PT90519B

PT90519B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo um farmaco peptidico e derivados do acido alfa-aminoboronico

Info

Publication number: PT90519B
Application number: PT90519A
Authority: PT
Inventors: Munir Alwan Hussain; Ashokkumar Bhikkappa Shenvi
Original assignee: Du Pont Merck Pharma
Priority date: 1988-05-11
Filing date: 1989-05-10
Publication date: 1994-10-31
Also published as: FI892254A0; NZ229053A; ZA893517B; PT90519A; AU616968B2; FI892254L; EP0341661A2; NO891926L; NO891926D0; EP0341661A3; AU3468289A; KR900017581A; JPH01319428A; DK229089A; FI892254A7; HUT51144A; MY104088A; IL90244A0; IL90244A; DK229089D0

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 90.519

REQUERENTE: E.I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY, norte-americana, com sede em Wilmington, Estado de Delaware, Estados Unidos da América

EPIGRAr-a: Processo para a preparaçao de composições far macêuticas contendo um fármaco peptídico e de rivados do ácido -aminoborónico

INVcN i ORES: Munir Alwan Hussain,

Ashokkumar Bhikkappa Shenvi,

P-eivindicação co direko de prioridade ac a: de 20 de Março de 1SS3.

do arriao 4? da Convenção de Paris í U.S.A., 11 de Maio de 1988, sob o NQ.: 192,690

E.I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO UM FÁRMACO PEPTlDICO E DERIVADOS DO ÁCIDO -AMINOBORÕNICO

Âmbito da Invenção

A presente invenção refere-se a composições farmacológicas peptídicas que contêm derivados de ácido a-aminoborónico, mais particularmente a tipos de composições em formas que são administradas através de várias mucosas absorventes.

Antecedentes da Invenção

Os peptidos e as proteínas são normalmente administrados por via parentérica devido à sua fraca biodisponibilidade quando administrados por outras vias tais como a via oral, nasal, bucal e vaginal. A fracção de péptido ou de proteína que é absorvida de forma intacta pela circulação sistémica depende do modo como possa resistir à degradação provocada pelas peptidases e proteases que geralmente existem no sítio da administração e na barreira constituída pelas mucosas.

As peptidases são geralmente responsáveis pela degradação dos peptidos nos tecidos dos animais (Mammalian Proteases, A. J. Barrett e J. K. McDonald, Eds., Vol . II,

23-102).

Admite-se que a barreira enzimática seja bastante eficiente no que diz respeito à degradação dos peptidos administrados por via oral, originando consequentemente uma fraca biodisponibilidade dos peptidos por via oral. Por outro lado admite-se também que essa barreira seja de eficiência moderada para vias de administração diferentes da via oral favorecendo consequentemente a biodisponibilidade dos peptidos. Por exemplo, demonstrou - se já que o fornecimento do leuprolido, um dos peptidos mais amplamente estudados, por via nasal, rectal e vaginal aumenta a sua biodisponibilidade por um factor correspondente respectivamente a 3, 35 e 112 vezes comparativamente com a via oral. Contudo, a fracção de peptido absorvida pela circulação sistémica é apenas de 0.1, 1.2 e 3.8% da dose aplicada, respectivamente. Por outro lado, a administração subcutânea do leuprolido faz com que mais de 65% do fármaco seja absorvido por via sistémica (Okada et al., J. Pharm. Sei. 71 , 1 367 - 1 37 1, 1 982). É possível que este fenómeno seja devido à presença de aminopeptidases na mucosa nasal, na mucosa rectal e na mucosa vaginal (Stratford et al. , Int. J. of Pharm. 30, 73 - 82, 1985). Como postulado admite-se que a hidrólise da leucina encefalina na cavidade

nasal seja o possível factor responsável pela fraca biodisponibilidade dos pêptidos administrados por via nasal (A. Hussain, J. Faraj, A. Yukihiko, e J. E. Truelove, Biochem. Biophys. Res. Com. 1 33, 923, 1 985) .

Os inibidores análogos em fase de transição são moléculas com geometria semelhante à de um substrato na sua fase de transição e possuem uma afinidade muito mais elevada para o sítio activo de uma enzima do que para o próprio substrato. Esses inibidores são os derivados de ácido aminoborónico descritos na Patente Norte - americana n⁹ . 4 537

733 e na Patente Norte - americana n⁹ . 4 499 082, ali se afirmando que são poderosos e reversíveis inibidores de algumas enzimas proteolíticas. Esses derivados de ácido aminoborónico formam espécies boronato tetraédricas a partir do ácido borónico de estrutura trigonal. Esses boronatos tetraédricos têm comportamento semelhante ao da fase de transição dos pêptidos durante a sua hidrólise provocada pelas proteases.

