DE3910308A1 - Organisch-chemische verbindung, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als schaedlingsbekaempfungsmittel - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue organisch-chemische Verbindung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung auf mikrobiologischem Wege und ihre Verwendung als Schädlingsbekämpfungsmittel, insbesondere zur Bekämpfung von Bakterien und Schadpilzen sowie von unerwünschtem Pflanzenwachstum.

Es wurde die neue organisch-chemische Verbindung (Bezeichnung: Phomopsis-Wirkstoff) gefunden, welche wie folgt charakterisiert werden kann:

• 1. Aussehen:
  Hellgelber kristalliner Feststoff
• 2. Schmelzpunkt:
  ca. 242°C (Bestimmung nach Thiele)
• 3. Löslichkeit:
  Der Stoff ist löslich in Methanol und Ethylacetat und schwerlöslich in Wasser.
• 4. Molekulargewicht (MG): 424
  Das Massenspektrum (vgl. Fig. 1) zeigt den Molekül-Ionenpeak bei m/e 424.
  (Aus dem Spektrum ergeben sich Hinweise auf das Vorhandensein eines Aromaten sowie evtl. einer Acetylgruppe und mehrerer Methylgruppen).
• 5. UV-Spektrum (vgl. Fig. 2):
  = 215 nm, 270 nm und 342-345 nm
• 6. IR-Spektrum (vgl. Fig. 3)

Zur weiteren Charakterisierung können auch die folgenden Ergebnisse dünnschichtchromatographischer Untersuchungen herangezogen werden.

Für die Dünnschichtchromatographie wurden Kieselgelplatten verwendet. Pro Trennungsgang wurden maxinal 20 mg Substanzgemisch punktförmig (qualitativ) bzw. strichförmig (quantitativ) aufgetragen. Folgende Fließmittelsysteme kamen zum Einsatz (die Mengenverhältnisse bedeuten Volumenteile):

• F1: Toluol : Ethylacetat : Ameisensäure/70 : 30 : 1
• F2: n-Hexan : Ethylacetat : Ameisensäure/120 : 40 : 5
• F3: Toluol : Ethylacetat : Essigsäure/60 : 30 : 10
• F4: Toluol : Methanol/90 : 10
• F5: Dichlormethan : Methanol/90 : 10
• F6: Dichlormethan : Aceton/90 : 10

Die Lokalisierung der Substanzen erfolgte auf der DC-Platte:

• a) visuell nach Farbe
• b) Fluoreszenzlöschung bei 254 nm
• c) Fluoreszenz bei 366 nm und 254 nm
• d) Anfärbung mit 10% H₂SO₄ in EtoH
• e) Anfärbung mit H₂SO₄ und 1% Vanillin
• f) Anfärbung mit Anisaldehyd

Hierbei ergaben sich folgende Rf-Werte bzw. das folgende Fluoreszenzverhalten der neuen Verbindung:

Zur weiteren Charakterisierung können auch die unten angegebenen biologischen Eigenschaften sowie das Herstellungsverfahren herangezogen werden.

Weiter wurde gefunden, daß der neue Phomopsis-Wirkstoff zur Bekämpfung von Bakterien und Schadpilzen sowie von unerwünschten Pflanzenwuchs verwendet werden kann. Der neue Wirkstoff kann vorteilhaft im Pflanzenschutz, im Hygienebereich sowie im Material- und Vorratsschutz eingesetzt werden.

Man erhält den neuen Phomopsis-Wirkstoff, wenn man geeignete Mikroorganismen der Art Phomopsis viticola in üblicher Weise in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und den neuen Wirkstoff nach üblichen Methoden isoliert.

Die Erfindung betrifft auch Kulturbrühen und die aus diesen gewonnenen Extrakte und Konzentrate, welche den Phomopsis-Wirkstoff enthalten.

Bei Kenntnis der Eigenschaften der neuen Verbindung ist es mit Hilfe von üblichen chromatographischen, spektroskopischen und/oder mikrobiologischen (z. B. Hemmhoftest) Methoden leicht möglich, in Routineverfahren geeignete Mikroorganismenstämme auszusuchen, welche den erfindungsgemäßen Phomopsis-Wirkstoff produzieren.

