DE3834662A1 - Chlorocyclohexenonylalanin-derivat, ein verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als mikrobizid - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Chlorocyclohexenonylalanin-Derivat, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Mikrobizid und Schädlingsbekämpfungsmittel, insbesondere zur Bekämpfung von Bakterien und Schadpilzen.

Es wurde das neue Chlorocyclohexenonylalanin-Derivat der Formel (I)

gefunden.

Weiter wurde gefunden, daß das neue Chlorocyclohexenonylalanin-Derivat der Formel (I) zur Bekämpfung von Bakterien und Schadpilzen verwendet werden kann. Das erfindungsgemäße Chlorocyclohexenonylalanin-Derivat kann vorteilhaft im Pflanzenschutz, im Hygienebereich und in der Tierzucht und Tierhaltung eingesetzt werden.

Man erhält das neue Chlorocyclohexenonylalanin-Derivat der Formel (I)
wenn man geeignete Mikroorganismen der Familie Bacillaceae, vorzugsweise aus der Gattung Bacillus, in üblicher Weise in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und das Produkt der Formel (I) nach üblichen Methoden isoliert.

Die Erfindung betrifft auch Kulturbrühen und die aus diesen gewonnenen Extrakte und Konzentrate, welche die Verbindung der Formel (I) enthalten.

Bei Kenntnis der Eigenschaften der neuen Verbindung der Formel (I) ist es mit Hilfe von üblichen chromatograpischen, spektroskopischen und/oder mikrobiologischen (z. B. Hemmhoftest) Methoden leicht möglich, in Routineverfahren geeignete Mikroorganismenstämme auszusuchen, welche die erfindungsgemäße Verbindung der Formel (I) produzieren.

Für die mikrobiologische Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung der Formel (I) werden vorzugsweise Bacillus-subtilis-Stämme eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt werden hierbei die plasmidhaltigen Stämme BGSC 1E2 und IFO 3022 sowie die Varianten und Mutanten dieser Stämme wie auch die das Plasmid aus BGSC 1E2 und IFO 3022 enthaltenden Stämme anderer zur Produktion der Verbindung (I) geeignete Mikroorganismen, welche die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung wesentlichen Merkmale aufweisen.

Die Bacillus subtilis Stämme BGSC 1E2 und IFO 3022 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Bundesrepubik Deutschland, hinterlegt.

Das erfindungsgemäße Fermentationsverfahren kann mit Hilfe fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien durchgeführt werden. Bevorzugt werden wäßrig-flüssige Nährmedien verwendet.

Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt nach allgemein üblichen Methoden, z. B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.

Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen z. B. in Schüttelkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung im aeroben Submersverfahren in belüfteten Fermentern, z. B. in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kulturen kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird diskontinuierlich gearbeitet.

Die Kultur kann in allen Nährmedien durchgeführt werden, welche bekannterweise zur Kultivierung von Mikroorganismen der Familie Bacillaceae verwendet werden. Das Nährmedium muß eine oder mehrere assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten, wobei diese Produkte in Form von definierten Einzelbestandteilen, aber auch in Form von komplexen Gemischen, wie sie insbesondere biologische Produkte verschiedenen Ursprungs darstellen, vorliegen können. Als Kohlenstoffquellen kommen alle üblichen Kohlenstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie Stärke oder Dextrine, Disaccharide, wie Maltose oder Rohrzucker, Monosaccharide, wie Glycose oder Xylose, Zuckeralkohole, wie Mannit oder Glycerin sowie natürlich vorkommende Gemische wie Malzextrakt, Melasse oder Molkepulver genannt. Als Stickstoffquellen kommen alle üblichen organischen und anorganischen Stickstoffquellen in Frage. Beispielsweise seien Eiweißstoffe, Eiweißhydrolysate, Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Asparaginsäure, Arginin, Lysin, Ornithin oder Serin, Nucleosidbasen, wie Cytosin oder Uracil sowie Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, lösliche und unlösliche pflanzliche Proteine, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Peptone und Fleischextrakt sowie Ammoniumsalze und Nitrate, z. B. NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄, NaNO₃ und KNO₃ aufgeführt. Die Mineralsalze, welche im Nährmedium enthalten sein sollten, liefern z. B. folgende Ionen:

Mg⁺⁺, Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, NH₄⁺, Cl^-, SO₄^--, PO₄^--- und NO₃^-

sowie Ionen der üblichen Spurenelemente, wie Cu, Fe, Mn, Mo, Zn, Co, Ni. Falls die Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen bzw. das verwendete Wasser nicht ausreichend diese Salze bzw. Spurenelemente enthalten, ist es zweckmäßig, das Nährmedium entsprechend zu ergänzen. Die Zusammensetzung der Nährmedien kann in weiten Bereichen variiert werden. Art und Zusammensetzung der Nährmedien werden im allgemeinen davon abhängig sein, welche Bestandteile jeweils besonders günstig zur Verfügung stehen. Im allgemeinen enthalten die Nährlösungen vorzugsweise etwa 0,5 bis 8%, insbesondere 0,6 bis 6% Kohlenstoffquellen, vorzugsweise etwa 0,5 bis 4%, insbesondere 0,5 bis 2% Stickstoffquellen und vorzugsweise etwa 0,001 bis 0,5%, insbesondere 0,003 bis 0,3% Mineralsalze.

Als besonders bevorzugt seien die folgenden Nährmedien 1 und 2 aufgeführt:

Nährmedium 1: "Komplexes Kulturmedium" (ACM)

70,0 g Mannit, 11,7 g Citronensäurehydrat, 4,0 g Na₂SO₄, 5,0 g Hefeextrakt, 4,2 g Ammoniumsulfat, 0,76 g KCl, 0,42 g MgCl₂×6 H₂O, 10,4 mg ZnCl₂, 24,5 mg FeCl₃×6 H₂O, 18,1 ml MnCl₂×4 H₂O, 1000 ml entionisiertes Wasser pH 6,8 bis 6,9 (mit Ammoniak eingestellt).

Nährmedium 2: "Definiertes Kulturmedium" (P1)

20,0 g Mannit, 5,0 g Glutaminsäure, 1,0 g Asparagin, 1,0 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄×7 H₂O, 0,5 g KCl, 0,15 mg FeSO₄×7 H₂O, 0,16 mg CnSO₄×5 H₂O, 5,0 mg MnSO₄×H₂O.

Der pH-Wert der wachsenden Kulturen sollte vorzugsweise zwischen etwa 4 und etwa 8, insbesondere zwischen 4,5 und 7,0 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereichen kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO₃ vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säure, z. B. H₂SO₄, oder sterile Lauge, z. B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt wird.

Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit Sauerstoff sowie den Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.

Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa 15°C und etwa 40°C, vorzugsweise zwischen 20°C und 35°C liegen. Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z. B. die Zusammensetzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikrobiologischen Gebiet leicht festgelegt werden.

Es hat sich herausgestellt, daß die Menge der sich in der Kulturbrühe anreichernden erfindungsgemäßen Verbindung im allgemeinen ihr Maximum etwa 1 bis 10, vorzugsweise etwa 2 bis 7 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht. Das gewünschte Endprodukt der Fermentation kann mit Hilfe von dünnschichtchromatographischen Untersuchungen oder im Plattendiffusionstest mit einem geeigneten Pilz als Teststamm bestimmt werden.

Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren sollten Fremdinfektionen der Kulturmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen, wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung notwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtungen können z. B. die Dampf- als auch die Trockensterilisation verwendet werden, wobei die Temperaturen vorzugsweise bei 100°C bis 140°C, insbesondere bei 120°C bis 130°C liegen können.

Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z. B. flüssige Fette und Öle, Öl-Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octadecanol, Siliconöle, Polyoxyethylen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen (z. B. in Mengen bis etwa 1%) zugesetzt werden. Schaum kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z. B. Zentrifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung der Formel (I) kann aus dem Kulturmedium nach allgemein üblichen physikalisch-chemischen Methoden isoliert werden. Die Isolierung kann z. B. gemäß den üblichen Adsorptions- und Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren erfolgen. Der isolierte Stoff kann mit Hilfe der genannten Methoden auch feingereinigt werden. Für viele Fälle ist jedoch eine Feinreinigung nicht erforderlich, da gegebenenfalls vorhandene geringfügige Verunreinigungen die Wirksamkeit der Verbindung nicht nachteilig beeinflußt.