Existe actualmente a necessidade de dispor de inibidores eficazes das aminopeptidases de modo a estabilizar e melhorar a administração de pêptidos e proteínas farmacologicamente activos por via nasal, bucal, rectal e intramuscular. Os derivados de ácido aminoborónico satisfazem essa necessidade.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção proporciona - se uma composição farmacêutica constituída essencialmente por um veículo adequado sob o ponto de vista farmacêutico, uma proteína ou um péptido, facultativamente também um agente para aumentar a absorção e ainda um derivado de ácido a- aminoborónico de fórmula estrutural:

em que o símbolo HW representa um ácido de origem mineral, um ácido sulfónico, um ácido alcanóico ou um ácido perfluoro-alcanóico;

o símbolo Y representa um radical derivado de um composto de grupo di-hidroxi possuindo pelo menos 2 grupos hidroxi separados pelo menos por dois átomos de ligação em cadeia ou em anel, sendo essa cadeia ou anel constituídos por átomos de carbono e, facultativamente, por um heteroátomo seleccionado entre azoto, enxofre ou oxigénio;

o símbolo R representa um grupo alquilo ou

representa um grupo de fórmula geral -CH₂Ri; o símbolo R] representa um grupo de fórmula geral

-XR2, um grupo arilo ou um grupo arilo substituido com um vários grupos alquilo;

o símbolo X representa o átomo de oxigénio ou de enxofre;

o símbolo R₂ representa -H, alquilo, ou um grupo de fórmula geral -SÍR3R4R5 os símbolos R3, R4 e R5 representam independentemente grupos alquilo, arilo ou arilo substituido com um ou vários grupos alcoxi.

A presente invenção refere-se também à utilização desses inibidores eficazes das aminopeptidases para estabilizar e para melhorar a administração de péptidos ou de proteínas farmacologicamente activos por via nasal, bucal, rectal e intramuscular.

Descrição Pormenorizada da Invenção (1) 0 termo proteína ou péptido significa especificamente os péptidos susceptíveis de serem hidrolisados por proteases, especificamente por aminopeptidases. As proteínas ou péptidos preferenciais são a leucina encefalina, a hormona libertadora da hormona de leutenização (LHLH), Tyr-Phe-Met-Arg-Phe-NH₂, Tvr-Bradiquinina e Timopoietina II (TP5).

f (2) Ο termo agentes para aumentar a absorção significa substâncias que aumentam a incorporação de proteínas e de péptidos e que podem ser utilizados para alterar as características de penetração dos fármacos. Como agentes preferenciais para aumentar a absorção refere-se o colato de sódio, o taurocolato de sódio, o glicocolato de sódio, o desoxicolato de sódio, o taurodesoxicolato de sódio e o glicodesoxicolato de sódio. Existem outros produtos equivalentes que são do conhecimento dos especialistas na matéria.

(3) 0 termo veículo farmaceuticamente adequado significa qualquer veículo não tóxico adequado sob o ponto de vista farmacêutico. Como veículos adequados refere-se os veículos convencionais utilizados para a preparação de formas de dosagem tais como as cápsulas, os comprimidos, os supositórios, as aspersões nasais, os emplastros e os pensos mucosais, dispositivos intra-uterinos (DIU), soluções ou suspensões no estado líquido. Além disso, os componentes separada ou conjuntamente podem ser dissolvidos em veículos normalmente utilizados para injecção. As correspondentes formulações podem ser obtidas recorrendo - se a técnicas utilizadas normalmente pelos especialistas na matéria. As formulações adequadas para outras vias de administração podem ser preparadas com ingredientes não tóxicos vulgarmente utilizados pelos especialistas na matéria. É preferível

utilizar um veículo que seja adequado para administração através de uma mucosa absorvente.

(4) 0 termo derivado de ácido α-aminoborónico significa qualquer derivado descrito na Patente Norte-americana n^s. 4 499 082 e na Patente Norte - americana n^! . 4

537 773. Como derivados preferenciais refere-se os dos Exemplos 5, 13 e 21 da Patente Norte - americana n^a. 4 537 773.

