PT93090A - Processo para a reducao quiral microbiologica de grupos carbonilo e novo microrganismo - Google Patents

Description

Ο invento αχζ respeito bioloqica cie qrupos carbonilo e efectuar esta. redução π to a. uma redução quiral microrganismo é Aspergi

uma redução quiral micro-um novo microrganismo para

Maxs parLicuIarusen Le o iuvento dii (Ricrobio 1 ogica de grupos cstona. 1lus niveus íATCC 20922)« ι w j!3 Ur X ~~ 0 novo 0 invento refere— ração do composto dilevalol ;e- também a um processo para a prepa-utilizando o referido microrganismo. — l í Iri )-1 -mafcii-ó-fsnx1propxI ;amxnt também conhecido como hidrocloreto dilevalol actividade vasodilatadora jl-adrer para o tratamento da hipertensão5 s to ( ) —η—Ϊ ( 1K ) — 1 ~hid γοκ i—>‘— til >sa 1 ic i 1 amida t—ΌϊΙΐ t.G 1 d i1eva101H e κ i be uma potente qxc-a faxoquesnte sendo utíl sr U.B» Patent No 4.619.919«

CONH2

I aao descritos processos estereoespecíficos para a preparação do dilevalol na referida patente americana e na U.B. Patenfc Mo 4.658.060. Na preparação do dilevalol torna-se necessária uma redução quiral do grupo cetona para se dispor a própria configuração do estereoisómero R« 0 inventor investigou mais ds 50 culturas de microrganismos relacionados com a redução de grupos cetona em grupos hidroxiP por exemplos bactérias tal como a Schizomy cetes5 fungos tais como AscomvcetesR Basidiomvcetes e PhycQiTiVcetesg no entanto nenhum dos microrganismos testados eram activos na redução de grupos cetona no próprio estereoisómeroí R,

anismo a niveus q com a pró partir do ϊ2·ο1ο us era O 3. O-S O d S pria configura™ 0 inventor procurou, então um novo microrg ε descobriu um microrganismo* Asoerqillus reduzir o grupo cetona num grupo hidroíi ção Bsterso R„

SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento Aspergi 1lus niveus íATCC 2Φ922) apresenta caracteristicas disti engloba o novo microrganismo e seus mutantes e variantes, que itas do Asperqi 11 us niveus„ 0 Dressn redução quiral de qr preende a cultura do invento é também dirigido a um processo de pos cetona em grupos hidroKÍ5 o qual com-microrganismo Asperqi11us niveus num meio de cultura ao qual foi ad estereoespec i f i c idsde acumulada no referido hidrosíi. 0 processo dilevalol a partir acetil>salicilamida» icionatío o composto cetona de maneira que a do grupo hidroxi possa ser formada e meio 5 e a recolha do referido composto da particularmente útil na preparação do -·£ <R>--E C1—metii-3—fenilpropil laminol

DESCRIçm DETALHADA í"*i Uli

[NVENTO 0 microrganismo Asperqi11us niveus foi descoberto e isolado pelo inventor a partir de solo obtido de uma escavação localizada em New Jersey, U.S.A. A separação do microrganismo foi sfestuada pelo método de melhoramento do solo, através do qual uma amostra tío sola é misturada com um composto que limita o crescimento daquekes organismos que podem utilizar aquele composto. Neste caso particular o composto 5— Cmetoxiaceti 1)~2™hidraxi~ oenzami-da toi adxcxonado ã ssiiostrs do s-olo s a mistura toi incubada durante vários dias. De tempos a tempos a mistura foi amostrada por métodos microbiologicos padrão e posta em lâminas. ί

Ur* revelou-se muito active» na redução do grupo cetona do substacto de teste» Esta cultura pura activa, um molde branco., foi caracte-risada como pertencendo ao gene ftsoerqí1lus e pósteriormente x cl sn t x τ 2. e ao a c om o hs pe rg 3.11 us n i v eus»

As características bacteriológicas do Aspero i i1us Π1V8UB 'Ξ·θ.Q -33 3‘SQU.Ín t*33 % κ & / uresciínento @m vanos maios s < I) Meio de extracto de malte agars

