PT90511B

PT90511B - Processo de producao de dimeros de acido nucleico

Info

Publication number: PT90511B
Application number: PT90511A
Authority: PT
Inventors: Barbara Chen Fei Chun; Leslie Eleazer Orgel
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1988-05-09
Filing date: 1989-05-09
Publication date: 1994-10-31
Also published as: PT90511A; ZA893390B; AU3764989A; WO1989010978A1

Description

MEMORIA DESCRITIVA

Governo dos Estados Unidos tem alguns direitos sobre o invento aqui revelado e reivindicado, em consequência do financia mento para o trabalho relacionado com o referido invento ter sido concedido por U.S. National Institutes of Health.

Âmbito Técnico presente invento refere-se genericamente, â ligação, um ao outro, de dois ácidos nucleicos. Mais particularmente, o invento refere-se a um processo de produção de um dimero de dois ácidos nucleicos, ligados covalentemente através dum ligante, o qual inclui uma fonte dissulfureto e que está ligado a um carbono da ribose de um nucleótido terminal de cada um dos ácidos nucleicos.

Antecedentes do Invento

Novos procedimentos para ligar, uns aos outros, biopolime ros discretos, estão a ser activamente procurados nos campos da biologia molecular e da biotecnologia. Uma abordagem que tem sido largamente utilizada envolve a incorporação de um análogo de nucleótido contendo um grupo ligante convenientemente protegido em lugar de um dos monómeros padronizados num procedimento sintético de fase sólida para produção de um oligodesoxinucleótido sin tético e, em seguida, após isolamento e desprotecção do oligonucle^ ótido, reacção da porção de ligação do grupo ligante com uma porção de ligação adequada unida ao outro ácido nucleico ou a outro tipo de biopolímero. Estes procedimentos que introduzem um grupo tiol no terminal 5' ou no terminal 3' de um oligonucleótido foram relatados e num caso o produto oligonucleótido foi acoplado a uma proteína, uma nuclease de micrococo.

Contudo, estes procedimentos sintéticos não são aplicáveis quando é necessário unir um ligando a um oligonucleótido ou ácido nucleico não protegido que tenha sido sintetizado enzimaticamente ou isolado a partir de fontes naturais. Seria, portanto, vantajoso possuir uma metodologia alternativa para ligar um polinucleótido ou oligonucleótido não protegidos a qualquer um de uma

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larga série de ligandos, incluindo outros ácidos nucleicos.

Chu e colab., Nucleic Acids. Res. 11, 6513-6529 (1983);

Chu e Orgel, Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA 82, 963-967 (1985); e Chu e Orgel, DNA 4, 327-331 (19Θ5) revelam métodos para derivar oligonucleótidos curtos, através de um fosfato terminal, com compostos com um grupo amino primário, o qual forma um grupo fosfora midato com o fosfato. Cm Chu e colab., Nucleic Acids Res. 14,

5591 - 5603 (1986), e Publicação do Pedido Internacional - PCT N9. W0 87/06270, é descrita a derivação de oligonucleótidos ou ARNs replicativos com cistamina, (NH₂(CH₂)₂SS(CH₂)₂NH₂), através de um fosfato do terminal 5' do ARN replicativo ou de um dosfato do te_r minai 5' ou do terminal 3' do oligonucleótido, assim como a ligação de um ARN replicativo e de um oligonucleótido, assim derivado, através de uma porção de ligação de fórmula

-q(po₂)nh(ch₂)₂ss(ch₂)₂nh(po₂)o-.

Chu e colab., Nucleic Acids Res. 14, 5591 - 5603 (1986) e Publicação da Aplicação Internacional - PCT NS. W0 87/06270, também revelam o uso de ARN replicativos, tal como ARN MOV-1, ligados covalentemente a uma molécula com afinidade para oligonucleótidos, como sonda num ensaio de hibridação com sonda de ácido nucleico para ácido nucleico de analito, ao qual a molécula com afi nidade se liga especificamente através do empareihamento das bases complementares. Num tal ensaio, em que o ligante entre o ARN replicativo e a molécula com afinidade inclui um grupo dissulfure to, o ARN replicativo é separado da molécula com afinidade, após hibridação do aduto de ARN replicativo-molécula com afinidade para o analito numa amostra e remoção, por lavagem, do sistema de ensaio, de aduto de ARN replicativo-molécula com afinidade que não se tenha hibridado a analito, por redução do dissulfureto, e, em seguida, o ARN replicativo libertado é replicado autocataliticamente com uma replicase adequada e detectado.

