PT93104A - Processo para a preparacao de metotrexato fixado a polimeros - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIEN-GESELLSCHAFT, alema, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alema, (inventores: Dr. Hubert Bader, Dr. Michael Magerstádt, Prof. Dr. Merten Schlingmann, Dr. Axel Walch,

Dr. Thomas Gronau, Dr. Dieter Hoffmann, Dr. Hans-Peter Krae-mer e Dr. Hans-Harald SedlaceK, residentes na Alemanha Ocidental), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MET0TREXAT0 FIXA DO A POLÍMEROS".

DESCRIÇÃO

Por todo o mundo efectuam-se, desde há alguns anos, trabalhos de investigação para o desenvolvimento de polímeros farmacologicamente activos, especialmente também de agentes antitumóricos polimlricos (US 4460560, US 4551502, EP 0040506, W0 875031, DE 3515178, BE 902344 e EP 0111388).

Um objectivo fundamental, neste caso, é a preparaçao de meios citoestáticos com acções colaterais reduzidas ou eliminadas, e amplitude terapêutica aperfeiçoada. 0s problemas dos agentes citoestáticos anteriormente utilizados clinicamente têm menos a ver com uma citotoxicidade insuficiente, mas pelo contrário estão associados mais a uma redu_ zida selectividade. Isto significa que a maior parte dos compostos fortemente citotóxicos nao actuam somente nas células 1 r

de tumores mas também em células sãs do corpo, e, em muitos casos, também ainda mais fortemente em orgãos individuais.

Seria pois desejável uma forma farma_ ceutica na qual se pudesse alcançar e manter, durante períodos de tempo mais longos, um nível do agente citoestatico no sangue que se situasse no intervalo de amplitude terapêutica, is. to é, intensificado com as células de tumores, mas que nao se 4f ja prejudicial às células sas do corpo, ou o seja o mínimo possível, para se conseguir uma elevada toxidade ao tumor, a par de uma reduzida toxicidade global, com doses do agente quimioterapeutico que globalmente sejam o mais reduzidas possível .

Até agora foram seguidos diversos de^ senvolvimentos: -polímeros como agentes citoestaticos (polia-nioes, como copolímeros de pirano, polivinilsulfonatos, etc.) que devem possuir por si próprios acçao inibidora de tumores. Inconvenientes mais frequentes: acçoes colaterais toxicas e limites estreitos do intervalo de pesos moleculares (nefroto-xicidade PM 50 KD). -Polímeros com acçao citoestática nos quais os componentes do "esqueleto de polímero" depois da degradação apresentam uma determinada eficácia. Inconvenientes mais frequentes: escolha limitada dos componentes de polímero, imunogenidade, acçoes colaterais dos polímeros e sobretudo a insolubilidade dos pro_ dutos em água (J 58174409, DE 3026448, DE 3515178, DE 3026574, BE 902344 e DE 3026575). -Agentes citoestáticos fixados em polímeros nos grupos laterais amida funcionais (W0 875031, EP 0111388, DE 3539951, W0 8700056, EP 0190464, US 4551502, JP 57143325, EP 0040506 e JP 57143326). A libertação destes agentes citoestá_ ticos da sua ligação com o polímero pode realizar-se, como teoricamente, por endocitose de todo o conjugado a um pH ácido do lisosoma, todavia uma endocitose só tem lugar de forma muito limitada, como a prática mostra, mesmo para conjugações de polímeros modificadas específicas do objectivo (por exemplo conjugados de anticorpos). Para além disso, a introdução de 2

cadeias de separaçao, que frequentemente têm reduzidas densidades de carga e exigem sínteses difíceis, apresenta grandes problemas. Os resultados in vivo com estes conjugados não for_ ma pois, até ao presente, encorajadores.

