sich in Abhängigkeit von der Konzentration zur
Totalunkrautbekämpfung z.B. auf Industrie- und Gleisanlagen und auf Wegen und Plätzen
mit und ohne Baumbewuchs. Ebenso kann die Verbindung zur Unkrautbekämpfung in Dauerkulturen
z.B. Forst-, Ziergehölz-, Obst-, Wein-, Citrus-, Nuss-, Bananen-, Kaffee-, Tee-,
Gummi-, ölpaim-, Kakao-, Beerenfrucht-und Hopfenanlagen und zur selektiven Unkrautbekämpfung
in einjährigen Kulturen eingesetzt werden.
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Der Wirkstoff kann als solcher oder in Formulierungen auch in Mischung
mit bekannten Herbiziden zur Unkrautbekämpfung Verwendung finden, wobei Fertigformulierung
oder Tankmischung möglich ist.
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Der Wirkstoff kann in die üblichen Formulierungen übergeführt werden
wie Lösungen, Emulsionen, Spritzpulver, Suspensionen, Pulver, Stäubemittel, Schäume,
Pasten, lösliche Pulver, Granulate, Aerosole, Suspensions-Emulsionskonzentrate,
Saatgrupuder, Wirkstoff-imprägnierte Natur- und synthetische Stoffe, Feinstverkapselungen
in polymeren Stoffen und in Hullmassen für Saatgut, ferner in For-
mulierungen
mit Brennsätzen, wie Räucherpatronen, -dosen, -spiralen u.ä. sowie ULV-Kalt- und
Warmnebel-Formulierungen.
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Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z.B. durch
Vermichen des Wirkstoffs mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln, unter
Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls
unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln
und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel
können z.B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden.
Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: Aromaten, wie Xylol,
Toluol oder Alkylnaphthaline, chlorierte Aromaten oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe,
wie Chlorbenzole, Chlorethylene oder Methylenchlorid, aliphatische Kohlenwasserstoffe,
wie Cyclohexan oder Paraffine, z.B. Erdölfraktionen, Alkohole, wie Butanol oder
Glykol sowie deren Ether und Ester, Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon
oder Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid,
sowie Wasser; mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder Trägerstoffen sind
solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck
gasförmig sind, z.B. Aerosol-Treibgas, wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie
Butan,
Propan, Stickstoff und Kohlendioxid; als feste Trägerstoffe: natürliche Gesteinsmehle,
wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde
und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und
Silikate; als feste Trägerstoffe für Granulate: gebrochene und fraktionierte natürliche
Gesteine wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate
aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material
wie Sägemehle, Kokosnußschalen, Maiskolben und Tabakstengel; als Zmulgier- und/oder
schaumerzeugende Mitteil: nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäure-Ester,
Pol.yoxyethylen-Fettalkohol-Ether, z.B. Alkylaryl-polyglykol-ether, Alkylsulfonate,
Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie EiweiB-hydrolysate; als Dispergiermittel: z-.B.
Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose.
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Es können in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose,
natürliche und synthetische pulverige, körnige oder latexftJrmige Polymere verwendet
werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat.
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Es können Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z.B.
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Eisenoxid, Titanoxid, Ferrocyanblau und organische Farbstoffe, wie
Alizarin-, Azo-Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennährstoffe wie Salz von Eisen,
Bot, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zin verwendet werden.
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Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gewichtsprozent
Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90 %.
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Beispiel 1 Beimpft man einen 1 1 Erlenmeyerkolben, der 150 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung 0,5 % (NH4)2S04, 0,3 % KO03, 0,4 % Sojamehl., 0,4
% Maisquellwasser, 6,0 % Stärke, 0,5 % CaCO3 (pH-Einstellung vor Sterilisation auf
7,0 mit KOH, Sterilisation 20 Minuten 121 0C) enthält mit 3 ml einer Vorkultur des
Stammes 587 (gewonnen in derselben Nährlösung, beimpft mit einer Schrägröhrchenkultur)
und bebrütet diese Kultur bei 28 0C auf einer Rundschüttelmaschine bei 280 Upm,
so erhält man nach einer Kulturdauer von 3 Tagen eine Kulturbrühe, deren Gehalt
an Wirkstoff gemäß Beispiel 9 zu 32 mg/l bestimmt wird.