Consequentemente, seria vantajoso um processo fácil e ef_i ciente para produzir adutes de ácidas nucleicos de cadoia simples com moléculas com afinidade para oligonucleótidos (ou polinucle_ó tidos), em que o ligante entre os ácidos nucleicos de um aduto

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inclui um grupo dissulfureto e particularmente os adutos entre ARN replicativos e moléculas com afinidade para oligonucleótidos (ou polinucleótidos).

presente inuento fornece um tal processa fácil e eficiente o qual, adicional e vantajosamente, não necessita de grupos protectores nos reagentes de ácido nucleico, pode ser aplicado com ácidos nucleicos que foram sintetizados enzimaticamente ou produzidos in vivo, e não requer a utilização de biotina-avidina ou outras substâncias proteináceas no ligante entre ácidos nucle_i cos.

Sumário do Invento invento refere-se a um processo aperfeiçoado para sinte tizar um aduto de dois ácidos nucleicos, os quais estão ligados covalentemente por um ligante que inclui um dissulfureto e que es tá ligado através de uma porção de ligação ao carbono 5’ do nucleó^ tido 5' ou ao carbono 3’ do nucleótido 3' de um dos ácidos nuclei. cos e através da outra porção de ligação ao carbono 5’ do nucleótido 5’ ou ao carbono 3' do nucleótido 3’ do outro ácido nucleico.

No processo aperfeiçoado, os dois ácidos nucleicos a serem dimerizados, cada um deles derivado terminalmente (isto é, através de uma porção de ligação ligada ao carbono 5' do nucleóti do 5' ou ao carbono 3' do nucleótido 3') com um grupo contendo dissulfureto, são combinados numa solução aquosa com um agente re dutor numa concentração redutora e eficaz de dissulfureto, e, em seguida, enquanto a solução é mantida sob condiçães redutoras, os compostos contendo grupos sulfidrilo de baixo peso molecular formados pela redução dos dissulfuretos ligados aos ácidos nucleicos, são dialisados da solução. Finalmente, a solução é submetida a condiçães oxidantes, facultativamente enquanto o agente redutor é dialisado da solução e forma-se o desejado dímero de ácido nucle_i co, com os ácidos nucleicos ligados através de um dissulfureto. Descrição Detalhada do Invento □ presente invento refere-se a um aperfeiçoamento de um processo de ligação de um primeiro ácido nucleico, o qual é derivado terminal mente com uma porção de Fórmula I

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-6-0(P0₂)NH(R₁₁)55(R₁₂)NH₂ e de um segundo ácido nucleico, o qual é derivado terminalmente com uma porção de fórmula II

-0(P0₂)NH(R₂₁)ΞΞ(R₂₂)NH₂ II na qual R^» R·^, ^₂l ^θ ^22 ^sSo ^9^ua^^{s ou} diferentes e cada um d.e les é um grupo alquileno de 2 a 20 átomos de carbono ou um grupo cicloalquileno de 3 a 20 átomos de carbono, para produzir um dime ro dos referidos dois ácidos nucleicos unidos por um ligante de fórmula III)

-o(po₂)nh(r₁₁)ss(r₂₁)nh(po₂)o- iii processo este que compreende a combinação dos referidos primeiro e segundo ácidos nucleicos numa primeira solução aquosa, com uma concentração, eficaz na redução de dissulfureto, de um agente redutor seleccionado a partir do grupo constituído por ditiotreitol ditioeritritol, M^(BH^) e M^(BH^CN), em que é seleccionado a partir do grupo constituído por Li⁺, Na⁺ e K⁺, e, em seguida, sujeitando a referida primeira solução a condiçães oxidantes, por meio do que se forma o referido dimero dos referidos dois ácidos nucleicos.

aperfeiçoamento, do invento, compreende a diálise da re ferida primeira solução contra uma segunda solução aquosa, a qual tem uma composição tal que (i) a concentração, na referida prime.! ra solução, de um agente redutor, seleccionado a partir do grupo constituído ditiotreitol, ditioeritritol, M^(BH^) e M^(BH^CN), em que M é seleccionado a partir do grupo constituído por Li⁺, Na⁺e K⁺, é mantida num nível eficaz na redução de dissulfureto, e (ii) a proporção da concentração molar na referida primeira solução, do composto de fórmula IV hs(r₁₂)nh₂ IV para a concentração molar, na referida primeira solução, de todos os derivados do referido primeiro ácido nucleico (isto é, do refe rido primeiro ácido nucleico em todas as suas formas), e a propo_r

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-7ção da concentração molar, na referida primeira solução, do composto de fórmula V hs(r₂₂)nh₂ V para a concentração molar, na referida primeira solução, de todos os derivados do referido segundo ácido nucleico, diminuem.