Um caso particular é representado por agentes citoestaticos específicos de fase, como por exemplo o metotrexato, visto que só actuam numa determinada fase do ciclo celular (fase de síntese para o inibidor de deshidro_ folato-reductase metotrexato). Uma única aplicação frequentemente nao tem qualquer acçao anti-tumórica, no caso do período de semi-vida relativamente curto biologicamente do metotre xato. Apenas múltiplas aplicações individuais, com doses muito elevadas, apresentam um efeito terapêutico. Frequentemente é necessária uma "terapia de salvaçao" para evitar então lesõ_ es excessivas, agravadas com o tempo, nas células sãs.

Devido a estes problemas, uma forma do metotrexato fixado em polímeros reveste-se de interesse particular. Todavia, pela fixaçao do metotrexato a poli-L-li-sina, derivados de poli-lactido-glicólido (PLG), etc, (ver WO 875 031) nao foi possível até ao presente obter qualquer solu çao satisfatória.

Surpreendentemente, pela fixaçao do metotrexato a polímeros biocompatíveis transportando grupos hidroxilo, solúveis em água, obtiveram-se agora excelentes propriedades tanto in vitro como in vivo, com relevância para a terapia humana. A invenção refere-se, por consequên-?· cia, a: ls - Um metotrexato, ou derivado de metrotrexato, fixado a po_ límeros, que se caracteriza por - uma ligação éster do grupo o<-carboxilo e/ou Jf-carboxilo do metotrexato, ou do derivado de metotrexato, com grupos hidroxilo dos polímeros biocompatíveis solúveis em água;

- uma acção de prolongamento de vida de mais do que 125% em ratos, relativamente a controles nao tratados, com leucêmia L1210, para aplicaçao por uma única vez, por via intraperitoneal, de 60 mg de metotrexato, ou de derjL 3

vado de metotrexato, que está fixado no polímero acima referido, por kg de peso corporal. 2- - Um processo para a preparaçao do metotrexato fixado a po^ límeros, ou do derivado de metotrexato fixado a polímeros caracterizados no ponto 1, processo esse que se caracte-riza por se fazer reagir o metotrexato, ou o correspondeii te derivado de metotrexato, transportando grupos e/oue(-carboxilo e/ou Jf-carboxilo, na presença de reagentes de acoplamento deshidratantes, com um polímero biocompatí-vel solúvel em água transportando grupos hidroxilo. 3a - Utilização do metotrexato fixado a polímeros, ou do deri^ vado de metotrexato fixado a polímeros, caracterizados no ponto 1, como agentes terapêuticos contra tumores. A invenção será agora descrita porme^ norizadamente, especialmente nas suas formas de realizaçao preferidas. Para além disso a invenção ê definida pelo conteu do das reivindicações. 0 metotrexato, ou ácido N- [4-11(2,4--diamino-6-pteridinil)-metil] -metilamino] -benzoil]- glutâmico, é apresentado como composto, com as suas características essen ciais, no artigo de A.R. Chamberlain et al, em Analytical Pro, files of Drug Substances, vol, 5, Editor K.Florey, Academic Press, Nova Iorque (1976), págs 283-306. A preparação do composto é descrita por Seeger et al J.Am Soc 71, 1753 (1949) ou Rahmann et al, Medic. Res. Rev., 8, 95.

Como derivados, ou compostos análogos do metotrexeto podem utilizar-se compostos que foram modifica, dos no anel pteridina ou na zona das pontes, mas também compos^ tos que apresentam substituintes no anel aromático ou na fraç, ção ácido glutâmico. A condição fundamental é, todavia, que pelo menos um grupo carboxilo necessário para a ligaçao ao po^ límero permaneça intacto. Estes compostos análogos e o seu processo de preparaçao estão descritos profusamente no artigo de Rahmann et al (obra citada). Podem ser utilizados como derivados especialmente preferidos metopterina (MercK Index 10 (1983) 5860) e aminopterina (Merck Index 10 (1983) 477).

Os compostos mencionados podem ser 4

?^i<i3na!nucat4l1 fixados a polímeros que transportam grupos hidroxilo, biocom-patíveis, solúveis em água, através de uma ligação éster. Por polímeros biocompatíveis entendem-se compostos que são fisio-logicamente aceitáveis, bem como os que sao degradáveis no or_ ganismo e/ou os que podem ser eliminados. Podem ser utilizados preferivelmente polímeros nos quais a fracçao de grupos ionizáveis, antes da carga com a substância activa, se situa abai^ xo de 10% molar.