Um bei den oben angegebenen Isolierungs- und Reinigungsmethoden die Fraktionen herauszufinden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung in höchster Konzentration bzw. Reinheit vorliegt, können die üblichen physikalisch-chemischen Methoden, z. B. Messen einer chrakteristischen Bande im Spektrum oder der R _f -Werte, Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität usw. herangezogen werden. Diese Methoden können auch verwendet werden, um in Routineverfahren geeignete Mikroorganismen aufzufinden.

Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindung kann z. B. im Falle, daß ein flüssiges wäßriges Nährmedium verwendet wird, wie folgt vorgenommen werden:

Nach seiner Anreicherung im Kulturüberstand werden Kulturfiltrat und Mycel mit üblichen Methoden separiert (z. B. Zentrifugation).

Aus dem Kulturfiltrat kann die erfindungsgemäße Verbindung mit Hilfe von üblichen Extraktionsverfahren, Fällungsverfahren und/oder Chromatographieverfahren isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchgeführt werden.

Als Adsorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z. B. Aluminiumoxid, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze wie Polyamide, z. B. acetyliertes Polyamid, Dextrangele oder modifizierte Dextrangele. Als Laufmittel können die verschiedensten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische verwendet werden, in welchen die erfindungsgemäße Verbindung löslich ist. Bevorzugt werden Wasser, Ammoniaklösung und Methanol oder Lösungsmittelgemische (beispielsweise Gemische aus Chloroform, Methanol und wäßrigem Ammoniak oder Methanol und Wasser) eingesetzt.

Bevorzugt werden zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindung Chromatographie-Verfahren verwendet, z. B. unspezifische Adsorption an Sorbentien wie Kieselgel, Ionenaustauschchromatographie oder Geldiffusionschromatographie bzw. Gelfiltrationschromatographie. Dies sind die von der Reinigung wasserlöslicher, geladener Naturstoffe her bekannten Methoden.

Aus ihren Lösungen kann die erfindungsgemäße Verbindung nach den üblichen Methoden, z. B. Verdampfen des Lösungsmittels, Gefriertrocknung usw. erhalten werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird aus dem bei der aeroben Kultur der Stämme bei 20°C bis 35°C erhaltenen Fermentationsgut (Kulturbrühe und Mycel) durch Zentrifugation das Kulturfiltrat gewonnen.

Der neue Stoff kann aus dem Kulturfiltrat durch Adsorption an Aktivkohle bzw. an geeignete Harze isoliert werden. Als ökonomischste Methode erwies sich die Bindung des erfindungsgemäßen Stoffes an unspezifische Adsorberharze an Polystyrolbasis (z. B. Amberlite XAD oder Lewatit OC 1031). Die Desorption des erfindungsgemäßen Stoffes wird fraktioniert, durch organische Lösungsmittel oder Mischungen aus Wasser und organischen Lösungsmitteln, insbesondere Wasser/Aceton, Wasser/Methanol oder Wasser/Ethanol vorgenommen.