Os derivados de ácido cx-aminoborónico úteis na presente invenção reduzem bastante a hidrólise dos pêptidos e das proteínas tais como a leucina encefalina, HLHL, Tyr-Phe-Met-Arg-Phe-NH2 e Tyr-Bradiquinina em concentrações variando entre valores nanomolares e micromolares ao passo que com outros inibidores conhecidos tais como por exemplo a Bestatina e a Puromicina são necessárias concentrações mais elevadas para exercer um grau idêntico de inibição.

Conforme referido antes, a administração de pêptidos e de proteínas utilizados em combinação com um derivado de ácido a-aminoborónico pode ser efectuada por diversas vias. Esse derivado é utilizado' numa quantidade eficaz suficiente para inibir a hidrólise do péptido ou da proteína provocada por proteases e para aumentar a biodisponibi1 idade através de diversas mucosas. Nos estudos seguintes foram utilizadas soluções para testar a administração de um péptido sem se utilizar um inibidor derivado de ácido α-aminoborónico e procedeu-se à comparação

com a administração do mesmo péptido com adição do inibidor e com adição de um agente para melhorar a absorção, se desejável.

As preparações para administração nasal são geralmente preparações no estado liquido que contêm o péptido que se pretende administrar conjuntamente com uma determinada quantidade de agente inibidor da hidrólise e facultativamente contendo também um agente para melhorar a absorção. Tipicamente essas formulações são preparadas de tal modo que um aspersor calibrado possa administrar uma quantidade aproximada de 0.1 cm³ de líquido contendo todos os ingredientes.

A proporção entre componentes, com base no peso, é geralmente de 0.0001 a 10% no caso do péptido ou da proteína, 0 a 10% no caso do agente para melhorar a absorção, 0.00001 a 5% no caso do inibidor derivado de ácido α-aminoborónico, e 0 a 10% no caso dos conservantes e quantidades de equilíbrio de água destilada, solução salina fisiológica ou solução tampão.

As formulações típicas para administração bucal contêm, em proporções calculadas com base no peso, entre 0.0001 e 10% no caso do péptido ou da proteína, entre 0 e 10% no caso do agente para aumentar a absorção, entre 0.00001 e 5% no caso do inibidor, entre 0 e 10% no caso dos conservantes, entre 0 e 99.9% no caso do veículo não tóxico, entre 0 e 20% no caso do agente de suspensão e quantidades

necessárias de uma matriz polimérica de equilíbrio e/ou de um agente de adesão às mucosas.

As formulações típicas para administração oral que contêm o péptido ou a proteína de valor farmacológico, o inibidor e facultativamente um agente de absorção podem incorporar também diluentes, agentes de granulação, agentes conservantes, agentes aglutinantes, agentes aromatizantes, pigmentos e agentes de revestimento.

É possível preparar outras formulações tais como supositórios, DIU, etc., recorrendo a técnicas e materiais normalmente utilizados pelos especialistas na matéria.

A presente invenção pode ser melhor compreendida tomando como referência os exemplos adiante descritos nos quais todas as partes e percentagens são determinadas em relação ao peso salvo quando especificado de outro modo.

MÉTODOS PARA TESTAR OS INIBIDORES

Para se avaliar a eficácia dos inibidores derivados de ácido a-aminoborónico da presente invenção utilizou-se um modelo animal (de acordo com A. Hussain, J. Furaj, A. Yukihiko e J. E. Truelove, Biochem, Biophys. Res. Com. 133, 923, 1985) de modo a avaliar a degradação das proteínas e dos péptidos in situ e in vivo in situ na cavidade nasal dos ratos.

Modelo Animal método praticado implicou a utilização de ratos da estirpe Sprague-Dawley com a massa aproximada de 300 gramas. Cada um dos ratos foi anestesiado com pentobarbitol de sódio (50 mg/kg). Efectuou-se uma incisão no pescoço e introduziu - se uma cânula pela traqueia constituída por um tubo PE 240. Para os estudos in si tu inseriu-se um segundo tubo, que serviu para introduzir a solução de perfusão, através do isófago até à parte posterior da cavidade nasal. Fechou-se a região nasopalatina com uma fita adesiva para evitar a drenagem da solução de perfusão da cavidade nasal para a cavidade oral. Para os estudos in vivo in situ introduziu - se uma cânula no esófago utilizando um tupo PE 240 fechado numa das extremidades. Empurrou-se a extremidade fechada para a extremidade posterior da passagem nasal e depois fixou-se o tubo nessa posição. Fechou-se a região nasopalatina com uma fita adesiva para evitar a drenagem da solução de perfusão da cavidade nasal para a cavidade oral. A cada rato aplicou-se numa das fossas nasais uma dose de 50 μΐ de solução peptídica em duas formas: a solução de controlo que não continha qualquer inibidor e a solução de ensaio contendo inibidor em concentrações especificadas nos exemplos adiante descritos. A solução de dosagem foi preparada em tampão fosfato 0.1 M (pH 7.4). A determinados intervalos de tempo (um rato/intervalo de tempo) procedeu-se à lavagem do fármaco removendo-o do nariz através da outra fossa nasal utilizando - se para esse efeito 10 ml de tampão fosfato 0.1 M (pH 3.8) com o auxílio de uma bomba peristáltica. Depois