Für die mikrobiologische Herstellung des erfindungsgemäßen Wirkstoffs werden Phomopsis viticola-Stämme eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt wird hierbei der Phomopsis viticola-Stamm F 0377 sowie die Mutanten dieses Stammes, welche die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung wesentlichen Merkmale aufweisen. Der neue Phomopsis viticola-Stamm F 0377 gehört zu den Pilzen und wurde von Rebblättern aus der Traubenzone aus Weinbergen im Anbaugebiet Rheinpfalz, Bundesrepublik Deutschland isoliert. Der neue Stamm F 0377 und seine Mutanten, welche die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung wesentlichen Merkmale aufweisen, sind Teil der vorliegenden Erfindung.

Der Phomopsis viticola-Stamm F 0377 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt.

Das erfindungsgemäße Fementationsverfahren zur Herstellung des Phomopsis-Wirkstoffes kann mit Hilfe fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien in üblicher Weise durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig-flüssige Nährmedien verwendet.

Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt nach allgemein üblichen Methoden, z. B. über Platten-, Schrägröhrchen- oder Kolbenkulturen.

Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen z. B. in Schüttelkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung im aeroben Submersverfahren in belüfteten Fermentern, z. B. in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kulturen kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.

Die Kultur kann in allen Nährmedien durchgeführt werden, welche bekannterweise zur Kultivierung von Mikroorganismen, insbesondere von Pilzen verwendet werden. Das Nährmedium muß eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, wobei diese Produkte in Form von definierten Einzelbestandteilen, aber auch in Form von komplexen Gemischen, wie sie insbesondere biologische Produkte verschiedenen Ursprungs darstellen, vorliegen können. Als Kohlenstoffquellen kommen alle üblichen Kohlenstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie Stärke oder Dextrine, Disaccharide, wie Maltose oder Rohrzucker, Monosaccharide, wie Glycose oder Xylose, Zuckeralkohole, wie Mannit oder Glycerin sowie natürlich vorkommende Gemische wie Malzextrakt, Melasse oder Molkepulver genannt. Als Stickstoffquellen kommen alle üblichen organischen und anorganischen Stickstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Eiweißstoffe, Eiweißhydrolysate, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Asparaginsäure, Arginin, Lysin, Ornithin oder Serin, Nucleosidbasen, wie Cytosin oder Uracil sowie Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, lösliche und unlösliche, pflanzliche Proteine, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Peptone und Fleischextrakt sowie Ammoniumsalze und Nitrate, z. B. NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄, NaNO₃ und KNO₃ aufgeführt. Die Mineralsalze, welche im Nährmedium enthalten sein sollten, liefern z. B. folgende Ionen:

Mg⁺⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, NH₄⁺, Cl⁻, SO₄⁻⁻, PO₄⁻⁻⁻ und NO₃⁻

sowie Ionen der üblichen Spurenelemente, wie Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co, Ni. Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bzw. das verwendete Wasser nicht ausreichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthalten, ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen. Die Zusammensetzung der Nährmedien kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammensetzung der Nährmedien werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils besonders günstig zur Verfügung stehen. Im allgemeinen enthalten die Nährlösungen vorzugsweise etwa 0,5 bis 8%, insbesondere 0,6 bis 6% Kohlenstoffquellen, vorzugsweise etwa 0,5 bis 4%, insbesondere 0,5 bis 2% Stickstoffquellen und vorzugsweise etwa 0,001 bis 0,5%, insbesondere 0,003 bis 0,3% Mineralsalze.

Als besonders geeignet kann auch ein Biomalz-Medium verwendet werden, welches beispielsweise aus 50 Gew.-% Biomalz und 50 Gew.-% Agar-Agar besteht. Besonders bevorzugt wird die Kultivierung auf Platten.

Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa 6 und etwa 8, insbesondere zwischen 6,5 und 7,5 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereichen kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO₃ vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säure, wie z. B. H₂SO₄, oder sterile Lauge, z. B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt wird.

Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemeinen üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.

Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa 15°C und etwa 40°C, vorzugsweise zwischen 18°C und 25°C liegen. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z. B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.

Es hat sich herausgestellt, daß die Menge der sich in der Kulturbrühe anreichernden erfindungsgemäßen Verbindung im allgmeinen ihr Maximum etwa 5 bis 20, vorzugsweise etwa 8 bis 15 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht. Das gewünschte Endprodukt der Fermentation kann mit Hilfe von dünnschichtchromatographischen Untersuchungen oder im Plattendiffusionstest mit einem geeigneten Pilz als Teststamm bestimmt werden.

Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren sollten Fremdinfektionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen können z. B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation verwendet werden, wobei die Temperaturen vorzugsweise bei 100°C bis 140°C, insbesondere bei 120°C bis 130°C liegen können.

Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z. B. flüssige Fette und Öle, Öl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octadecanol, Siliconöle, Polyoxyethylen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen (z. B. in Mengen bis etwa 1%) zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z. B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen Methoden isoliert werden. Die Isolierung kann z. B. gemäß den üblichen Adsorptions- und Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren erfolgen. Der isolierte Stoff kann mit Hilfe der genannten Methoden auch feingereinigt werden. Für viele Fälle ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da gegebenenfalls vorhandene geringfügige Verunreinigungen die Wirksamkeit der Verbindung nicht nachteilig beeinflussen.

Um bei den oben angegebenen Isolierungs- und Reinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung in höchster Konzentration bzw. Reinheit vorliegt, können die üblichen physikalisch-chemischen Methoden, z. B. Messen einer charakteristischen Bande im Spektrum oder der R _f -Werte, Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität usw. herangezogen werden. Besonders gut geeignet ist die Prüfung auf die botrytizide Wirkung (Botrytis cinera) im Agardiffusionstest.

Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindung kann z. B. im Falle, daß ein flüssiges wäßriges Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden:
Nach seiner Anreicherung im Kulturüberstand werden gewünschtenfalls Kulturfiltrat und Mycel mit üblichen Methoden separiert (z. B. Zentrifugation).

Aus dem Kulturgut oder dem Kulturfiltrat kann die erfindungsgemäße Verbindung mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchgeführt werden.

Als Adsorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, z. B. acetyliertes Polyamid, Dextrangele oder modifizierte Dextrangele. Als Laufmittel können die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung löslich ist. Bevorzugt werden Methanol, Ethylacetat, Toluol, Ameisensäure, Hexan, Dichlormethan bzw. entsprechende Lösungsmittelgemische eingesetzt.

Bevorzugt werden zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindung Chromatographieverfahren verwendet, z. B. unspezifische Adsorption an Sorbentien wie Kieselgel, Ionenaustauschchromatographie oder Geldiffusionschromatographie bzw. Gelfiltrationschromatographie. Dies sind die von der Reinigung wasserlöslicher, geladener Naturstoffe her bekannten Methoden.

Aus ihren Lösungen kann die erfindungsgemäße Verbindung nach den üblichen Methoden, z. B. Verdampfen des Lösungsmittels, Gefriertrocknung usw. erhalten werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kulturgut (vorzugsweise Biomalzagar) mit einem polaren organischen Lösungsmittel, in dem sich der Phomopsis-Wirkstoff leicht löst (vorzugsweise Ethylacetat) extrahiert. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wird ein Rohprodukt erhalten, das an Kieselgel (Laufmittel Hexan : Dichlormethan (50 : 50 Vol.- )) chromatographiert wird. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden über Hemmhoftest (z. B. mit Cladosporium cladosporioides, Penicillium expansum oder Botrytis cinera oder über die Spektren der Inhaltsstoffe ermittelt. Aus diesem aufgereinigten Rohprodukt wird durch weitere Chromatographie (vorzugsweise durch Gelchromatographie an einem Cellulose-Derivat, besonders bevorzugt Sephadex (WZ) LH 20, Laufmittel Methanol) ein angereichertes Produkt erhalten. Dieses kann, falls gewünscht, chromatographisch weiter gereinigt werden.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff weist eine stark mikrobizide Wirkung auf und kann zur Bekämpfung von unerwünschten Mikroorganismen, insbesondere Pilzen eingesetzt werden. Der Wirkstoff kann vorzugsweise zur Bekämpfung von unerwünschten Mikroorganismen in den Bereichen Pflanzenschutz, Vorratsschutz und Materialschutz eingesetzt werden. Der Wirkstoff ist insbesondere für den Gebrauch als Pflanzenschutzmittel geeignet, wobei der Einsatz als Fungizid bevorzugt wird.