Sao utilizados de preferência amidos solúveis em água com um peso molecular médio de 100 até 200000, de preferência de 5000 a 50000, que também podem estar modificados. Além disso sao ainda utilizáveis acetato de celulose, especialmente acetato de celulose solúvel em água da firma (Celanese/WSCA), ou dextranos com um peso molecular médio compreendido entre 1000 e 200000, especialmente com um peso molecular médio situado entre os limites 40000 a 70000, ou insulina.

Também podem ter aplicaçao, analogamente, polímeros sintéticos. Um exemplo é a poli-c<,^-(hidroxi_ etil)-D,L-aspartamida de fórmula I

0

NH

CHoP 0 - NH (çh2)2 ch2oh s

I 5

na qual a relaçao de m para n está situada num intervalo de 0:1 até 1:0, de preferência 0,7:0,3 até 0,95:0,05. 0 peso mole_ cular de compostos deste tipo está compreendido entre cerca de 2000 e 100000, de preferência entre 50000 e 50000. Os correspondentes compostos e os respectivos processos de preparação foram descritos amplamente na Especificação publicada ale_ mã 3 700 128.

Um outro exemplo de um polímero sintético é a polilisina fumaramida/polilisina glutaramida com grupos amida de fórmula II 0 0 -(-NH-(CH2)4- CH - NH-C-X-C-)n-

C=0 II

NH (CH„) 0H 2 m na qual X pode representar -((^3)3 ou -CH=CH-, m pode representar os números 1 a 10, de preferência 2, e n pode represen tar os números de 5 a 2000. Estes polímeros têm um peso molecular compreendido entre 1000 e 300000. Estes polímeros, bem como os seus processos de preparaçao, foram descritos na Espe_ cificaçao publicada Alema 3 707 369.

Um outro exemplo é um copolimero de fórmula III, de poli-®<,p-(2-hidroxietil)-D,L-aspartamida (com posto de fórmula I) e polisuccinimida,

na qual a relaçao de y para z esta situada num intervalo de cerca de 0,99:0 até 0,1:0,99, de preferência 2,5:7,5 até 7,5: : 2,5.

Muito preferivelmente sao utilizados como polímeros de acordo com 0 processo da invenção os compo^ 6 i

tos sintéticos representados pelas fórmulas I, II, e III.

Para a preparação do metotrexato fixado a polímeros, ou dos correspondentes derivados, dissolve--se a substância activa, de preferência em água, em sulfóxido de dimetilo (DMSO), formamida, N,N-dimetilformamida ou cloreto de metileno, ou numa mistura dos' últimos três dissolventes. 0 correspondente polímero é incorporado no mesmo dissolvente que também foi utilizado para a dissolução da substância acti^ va. Os dois preparados sao misturados entre si e podem ser iii cubados, preferivelmente sob agitação, na presença de um reagente de acoplamento desidratante, eventualmente com exclusão da luz, a um valor de pH situado no intervalo de 7 a 9, de preferência de 8 a 8,5, e a uma temperatura de 0 até 100SC, de preferência de 20 a 30aC, durante um período de tempo de cerca de 1 a 29 horas.

Como reagentes de acoplamente desi-dratantes podem utilizar-se carbodiimidas, anidridos de ácidos alquilofosfónicos, carbonildiaminas, etc. Muito preferivelmen te são utilizados carbonildiimidazol e diciclohexilcarbodiimi da. 0 produto bruto resultante pode, para a sua purificação, ser precipitado com um dissolvente no qual o polímero nao seja solúvel. Para este efeito podem utilizar-se, por exemplo, tetrahidrofurano, acetona, dioxano e álcoois. Uma outra purificação poderá ser realizada com métodos para a distribuição por pesos moleculares, como por exemplo ultrafiltraçao, diálise e permeaçao por gel.