0 colocou-se o produto da lavagem nasal num balão com a capacidade de 10 ml e ajustou-se o volume desse produto para 10 ml com o mesmo tampão e submeteu-se a análise para detecção de petidos por cromatografia em líquido de elevada pressão (CLEP).

As formulações utilizadas para os estudos nasais in vivo in situ continham: o peptido, o inibidor, tampão fosfato 0.1 M a pH 7.4, água purificada e um agente para aumentar a absorção, se desejado. As formulações específicas estão enumeradas em cada exemplo.

MÉTODO ANALÍTICO: A análise da leucina encefalina e do seu principal metabolito implicaram a tomada de aliquotas das amostras que foram diluídas com 200 μΐ de ácido cítrico 0.1 M (pH 2.3) para temperar a hidrólise e submetendo posteriormente essas amostras a análise (para os estudos in vivo in situ, os produtos de lavagem foram injectados tal como foram obtidos). a cromatografia em líquido de elevada pressão (CLEP) foi efectuada em coluna Cg de 4.6 x 250 mm. A fase móvel foi constituída por 0.1 M de NaHgPOzj - Hg PO4 -acetonitrilo (916:5:275) e foi utilizada com um débito de 1.7 ml/minuto. A detecção foi efectuada por UV a 210 nm. Os tempos de renteção para a leucina encefalina e para o seu principal produto de degradação, Des-Tyr-leucina encefalina foram respectivamente de 7.3 e 4.8 minutos. Os resultados foram calculados em percentagem (%) da leucina encefalina

1 remanescente no perfusato nasal em função do atribuindo - se o valor de 100% ao correspondente valor concentração no instante zero.

Exemplo 1 tempo, da

Neste exemplo efectuou-se a perfusão nasal em ratos, conforme descrito antes, com 10 mi de uma solução constituída por uma outra solução de tampão fosfato 0.1 M (pH 7.4) contendo 100 μΜ de leucina encefalina (o peptido) na ausência ou em presença de 0.1 μΜ de sal do ácido trifluoroacético de 3-metil -1 (4,4,5,5- tetrametil-1,3,2 -dioxaborolano- 2 -il)-1 -butamina, (boroleucina) que constitui o inibidor.

Introduziu - se uma quantidade de 10 ml da solução peptídica num recipiente envolto em camisa de água cuja temperatura foi mantida a 37°C e fez-se circular através da cavidade nasal dos ratos utilizando uma bomba peristáltica.

Fez - se	passar	a solução de	perfusão	através	da	cavidade
nasal,	saindo	pelas fossas	nasais at	ravés de	um	funil	e
regressando ao	recipiente	envolto em	camisa	de	água .	0

perfusato foi analisado em conformidade com o MÉTODO ANALÍTICO descrito antes.

Os resultados obtidos neste estudo estão agrupados no Quadro 1.

2

QUADRO 1

DESAPARECIMENTO NASAL IN SITU DE 100 μΜ DE LEUCINA

ENCEFALINA E APARECIMENTO DE DES-TYR-LEUCINA

ENCEFALINA NO PERFUSATO NASAL (10 ml) NA AUSÊNCIA E EM PRESENÇA DE 0.1 μΜ DE BOROLEUCINA

Sem Inibidor 0.1 μΜ de boroleucina

0 Tempo	(Min)	% Leucina Encefalina Remanescente	% Des-Tyr-Leucina Encefalina Formada	% Leucina Encefalina Remanescente	% Des-Tyr-Leucina Encefalina Formada
1	0	100.0 = 0.0	0.0 = 0.0	100.0=0.0	0.0 = 0.0
2	5	94.3 = 0.9	7.7=0.7	96.6 = 1 .5	0.6=0.2
3	1 0	90.5=1.5	12.5=1 .1	93.5 = 3.0	0.9 = 0.3
4	20	79.9 = 6 . 8	23 .0 = 2 . 9	96.4 = 1 .7	1 .3 = 0.6
5	30	66. 0 = 7 .6	31 .3 = 4 . 4	92.7 = 3.3	1 .4 = 0.2
6	45	53.4=6.7	44.0 = 6 . 8	91 .8 = 2 . 5	1 .9 = 0.2
7	60	40.0 = 6 . 7	51 .8 = 5 . 9	88 .8 = 2 . 6	2.4=0.3
8	90	21 . 5±7 . 1	58.4=3.3	85.6=3.5	3.4=0.5