Fungizide Mittel im Pflanzenschutz werden eingesetzt zur Bekämpfung von Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes.

Bakterizide Mittel werden im Pflanzenschutz zur Bekämpfung von Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae und Streptomycetaceae eingesetzt.

Beispielhaft, aber nicht begrenzend seien einige Erreger von pilzlichen und bakteriellen Erkrankungen, die unter die oben aufgezählten Oberbegriffe fallen, genannt:

Xanthomonas-Arten, wie beispielsweise Xanthomonas campestris pv. oryzae;
Pseudomonas-Arten, wie beispielsweise Pseudomonas syringae pv. lachrymans;
Erwinia-Arten, wie beispielsweise Erwinia amylovora;
Pythium-Arten, wie beispielsweise Pythium ultimum;
Phytophthora-Arten, wie beispielsweise Phytophthora infestans;
Pseudoperonospora-Arten, wie beispielsweise Pseudoperonospora humuli oder Pseudoperonospora cubensis;
Plasmopora-Arten, wie beispielsweise Plasmopora viticola;
Peronospora-Arten, wie beispielsweise Peronospora pisi oder P. brassicae;
Erysiphe-Arten, wie beispielsweise Erysiphe graminis;
Sphaerotheca-Arten, wie beispielsweise Sphaerotheca fuliginea;
Podosphaera-Arten, wie beispielsweise Podosphaera leucotricha;
Venturia-Arten, wie beispielsweise Venturia inaequalis;
Pyrenophora-Arten, wie beispielsweise Pyrenophora teres oder P. graminea;
(Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium);
Cochliobolus-Arten, wie beispielsweise Cochliobolus sativus;
(Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium);
Uromyces-Arten, wie beispielsweise Uromyces appendiculatus;
Puccinia-Arten, wie beispielsweise Puccinia recondita;
Tilletia-Arten, wie beispielsweise Tilletia caries;
Ustilago-Arten, wie beispielsweise Ustilago nuda oder Ustilago avenae;
Pellicularia-Arten, wie beispielsweise Pellicularia sasakii;
Pyricularia-Arten, wie beispielsweise Pyricularia oryzae;
Fusarium-Arten, wie beispielsweise Fusarium culmorum;
Botrytis-Arten, wie beispielsweise Botrytis cinerea;
Septoria-Arten, wie beispielsweise Septoria nodorum;
Leptosphaeria-Arten, wie beispielsweise Leptosphaeria nodorum;
Cercospora-Arten, wie beispielsweise Cercospora canescens;
Alternaria-Arten, wie beispielsweise Alternaria brassicae;
Pseudocercosporella-Arten, wie beispielsweise Pseudocercosporella herpotrichoides.

Als gegen den erfindungsgemäßen Wirkstoff besonders empfindliche Pilze seien genannt. Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Penicillium expansum, Phomopsis viticola und Trichoderma viride genannt. Der Wirkstoff ist besonders gut auch zur Bekämpfung von Botrytis cinera (z. B. bei Weinreben) geeignet.

Die gute Pflanzenverträglichkeit des Wirkstoffs in den zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten notwendigen Konzentrationen erlaubt eine Behandlung von oberirdischen Pflanzenteilen, von Pflanz- und Saatgut, und des Bodens.

Der Phomopsis-Wirkstoff kann auch zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwachstum verwendet werden. Er kann somit als Defoliants, Desiccants, Krautabtötungsmittel und insbesondere als Unkrautvernichtungsmittel verwendet werden. Unter Unraut im weitesten Sinne sind alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, wo sie unerwünscht sind. Ob die erfindungsgemäßen Stoffe als totale oder selektive Herbizide wirken, hängt im wesentlichen von der angewendeten Menge ab.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann z. B. bei den folgenden Pflanzen verwendet werden:

Dikotyle Unkräuter der Gattungen:
Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea.