Das gegebenenfalls zusätzlich über Adsorption/Desorption an Aktivkohle gereinigte Eluat wird eingeengt, gegebenenfalls lyophilisiert und gegebenenfalls weiteren, vorzugsweise gelchromatographischen Reinigungsprozessen (z. B. an Sephadex) unterzogen. Die Endreinigung erfolgt vorzugsweise durch Chromatographie an Cellulose.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein komplexes Nährmedium mit einer Sporensuspension des zur Produktion verwendeten Stammes beimpft und bei etwa 27°C für etwa 84 Stunden inkubiert. Die Kulturbrühe wird auf pH 5 eingestellt und die Bakterien mit einer Zentrifuge abgetrennt. Gegebenenfalls nach einer adsorptiven Abtrennung von Verunreinigungen, vorzugsweise mit Hilfe eines Adsorberharzes, wird die Flüssigkeit durch Destillation unter verminderten Druck eingeengt (vorzugsweise auf etwa 1/10 bis 1/20 des ursprünglichen Volumens). Durch Zugabe eines Alkohols (vorzugsweise Ethanol) werden unerwünschte Bestandteile ausgefällt. Durch Destillation unter vermindertem Druck wird aufkonzentriert und der Rückstand in Wasser gelöst. Zur Adsorption des gewünschten Produktes wird die Lösung mit Aktivkohle behandelt. Aus der Aktivkohle wird das Produkt mit einem Lösungsmittel, vorzugsweise Aceton, eluiert. Das Lösungsmittel wir entfernt, das Produkt lypophilisiert und in üblicher Weise chromatographisch weiter gereinigt.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff weist eine stark mikrobizide Wirkung auf und kann zur Bekämpfung von unerwünschten Mikroorganismen praktisch eingesetzt werden. Der Wirkstoff kann vorzugsweise zur Bekämpfung von unerwünschten Mikroorganismen in den Bereichen Pflanzenschutz, Vorratsschutz und Materialschutz eingesetzt werden. Der Wirkstoff ist insbesondere für den Gebrauch als Pflanzenschutzmittel geeignet, wobei der Einsatz als Fungizid bevorzugt wird.

Fungizide Mittel im Pflanzenschutz werden eingesetzt zur Bekämpfung von Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes.

Bakterizide Mittel werden im Pflanzenschutz zur Bekämpfung von Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae und Streptomycetaceae eingesetzt.

Beispielhaft aber nicht begrenzend seien einige Erreger von pilzlichen und bakteriellen Erkrankungen, die unter die oben aufgezählten Oberbegriffe fallen, genannt:
Xanthomonas-Arten, wie beispielsweise Xanthomonas campestris pv. oryzae;
Pseudomonas-Arten, wie beispielsweise Pseudomonas syringae pv. lachrymans;
Erwinia-Arten, wie beispielsweise Erwinia amylovora;
Pythium-Arten, wie beispielsweise Pythium ultimum;
Phytophthora-Arten, wie beispielsweise Phytophthora infestans;
Pseudoperonospora-Arten, wie beispielsweise Pseudoperonospora numuli oder Pseudoperonospora cubensis;
Plasmopara-Arten, wie beispielsweise Plasmopara viticola;
Peronospora-Arten, wie beispielsweise Peronospora pisi oder P. brassicae;
Erysiphe-Arten, wie beispielsweise Erysiphe graminis;
Sphaerotheca-Arten, wie beispielsweise Sphaerotheca fuliginea;
Podosphaera-Arten, wie beispielsweise Podosphaera leucotricha;
Venturia-Arten, wie beispielsweise Venturia inaequalis;
Pyrenophora-Arten, wie beispielsweise Pyrenophora teres oder P. graminea
(Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium);
Cochliobolus-Arten, wie beispielsweise Cochliobolus sativus
(Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium);
Uromyces-Arten, wie beispielsweise Uromyces appendiculatus;
Puccinia-Arten, wie beispielsweise Puccinia recondita;
Tilletia-Arten, wie beispielsweise Tilletia caries;
Ustilago-Arten, wie beispielsweise Ustilago nuda oder Ustilago avenae;
Pellicularia-Arten, wie beispielsweise Pellicularia sasakii;
Pyricularia-Arten, wie beispielsweise Pyricularia oryzae;
Fusarium-Arten, wie beispielsweise Fusarium culmorum;
Botrytis-Arten, wie beispielsweise Botrytis cinerea;
Septoria-Arten, wie beispielsweise Septoria nodorum;
Leptosphaeria-Arten, wie beispielsweise Leptosphaeria nodorum;
Cercospora-Arten, wie beispielsweise Cercospora canescens;
Alternaria-Arten, wie beispielsweise Alternaria brassicae;
Pseudocercosporella-Arten, wie beispielsweise Pseudocercosporella herpotrichoides.