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Beispiel 2 Beimpft man einen 1 1 Erlenmeyerkolben, der 150 ml einer
Nährlösung aus 2 % Stärke, 1 % Glucose, 0,5 % N-Z Amine, 1,0 % Hefeextrakt enthält,
deren pH-Wert mit Na2CO3 auf 7,2 eingestellt und die dann mit 0,4 % CaC03 versetzt
und 30 Minuten bei 1210C sterilisiert worden war, mit 3 ml einer Vorkultur des Stammes
587, gewonnen in derselben Nährlösung, und bebrütet auf einer Rundschüttelmaschine
bei 28 C und 280 Upm, so erhält man nach 2 Tagen eine Kulturbrühe, deren Gehalt
an Wirkstoff gemäß Beispiel 9 zu 4 mg/l bestimmt wird.
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Beispiel 3 Beimpft man einen 1 1 Erlenmeyerkolben, der 150 ml einer
Nährlösung
aus 3 % Sojamehl entfettet, 3 % Glyzerin, 0,2 z CaC03, 0,1 % Polyol-Entschäumer
enthält und 30 Minuten bei 1210C sterilisiert worden war, mit 3 ml eine Vorkultur
des Stammes 587, gewonnen in derselben Nährlösung, und bebrütet bei 280C auf einer
Rundschüttelmaschine bei 280 Upm, so erhalt man nach 3 Tagen eine Kulturbruhe, deren
Gehalt an Wirkstoff gemäß Beispiel 9 zu 8 mg/l bestimmt wird.
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Beispiel 4 Beimpft man einen 1 1 Erlenmeyerkolben, der 150 ml einer
Nährlösung aus 3 % Stärke, 2 % Hefeautolysat, 0,1 % K2H204, O,1 % MgS04 * 7H20,
0,1 z NaCl, 0,2 % (NH4)2S04 und 0,2 % CaCO3 enthält, deren pH-Wert auf 7,0 eingestellt
und die 30 Minuten bei 121 0C autoklaviert worden war, mit 3 ml einer Vorkultur,
gewonnen in derselben Nähr-Lösung, und bebrütet auf einer Rundschüttelmaschine,
bei 280c und 280 Upm, so erhält man nach 3 Tagen eine Kultur brühe, deren Gehalt
an Wirkstoff gemäß Beispiel 9 zu 4 mg/l bestimmt wird.
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Beispiel 5 Beimpft man einen Fermenter, der 200 1 einer Nährlösung
nach Beispiel 1 enthält, mit 10 1 einer in einem Vorfermenter gewonnenen Vorkultur
des Stammes 587 und bebrütet unter Rührung (200 Upm) und Belüftung (0,5 vvm) 5 Tage
bei 28&C, so erhält man eine Kulturbrühe, deren Gehalt an Wirkstoff gemäß Beispiel
9 zu 128 mg/l bestimmt wird.
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Beispiel 6 Bei einer Fermentation gemäß Beispiel 5 werden nach dem
Abzentrifugieren 170 1 Kulturfiltrat gewonnen. Der Kulturtiberstand wird mit 50
l/h auf eine Säule (30x50 cm), die ein hydrophobes Trägerharz auf Sulfonsäurebasis
(z.B. Lewapol) enthält, aufgetragen und die Säule mit 100 1 R20 nachgewaschen. Durchlauf
und Waschwasser sind nicht herbizid wirksam un-d werden verworfen. Anschließend
wird zunächst mit 100 1 50 %igem Methanol desorbiert.
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Das inaktive Desorbat wird verworfen. Anschließende Desorption mit
100 1 100 %igem Methanol führt zu einem herbizid wirksamen Eluat. Das Eluat wird
zur Trockene eingeengt, der so erhaltene Rdckstand in 2 1 Wasser autgen-emmen und
die Suspension lyophilisiert (Ausbeute 40,2. g 3,5 %iger Wirkstoff).
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beispiel 7 Man löst 4,0 g des 3,5 %igen Wirkstoffs gemäß Beispiel
6 in 50 ml Methanol, zentrifugiert ab und chromatographiert den bestand an Sephadex
LH-20 in Methanol (Säule 5 cm x 100 cm, Fließrate 100 ml/h, 12'/Glas). Die Fraktionen
?5-78 zeigen Hemmwirkung gegen die Hefe HT-21 und sind auch herbizid wirksam (Ausbeute
119 mg). Der Wirkstoffgehalt läßt sich gemäß Beispiel 9 zu ca. 50 % bestimmten.
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Beispiel 8 Man löst 100 mg angereichertes Präparat gemäß Beispiel
7 in 5 mi Chloroform/Methanol = 5/1 (v/v) und trägt linien-
förmig
auf eine präparative 2 mm dicke Kieselgelplatte (KG 60, Merck) auf. Es wird mit
dem angegebenen Fließmittel eluiert. Die Zone mit einem Rf-Wert von 0,55 bis 0,75
wird mit Methanol eluiert und enthält 27,7 mg des reinen Wirkstoffs.