De acordo com o processo da invenção obtém-se um produto de metotrexato fixado ao polímero, com uma carga de metotrexato ou dos seus análogos de 1 a 85%, de preferência de 15 a 75%, referida ao peso do produto fixado ao polímeros. Além disso o produto possui um coeficiente de extinção compreendido entre 0,0001 1/mg e 0,05 1/mg, de prefe_ rência entre 0,005 1/mg e 0,03 1/mg, em solução aquosa, para um valor de pH entre 7 e 8,5, e um comprimento de onda de 302 nm para o metotrexato e a metopterina, ou um coeficiente de extinção de 0,0005 1/mg até 0,04 1/mg aos valores de pH refe- 7

ridos e para um comprimento de onda de 282 nm para a aminopte^ rina. A partir dos metotrexatos fixados a polímeros, de acordo com a invenção, a substância activa pode libertar-se lentamente no organismo por simples hidrólise, ao contrário de uma fixação mais sólida através de grupos amida funcionais, dos quais a substância activa só pode ser posta na forma livre por dissociação enzimática.

Em ensaios in vivo conseguem-se obter com estes conjugados polímero-metotrexato de acordo com a invenção, por exemplo em ratos com leucemia L1210, prolongamentos de vida de mais do que 125%, de preferência mais do que 150%, relativamente a controles nao tratados, mesmo para uma única aplicação (intraperitoneal i.p) de 60 mg/kg de peso cor poral de metotrexato ou dos seus derivados que, de acordo com a invenção, estão fixados a polímeros que transportam grupos hidroxilo, biocompatíveis, solúveis em água (equivalentes de metotrexato ou do seu derivado). Estes valores foram determinados como se descreve no exemplo 7. Nas condiçoes referidas o metotrexato, ou os seus derivados, nao sao eficazes. Para 330 mg/kg de equivalentes de metotrexato ou dos seus derivados foi possível observar-se, em 2 de 5 animais, uma remissão completa sem recaída até à interrupção do ensaio ao fim de 60 dias. Esta dose situa-se já acima do valor do metotrexa to livre.

Os conjugados polímero-metotrexato de acordo com a invenção mostram ainda, in vitro, valores IC,-q mais altos do que o metotrexato (por exemplo, contra células L1210, HT29, A549). Em conjugação com os resultados in vivo descritos acima, este facto é considerado como uma prova de uma lenta libertação do metotrexato, conforme pretendido. A invenção será elucidada a seguir com bases nos exemplos. Os valores de percentagem, se nao for indicado o contrário, referem-se ao peso.

Exemplo li Preparação de um éster de poli-metotrexato-poli-o(, ^-(2-hidroxietil)-D,L-aspartamida com auxílio de carbonildii-midazol. 8

0 metotrexato para todos os exemplos foi obtido da firma Sigma. 0 polímero poli-o(,j(?-(2-hidroxietil) -D,L-aspartamida é preparado de acordo com P.Neri, G. Antoni, F. Benvenuti, F.Cocola, G.Gazzei, J. Med. Chem. 16, 893 (1973) 3 g de metotrexato sao dissolvidos em 15 ml de uma mistura de formamida:N,N-dimetilformamida: di. clorometano (10:9:1). Adiciona-se-lhe uma solução de 300 mg de pirrolidinopiridina e 2,44 g de carbonildiimidazol em 5 ml da mistura de dissolventes anterior. A mistura reactiva é agi^ tada uma hora à temperatura ambiente (TA). Simultaneamente dissolvem-se 3,1 g de poli-o(,^-(2-hidroxietil)-D,L-aspartami-da (PHEA) em 9 ml da mistura de dissolventes descrita acima e agitam-se a temperatura ambiente. As 2 soluçoes sao reunidas e agitam-se 20 h ã temperatura ambiente na ausência de luz. 0 produto bruto precipita vertendo-se a mistura em 250 ml de acetona. 0 sedimento amarelo é separado, é lavado com acetona, é seco e é depois tomado em 25 ml de solução aquosa de hidro-genocarbonato de sódio (pH 8-9). A solução aquosa amarelo marfim é passada através de uma coluna de cromatografia por gel Sepha-dex (PD10,Pharmacia) e, mediante a eluição com água, separa--se numa fracçao de baixo peso molecular e uma fracçao de alto peso molecular. A fracçao de alto peso molecular é liofili. sada. 0 teor de metotrexato é determinado por espectroscopia UV a ^.=302 nm em solução aquosa. 0 produto é caracterizado por ^H-RMN, análise CHN e cromatografia de camada delgada. 0 espectro H-RMN em D2O corresponde a uma soma dos espectros do metotrexato e PHEA, podendo-se deduzir 0 grau de carga a partir da relação integral. 0 grau de ocupação (carga) medido por HPLC, de 22% em peso de metotrexato, corresponde ao resul tado da determinação por UV. Em TLC em éter dietílico 0 reagente de acoplamento migra, enquanto que o metotrexato e o produto permanecem na Rf=0. A presença de metotrexato livre podia ser evitada por ultrafiltraçao com membranas com diversos limites de exclusão.