3 produto

Na ausência do inibidor formou-se cerca de 58% de de degradação, Des-Tyr-Leucina Encefalina depois de se ter feito circular o perfusato pelo nariz durante 90 minutos. Por outro lado, em presença de inibidor apenas se formou cerca de 3% desse produto de degradação.

Exemplo 2

Neste exemplo efectuou-se a perfusão nasal de ratos por um processo idêntico ao descrito no Exemplo 1 utilizando 10 ml de uma solução de de tampão fosfato 0.1 M (pH 7.4) contendo 100 μΜ de leucina encefalina na ausência de inibidor e em presença de 0.01, 0.03 ou 0.1 μΜ de boroleucina. Analisou-se o perfusato por CLER conforme descrito no Exemplo 1 e analisou-se também para detecção do produto de degradação da leucina encefalina. Os resultados obtidos estão agrupados no Quadro 2.

4

QUADRO 2

DEGRADAÇÃO NASAL IN SITU DE 100 μΜ DE LEUCINA ENCEFALINA NO PERFUSATO NASAL (10 ml)

NA AUSÊNCIA DE BOROLEUCINA E EM PRESENÇA DE 0.01 μΜ DE BOROLEUCINA, 0.03 μΜ DE BOROLEUCINA

E 0.1 μΜ DE BOROLEUCINA ,

Tempo (Min)	Sem Inibidor	0.01 μΜ de Boroleucina	0.03 μΜ de Boroleucina	0.1 μΜ de Boroleucina
0	100.0 = 0.0	100.0 = 0.0	100.0 = 0.0	100.0 = 0.0
5	94.3 = 0.9		94.1=1.7	96.6 = 1 .5
1 0	90.5=1.5	90.6=3.5	93.6=1.6	93 .5 = 3.0
20	79 . 9±6.8	89.1±5 . 3	91 .8 = 2 . 2	96.4 = 1 .7
30	66.0 = 7 .6	79. 1±2 . 9	88.3 = 1 .4	92 .7 = 3 . 3
45	53 .4 = 6 . 7	74 . 9 = 2.8	85.7=1.3	91 .8 = 2.5
60	40.0 = 6 . 7	69.2=2.0	81 .5 = 1 .4	88.8 = 2 . 6
90	21 . 6 = 7 . 1	56.2=1 .6	72.9 = 1 .0	85.6=3.5

5

Os resultados obtidos demonstram que concentrações crescentes do inibidor boroleucina originam uma inibição crescente da degração da leucina encefalina e consequentemente encontramse concentrações mais elevadas de leucina encefalina no perfusato em função do tempo.

Exemplo 3

Neste exemplo efectuou-se a perfusão nasal em ratos conforme descrito no Exemplo 1 utilizando uma solução de tampão fosfato 0.1 M (pH 7.4) contendo 100 μΜ de leucina encefalina na ausência de inibidor e em presença de quantidades de inibidores correspondentes a 0.1 μΜ de boroleucina ou 0.1 μΜ de sal do ácido trifluoro-acético com

4,4,5,5- tetrametil-a-(1-metil-etil)-1,3,2-dioxaborolano- 2 -metanamina, (borovalina) ou 0.1 μΜ de sal do ácido trifluoro-acético com a,4,4,5,5-pentametil-1,3,2 -dioxaborolano-2-metanamina, (boroalanina) . A análise da degradação da leucina encefalina foi seguida por cromatografia em líquido de elevada pressão (CLEP) tal como descrito no Exemplo 1. Os resultados obtidos estão agrupados no Quadro 3 seguinte.