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Beispiel 9 Aus einer Lösung von 1 mg/ml des reinen Wirkstoffs gemäß
Beispiel 8 wird im Lochtest die Hemmpotenz gegen die Hefe HT-21 bestimmt. Dabei
wird nach 12 Stunden Inkubation bei 280C der Durchmesser des Hamhofes in Abhbängigkeit
von der Konzentration gemessen.
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1 mgjml unverdünnt 1:1 1:4 1:8 1:16 Wirkstoff Hemmhof mm 59 49 45
43 42 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 4.0 35 30 23 19 14 12 -Durch
Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration der Präparate der Beispiele 1 bis 8 konnte
daher der Wirkstoffgehalt bestimmt werden.
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Beispiel 10 pre-emergence-Test In Schalen, die mit Vermiculite gefüllt
sind, werden
Samen von Kresse (Lepidium sativium) ausgelegt. Die
Schalen werden dnnn mit einer Hoagland-Nährlösung gegossen, der die erfindungsgemäßen
Wirkstoffe zugesetzt sind.
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Nach 2 Wochen wird der Schädigungsgrad der Pflanzen bonitiert in %
Schädigung im Vergleich zur Entwicklung der unbehandelten Kontrolle.
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Die Präparate gemäß den obigen Beispielen zeigen eine hohe Wirksamkeit.
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Beispiel 11 post-emergence-Test In Schalen, die mit Vermiculite gefüllt
sind, werden Samen von Kresse (Lepidium sativum) ausgelegt. Die Schalen werden dann
mit einer Hoagland-Nährlösung gegossen, bis die Pflanzen eine Größe von 5 bis 10
cm erreicht haben.
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Dann werden die Pflanzen mit einer Wirkstoffzubereitung gespritzt.
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Nach 2 Wochen wird der Schädigungsgrad der Pflanzen bonitiert in %
Schädigung im Vergleich zur Entwicklung der unbehandelten Kontrolle.
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Die Präparate gemäß den obigen Beispielen zeigen eine hohe Wirksamkeit.
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Beispiel 12 Pre-emergence-Test Lösungsmittel: 5 Gewichtsteile Aceton
Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether Wst: Wirkstoff Zur Herstellung
einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gewichtsteil Wirkstoff mit
der angegebenen Menge Lösungsmittel, gibt die angegebene Menge Emulgator zu und
verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.
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Samen der Testpflanzen werden in normalen Boden ausgesät und nach
24 Stunden mit der Wirkstoffzubereitung begossen. Dabei hält man die Wassermenge
pro Flächeneinheit zweckmäßigerweise konstant. Die Wirkstoffkonzentration in der
Zubereitung spielt keine Rolle, entscheidend ist nur die Aufwandmenge des Wirkstoffs
pro Flächeneinheit.
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Nach 3 Wochen wird der Schädigungsgrad der Pflanzen bonitiert in %
Schädigung im Vergleich zur Entwicklung der unbehandelten Kontrolle. Es bedeuten:
O % = keine Wirkung (wie unbehandelte Kontrolle) 100 % = totale Vernichtung Bei
diesem Test weist der erfindungsgemäße Wirkstoff gegenüber dem Stand der Technik
deutliche Vorteile auf.
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Beispiel 13 Post-emergence-Test Ussungamittel: 5 Gewichtsteile Aceton
Emulgator: 1 Gewichtsteil Alkylarylpolyglykolether Zur Herstellung einer zweckmäßigen
Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gewichtsteil Wirkstoff mit der angegebenen
Menge Lösungsmittel, gibt die angegebene Menge Emulgator zu und verdünnt das Konzentrat
mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.
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Mit der Wirkstoffzubereitung spritzt man Testpflanzen, weiche eine
Höe von 5 bis 15 cm haben so, daß die in der Tabelle angegebenen Wirkstoffmengen
pro Flächeneinheit ausgebracht werden. Die Konzentration der Spritzbrühe wird so
gewählt, daß in 2000 1 Wasser/ha die in der Tabelle angegebenen wirkstoffmenge ausgebracht
werden Nach 3 Wochen wird der Schãdigungsgrad der Pflanzen bonitiert in % Schädigung
im Vergleich zur Entwicklung der unbehandelten Kontrolle. Es bedeuten: 0 z - keine
Wirkung (wie unbehandelte Kontrolle) 100 % = totale Vernichtung Bei diesem Test
weist der erfindungsgemäße Wirkstoff qaelentfber dem Stand der Technik deutliche
Vorteile auf.
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