Rendimento: 3 g de metotrexato fixado ao polímero (cerca de 20% do valor teórico, referido ao me 9

totrexato). A maior parte do metotrexato não reagido é recupe^ rado por precipitação a partir da fracção de peso molecular baixo.

Exemplo 2: preparação de um éster poli-metotrexato-dextrano (40000) com auxílio de carbonildiimidazol. 0 dextrano 40000 foi obtido da firma Fluka, Buchs, Suissa. 3g de metotrexato sao dissolvidos em 10 ml de uma mistura de for. mamida, Ν,Ν-dimetilformamida:diclorometano (10:9:1) e misturam -se 2,39 g de carbonildiimidazol bem como 0,29 g de pirrolidi. nopiridina em 5 ml da mistura de dissolventes acima, e agitam -se 2 h à temperatura ambiente. Seguidamente adiciona-se-lhes uma solução de 3,2 g de dextrano 40000 em 20 ml da mesma mistura de dissolventes e agita-se 20 h à temperatura ambiente na ausência da luz. 0 produto bruto é precipitado em 350 ml de acetona anidra e depois de separado é lavado com acetona e seco. 0 sólido é tomado em 25 ml de água e é passado através de uma coluna de cromatografia por gel PD10. A eluiçao com água produz uma fracção de peso molecular alto e uma fracçao de peso molecular baixo. A fracçao de peso mole_ cular alto é liofilisada e é analisada como foi descrito no exemplo 1. A recuperação do metotrexato nao reagido é possível por precipitação.

Rendimento: 3 g de metotrexato fixado ao polímero.

Carga: 17,3% em peso de metotrexato.

Exemplo 3: preparaçao de um éster poli-metotrexato-dextrano (40000) com auxílio de diciclohexilcarbodiimida (DCC). 0 dextrano 40000 foi obtido da firma Fluka, Buchs, Suissa. 3g de metotrexato são dissolvidos em 10 ml de uma mistura de for. mamida :N,N-dimetilformamida:diclorometano (10:9:1) e são adi. cionados a uma solução de 2,9 g de DCC com 1,8 g de N,N-dime-tilaminopiridina (DMAP) em 5 ml da mistura de dissolventes (como é descrita acima). Depois de uma breve agitaçao adiciona-se uma solução de 3,2 g de dextrano 40000 em 20 ml da mesma mistura de dissolventes e agita-se 20 h à temperatura ambiente na ausência de luz. Depois da remoção de um sedimento por filtraçao o produto bruto é precipitado vertendo-o em 350 10

ml de acetona e lava-se com acetona, secando-se finalmente. 0 sólido e tomado em 30 ml de água e e passado através de uma coluna cromatográfica de permeação por gel PD10 e é eluido com água. A fracção de peso molecular elevado é liofilisada e analisada como se descreveu no exemplo 1.

Rendimento: 3 g do metotrexato fixado a polímero Carga: 8,5% em peso de metotrexato;

Recuperação do metotrexato por reprecipitação.