Os especialistas compreenderão que porções diferentes das acima definidas para R^^, R^₂, R22 ^e ^22’ P^oc^^{eni ser} empregues para ligar covalentemente o grupo fosfamidato ao sulfidrilo ou ao dissulfureto (no caso de Rj^ e R^) ^{e 0} dissulfureto ao grupo amino (no caso de R^₂ ^e ^22^ ^{nos ac}'^u^^os de ácido nucleico empregues em, ou produzidos de acordo com o inuento. Enquanto os grupos alquileno e cicloalquileno acima descritos são adequadamente estáveis, não reactivos com grupos funcionais nos ácidos nucleicos, e, particularmente, no caso de n-alquilenos com cerca de 2 a 8 átomos de carbono, convenientemente disponíveis, outros grupos que são estáveis nas condiçães reaccionais empregues na realização do invento, que não reagem com grupos funcionais nos ácidos nucleicos e que não diminuem a solubilidade, em solução aquosa, dos ácidos nucleicos derivados, a níveis tão baixos que os métodos de acordo com o invento não possam ser realizados numa escala de tempo utilizável na prática, podem ser empregues. Assim, por exemplo, cada um de Rj_j, R^2’ ^R21 ^{6 R}22’ Ρ°^^ε ter a fórmula ’ em que R^ é igual ou diferente de R^^, θ cada um de R^^ e R-j-j é seleccionado a partir de alquileno, preferivelmente de 1 a 4 átomos de carbono e R^₂ é seleccionado a partir do grupo constituído por fenileno ou -(NH)(CO)-.

Por concentração ou nível eficaz na redução de dissulfure to significa que a proporção da concentração do agente reduror (em todas as formas, incluindo completamente reduzido, parcialme_n te oxidado (se há mais do que um estado de oxidação), e completamente oxidado) numa solução, para a concentração na solução dos ácidos nucleicos derivados terminalmente (de todos os seus deriva^ dos, incluindo monómeros, homodímeros e heterodímeros) a serem l_i gados de acordo com o processo do invento, é tal que, em equilíbrio à temperatura ambiente, pelo menos metade das moléculas de

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cada um dos referidos ácidos nucleicos estaria na forma monomérica, isto é, não ligada através de um ligante com um grupo dissulfureto a outra molécula de ácido nucleico. As concentrações ef_i cazes na redução de dissulfureto dependerão da natureza do agente redutor, da concentração do(s) agente(s) oxidante(s), se existir algum na solução, e das concentrações, na solução, dos ácidos nucleicos a serem ligados de acordo com o invento. A determinação das concentrações, eficazes na redução de dissulfureto, dos agentes redutores empregues no processo de acordo com o invento, é simples e directa para os especialistas vulgares.

A fim de conduzir rapidamente as reduções do dissulfureto até à conclusão ou de assegurar que virtualmente todos os dissulfuretos ligados a ácidos nucleicos numa solução sejam mantidos no estado reduzido, devem ser empregues concentrações do agente redu tor em grande excesso relativamente às concentrações eficazes na redução de dissulfureto.

agente redutor mais preferido para uso de acordo com o invento é ditiotreitol. Porém, tal como acima indicado, outros agentes redutores, tais como ditiocritritol e sais, particularme_n te os sais de metais alcalinos, de BH^ e BH^CN, podem também ser empregues. Na generalidade, pode ser utilizado qualquer agen te redutor que, em água, seja solúvel até, pelo menos, cerca de 1 mM, e suficientemente estável (isto é, não seja oxidado, decompos. to ou de qualquer outro modo tornado ineficaz como agente redutor em água, com um tj_/2 ^{8e menDS} de cerca de 1 hora), e não forma, com um grupo sulfidrilo, ligado através de um grupo de fórmula -0(P0?)NH(R₁i)- a um carbono 5' de um nucleótido 5' ou a um carbo no 3' de um nucleótido 3' de um ácido nucleico, um aduto que seja tão estável que, sob condições oxidantes, a formação de dissulfuretos entre tais sulfidrilos ligados a ácidos nucleicos seja subs. tancialmente impossibilitada. Assim, por exemplo, o beta-mercapto etanol não é um agente redutor aceitável para uso no processo aperfeiçoado de acordo com o invento.

Na realização do processo de acordo com o invento, é prefe rido que a diálise, enquanto o agente redutor é mantido a um nível eficaz na redução de dissulfureto, seja continuada até que a

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-9concentração molar do composto de Fórmula IV, na primeira solução, se torne menor do que cerca de 10% da concentração molar do primeiro ácido nucleico, em todas as suas formas, nessa solução e a concentração molar do composto de Fórmula V na solução de ácido nucleico, se torne, de forma similar, menor do que cerca de 10% da concentração molar do segundo ácido nucleico, em todas as suas formas, nessa solução.