6

QUADRO 3

NA AUSÊNCIA DE BOROLEUCINA E EM PRESENÇA DE 0.1 μΜ DE BOROLEUCINA, 0.1 μΜ DE BOROVALINA

E 0.1 μΜ DE BOROALANINA
Tempo (Min)	Sem Inibidor	0.1 μΜ de Boroleucina	0.3 μΜ de Borovalina	0.1 μΜ de Boroalanina
0	100.0 = 0.0	100.0 = 0.0	100.0 = 0.0	100.0= 0.0
5	94.3=0.9	96.6 = 1 .5	96.3 = 1 .9	94.7= 3.0
1 0	90.5±1.5	93.5=3.0	95.7 = 1 .5	91.9= 2.1
20	79.9 = 6.8	96.4 = 1 .7	94.8 = 1 .4	88.5= 2.2
30	66.0=7.6	92.7 = 3 . 3	91.6=1.6	84.1= 3.1
45	53.4*6.7	91.8=2.5	89.1=2.5	77.5= 4.4
60	40.0 = 6 . 7	88.8 = 2.6	86.2=2.5	69.9= 6.7
90	21.6 = 7.1	85.6=3.5	78.3=4.3	56.4=12.1

7 _χ·

Os resultados agrupados neste quadro mostram uma comparação entre o efeito inibidor de concentrações equimolares de três derivados de ácido ct - aminoborónico em presença de leucina encefalina. Os inibidores boroleucina e borovalina são superiores ao inibidor boroalanina.

Exemplo 4

Neste exemplo efectuou-se a comparação de uma solução de tampão fosfato 0.1 M (pH 7.4) contendo 100 μΜ de leucina encefalina na ausência de inibidor e em presença de inibidores conhecidos (10 μΜ de bestatina ou 100 μΜ de puromicina) em presença de 0.1 μΜ de boroleucina. As soluções foram aplicadas aos ratos por perfusão nasal em conformidade com o procedimento descrito no Exemplo 1 e depois efectuou-se a análise por CLER conforme descrito no Exemplo 1.

Os resultados obtidos estão agrupados no Quadro 4 seguinte.

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QUADRO 4

NA AUSÊNCIA DE INIBIDOR E EM PRESENÇA DE 10 μΜ DE BESTATINA, 100 μΜ DE PUROMICINA

E 0.1 μΜ DE BOROLEUCINA
Tempo (Min)	Sem Inibidor	10 μΜ de Bestanina	100 μΜ de Puromicina	0.01 μΜ de Boroleucina
0	1 00.0 = 0.0	100.0 = 0.0	100.0 = 0.0	1 00.0 = 0.0
5	94 . 2±0.9	97.3 = 1 .6	96.7 = 2 . 4	96.6 = 1 .5
1 0	90.5=1.5	94.7=1 .7	91.3=3.4	93.5 = 3 . 0
20	79.9 = 6.8	90.0 = 3 . 3	82.4 = 4 . 1	96.4 = 1 .7
30	66.0 = 7.6	86.6=3.8	78.5 = 3 . 2	92 .7 = 3 . 3
45	53.4 = 6.7	79.0 = 5 . 3	73.6=2.2	91 .8 = 2.5
60	40.0 = 6 . 7	72.3=6.7	63 . 5 = 5 . 6	88.8=2.6
90	21 . 5 = 7.0	57.3=3.8	48.9=6.7	85.7 = 3 . 5

9

Os resultados agrupados no Quadro anterior nostram uma comparação da degradação in situ do péptido leucina encefalina na ausência de inibidores e em presença de três inibidores diferentes administrados em concentrações diferentes. A inibição de degradação foi ordenada pela ordem seguinte: boroleucina> bestatina> puromicina. 0 efeito inibidor da boroleucina foi melhor do que o efeito da bestatina para concentrações molares que correspondem a 1/100 da concentração da bestatina. Este facto demonstra claramente a potência da boroleucina como inibidor comparativamente com os inibidores actualmente conhecidos.

Exemplo 5

Neste exemplo administrou - se aos ratos, conforme descrito no Exemplo 1, uma solução de tampão fosfato 0.1 M (pH 7.4) contendo 35 μΜ de HLHL (fragmento 3-10) na ausência de inibidor e em presença do inibidor boroleucina para uma concentração de 0.46 μΜ. Efectuou-se a análise do perfusato por CLEP conforme descrito no Exemplo 1 com excepção da fase móvel utilizada. A fase móvel que realmente se utilizou foi constituída por 0.1 M de NaH₂PO₄:H3PO4:CH3CN(916:5:240) aplicada com um débito de 1.7 ml/minuto e analisou-se por UV a 210 nm. Os resultados obtidos estão agrupados no Quadro 5 seguinte.