Crescimento abundante neste meio com formação de colónias brancas5 em relevo e em flocos no centro,! macia,, com cabeças conidiais não evidentes à vista desarmada» A porção periférica da colónia é plana, aveludada, consistindo d»e abundantes cabeças conidiais que se originam a partir das hifas ligadas à superfície do agar„ Exudato em falta. Reverso da colónia castanho amarelado» Cabeças conidiais na primeira disposição radial, tornando-se colunar pouco exacta, por vezes levemente cintilante no àoice branca, Conidiaforos erectas, com uma célt •distinta no pé, com paredes os que relativamente espessas, por vezes com septos, ocasio-nalmente ramificada» Aspecto visual em Conidioforos hialinos mas- cora ura matiz distinto acastanhado na superfície» Ápice do conidioforo alargando-se gradual-mente para formar uma vesícula. Vesículas hemiesféri— cas, suportando aparelhos esporogénios na superfície superior» Aparelhos esporogénios bisseriados, mas ocasionalmente unisseriados, especialmente em pequenas-cabeças ou na margem da vesícula» Cabeças bisseriadas que consistem de metulse, fialídeos de suporte

afuniIam formando uma ponta fina» Fialideos suportando longas cadeias de conídios» Conidios globosos, macios de paredes finas, hialinos <2> Meio Czapek agars

Crescimento abundante neste meio formando uma colónia fortemente em flocos, superfície apresentando-se macia e compacta com cabeças conidiais não aparentes à vista desarmada,Colónia branca,com uma cor levemente creme amarelada ou cor de camurça com envelhecimento, Cabeças conidiais formadas par meio de micélio aéreo da colónia como descrito em extracto de malte agar, apenas com a diferença de ser ligeiramente mais pequena e não uni formemente co1unar , (3) Meio agar sumo V-Bs

Crescimento abundante neste meio formandouma colónia branca, fortemente em flocos no seu centro, moderada- em flocos nas regiões perifêricas? o centra da ia rapidamente tornando-se amarei o—i_or de camurça. enve1hecimen to, Cabeças conidiais abundantes, das no micélio aéreo, como descrito no extrscto de malte agar,

Cfo) Propriedades fisiológicas? C i ) Formação de sf 3. a toxinas negativa, <c> Fontes solo.

Uma cultura viável de Asperqi11us niveus encontra—se depositada na coplecção da American Type Culture Collection (ATCC) em Rockville, MD, onde é desiqnads com o número de acesso ATCC * *

iá por d e s t r u i c S o por nSo anos a partir da _·___:__ u m de 3 de c inco anos a fi..V I | i Γ à 20922. A cultura depositada perder—s •subsistir durante um período de trinta anos depósito da cultura ou durante o período de última petição da cultura depositada ou a vida sfectiva da patente que resultar deste pedido, a cultura será substituída, após notificação, pelos requerentes ou pelos sionário dt pedido» Subculturas de Ásperai 11 us niveus. ATCC 20922, estio disponíveis durante o processamento deste pedido para aqueles a quem o Commissioner of Patents and Trademarks determinar autori™ Z -f:l Ç ¢5. CD o:· O Li Θ. ó / CFR 1=14 e 35 USC 122 e 5=*ϊ»1iará U i bpGn i V ir' 1 ao público em g ieral sem restrições logo que a patente a. 00-sei a n 0 0 Ir. 0 p 0 Ο X D O Sír* 0 J -*S CDnCBOld a= A utilização dos mieror ganismos está dependente d ias Leis d e patentes dos Estados Unidos da América» 0 processo do presente invenuo T ΟΓΠ0C 0 um método de redução quiral microbiológica do grupo cetona no correspondente grupo hidro;·;! apresentando a configuração estereo própria» 0 processo de redução ilustrado pela prepa 1—meti 1—3—fsni1propi1) (

inventoé 5--Í (R) — C quiral microbiolóqica do presente •ação do dilevalol a partir da .mino lace ti 1 Jsal icilamidas

HíÍC Γ 'organismo. A qama . os entre ~y r à-Ui •S-is-:U e 34:-!C, enquanto se mar reacção na gama de entre 6,5 reacçao poa evariar 25mq/100ml.

ser conduzida a temperaturas na © 1 trfT ãncia Oi a ga ma d tf ent r© alor do pH da mi stur a ÚB de ρ rei erên- ria _ feri l L· Γ c: è 58 to c e t on a na mi stur 2 d© mg /1 ΘΘ ml * de pr ’-S*f sr ®nc ia A duração da reacção da redução quiral pode variar desde 48 até Γ2Θ horas, de preferência 72 horas*

No fim da redução quiral. pode ser extr aid d*s mistura os reacção d x 1svs101 po r u t i1i ΞaçSo d© solventes orgânicos, ta1 cornopoe eKemp-10 5 acetato de eti Ιο, cloreto de me tileno, e sems1han tes* A partir Q QC, ÇC- ν' ΤΓ i~ r~ T* ÇiC Uv q a.n x L. Ofe- sÃfe sim obtidos- o concentrados5 pode ser então separado o dievalol. A purificação do composto hidroxi pode ser efectuada por cromatografia TLC e HPLC.