Não é necessário, no inicio da diálise, para diminuir as concentrações dos compostos de Fórmulas IV e V na referida primei, ra solução de ácido nucleico, que o agente redutor, na segunda s_o lução, contra a qual a referida primeira solução é dialisada, con sista no(s) mesmo(s) composto(s) que o agente redutor na referida z

primeira solução. F apenas necessário, quaisquer que sejam as composições dos agentes redutores respectiuos e o modo como a coni posição do agente redutor na referida primeira solução possa mudar no decurso da diálise, que as concentrações do(s) composto(s) de agente redutor, na referida primeira solução, se mantenham ef_i z

cazes na redução de dissulfureto durante a diálise. E, contudo, preferido que seja empregue como agente redutor em ambas as referidas primeira e segunda soluções um de entre ditiotreitol e ditioeritritol. Tal como indicado acima, o mais preferido é o ditiotreitol .

z

E após a diálise que, de acordo com o invento, a primeira solução é submetida a condições oxidantes, para diminuir as concentrações dos compostos de Fórmula IV e V.

Os processos para submeter uma solução a condições oxidan tes, a fim de provocar a formação de dissulfuretos a partir de tióis, são também bem conhecidos dos especialistas. A exposição simples da solução ao ar, facultativamente com agitação, é geralmente suficiente. Um gás contendo 0₂ diferente do ar, incluindo 0₂ puro e misturas de 0₂ com N₂ ou vários gases inertes, pode tani bém ser utilizado e pode ser introduzido por depuração da solução com o gás, ou borbulhamento do gás através da solução.

Num processo preferido para submeter uma solução a condições oxidantes, após as concentrações dos compostos de Fórmulas IV e V terem sido reduzidas até a um nível desejado, permite-se

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-10que o oxigénio do ar entre na solução depois, ou durante, a drálise da solução contra uma terceira solução a qual está substancialmente livre de agente redutor capaz de reduzir ligações dissul fureto. Subs tancial mente liure significa que, no início da di_á lise, a concentração do agente redutor está, pelo menos, um factor de 10 abaixo da concentração eficaz na redução de dissulfureto na referida solução de ácido nucleico, a qual está a ser submetida a condições oxidantes. Preferivelmente no início da referida diálise não haverá essencialmente, agente redutor capaz de reduzir as ligações de dissulfureto, na referida terceira solução.

Os processos de preparação de ácidos nucleicos derivados empregues no processo aperfeiçoado de acordo com o invento, são conhecidos. Ver, por exemplo, a Publicação Internacional do Ped_i do do ^atente Cooperation Treaty nS. W0 87/06270.

Prefere-se sobretudo que ps ácidos nucleicos sejam deriva, dos terminalmente através do carbono 5' do nucleótido 5'.

Além disso, é preferido que R·^ , R·^» ^21 ^{e R}22 ’ ^seJ^a’ ^c— da um deles, n-alquileno de 2-8 átomos de carbono e o mais preferido é que cada um deles seja etileno (-(082)2)·

Numa aplicação preferida do invento, um oligonucleótido, que é uma molécula com afinidade para um analito de ácido nucle_i co a ser detectado num ensaio de hibridação com uma sonda de ácido nucleico e que consiste preferivelmente em 10-100 nucleótidos numa sequência que é complementar à de um segmento do analito, é ligada a um ARN replicativo. Métodos para a utilização de um tal dímero de oligonucleótido-ARN replicativo estão descritos na Publ_i cação Internacional do Pedido do Patente Cooperation Treaty n⁹.

WO 87/06270.

A utilização nos ensaios de hibridação com sondas de ácj_ dos nucleico de dímeros de um oligonucleótido ligado a outro, em que pelo menos um dos oligonucleótidos é uma molécula com afinidai de para um analito de ácido nucleico, é descrita em seguida.

invento será agora ilustrado em algum detalhe com os exemplos seguintes.

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File 47100 «5- ff

-11EXEMPLO 1

Materiais e Métodos

A electroforese em gel foi realizada numa matriz de geles de poliacrilamida a 6% ou 20%, com 0,5-1,0 mm de espessura e processada em borato de Tris 90 mM, pH 8,0 e EDTA 1 mM, com ou sem ureia 7 M.

Auto-radiografias dos geles foram obtidas por exposição a uma película Kodak X-Omat AR a -80QC com ou sem um écran de interi sificação Cronex Lightning Plus da DuPont.

0s ARN foram precipitados da solução por adição de 2 volu.

mes de etanol a -80QC, na presença de NaCl 100 mM. Todos os adutos de ARN e oligonuclefitidos foram extraídos a partir dos geles com acetato de amónio 500 mM, pH 7,2, EDTA 0,1 mM e SDS a 0,01%.