Als gegen den erfindungsgemäßen Wirkstoff besonders empfindliche Pilze seien Aspergillus fumigatus, Candida albicans und Paecilomyces variotii genannt.

Die gute Pflanzenverträglichkeit des Wirkstoffs in den zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten notwendigen Konzentrationen erlaubt eine Behandlung von oberirdischen Pflanzenteilen, von Pflanz- und Saatgut, und des Bodens.

Der Wirkstoff kann in übliche Formulierungen übergeführt werden, wie Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Pulver, Schäume, Pasten, Granulate, Aerosole, Feinstverkapselungen in polymeren Stoffen und in Hüllmassen für Saatgut, sowie ULV-Kalt- und Warmnebel-Formulierungen.

Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z. B. durch Vermischen des Wirkstoffs mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln, unter Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z. B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: Alkohole, wie Butanol oder Glycol sowie deren Ether und Ester, stark polare Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser; mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder Trägerstoffen sind solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasförmig sind, z. B. Aerosol-Treibgase, wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie Butan, Propan, Stickstoff und Kohlendioxid; als feste Trägerstoffe kommen in Frage: z. B. natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate; als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage: z. B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material wie Sägemehl, Kokosnußschalen, Maiskolben und Tabakstengel; als Emulgier- und/oder schaumerzeugende Mittel kommen in Frage: z. B. nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäure-Ester, Polyoxyethylen-Fettalkohol-Ether, z. B. Alkylarylpolyglykol-Ether, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate; als Dispergiermittel kommen in Frage: z. B. Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose.

Es können in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose, natürliche und synthetische pulverige, körnige oder latexförmige Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, sowie natürliche Phospholipide, wie Kephaline und Lecithine, und synthetische Phospholipide. Weitere Additive können mineralische und vegetabile Öle sein.

Es können Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z. B. Eisenoxid, Titanoxid, Ferrocyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo- und Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennährstoffe wie Salze von Eisen, Mangan, Bor, Kupfer, Koblat, Molybdän und Zink verwendet werden.

Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gewichtsprozent Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90%.

Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann in den Formulierungen in Mischung mit anderen bekannten Wirkstoffen vorliegen wie Fungizide, Insektizide, Akarizide und Herbizide sowie in Mischungen mit Düngemitteln und Wachstumsregulatoren.

Der Wirkstoff kann als solcher, in Form seiner Formulierungen oder den daraus bereiteten Anwendungsformen wie gebrauchsfertige Lösungen, Suspensionen, Spritzpulver, Pasten, lösliche Pulver, Stäubemittel und Granulate angewendet werden. Die Anwendung geschieht in üblicher Weise, z. B. durch Gießen, Verspritzen, Versprühen, Verstreuen, Verstäuben, Verschäumen, Bestreichen usw. Es ist ferner möglich, den Wirkstoff nach dem Ultra-Low- Volume-Verfahren auszubringen oder die Wirkstoffzubereitung oder den Wirkstoff selbst in den Boden zu injizieren. Es kann auch das Saatgut der Pflanzen behandelt werden.

Bei der Behandlung von Pflanzenteilen können die Wirkstoffkonzentrationen in den Anwendungsformen in einem größeren Bereich variiert werden. Sie liegen im allgemeinen zwischen 1 und 0,0001 Gew.-%, vorzugsweise zwischen 0,5 und 0,001%.

Bei der Saatgutbehandlung werden im allgemeinen Wirkstoffmengen von 0,001 bis 50 g je Kilogramm Saatgut, vorzugsweise 0,01 bis 10 g benötigt.

Bei Behandlung des Bodens sind Wirkstoffkonzentrationen von 0,00001 bis 0,1 Gew.-%, vorzugsweise von 0,0001 bis 0,02% am Wirkungsort erforderlich.

Herstellungsbeispiele Beispiel 1

500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit seitlichem Einstich werden jeweils mit 100 ml des oben angegebenen Nährmediums 1 beschickt, mit 0,4 ml Sporensuspension des Bacillus-subtilis- Stammes BGSC 1E2 beimpft und auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 120 rpm und 27°C ca. 84 Stunden inkubiert.