Dikotyle Kulturen der Gattungen:
Gossypium, Glycine, Beta, Daucus, Phaseolus, Pisum, Solanum, Linum, Ipomoea, Vicia, Nicotiana, Lycopersicon, Arachis, Brassica, Lactuca, Cucumis, Cucurbita.

Monokotyle Unkräuter der Gattungen:
Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristylis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.

Monokotyle Kulturen der Gattungen:
Oryza, Zea, Triticum, Hordeum, Avena, Secale, Sorghum, Panicum, Saccharum, Ananas, Asparagus, Allium.

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Wirkstoffs ist jedoch keineswegs auf diese Gattungen beschränkt, sondern erstreckt sich in gleicher Weise auch auf andere Pflanzen.

Die Verbindung eignet sich in Abhängigkeit von der Konzentration zur Totalunkrautbekämpfung z. B. auf Industrie- und Gleisanlagen und auf Wegen und Plätzen mit und ohne Baumbewuchs. Ebenso kann die Verbindung zur Unkrautbekämpfung in Dauerkulturen, z. B. Forst, Ziergehölz-, Obst-, Wein-, Citrus-, Nuß-, Bananen-, Kaffee-, Tee-, Gummi-, Ölpalm-, Kakao-, Beerenfrucht- und Hopfenanlagen und zur selektiven Unkrautbekämpfung in einjährigen Kulturen eingesetzt werden.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann als solcher oder in seinen Formulierungen auch in Mischung mit bekannten Herbiziden zur Unkrautbekämpfung Verwendung finden, wobei Fertigformulierungen oder Tankmischungen möglich sind.

Für die Mischungen kommen bekannte Herbizide wie z. B. 1-Amino-6-ethylthio-3-(2,2-dimethylpropyl)-1,3,5-tri­ azin-2,4(1H,3H)-dion oder N-(2-Benzthiazolyl)-N,N′-di­ methyl-harnstoff zur Unkrautbekämpfung in Getreide; 4- Amino-3-methyl-6-phenyl-1,2,4-triazin-5(4H)-on zur Unkrautbekämpfung in Zuckerrüben und 4-Amino-6-(1,1-di­ methylethyl)-3-methylthio-1,2,4-triazin-5(4H)-on zur Unkrautbekämpfung in Sojabohnen, in Frage. Einige Mischungen zeigen überraschenderweise auch synergistische Wirkung.

Auch eine Mischung mit anderen bekannten Wirkstoffen, wie Fungiziden, Insektiziden, Akariziden, Nematiziden, Schutzstoffen gegen Vogelfraß, Pflanzennährstoffen und Bodenstrukturverbesserungsmitteln ist möglich.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann sowohl vor als auch nach dem Auslaufen der Pflanzen appliziert werden.

Der Wirkstoff kann in übliche Formulierungen übergeführt werden, wie Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Pulver, Schäume, Pasten, Granulate, Aerosole, Feinstverkapselungen in polymeren Stoffen und in Hüllmassen für Saatgut, sowie ULV-Kalt- und Warmnebel-Formulierungen.

Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z. B. durch Vermischen des Wirkstoffs mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln, unter Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z. B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: Alkohole, wie Butanol oder Glycol sowie deren Ether und Ester, stark polare Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser; mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder Trägerstoffen sind solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasförmig sind, z. B. Aerosol-Treibgase, wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie Butan, Propan, Stickstoff und Kohlendioxid; als feste Trägerstoffe kommen in Frage: z. B. natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate; als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage: z. B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material wie Sägemehl, Kokosnußschalen, Maiskolben und Tabakstengel; als Emulgier- und/oder schaumerzeugende Mittel kommen in Frage: z. B. nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäure-Ester, Polyoxyethylen-Fettalkohol-Ether, z. B. Alkylarylpolyglykol-Ether, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate; als Dispergiermittel kommen in Frage: z. B. Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose.