Eles foram então purificados por passagem através de um cartucho 2 0 de purificação de ácido nucleico Nensorb da Du Pont (DuPont, Inc., Wilmington, Delaware, E.U.A.).

A tubulagem de diálise (cut-off de P.M. 1000) foi tratada com anidrido acético durante 1 hora e, em seguida, lavada com NaHCO^ a 2% e EDTA 1 mM.

A não ser que seja especificado de outro modo, os adutos ligados por meio das ligações dissulfureto foram reduzidos durante 1 hora, à temperatura ambiente, com DTT 10 mM em Tris-EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) a pH 7,2. A redução das ligaçães dissulfureto necessitou de uma concentração de, pelo menos, 5 mM de DTT e podiam ser mantidas na condição reduzida com 0,1 mM de DTT.

0s heterodímeros de ácido nucleico formados pelo processo de acordo com o invento podem ser separados dos componentes que não reagiram e dos homodlmeros por electroforese em gel de poliacrilamida em matrizes de geles e processados em borato de Tris 90 mM, EDTA 1 mM, ureia 7 M (pH 8,0), tal como é sabido na especialidade, e em seguida eluldos do gel e concentrados num con centrador speed vac.

A cromatografia líquida de elevado rendimento (HPLC) dos oligonucleótidos pode ser realizada em RPC-5 a pH 12, utilizando

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um gradiente de perclorato, tal como descrito por Bridson e Orgel, 0. Mol. Biol. 144, 567-577 (19B0).

ARN MDV-1 derivado com cistamina através de um grupo fosforamidato ligado ao carbono 5' do nucleótido 5' foi preparado tal como descrito na Publicação do Internacional do pedido do Patent Cooperation Treaty NQ. W0 87/06270. 0 ARN MDV-1 derivado com cistamina 5' pode ser separado da cistamina que não reagiu por electroforese em gel ou por HPLC numa coluna de exclusão de gel SynChropak GPC 60 (SynChrom, Inc., Lafayette, Indiana, E.U.A.) por eluição com EDTA 0,1 mM a pH 7.

oligodesoxiribonucleótido,

5'-CACAATTCCACACAAC-3 ' (daqui em diante 16 mero) é complementar em sequência aos resíduos 6170-6185 da cadeia (+) de ADN M13mplB. 0 oligodesoxiribonucleótido

5'-TCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTT-3' (daqui em diante 37 mero) tem a mesma sequência que os resíduos 6164-6200 da cadeia (+) M13mplB.

16mero e o 37mero foram sintetizados em Applied Biosystems Synthesizsd Model 380. A purificação dos dois oligómeros, e a sua conversão a fosfatos 5', ô descrita por B,C.F. Chu, e colab. , Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA, 82, 963-967 (1985). 0 ADN M13mpl8 de cadeia simples pode ser adquirido em Nem England Biolabs (Beverly, Massachusetts, E.U.A.).

0,01-0,5 unidades de O.D. (medidas a 260 nm) de 5'-P-15me 32 ro ou 5'-/~ P_7-16mero reagiram com 1-metilimidazol 0,1 M (pH 7), l-etil-3,3-dimetilaminopropilcarbodiimida 0,15 M (carbodiimida) e di-hidrocloreto de cistamina 0,5 M (pH 7,2) num volume de 50-250 yx.1 a 50BC durante 2 horas. 0 produto foi separado dos reagentes por HPLC em RPC-5. 0 rendimento variou entre 75% e 85%. 0 16mero derivado no carbono 5' do nucleótido 5’ com nh₂ ( ch₂ ) ₂ss ( ch₂ )₂nh (/“³²p_7o₂ ) 069 270

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/“32 7 /“32 ”7 (designado por 5 ’-cistamina-^i P_/-16mero) e o 5’-2j P_/-16mero foram também facilmente separados por electroforese em gel de poliacrilamida a 20% contendo ureia 7 M.

/—32 -7 aduto de cistamina correspondente de 5'£ P_/-37mero foi obtido por procedimentos análogos.

Para mostrar que a carbodiimida não reage com o grupo dis sulfureto, uma amostra de 5'-cistamina-P-16mero foi produzida, primeiro, por isolamento do aduto estável 5’-imidazolido de 5'-P-lómero (ver Chu e colab., Nucl. Acids Res. 11, 6513-6529 (1983)) e, em seguida, tratamento do aduto de imidazolido com cistamina na ausência de carbodiimida. Este procedimento originou um produ. to que apresentava a mesma mobilidade, quer na HPLC com RPC-5, quer na electroforese em gel, que o produto produzido pelo procedimento de passo único com 1-metilimidazol.