Exemplo 4: preparação de um éster poli-metotrexato-|_o(,?-(2-hi_ droxietil)-D,L-aspartamida/polisuccinimida] 10 g (103 mmole) de ácido polianidroaspárgico (polissuccinimi. da) são levados a reagir, apenas parcialmente, com 1,83 g (30 mmole) de 2-aminoetanol, obtendo-se poli-c<,^-(2-hidroxietil)--D,L-aspartamida. A polianidroaspargoilo-co-o<,0-(2-hidroxie-til)-D,L-aspartamida, caracterizada por espectroscopia RMN, contém cerca de 30% de grupos hidroxietilo e, ao contrário da homo-poli-ο(,β-( 2-hidroxietil)-D ,L-aspartamida, que pode ser dissolvida em água fria, só é solúvel em água quente. A reacçao e realizada analogamente ao exemplo 1, com a unica diferença de se utilizar o copolíme_ ro em vez da poli-o(,^-(2-hidroxietil)-D-L-aspartamida. A quan_ tidade de polímero utilizado depende da fracçao de poli-o(,(3--(2-hidroxietil)-D,L-aspartamida no copolímero. Para um mole de metotrexato adiciona-se, em cada caso, uma quantidade do polímero correspondente a um mole de grupos hidroxilo. 0 produto final de peso molecular elevado, depois de cromatografa-do por gel, contêm 20% em peso de metotrexato ligado (determi. nado por HPLC).

Rendimento cerca de 20% do valor teó. rico, referido ao metotrexato .

Exemplo 5: preparação de um éster poli-metotrexato-inulina A reacçao ê realizada analogamente ao exemplo 1, com a única diferença de se utilizar inulina (Fluka AG, Buchs, Suissa) em vez de poli-p(,^-(2-hidroxietil)--D,L-aspartamida. Para um mole de metotrexato utiliza-se uma quantidade de inulina correspondente a um mole de unidades do 11

monomero. 0 produto final de peso molecular elevado, cromato-grafado por gel, contém 68% em peso de metotrexato ligado. Rendimento cerca de 70% em peso do valor teórico, referido ao metotrexato utilizado.

Exemplo 6: Preparação de um éster poli-metotrexato-poli-/(2--hidroxietil-amido)-lisino-fumari daj com auxílio de carbonil--diimidazol. A preparaçao do polímero é realizada analogamente à Especificação DOS 3 707 369, exemplo 2, utilizando-se em vez do éster metílico de lisina, a (2-hidroxietil)_ -amidolisina. 3 g de metotrexato sao dissolvidos em 15 ml da mistura de dissolventes descrita nos exemplos 1 a 3 e sao misturados com uma solução de 2,39 g de carbonildiimi. dazol e 0,29 g de pirrolidinopiridina em 5 ml da mistura de dissolventes. Depois de. 2 horas de agitaçao à temperatura ambiente mistura-se com uma solução de 3,3 g do polímero em 20 ml da mistura de dissolventes e agita-se à temperatura ambieri te durante 20 horas, na ausência de luz. Seguidamente faz-se precipitar vertendo em 300 ml de acetona, o resíduo é lavado com acetona e é seco. 0 sólido é dissolvido em 25 ml de água, e é separado em duas fracçoes de peso molecular alto e baixo através de uma coluna de cromatografia por gel PD-10. A frac-çao de peso molecular alto, depois de seca é analisada como se descreve no exemplo 1.

Rendimento: 3,1 g do metotrexato fixado ao polímero Carga: 19,1% em peso de metotrexato;

Recuperação do metotrexato por precipitação.

Exemplo 7: Preparação de um éster poli-metotrexato-(amido hi-drosolúvel) com auxílio de carbonildiimidazol.

Foram utilizados diversos amidos solúveis em água obtidos comercialmente. 3 g de metotrexato sao dissolvidos em 15 ml da mistura de dissolventes descrita nos exemplos 1 a 3 e misturam-se com uma solução de 2,39 g de carbonildiimidazol e 0,29g de pirrolidinopiridina em 5 ml da mesma mistura. Depois de duas horas de agitaçao à temperatura ambiente adicionam-se 3,2 g da fracção de amido solúvel em água em 30 ml da mistura 12 * *

Hu3F*»ki., de dissolventes e a solução reactiva é agitada 20 horas à tem peratura ambiente e na ausência de luz.