Es können in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose, natürliche und synthetische pulverige, körnige oder latexförmige Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, sowie natürliche Phospholipide, wie Kephaline und Lecithine und synthetische Phospholipide. Weitere Additive können mineralische und vegetabile Öle sein.

Es können Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z. B. Eisenoxid, Titanoxid, Ferrocyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo- und Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennährstoffe wie Salze von Eisen, Mangan, Bor, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zink verwendet werden.

Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,01 und 95 Gewichtsprozent Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,05 und 90%.

Bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Schädlingsbekämpfungsmittel neben dem Phomopsis-Wirkstoff und einem oder mehreren Streckmitteln bzw. Trägerstoffen wenigstens einen oberflächenaktiven Stoff.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann in den Formulierungen in Mischung mit anderen bekannten Wirkstoffen vorliegen wie Fungizide, Insektizide, Akarizide und Herbizide sowie in Mischungen mit Düngemitteln und Wachstumsregulatoren.

Der Wirkstoff kann als solcher, in Form seiner Formulierungen oder den daraus bereiteten Anwendungsformen wie gebrauchsfertige Lösungen, Suspensionen, Spritzpulver, Pasten, lösliche Pulver, Stäubemittel und Granulate angewendet werden. Die Anwendung geschieht in üblicher Weise, z. B. durch Gießen, Verspritzen, Versprühen, Verstreuen, Verstäuben, Verschäumen, Bestreichen usw. Es ist ferner möglich, den Wirkstoff nach dem Ultra-Low-Volume-Verfahren auszubringen oder die Wirkstoffzubereitung oder den Wirkstoff selbst in den Boden zu injizieren. Es kann auch das Saatgut der Pflanzen behandelt werden.

Bei der Behandlung von Pflanzenteilen können die Wirkstoffkonzentrationen in den Anwendungsformen in einem größeren Bereich variiert werden. Sie liegen im allgemeinen zwischen 1 und 0,0001 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,5 und 0,001%.

Bei der Saatgutbehandlung werden im allgemeinen Wirkstoffmengen von 0,001 bis 50 g je Kilogramm Saatgut, vorzugsweise 0,01 bis 10 g benötigt.

Bei Behandlung des Bodens sind Wirkstoffkonzentrationen von 0,00001 bis 0,1 Gew.-%, vorzugsweise von 0,0001 bis 0,02% am Wirkungsort erforderlich.

Die biologische Wirksamkeit des Phomopsis-Wirkstoffs sei anhand der folgenden Beispiele erläutert:

A) Wirkung gegen Mikroorganismen

Zur Ermittlung der antibiotischen Aktivitäten wurde der Einfluß auf das Wachstum verschiedener Hyphomyzeten und Bakterien im Agargeldiffusionstest untersucht.

Die Bakterienplatten wurden zweischichtig angelegt, wobei die Organismen in Weichagar suspendiert ausgebracht wurden.

Die Bodenschicht der Bakterienfestplatten bestand aus 20 ml Standard I-Medium, versetzt mit 1,8% Agar, während die Weichagarschicht neben 4 ml Standard I-Medium (versetzt mit 0,6% Agar) 0,2 ml der jeweiligen exponentiell wachsenden Bakterienkultur enthielt.

Die Pilztestplatten wurden als einschichtiges Biomalzagarmedium gegossen. Zur Herstellung des Inokulums wurden die verschiedenen Pilze 10 Tage auf Biomalz-Nährboden vorkultiviert und die Sporen der Nährbodenplatten mit 0,1%iger, wäßriger Tween-80-Lösung abgeschwemmt. Um Myzelreste zu entfernen, wurde die Flüssigkeit anschließend durch ein steriles Gazetuch (Gitterweite 25 bis 30 µm) filtriert. Durch Verdünnungsschritte wurden, abhängig vom Wachstumsverhalten der Pilze, Sporenkonzentrationen von 10³ bis 10⁵ Sporen/ml eingestellt.

Im Falle von Rohextrakten bzw. gelösten Reinsubstanzen wurden die Testplatten mit Rundfilter (Durchmesser 10 mm), die mit diesen Lösungen getränkt waren, belegt.

Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Bei diesem Test können selbstverständlich auch andere üblicherweise verwendete Medien eingesetzt werden.

B) Pflanzenkeimungstest

Im Pflanzenkeimungstest wurde der Wirkstoff auf seine pflanzenwachstumshemmende (herbizide) Wirkung hin überprüft. Die nachfolgend aufgelisteten Pflanzenarten wurden eingesetzt:

Nach Aufbringen der Testsubstanz (in Methanol) auf Rundfilter (Durchmesser 10 mm) und Abdampfen des Lösungsmittels wurden diese in Kunststoffröhrchen gegeben. Auf jeden Filter wurde je nach Größe der Samen 150 bzw. 300 µl Leitungswasser pipettiert. Die Samen von Ackerwinde und Vogelmiere wurden zuvor mit einem Skalpell angeritzt. Der Kontrollansatz erfolgte entsprechend, jedoch ohne Testsubstanz.

Nach einer 4tägigen Inkubationsdauer (27°C) in wasserdampfgesättigter Atmosphäre erfolgte die Bonitur. Die Pflanzen standen 3 Tage im Dunkeln und wurden anschließend einen Tag belichtet. Bei der Auswertung wurden Keimungsrate, Sproßlänge, Schäden an Wurzel, Sproß und Blatt sowie chlorotische Symptome berücksichtigt.

Folgendes Bewertungsschema wurde dabei zugrunde gelegt:

0 = Wachstum wie Kontrollansatz
1 = Wachstum  5 bis 25% geringer als Kontrollansatz
2 = Wachstum 25 bis 50% geringer als Kontrollansatz
3 = Wachstum 50 bis 75% geringer als Kontrollansatz
4 = Wachstum 75 bis 100% geringer als Kontrollansatz
5 = gekeimt
6 = nicht gekeimt

Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Phomopsis-Wirkstoffes soll anhand der folgenden Ausführungen näher erläutert werden.

1. Kultivierung von Phomopsis viticola F 0377

Je Ansatz wurden 200 Biomalz-Agarplatten mit dem Pilz beimpft (entspricht einer Menge von etwa 3,5 l Nährmedium). Die Inkubationsdauer betrug 40 Tage und erfolgte bei 21°C, im Dunkeln.

2. Extraktion

Am Ende der Inkubationsdauer wurden die Produktionsansätze wie folgt aufgearbeitet:

Zerkleinern der bewachsenen Medien mittels Labormixer, Extraktion des Homogenisats mit Ethylacetat (6 l pro Ansatz), Einengen der organischen Extraktes im Rotationsverdampfer auf etwa 10 ml, Filtration des konzentrierten Extraktes, Einengung bis zur Trockene, Wiegen des Rohextraktes und Aufnahme in 2 bis 3 ml Methanol.

In dieser Form wurde das Rohprodukt bis zur weiteren Verwendung und bei 4°C aufbewahrt.

3. Reinigung

Das Rohprodukt wurde in methanolischer Lösung auf eine Kieselgel-60-Säule (Länge: 10 cm, Durchmesser: 0,5 cm, Korngröße: 0,063 bis 0,200 mm, Herkunft: Fa. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) gegeben. Anschließend wurden 100 ml Hexan durch die Säule geschickt und das Eluat verworfen. Dann wurde mit 100 ml Hexan/Dichlormethan (50 : 50-Vol.-Teile) eluiert. Die hierbei gewonnene Fraktion (mit Aktivität gegen Bortrytis cinera) enthielt das Rohprodukt.