5’-cistamina-P-16mero 6 convertido em 5’-tio-etilamino-P-16mero numa hora com DTT 5 mM a pH 7, e pode ser mantido no eg tado reduzido com DTT 0,1 mM. 0s 5’-P-16mero, 5'-cistamina-P-16 mero e 5'-tio-etilamino-P-16mero são facilmente separados por electroforese em gel.

EXEMPLO 2

Síntese de 5 '-£~^P_£-16meio-SS-5 '-£~'^>^Ρ_^-16ίηβτο ou 5'-£~^p£/-37mero

Uma solução de 5 yUM (25-50 ) de 5'-cis tamina-/32p_y_

-16mero (10^-10^ cpm), ou uma solução de 5 yxM de 5'-cistamina-P-16mero e 10^-10^ cpm de 5'-cistamina-/^-^^P_7-37mero, foi tratada cora ditiotreitol (DTT) 6 mM em tampão de Tris 10 mM contendo EDTA 1 mM (tampão Tris-EDTA) a pH 7 durante 1 hora a 25SC. A mistura reaccional foi então dialisada contra um litro de tampão contendo Tris 1 mM, pH 7,2 e DTT 1 mM, durante 30 minutos a 4SC. Foi, em seguida, dialisado contra tampão fresco contendo Tris 1 mM, pH 7,2 e EDTA 1 mM, durante mais 30 minutos. Após concentração num concentrador de speed-vac, os produtos foram separados dos reagej} tes por electroforese em poliacrilamida a 20% sob condiçães desna turantes (isto é, com ureia 7 M). Os rendimentos do lómero dimerizado variaram entre 30% e 40% e do 5^,-P-16mero-SS-/^—^^P_7-37mero de 45% a 55%.

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-14EXEMPLO 3

Síntese de 5¹-P-16mero-SS-5’^^P_7-ARN MDU-1

10^-10^ cpm (5-500 mg) de 5’-cistamina-/^-^^P_/-ARN MDU-1 e uma solução de 5 yxM de 5'-cistamina-P-16mero (volume total de 25-50 ^1) foram tratados durante 1 hora com DTT 6 mM e tampão de Tris-EDTA a pH 7. A mistura reaccional foi então dialisada contra um litro de tampão contendo Tris 1 mM, pH 7,2, EDTA 1 mM e DTT 0,1 mM, a 4flC durante 30 minutos. A solução foi, em seguida, dialisada contra 1 litro de tampão (saturado com ar à temperatura ambiente) contendo Tris 1 mM, pH 7,2, e EDTA 1 mM, durante mais 30 minutos a 42C. A solução reaccional foi então concentrada num concentrador de speed-vac e o produto separado dos reagentes em poliacrilamida a 6% contendo ureia 7 M. 0 rendimento do dímero desejado variou entre 45% e 55%.

EXEMPLO 4

Hibridação de 5'P_7~16mero e 5'-P-16-SS-5^^P_7-ARN MDU-1 a cadeia (+) da ADN M13mpl8

0s procedimentos de hibridação descritos por Meinkoth e Wahl, Anal. Biochem. 13Θ, 267-2B4 (19Θ4), foram utilizados para imobilizar o ADN (+) M13rapl8 de cadeia simples era filtros de nitrocelulose. Os filtros contando 100, 10 e 1 ng da ADN M13mpl8 de cadeia simples e 100 ng de lambda ADN foram pré-hibridados durante 1 hora a 320C num tampão de hibridação (NaCl 900 mM, EDTA 6 mM, Tris 90 mM, pH 7,5, SDS a 0,1%) contendo 2 00^<g/ml ób mistjj ra de homocromatografia I (ARN clivado aleatóriamente) (Oay e colab. , Nucleic Acids Res. 1, 331-354 (1974)). A hibridação foi le. vada a cabo durante toda a noite a 32CC com aproximadamente 7 000 o

cpm de 5’-/” P_7-16mero (0,0045 pmole ou 0,025 ng por ml) 5*-P-16mero-SS-5'^^P_7-ARN MDU-1 (aproximadamente 0,0045 pmole ou 0,36 ng de ARN por ml), ou 5'-r³²Pjz -cistamina-ARN MDU-1 (0,0045 pmole ou 0,34 ng de ARN por ml). Os filtros foram então lavados diversas vezes com 1 x SSPE (NaCl 180 mM, Na₂HP0^ 10 mM e EDTA 1 mM, pH 7,5), contendo SDS a 0,1%, à temperatura ambiente. Após secagem, os filtros foram auto-radiografados.