QUADRO 5

DESAPARECIMENTO NASAL IN SITU DE 35 μΜ DE HLHL (FRAGMENTO 3-10/ NO PERFUSATO NASAL (10 ml)

NA AUSÊNCIA E EM PRESENÇA DE 0.46 μΜ DE BOROLEUCINA

Tempo Ausência de 0.46 μΜ de (Min)_Boroleucina_Boroleucina

0	100.0	1 00
5	96.0	96
1 0	93 . 8	97
20	91.6	95
30	85 . 3	96
45	70.4	95
60	61.3	91
90	45.0	92
1 20	24 . 4	86

desaparecimento da HLHL é muito mais rápido na ausência de inibidor. A presença de boroleucina numa concentração muito pequena permitiu a retenção de cerca de 86% do composto comparativamente com o valor de 24% sem o inibidor.

Exemplo 6

Neste exemplo administrou - se por via nasal aos ratos, tal como descrito no Exemplo 1, uma solução de tampão fosfato 0.1 M (pH 7.4) contendo 100 μΜ de Tyr-Phe-Met-Arg--Phe-NH2. Administrou-se o péptido na ausência de inibidor e em presença de 2 μΜ de boroleucina. Analisou-se o perfusato por CLEP utilizando o procedimento descrito no Exemplo 1 com excepção da fase móvel a qual foi constituída por 0.1 M de NaH2PC>4 : H3PO4 : CH3CN (200:1:60) aplicada com um débito de 1.4 ml/minuto. A detecção foi efectuada por UV a 210 nm.

Os resultados obtidos estão agrupados no Quadro 6 seguinte.

QUADRO 6

DESAPARECIMENTO NASAL IN SITU DE 100 μΜ DE TYR-PHE-ARG-PHE-NH₂ NO PERFUSATO NASAL (10 ml)

NA AUSÊNCIA DE BOROLEUCINA E EM PRESENÇA DE 2 μΜ DE BOROLEUCINA

Tempo (Min)

Ausência de Boroleucina μΜ de Boroleucina

0	100.0	100.0
5	85 . 4	93.8
1 0	80.7
20	7 1.1	84 . 3
30	59.5	78.8
45	44.4	70.5
60	30.4	63 . 3
90	10.6	49.5
1 20	2 . 8	32.9

Os resultados agrupados no quadro demonstram que para uma concentração de permanece intacta uma proporção de comparativamente com a proporção de inibidor.

μΜ de

33% % na anterior boroleucina do péptido ausência de

Exemplo 7

Neste exemplo administrou - se aos ratos uma solução de tampão fosfato 0.1 M (pH 7.4) contendo leucina encefalina na dose de 100 μ9/Γ3ΐο utilizando - se como aditivo para melhorar a penetração colato de sódio a 0.05%. Administrou - se o péptido e o agente para melhorar a penetração na ausência de inibidor e em presença do inibidor boroleucina o qual foi utilizado numa concentração correspondente a 0.054 μg/rato. 0 modelo animal para este estudo foi o mesmo descrito no Exemplo 1 com as excepções do regime de dosagem e do regime de amostragem. O método de administração consistiu em aplicar as doses aos ratos por uma das fossas nasais com 50 μΐ da solução peptídica em presença ou na ausência de inibidor com o auxílio de uma seringa de 50 μΐ Hamilton a cuja extremidade estava ligado um tubo PE-50 de 0.5 cm. A intervalos de tempo determinados (um rato/intervalo) procedeu-se à lavagem do fármaco removendo-o do nariz pela outra fossa nasal com 10 ml de tampão fosfato 0.1 M (pH 3.8) com o auxílio de uma bomba peristáltica. O produto da lavagem nasal foi despois colocado num balão com a capacidade de 10 ml e ajustou-se o volume

4 *5ϊ desse produto até 10 ml com o mesmo tampão e depois analisou -se para determinação do peptido recorrendo - se ao mesmo método analítico descrito no Exemplo 1 .

Os resultados obtidos neste exemplo estão agrupados no Quadro 7 seguinte.

QUADRO 7

DESAPARECIMENTO NASAL IN VIVO/IN SITU DE LEUCINA

ENCEFALINA (100 pg/RATO) E APARECIMENTO DE DES-TYR-LEUCINA ENCEFALINA EM PRESENÇA DE

COLATO DE SODIO A 0.05% EM PRESENÇA E

NA AUSÊNCIA DE BOROLEUCINA (0.054 pg/RATO)

Leucina Leucina

Tempo Encefalina Des-Tyr Encefalina Des-Tyr (Min) Sem Inibidor Sem Inibidor Com Inibidor Com Inibidor