Das Lösungsmittel-Gemisch wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in 1 ml Methanol aufgenommen. Die Lösung wurde auf eine Sephadex-L20-Säule (Länge: 100 cm, Durchmesser: 2 cm, Herkunft: Fa. Pharmacia, Uppsala, Schweden) gegeben und mit Methanol eluiert. Der Durchfluß betrug 1 ml/min. Die Fraktionen 50 bis 65 wurden vereinigt (sie enthielten den gegen Botrytis cinera wirksamen Stoff) und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und durch präparative Dünnschichtchromatographie weiter gereinigt (DC-Fertigplatten mit Kieselgel 60 F₂₅₄, 20 × 20 cm, Herkunft: Fa. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland). Hierzu wurde die methanolische Lösung auf die Dünnschichtplatte aufgetragen und als Laufmittel Toluol/Ethylacetat/Ameisensäure (70 : 30 : 1-Vol.-Teile) eingesetzt. Die z. B. durch Fluoreszenzlöschung erkennbaren Flecken wurden ausgekratzt, mit Methanol extrahiert, das Methanol abdestilliert und auf Botrytis cinera-Wirkung geprüft. Der Fleck, der den R _f -Wert von 0,73 aufwies, enthielt den Phomopsis-Wirkstoff.

In dem nachfolgenden Fließschema sind die verschiedenen Aufreinigungsschritte, die zur Isolierung des Phomopsis-Wirkstoffs führten, beispielhaft für einen Produktionsansatz dargestellt.

Bei 8 Ansätzen schwankte die Ausbeute an Rein-Wirkstoff zwischen 7 und 12 mg pro Ansatz.

Erläuterungen der Fig. 1 bis 3

Fig. 1: Massenspektrum mit Molekül-Ionenpeak bei m/e 424.
Hierbei bedeuten die Ordinate die relative Intensität und die Abszisse das Massen/Ladungsverhältnis (m/e-Wert). Der m/e-Wert von 424 deutet auf ein Molekulargewicht des Phomopsis-Wirkstoffes von 424.

Fig. 2: UV-Spektrum
Das Spektrum wurde bei einer Lösung des Wirkstoffs in Methanol bestimt. Die Absorptionsmaxima liegen bei 215 nm, 270 nm und 342-345 nm. Hierbei bedeuten die Ordinate die Extinktion und die Abszisse die Wellenlänge (nm).

Fig. 3: IR-Spektrum
Das IR-Spektrum wurde mit einem KBr-Preßling aufgenommen.
Hierbei bedeuten die Ordinate die Transmission in % und die Abszisse die Wellenzahl in cm⁻¹.

Im vorliegenden Text beziehen sich alle %-Angaben, die Stoffanteile betreffen, auf Gewichtsprozente, wo nichts anderes angegeben wird.

Sephadex LH 20 ist ein Polysaccharid. Sephadex ist ein Warenzeichen der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden.

Claims (8)

1. Organisch-chemische Verbindung mit folgenden Eigenschaften:

• 1. Aussehen:
  Hellgelber kristalliner Feststoff
• 2. Schmelzpunkt:
  ca. 242°C (Bestimmung nach Thiele)
• 3. Löslichkeit:
  Der Stoff ist löslich in Methanol und Ethylacetat und schwerlöslich in Wasser.
• 4. Molekulargewicht (MG): 424
  Das Massenspektrum (vgl. Fig. 1) zeigt den Molekül-Ionenpeak bei m/e 424.
  (Aus dem Spektrum ergeben sich Hinweise auf das Vorhandensein eines Aromaten sowie evtl. einer Acetylgruppe und mehrerer Methylgruppen).
• 5. UV-Spektrum (vgl. Fig. 2):
  = 215 nm, 270 nm und 342-345 nm
• 6. IR-Spektrum (vgl. Fig. 3)

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus-Stamm Phomopsis viticola F 0377 (Hinterlegungsnummer DSM 5267) oder seine Mutanten in einem Nährmedium, welches assimilierbare C- und N-Quellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die gewünschte Verbindung nach üblichen Methoden isoliert.

3. Organisch-chemische Verbindung gemäß Anspruch 1, erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2.

4. Schädlingsbekämpfungsmittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 und 3.

5. Verwendung der Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 und 3 zur Schädlingsbekämpfung.

6. Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 und 3 auf die Schädlinge oder ihren Lebensraum einwirken läßt.

7. Verfahren zur Herstellung von Schädlingsbekämpfungsmitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 und 3 mit Streckmitteln und/oder oberflächenaktiven Mitteln vermischt.

8. Phomopsis viticola-Stamm F 0377 (Hinterlegungsnummer DSM 5267) und seine Mutanten.