Não foi detectada nenhuma hibridação com o ARN MDU-1 deri

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-15vado com cistamina. Um mínimo de 10 ng do ADN M13mpl8 pode ser detectado com lómero sozinho e um mínimo de 100 ng com o dímero de 16mero-ARN MOV-1. Contudo, nestes ensaios, o vector estava presente numa concentraçSo muito baixa e, alám disso, o ARN MDV-1 nSo foi libertado e amplificado. Estes resultados demonstraram que, no caso habitual, em que a sonda é utilizada em excesso subs^ tancial em relaçSo ao analito, a presença do ARN MDV-1 na sonda interferiria por significativamente menos que um factor 10 com a sensibilidade de uma sonda 16 mero.

Após remoção dos filtros, o fluido de hibridaçSo contendo material nSo hibridado foi passado através de um microconcentrador Amicon 30. Uma alíquota dos materiais recuperados foi analisada por electroforese em gel para testar a estabilidade do 5'-P-16mero-SS-5'-/“³²P_7-ARN MDV-1 sob condiçBes de hibridaçSo e foi verificado que o aduto nSo se decompBe sob condiçBes de hibridaçSo.

EXEMPLO 5

HibridaçSo de 5¹ -P-16mero-SS-5 '-A^^P_7-ARN MDV-1 num 37mero complementar

0,03 pmole do 37mero alvo, ou 0,03 pmole do 25mero nSo complementar, foram aquecidas a 952C-10QSC durante 1 minuto e rapidamente arrefecido antes da adiçSo de 0,02 pmole de 5'-P-16mero -SS-5'-/“³²P_7-ARN MDV-1 ou 5'-cistamina-/“³²P_7-ARN MDV-1. A hi bridaçSo foi levada a cabo durante 7 horas a 25BC num tampSo (10 ywl) contendo Tris 50 mM a pH 7,2, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM e 20_yMg de ARN clivado aleatoriamente. 0 híbrido, se formado, foi separa do do 5 ’-P-16mero-SS-5 ’-A³²P_J7-ARN MDV-1 nSo hibridado, por elejç troforese num gel de poliacrilamido a 6% sob condiçBes de nSo-des, naturantes (isto é, sem ureia) a 120 v (6ma) durante 15 horas.

Foi detectado um híbrido com 37mero complementar mas nSo com 25me ro não complementar.

EXEMPLO 6

Síntese de 5‘-cistamina-/^^-32P_7~ARN MDV-1 procedimento fornecido acima para a preparaçSo de aduto

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de cistamina de oligodesoxinucleótidos curtos não é aplicável ao

ARN porque o ARN de alto peso molecular reage com a carbodiimida a 50ac. A síntese do 5 '-cistamina-/^-^²P_/-ARN MDV-1 foi descrita anteriormente (Chu e colab., Nucl. Acids Res. 14, 5591-5603 (1986)) e requer o isolamento do 5’-imidazolido do ARN MDV-1 e a remoção da carbodiimida antes da reacção com a cistamina, a 50aC. 0 ARN é separado da cistamina em excesso, quer por electroforese em gel, quer, mais rapidamente (em 15 minutos) por HPLC numa coluna de filtração por gel. 0 produto purificado por electroforese em gel contém uma mistura de 5'-/” ^ZP_/-ARN MDV-1 não convertido e de 5'/—32 ™7

-cistamina-/ P_/-ARN MDV-1. 0 produto, se purificado por filtra ção em gel HPLC, também pode conter produtos da degradação do 5’P_/-ARN b os seus adutos de cistamina. A síntese completa, partindo do 5’-/” ^ZP_/-ARN MDV-1, pode estar concluída em 4 horas.

EXEMPLO 7

Ligação de 16mero com 16mero, 37mero ou ARN MDV-1, por meio de uma ligação dissulfureto

A dimerização foi alcançada pela redução de uma solução de 5 yw.M de 5¹-cistamina-/^- _/-16mero com DTT, remoção da 2-tio-etilamina sob condições redutoras, e, finalmente, remoção do DTT por diálise.

Após a remoção do DTT, a oxidação pelo ar ocorre no saco de diálise dentro de meia hora, resultando na formação de ligações dissulfureto entre os dois 16meros. A ligação de 16mero com 37me ro ou com ARN MDV-1 foi realizada do mesmo modo. A reacção de ox_i dação foi concluída em 30 minutos e o procedimento de ligação cojn pleto necessitou de 2 horas.

Uma vantagem deste procedimento á a de que todos os deriv_a dos podem ser armazenados como adutos de 5’-cistamina estáveis, em vez de o serem como adutos de tiol menos estáveis; os adutos de tiol não necessitam de ser isolados antes do inicio da reacção.