Outros microrganismos conhecidos da espécie Aspergi1lus tem sidi d su. j t; i to=> a investigação para determinar se out r os membros da classe da espécie podem ser produzidos a partir da. redução c 1 xncal oe grupos esto * Us s •eguintes mierorganismos não con seguem es zabeaec e r retíução Quiralde grupos cetona

Assergillus niger (AlCC lc=94)s Asperqi 1.1 us Qrhvae ÍAiCC 1454) § e Aspergi3.lus Orvzae CATCC 11488)* ré. à s c r i t d com mais det S tt Contudo sstss exemplos 1 he não o âmbito do nressnte invento. 0 presente invento s recorrendo aos seguintes exempl pretendem limitar de modo alqum hXEMPLu 0 novo funqo nsperqi11us niveusfoi isolado em cultura pura pelo “m létodo de snriq useimento da 1 501 O ís » Culturas principais rjQ activa foram preparadas e mantidas pelos métodos Λ i :·. c r o h i. o 1 á g i .cós usuais em um ou mais 003 5 SyUXff iiítr.1 iOS ciySr*« ctextroso do batata3 agar Sabouraud e 3. Q B. Γ' QΟX trO3£? 0Xtr*cicto íjp levedura„ 0 inóculo para fermentação foi preparado por subcultur no sequmi

Ina redi ente Quantida :iie Farinha de saia 35 g Dextrina de batata 5@ n Cerelose g Carbonato de cálcio Q Cloreto de cobalto òH_G q iTiQ .4gua macia para um 1 i tro pH oosterior 7,0 - * j ·£. 0 caldo foi distribuída em frascos de 30Θ ffl 13 c α n t a n d o frasco i00 ml de caldo..· Nos frascos semeados quei r" 3? to p Ο Γ O tt? quer micélios a ir de planos inclinados de agar e incubados '> em misturadores temperatura de água controlada operados a 320 batidas por minuta a ò'. inoculado a um nível riormente referido» < g asleveo: u r a auto1i z potássio mono— bás i co ds 3©© ml e esterili pos teri or 5S©-5S2= scimentoem 18- o—c on v e r sã o f( r do meio an ti por litros 5 atía5 i£i g de cersloss? e 2 = 5 g de fosfato de = D caldo (10© ml) foi distribuído em frascos sado a 121 °C- durante 3© minutos.s pH estéril

Depois da inoculaçOSo os frascos foram num vibrador de incubação s. 32© pancadas por minuto a 34°C„ Ao fim de 24 horas, 5Θ g de sal de hidrocloreto de 5-í(R)-C<i-meti 1-3—fenilpropil>— amino3aceti1>salici1amida secos ou dissolvidos em í—2 ml de dimet.ilformamida foram adicionados a cada frascoe a incubação continuou no agitador durante 24-72 horas» Foram tomadas amostras periodicamente para determinar a velocidade- de conversão do 5—í CR>-Γ ( i—metil-3-fenilpropil )amino3acstil>ss.licilamida em dx levai o 1 » 0 volume da te-i=?ce de 23 x lo© suj. adicionadosa cada tubo foi deixada assentar vapor até á secura.» 0 sujeito a cromatografi CTLC)indicou uma bio-c amostra foi de í © I colocados num tubo de = Acetato de stilo <25 ml) foram então e agitados 5©—6© veies» A camada, solvente e depois retirado e evaporadonum banho de resíduo foi dissolvido em 2 ml de metanóis a TLC e HPLC. Cromatograf ia de camada, fina onversão de 70-80% do 5—C (R}~E (1—metil—3—

-fenilpropillaminojacetilJ iciiamia em ci 11 sva 1 uj i«

Claims (1)

1. REZVINDICAGSES i§ - Cultura biologicamente pura de fungos Aspergi Ilus níveas, ATCC 20922s caractsrisada por ser capas de redução quiral de cetonas» 2i - Processo para a redução quiral de cetonas para os correspondentes compostos hitíroxi caracterizado por se pôr em contacto a referida cetona com Aspergi1lus niveus num meio de cultura s se recuperar o referido composto hidroxi assim formado do meio de cultura» 3:ã - Processo para a preparação de 5~í (Rl-l-hidroxi-2-E (R)-( i-mstil~3~fsni Ipropi1 >amina3eiil>salicilaínida caracteri-zsdo por compreender a cultura do microrganismo Aspergi1lus niveus (ATCC 20922) num meia de cultura contendo uma cetona contenda um composto capas de suportar a redução quiral do grupo cetona e recuperação da produto assim formado do meio de cultura» 4õ - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracte-rizado por o composto cetona ser 5-í(R)-Cí1-metii-3-fenilpropi1>~ — am 1 η o 3 ac e t. i 1 J sa licil am ida» Lisboas 8 de l-evereiro de 199Θ

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