PT92403B

PT92403B - Processo para a preparacao de glicoesfingolipidos com grupos susceptiveis de aclopamento na fraccao esfingoide e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT92403B
Application number: PT92403A
Authority: PT
Inventors: Herbert Wiegand; Silke Bosslet
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1988-11-27
Filing date: 1989-11-24
Publication date: 1995-08-09
Also published as: US5599914A; PT92403A; EP0371414A2; DK592489A; DK592489D0; KR900007861A; JP2919881B2; DE58909806D1; AU4548189A; CA2003662C; CA2003662A1; AU621688B2; ATE155141T1; ES2104558T3; DK16196A; DE3840044A1; EP0371414B1; US5571900A; KR0147845B1; JPH02184700A

Description

Descriç3o da patente de invençSo de BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, alenS, industrial e comercial, com sede em D-355O Marburg, Alemanha Ocidental, (inventores: Prof. Dr. Herbert Wiegand e Silke Bosslet, residentes na Alemanha Ocidental), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE GLICOESFINOLÍPIDOS COM GRUPOS SUSCEPTÍVEIS DE ACOPLAMENTO NA FRACÇÃO ESFÍNGOIDE E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

QUE OS CONTEM

Descrição

A presente invenção refere-se à modificação da fracção química esfingóide de glicoesfingolípidos. Por meio de uma série de reacções foi possível introduzir um grupo amina na posição da dupla ligação entre átomos de carbono na fracção esfingóide após cisão do aldeido de cadeia longa.

GSP

Os glicoesfingolípidos (Formula i) são lipidos da membrana plasmática que são constituídos por uma fracção hidrófila de um hidrato de carbono e por uma fracção hidrófoba de ceramida. A fracção de ceramida é constituída por esfingosina, um aminoálcool de cadeia longa, e por um

- 1 ácido gordo ligado por uma ligação do tipo amida

Ácido Gordo . ι j

--1 ,

Fracção de Ceramida Fracção de Hidrato de Carbono

Com esta fracção hidrófoba em dupla cauda os glicoesfingolípidos encontram-se fixos de tal modo na membrana plasmática exterior que a respectiva cadeia de oligossacárido sobressai no espaço extracelular.

Apesar do intenso trabalho de investigação ainda não é completamente conhecida a função biológica dos glicoesfingolípidos? no entanto parece que desempenham um papel na regulação do comportamento do crescimento e da diferenciação celular. Resultados que mostram que ocorrem em maiores quantidades relativas principalmente glicoesfingolipidos que contem ácido siálico, gangliósidos de origem neuroectodérmica de alguns tumores, enquanto que em tecidos normais estes compostos são expressos em quantidades mais reduzidas, lavaram a que fossem considerados de interesse como antigenes associados a tumores para o diagnóstico e para a terapia de tumores.

A fracção de hidrato de carbono apresenta neste caso um interesse especial. Foi possivel demonstrar

(pedido de Patente Alemã P 38 37 623.7) que o açúcar sialosílico correspondente isolado a partir de uma origem como o colostro de vaca e acoplado a uma protéina de suporte# pode imitar epítopos de gangliósidos: anticorpos monoclonais antigangliósidos reagem com estas neoglicoproteínas.

A fim de se poder estabelecer uma ligaçao dirigida universal aplicável a todos os glicoesfingolípidos, é necessária a modificação química da fracção esfingóide dos glicoesfingolípidos para o processamento adicional desta règião. I_sto diz respeito à preparaçao de vacinas sintéticas glicoesfingolipidicas. Adicionalmente a incorporação de um grupo com capacidade para acoplamento também para locais de interesse é relevante na investigação básica, por exemplo é possível utilizar glicoesfingolípidos acoplados a enzimas marcadas em investigação histológica, por exemplo para caracterização de lectinas de mamíferos como receptores para glicoesfingolípidos.

A presente invenção mostra que por meio das reacções seguidamente descritas é possível introduzii um grupo amina como grupo funcional na fracção esfingoide de glicoesfingolípidos após cisão de um aldeído de cadeia longa. Deste modo a fracção de hidrato de carbono conserva-se ligada por uma ligação glicosídica à fracção de ceramida sem alteração.

O grupo amina introduzido possibilita uma serie de outras reacções, por exemplo o acoplamento a reagentes heterobifuncionais para a síntese de conjugados de glicoesfingolípidos e a sua utilização como vacilas sintéticas na terapia de tumores de origem neuroectodérmica.

Para além da introdução de um grupo amina existe também a possibilidade de deixar reagir o produto intermediário (que possui um grupo aldeído) directamente comJoutras moléculas que possuam grupos capazes de acoplamen3 to, por exemplos grupos amina de proteínas, reagentes de acoplamento, etc., Nãs reacções deve-se ter em consideração qu o produto intermediário com os grupos aldeído não e muito estável e que em meio alcalino a fracção de hidrato de carbono á eliminada.