Aufarbeitung im 5-l-Maßstab:

• A) 5 l der Kulturbrühe werden mit 5 N HCl auf pH 5 eingestellt. Nach Zentrifugation bei 10 000 g wird das Sediment verworfen. Der Überstand wird über eine Amberlite XAD-16-Säule (Volumen: 1 Liter) geleitet und am Rotationsverdampfer bei 50°C auf ca. 300 ml aufkonzentriert. Durch Zugabe von Ethanol bis zu einer Konzentration von 70% Ethanol und Abkühlen auf 4°C wird eine Fällung durchgeführt. Nach Zentrifugation bei 10 000 g wird der (I) enthaltene Überstand aufbewahrt, das Sediment mit 70%igem Ethanol gewaschen, wiederum von der (I) enthaltenden Waschlösung getrennt und anschließend verworfen. Die vereinigten (I) enthaltenden Überstände werden nach Filtration über Celite (Kieselgur) unter obengenannten Bedingungen wieder aufkonzentriert.
• B) Das das Produkt der Formel (I) enthaltende Konzentrat wird in 500 ml Wasser gelöst und viermal mit je 100 g Aktivkohle gerührt. Die Aktivkohle wird dreimal mit Wasser gewaschen und das Produkt wird viermal mit 2 Liter 50%igem Aceton eluiert. Das Eluat wird bei ca. 50°C zur Trockene am Rotationsverdampfer eingeengt und lyophilisiert.
• C) Das Lyophilisat wird in 50 ml Wasser aufgenommen und über eine Sephadex CM-25-Säule (Länge: 60 cm, Dicke: 5,9 cm, Fließgeschwindigkeit 30 ml/h) in einzelnen Fraktionen aufgetrennt. Als Fließmittel wird hierbei 50 mM Natriumacetat Puffer (pH 5) verwendet. Die vereinigten (I) enthaltenden Fraktionen werden anschließend lyophilisiert.
• D) Das Lyophilisat wird in einem geringen Volumina von 40%igem 1-Propanol aufgenommen. Über eine Ausschlußchromatographie an Sephadex G-10 (Länge: 90 cm, d: 49 mm, v: 30 ml/h) mit 40%igem 1-Propanol als Fließmittel werden das Produkt (I) und eine weitere mikrobiell aktive Komponente gemeinsam eluiert. Die vereinigten, das Produkt (I) enthaltenden Fraktionen werden lyophilisiert und eine weitere Ausschlußchromatographie an Sephadex G-10 unter gleichen Bedingungen, jedoch mit 5% Methanol in Wasser als Fließmittel durchgeführt, wobei (I) gegenüber der zweiten aktiven Komponente zuerst eluiert wird.
• E) Die vereinigten (I) enthaltenden und aufkonzentrierten Fraktionen werden zur Endreinigung in 2 ml eines Gemisches 1-Butanol-1-Propanol-Wasser (6 : 2 : 2/vvv) aufgenommen und abschließend über Cellulose (Aricel der Fa. Merck) mit dem gleichen Gemisch als Fließmittel chromatographiert (l: 70 cm, d: 28 mm, v: 15 ml/h). Die nur (I) enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingeengt.
• Ausbeute 5 mg (I)/l Kulturbrühe.

Analysendaten von (I), welche auch zur Charakterisierung der Verbindung geeignet sind:

¹H-NMR[a]:
Alanin: 4.11 (H-2), 1.58 (H-3)
CCAla: 4.29 (H-2), 1.99 (H-3), 7.29 (H-2′), 2.60 (H _a -5′), 2.74 (H _e -5′), 1.85 (H _a -6′), 2.22 (H _e -6′)

¹³C-NMR[a]:
Alanin: 172.8 (C-1), 51.6 (C-12), 19.0 (C-3)
CCAla: 180.6 (C-1), 55.7 (C-2), 38.1 (C-3), 37.3 (C-1′), 156.3 (C-2′), 132.9 (C-3′), 198.8 (C-4′), 38.8 (C-5′), 29.4 (C-6′)