0	92.1*6.9		94 . 4± 7.2
5	54.0*5.4	17.0±2.7	71 . 4± 1.8
1 0	34.7±9.2	21 . 5±1 . 2	64 . 3± 5.6	0.6*0
20	19.8±9.2	21 .0*4 . 1	38 . 1±15 . 2	1 .6*0
30	7.6*6.2	16.5±3 . 8	28 . 7±10.8	1 . 9±1
50	2.3±1.2	7.9±2 . 2	1 2.8± 4.0	2,2±0

Observou-se o desaparecimento nasal in vivo in situ da leucina encefalina e o aparecimento do seu metabolito principal Des-Tyr-leucina encefalina. Na ausência de inibidor o desaparecimento da leucina encefalina ocorre por absorção e degradação em Des-Tyr-leucina encefalina e ainda por absorção deste último composto. Em presença do inibidor o desaparecimento da leucina encefalina deve-se fundamentalmente à absorção observando - se uma degradação desprezável.

Exemplo 8

Procedeu-se em conformidade com o Exemplo 7 com a excepção de se ter estudado o péptido Tyr-Phe-Met-Arg-Phe-NH2- Neste caso administrou - se o péptido para valores de concentração correspondentes a 50 μα num volume de 50 μΐ/rato em presença ou na ausência do inibidor boroleucina. A concentração para o inibidor utilizado foi de 0.3 pg/rato. Neste estudo não foi utilizado qualquer agente para melhorar a absorção.

Os resultados obtidos estão agrupados no Quadro 8 seguinte.

QUADRO 8

DESAPARECIMENTO NASAL IN 5ITU IN VIVO DE

TYR-PHE-MET-ARG-PHE-NH₂ (50 μg/RATO)

NA AUSÊNCIA E EM PRESENÇA DE

BOROLEUCINA (0.3 pg/RATO)

Tempo Ausência de (Min)Boro leucina

0.3 μg/Rato (Boroleucina)

0.0

2.5

5.0

10.0

100.0

60.4 . 9

1.5

0.0 . 5 . 2 . 9

100.0

84.2

67.3 . 1

0.0 . 8 . 7 . 7

Os resultados agrupados no quadro anterior demonstram que o desaparecimento de Tyr-Phe-Met-Arg-Phe-NH₂foi mais rápido na ausência de inibidor.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas, apropriadas para administração por via oral e nasal, caracterizado pelo facto de misturar essencialmente um derivado do ácido

C<_-aminoborónico de fórmula geral

0 R /\ s/

Y B \/ ²0 na qual

HW representa um ácido mineral, um ácido sulfônico, um ácido alcanóico ou um ácido perfluoroalcanõico;

Y representa um grupo derivado de um composto dihidroxi, comportando pelo menos 2 grupos hidroxi separados por peio mer.os dois átomos que se ligam numa. cadeia ou anel, incluindo a referida cadeia ou anel átomos de carbono e, facultativamente, um heteroátomo escolhido entre azoto, enxofre ou oxigénio ;

R representa um grupo alquilo ou um grupo de fórmula geral -CH^Rp ^Rj_ representa um grupo arilo comportando, facultativamente, como substituinte(s) um ou mais grupos alquilo, ou representa um grupo de fórmula geral -XR^;

X representa um átomo de oxigénio ou de enxofre;

R^ representa um átomo de hidrogénio, um grupo alquilo ou um grupo de fórmula geral -SiR^R^ç.,Rg, R^ e R_ representam, cada um, independentemente, um grupo alquilo ou arilo, comportando, facultativamente, como substituinte(s), um ou mais grupos alcoxi; como agente inibidor de hidrólise, em uma quantidade inibidora eficaz compreendida entre 0,00001 e 5%, com uma proteína ou péptido , com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e, facultativamente, com um agente indutor da absorção.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma proteína ou péptido susceptível de hidrólise pela acção de proteases.

BAD ORIGINAL
3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se escolher a proteína ou péptido no grupo constituído por encefalina leucina, LH-RH, Tyr-Phe-Met-Arg-Phe-NH₂, Tyr-braciquinina e Timopoietina II.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o símbolo Y representar um grupo (CH, ) _C-C (CHH ) , ,

I !

-CH₂CH₂-, (C?₃)₂C-C(CF₃)₂ ou -(CH₂)₂NK(CH₂)₂-.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o símbolo R representar um grupo -CH, , -CH(CH₃)₂,
6.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o símbolo HW representar o ãcido CF₃CC>₂H, CH₃CO₂H, HC1 ou HBr.
7·- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar o sal do ácido trifluoroacético de

3-metil-l-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano-2-il)-1-butamina como derivado do ácido -aminoborõnico,