As principais reacções para a introdução dos grcpos com capacidade de acoplamento na posição da dupla ligação entre átomos de carbono na fracção esfingóide são as seguintes:

1. A dupla ligação acima referida e cindica por ozono (H. Wiegandt e G. Baschang, Z. Naturforschung 20 6, (1965), 164-166) e o derivado de metoxi-hidroperóxido obtido como produto secundário (H. Wiegandt, Ang Chem. Intl. Ed. 7, (1968) 87-96) é reduzido a aldeído em metanol por meio da adição de sulfureto de dimetilo (Pappas et al., T_etrahedron Letters, 36 (1966), 4273-4278).

OH

CH ₂-o-GLICOSIIÍO

O composto obtido é estável apenas em meio neutro e ácido? em meio alcalino a fracção de hidrato de carbono e eliminada.

2. Após eliminação do aldeido de cadeia longa por extracção com hexano submete-se o produto da ozonólise em metanol a uma aminação redutiva por adição de acetato de amónio 1 M e de ciano-boro-hidreto de sódio (Wiegandt e Ziegler, Hoppe-Seyler·s Fhysiol. Chem. 355, (1974), 11-18).

CH^-O-iGUCOSi:

NaOOBH₃

NH^Ac 1 M cm Metanol

T_odas as fases reacionais decorrem com um rendimento muito elevado e podem ser seguidas por cromatografia em camada fina; o eluente é clorofórmio/metanol/ /água (65:25:4). A detecção dos produtos de reacção sobre as placas de cromatografia etn camada fina e feita com vapores de ibdo; ou por pulverização com reagente de ninidrina ou de fluoram e orcina.

produto de ozonólise apos a aminação redutiva é detectável positivamente sobre as placas de cromatografia em camada fina por ninidrina e por fluorarem e pode ser feito reagir completamente com reagentes específicos para grupos amina como o fluorodinitrobenzeno (reagente de Sanger), (Itasaka e Hori, J. Biochem. 85, (9179), 1469-1481) ou o SPDP (N-succinimidil-3-(3-piridilditio)-propionato) (C_arlsson et al., Biochem, J. 173, (1978), 723-737).

A presente invenção refere-se ainda a glicoesfingolipidos com grupos capazes de acoplamento na posição da dupla ligação entre átomos de carbono, sendo cindido um aldeído de cadeia longa e ficando inalterado o resto da molécula e especiaimente a ligação glicosídica da

fracção de açúcar, em que o grupo capaz de acoplamento e de preferência um grupo amina ou um grupo aldeído, bem como a um processo para a sua preparação e a sua utilização para o acoplamento com parceiros de reacção adequados e como componentes de composições farmacêuticas.

A presente invenção e adicionalmente ilustrada pelos exemplos que se seguem e definida pelas reivindicações.

Sxemplo As

1. Ozonólise

Num balão de reaoção dissolveram-se 6 mg de cerebrósido (galactosilceramida) em 5 ml de metanol e submeteram-se a ozonização (1 bolha por segundo) ate se detectar ozono não consumido por meio de coloração violeta da solução de detecção de KI-amido

2. Redução e aldeído

Sm seguida purgou-se a mistura reaccional com azoto, adicionaram-se 30 ;ul de sulfureto de dimetilo e deixou-se em repouso de um dia para o outro. Após evaporação à secura da solução em evaporador rotativo a frio eliminou-se o aldeído de cadeia longa libertando pela ozonólise por extracção com hexano (3 x 2 ml).

3. Aminação redutiva do produto da ozonólise

Dissolveu-se o resíduo da extracção em 4 ml de acetato de amónio 1 M em metanol, adicionaram-se 15 mg de ciano-boro-hidreto de sódio e aqueceu-se a mistura reaccional a 80°C durante 4 a 5 horas sob refluxo.

Em seguida eliminaram-se os sais do produto da ozonólise apos a aminaçâo redutiva por meio de cromatografia de fase invertida (RP-18) e purificou-se por passa gem através de uma coluna de gel de sílica.

4. ReacçSo do produto da ozonólise após a aminaçâo redutiva com fluorodinitrobenzeno.

Dissolveu-se uma alíquota do produto da ozonólise após a aminaçâo redutiva em 500 pl de metanol e adicionaram-se à mistura reaecional 4 gotas de trietilami na e 20 jil de fluorodinitrobenzeno a 5% em etanol.

A reacção prosseguiu à temperatura ambiente com agitação intermitente durante 1 a 2 horas.

Foi possível identificar imediatamente o dérivado de dinitrofenilo obtido por meio da sua cor amarela na placa de cromatografia em camada fina (placas HPTLC, gel de sílica 60 (Merck, Darmstadt); eluente: clorofórmio/metanol/água, 65:25:4).

Exemplo B

Acoplamento do produto da ozonólise após aminaçâo redutiva dos gangliósidos GM3, GD3, GE2 e GMl em albumina de soro humano (ASH) por meio do reagente de acoplamento heterobifuncional N-succinimidil-3-(2-piridiltio)-propionato (SPDP)t síntese de conj ugados com um grau de derivatizaçâo de 16 a 18 derivados de gangliósido por molécula de ASH.