UV:
in H₂O (pH 5.7): λ _max =249 nm (ε =7050), c=10^-4 Mol/l

R _f [b]:
0.47 n-Propanol/Wasser (70 : 30)
0.75 n-Propanol/Pyridin/Eisessig/Wasser (15 : 10 : 3 : 12)

FD-MS:
289/291 [M+H]⁺, 253 [M-HCl]⁺

GC-MS:
N-Tfa-dipeptidmethylester: 363 (M-Cl)⁺, 256, 230/232, 224, 214/216, 140/141

CD[c]:
Maxima: 245 nm ([0]) _M =+23 200), 312 nm ([0]) _m =-1475) in H₂O (pH 5,7), c=5×10^-3 Mol/l

[a] Signal H-1′ verdeckt von Signal H _e -5′; Bruker WM 400 (in D₂O, pH 5,5, 18 mg/0,5 ml;
[b] Kieselgel 60 F₂₅₄;
[c] [Theta] _M in [grad · cm2 · dmol^-1].

Ausgangsmaterial (Ausgangsstamm)

Bacillus subtilis BGSC 1E2 ist ein Derivat von Bacillus subtilis 168, das mit dem Plasmid pLS 11 aus Bacillus subtilis IFO 3022 transformiert wurde.

Wirkung der Verbindung (I) auf Mikroorganismen

Die Empfindlichkeit verschiedener Bakterien und Pilze gegen die Verbindung (Ia) wurde im Plattendiffusionstest bestimmt. Die minimale Hemmkonzentration wurde durch Extrapolation des Hemmhof-Durchmessers auf den Durchmesser der Filterrondellen kalkuliert.

Die Einteilung der Tabelle und die verwendeten Abkürzungen sind nachstehend erläutert:

• (A) Artname und Nährboden:
  MB=Minimalmedium
  MA=Malzagar
  NA=Fleischextrakt-Pepton-Agar
• (B) Hemmhofdurchmesser in mm beim Auftrag der angegebenen Menge in µg auf die Rondelle
• (C) Minimale Hemmkonzentration (MIC)
• (D) Hemmhoftyp:
  n=nicht oder sehr schwach bewachsen
  B=bewachsen
  BB=stark bewachsen

Tabelle: Wirkung von (I) auf Mikroorganismen

Im vorstehenden Text bedeuten Mengenangaben, wo nichts anderes angegeben wird, Volumenteile. Prozentangaben beziehen sich auf Gewichtsprozente.

Erläuterung einiger verwendeter Produktnamen:
AMBERLITE XAD 16 (Warenzeichen der Fa. Rohm und Haas, Philadelphia, USA)
ist ein unspezifisches hydrophobes Absorberharz auf Polystyrolbasis.
SEPHADEX (Warenzeichen der Fa. Pharmacia, Uppsala, Schweden)
ist ein Polysaccharid.
CM SEPHADEX (Warenzeichen der Fa. Pharmacia, Uppsala, Schweden)
ist ein carboxymethyliertes Polysaccharid.
LEWATIT OC 1031 (Warenzeichen der Fa. Bayer AG, Leverkusen, Bundesrepublik Deutschland)
ist ein unspezifisches hydrophobes Absorberharz auf Polystyrolbasis.

Claims (6)

1. Chlorocyclohexenonylalanin-Derivat der Formel (I)

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens einen der Mikroorganismus-Stämme Bacillus subtilus BGSC 1E2 und IFO 3022 oder seine Mutanten und Varianten in einem Nährmedium, welches assimilierbare C- und N-Quellen sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die Verbindung der Formel (I) nach üblichen Methoden isoliert.

3. Mikrobizide Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1.

4. Verwendung der Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 zur Bekämpfung von Mikroben.

5. Verfahren zur Bekämpfung von Mikroben, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 die Mikroben oder ihren Lebensraum einwirken läßt.

6. Verfahren zur Herstellung von mikrobiziden Mitteln, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1 mit Streckmitteln und oder oberflächenaktiven Mitteln vermischt.