Faz-se precipitar o produto bruto vertendo a solução em 300 ml de acetona e, depois da lavagem com acetona, seca-se. 0 resíduo, ê tomado em 30 ml e é ultra--filtrado. A fase de peso molecular elevado (retido, limite de exclusão da membrana 5000) é liofilisada e é analizada como foi descrito no exemplo 1.

Rendimento: 3 g de metotrexato fixado ao polímero.

Carga: 8% em peso de metotrexato; recuperação do metotrexato por repricipitação.

Exemplo 8: Acçao in vitro do éster metotrexato-dextrano sobre uma linha de células de tumor.

Teste de proliferação (redução de metotrexato) Células L1210, A549 ou HT29, na fase de crescimento exponen-ciai, são incubadas a uma densidade de células de 5 x 10° cé-lulas/ml em meio "Rosswell Park Memorial Institute" (RPMI) 1640 numa placa de microtítulo com 96 cavidades, durante 72 h, com diversas concentrações da substância de ensaio, a 37°C, com 5% de ϋθ£ e com 95% de humidade relativa do ar. Nas experiências de controle em vez da substância ensaiada utiliza-se o meio de crescimento. Para cada substância ensaiada, bem como para os controles, realizam-se determinações em quadruplicado. Apés 65 h de incubaçao adicionam-se 5 jil de uma solução de metotrexato (2,5 mg/ml em solução de cloreto de sódio tam-ponizada com fosfato). Na presença de células vivas o metotre^ xato é reduzido a um corante de formazano vermelho escuro, iii solúvel. Esta reacçao está terminada ao fim de 7 h (células L1210) ou ao fim de 24 h (células A549, HT29) e o meio sobre-nadante é removido aspirando-o cuidadosamente. 0 corante inso^ lúvel é dissolvido por adiçao de 100 jul de DMS0 e mede-se em seguida a extinção da solução assim formada, para cada cavidja de, num fotémetro Multiscan 340 CC da firma Flow, a um comprjl mento de onda de 492 nm. A partir das relações de extinções de células tratadas e células nao tratadas traça-se uma curva dose-acçao, a partir da qual se pode ler a concentração que origina exactamente 50% de extermínio das células (IC^q). Pa- 13

ra ensaios repetidos o coeficiente de variaçao ê menor do que 15%.

Quadro 1

Substância Célula IC5()(ug/ml) L1210 0,01

Metotrexato (MTX) HT 29 0,008 A 549 0,01 L1219 0,13 MTX-Dextrano HT 29 0,41 A 549 0,58

Exemplo 9: Eficacia in vivo sobre células de leucémia L1210 em ratos.

Obtenção do tumor;

Recolhe-se líquido de ascite 7 dias depois da implantação do tumor, em condiçoes estéreis, de ratos DBA 2 (fêmeas, 18 a 20 g). 0 líquido de ascite é lavado 3 vezes com PBS (cloreto de sódio tamponizado com fosfato) é contado e em seguida é diluí_ do em PBS até uma concentração final de 10^ células por 0,2 ml.

Aplicam-se por via intraperitoneal 10^ células em 0,2 ml de PBS a ratos DBA2 (fêmeas, 18 a 20 g). Esta transferência é repetida uma vez por semana.