1. Ρχ-eparaçâo do produto da ozonólise após aminaçâo redutiva dos gangliósidos GM3, GD3, GM2 e GMl

A preparação foi levada a efeito como no Exemplo A para o cerebrósido descrito em 1. a 3.-.

•4Í-·

Por análises de espectro de massa dos derivados de GM1 e de GM3 foi confirmada a estrutura esperada.

As fases de fracção seguintes;

2. Reacção do produto da ozonólise após aminação redutiva com SPDP

3. Reacção de ASH com SPDP

4. Redução do derivado ASH-3PDP

5. Acoplamento do derivado do gangliósido com o derivado proteico bem como os respectivos métodos de détecção foram efectuados de modo análogo aos métodos descritos por J. Carlson et al., (1987) Biochem. J. 173, 723-737 e no pedido de Patente de DE P 38 37 623.7.

As fases 2 e 3 foram levadas a efeito em tampão de fosfato de sódio 0,1 M a pH 7,5 com um excesso de 3 a 5 equivalentes molares (em 3. referido aos grupos epsilon-amonosililo livres) de SPDP. A separação do derivado proteino-SPDP de 3. foi efectuado numa coluna de Sephadex G-25 que foi eluida com o tampão para a reacção seguinte (tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 6, EDTA 5 mM). A purificação do derivado de gangliósido após reacção com SPDP foi efectuada por meio de cromatografia de fase invertida (RP18).

A identificação por cromatografia em camada fina dos vários produtos intermediários foi efectuada por meio do diferente comportamento na eluição sobre placas de gem de sílica G-60 com o eluente cloroformio/ /metano1/solução aquosa de cloreto de cálcio a 0,2% (65í 25:4) ou (50:40:10).

A fase 4 foi levada a efeito como se segue;

- 9 Efectuou-se a redução das pontas de dissulfureto do derivado ASH-SPDP introduzidas de novo por meio da derivatização por adição de ditiotreitol 25 mM em tampão de fosfato de sódio 0,1 M a pH 6 e EDTA 5 mM com cisão de 2-tiopiridona. Nestas condições reaccionais as pontesde dissulfureto nativas da proteína não foram reduzidas.

A reacção procedeu à temperatura ambiente e o tempo de reacção foi de 1 a 2 horas.

Proteína

(4)

Proteína N-C--SH +

A separação do derivado ASH-SPDP reduzido foi efectuada numa coluna de Sephadex G-25 com tampão de fosfato de sódio 0,1 M a pH 6 com SDTA 5 mM como tampão eluente.

Por reacção de ASH com SPDP em defeito foi possível preparar derivados de ASH seleccionados com o grau de derivatização pretendido.

Os derivados de gangliósidos foram feitos reagir com ASH gue tinha sido derivatizada com 16 a 18 moléculas de SPDP. A transformação foi completa: o grau de derivatização do produto do acoplamento foi de 16 a 18 derivados de gantliósido (de cada um dos gangliósidos GM3, GD3, GM2 e GMl) por molécula de ASH.

O acoplamento (fase reaccional ns 5) foi realizada em pormenor como se segue:

Fez-se reagir o derivado ASH-SPDP reduzido imediatamente com o derivado gangliósido-SPDP. Empregou-se o derivado gangliósido-SPDP num excesso molar de 1 a 5 vezes em relação aos grupos epsilon-aminolisilo da proteína, A reacção demorou 24- a 48 horas à temperatura ambiente.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 19 P_rocesso para a preparação de glicoesfingollpidos com grupos reactivos na fracção esfingóide com a fórmula (2) ou (3).

nas quais X ou Y significam um grupo susceptível de acoplamen.v to que permita um acoplamento sob condições nas quais a molécula de partida não sofra qualquer outra alteração, caracterizado por se levar a efeito uma reacção de ozonólise a partir de glicoesfingolipidos com esfingosina na fracção de ceramida.
- 2« Processo para a preparação de compos0 tos da formula (2) ou (3) corn X = NH, e Y = C , caracte\ rizado por se levar a efeito uma reacção de ozonólise a partir de glicoesfingolipidos com esfingosina na fracção de ceramida.

3a

Processo para a preparação de compostos da fórmula (2) com X - NH , caracterizado por se levar a efei z to após uma reacção de ozonólise a partir de glicoesfingolipidos e esfingosina na fracção de ceramida uma aminação redutora com um cianoboro-hidreto alcalino.

- 4a Processo para a preparação de compostos de acoplamento caractérizado por se fazerem reagir moléculas apropriadas com compostos da fórmula (2) ou (3).

- 5a Processo para a preparação de compostos de acoplamento reactivos caracterizado por se acoplarem reagentes heterobifuncionais com compostos da fórmula (2) ou (3).

- 6β Processo para a preparação de conjugados proteicos caracterizado por se fazerem reagir compostos da fórmula (2) ou (3) ou compostos obtidos de acordo com a reivindicação 5 com proteínas.

--7a Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar como principio activo um composto obtido de acordo com o processo de qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em conjunto com substâncias veiculares apropriadas.

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 27 de Novembro de 1988, sob