Determinação do efeito antitumórico; 105 células do líquido de ascite em 0,2 ml de PBS sao aplicados por via intraperitoneal a ratos BDF1 (fêmeas, 18 a 20 g). Utilizam-se 6 animais para cada concentração da substância, bem como para o controle. a) 0s animais são pesados no dia 1 e no dia 5 depois da implaxi tação das células de tumor. Uma perda de peso de mais do que 20% no dia 5 é utilizada como indicador de um efeito tóxico da substância. b) No termo da experiência (morte de todos os animais, ou quando se atinge o dia 60) determina-se a mediana do tempo de 14

sobrevivência do grupo tratado, desde que este contenha 65% de animais sobreviventes no dia 5. A determinação das medianas do tempo de sobrevivência é realizada de harmonia com a fórmula: (MST) = .D 2 mediana de tempo de sobrevivência

Nesta fórmula X representa o 1- dia em que o número de animais sobreviventes é N/2 e Y representa o le dia em que o número de animais sobreviventes é (N/2)-l. No caso de N ser um número ímpar a mediana do tempo de sobrevivência corresponde ao instante X. A mediana do tempo de sobrevivência é determinada exclusivamente para os animais que morrem no de^ curso da experiência. Os animais curados (sobreviventes a lon go prazo, LTS) sao excluídos da determinação da mediana do tempo de sobrevivência e sao contados separadamente. A partir dasâmedianas dos tempos de sobrevivência do grupo tratado (MST ) e do grupo de con- trole (MST . , ) calcula-se o efeito antitumórico tumor/con controle' — trole (T/C) de harmonia com a fórmula T/C % x 100 MSTC ’

Valores T/C de mais do que 125% são considerados como indicadores de uma eficácia antitumórica significativa do composto ensaiado. As doses que causam, em cada caso, o maior efeito antitumórico (doses óptimas) estão indicadas no quadro 2. Os animais ainda vivos no dia 60 sao considerados curados (LTS). Resultados: ver quadro 2 Discussão:

Devido a estes resultados deduz-se que o polímero de metotre-xato esterifiçado, para uma única aplicaçao intraperitoneal (i.p.), ultrapassa o metotrexato puro, o que significa uma 15

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Substância Tumor

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - Ia - Processo para a preparaçao de meto-trexato fixado a polímeros, ou de derivados de metotrexato fi xados a polímeros com - uma ligação éster do grupo p4-carboxilo e/ou ^-carboxilo do metotrexato, ou do derivado de metotrexato, com grupos hidroxilo de polímeros solúveis em água, biocompatíveis, - uma ocupaçao de 1 a 85% de metotrexato, ou de derivado de metotrexato, caracterizado por se fazerem reagir, na presença de reagentes de acoplamento deshidratantes, o metotrexato ou o correspondente derivado do metotrexato transportando grupos o<-carboxi-lo e/ou /-carboxilo, com um polímero que transporte grupos hi_ droxilo, solúvel em água e biocompatível. - 2a - Processo de acordo com a reivindica^ çao 1, caracterizado por se utilizar como polímero a) uma poli-o/, f-( 2-hidroxil)-D , L-aspar tamida de fórmula I

   CEJ

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   na qual a relaçao de m para n e de 0:1 a 1:0, com um peso molecular de 2000 a 100 000, b) uma polilisina-fumaramida ou glutaramida, de fórmula II 0 0 II II -(-NH-(CH0), -CH-NH-C-X-C- ) - 2 4 ' n II C=0 NH (CH0) -0H 2'm na qual X representa -((^2)^- ou -CH=GH-, m é um número de 1 a 10 e n é um número de 5 a 2000, com um peso molecular compreendido entre 1000 e 300 000 c) uma poli-oc, 2-hidr oxietil )-D , L-aspartamida/polisuccinimi^ da de fórmula III

   na qual a relaçao de y para z se situa no intervalo de cerca de 0,99:0,01 até 0,01:0,99. d) um dextrano com um peso molecular médio compreendido entre 1000 e 200 000 e e) uma fracção de amido com um peso molecular médio compreendido entre 100 e 200 000 f) inulina. - 3â - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se utilizar como reagente de acoplamento carbonildiimidazol ou diciclohexilcarbodiimida. 19 - 4â - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a reacçao ter lugar a uma valor de pH de 7 a 9 e a uma temperatura compreendida de 0 a 100°C. A requerente reivindica a prioridade do pedido alemao apresentado em 11 de Fevereiro de 1989, sob o Na P 39 04 119.0. Lisboa, 9 de © à.mm «cm. Fevereiro de 1990 1M ^

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