Quando os adutos ligados por dissulfureto de lómero com 16mero, 37mero ou ARN MDV-1 foram tratados com DTT 10 mM, as liga ções S-S foram reduzidas e os oligonucleótidos libertados como d_e rivados de 5'-tio-etilamina.

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-17EXEMPLO 8

Este exemplo descreve um ensaio para detectar simultaneamente a presença de uma ou ambas as sequências de ácidos nucleicos que se pensa ser possível estarem presentes numa amostra biológica. As duas sequências de ácido nucleico podem estar relaci.0 nadas uma com a outra por, apesar de diferirem na sequência e serem provenientes de organismos patogénicos que são diferentes, os organismos provocarem doenças que podem apresentar sintomas ou nua nifestaçSes semelhantes. Por exemplo, é bem sabido que doenças acompanhadas por diarreias podem ser causadas por Eschsrichia Coli ou 5hiqella dysenteriae. Em tal caso, um ensaio do tipo descrito nestes exemplo pode ser empregue para determinar o agente etiológico real, se este está presente num espécime clinico.

Uma fracção de ácido nucleico de um espécime obtida de um doente é preparada e imobilizada sob a forma de cadeia simples num substrato sólido. Sondas de oligonucleótidos marcadas com P e derivados com 5’-cistamina (isto ô, moléculas com afinidade, uma para cada um dos dois analitos¹* de ácido nucleico, um dos quais é caracteristico de cada um dos organismo a serem analisados) sSo preparadas tal como no exemplo 1. As duas sondas, que diferem na sequência e comprimento da cadeia de nucleótidos (de modo a serem separáveis com base no peso molecular), são dimerizadas tal como no exemplo 2. 0 heterodlmero de oligonucleótido é deixado a hibridar, durante 1 hora, com a amostra de ácido nucleico imobiliza, da e, em seguida, o suporte é lavado extensivamente com um tampão redutor.

Tal como os especialistas compreenderão, apenas a sonda de nucleótido imobilizada por hibridação directa na amostra de ácido nucleico imobilizada ficará associada ao suporte depois da lavagem. 0 ácido nucleico é então eluído do suporte e submetido a electroforese num gel de poliacrilamida sob condiçães desnaturantes. 0 dímero radiomarcado ó processado como controlo. Dada a diferença de mobilidade relativa dos dois oligonucleótidos no gel, a presença de uma ou ambas as sondas de nucleótidos no gel, e consequentemente dos respectivos ácidos nucleicos do analito na

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-18amostra, pode ser detectada por auto-radiografia do gel.

invento foi aqui descrito com alguma especificidade e os especialistas reconhecerão numerosas modificações e variações ao que foi aqui descrito que se situam dentro do espirito do invento. Fntende-se que tais modificações e variações se encontram dentro do âmbito do invento tal como á aqui descrito e reivindicado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de produção de um dímero de ácido nucleico, o qual compreende um primeiro ácido nucleico, o qual é derivado terminal mente com uma porção de fórmula I

-o(po₂)nh(r₁₁)ss(r₁₂)nh₂ I e um segundo ácido nucleico, o qual está derivado terminalmente com uma porção de fórmula II

-o(po₂)nh(r₂₁)ss(r₂₂)nh₂ II em que R^^, Rj^» R21 θ ^22 ^s^° Í9^uai^{s ou} diferentes e cada um deles 6 um grupo alcileno de 2 a 20 átomos de carbono ou um grupo cicloalcileno de 3 a 20 átomos de carbono, em que pelo menos um dos referidos primeiro e segundo ácidos nucleicos é uma molécula com afinidade para um analito (amostra a ser analisada) de ácido nucleico detectável num ensaio de hibridação de uma sonda de ácido nucleico, estando o dímero dos dois ácidos nucleicos referi dos unidos por uma porção de ligação de fórmula III

-o(pq₂)nh(r₁₁)ss(r₂₁)nh(pd₂)o- III caracterizado por compreender a combinação dos referidos primeiro e segundo ácidos nucleicos numa primeira solução aquosa com uma concentração redutora de dissulfureto eficaz de um agente redutor seleccionado a partir dos do grupo constituído por ditiotreitol, ditioeritritol, M^(BH^) e M^(BHjCN), em que é seleccionado a partir do grupo constituído por Li⁺, Na⁺ e K⁺, e, em seguida, sujeitando a referida primeira solução a condições oxidantes, por meio do que o referido dímero dos dois referidos ácidos nucleicos se forma e por compreender a diálise da referida primeira solução contra uma segunda solução aquosa, a qual tem uma composição tal que (i) a concentração na referida primeira solução de um agente redutor, seleccionado a partir do grupo constituído por ditiotrei. tol, ditioeritritol, M^(BH^) e M^(BHjCN), em que ó seleccionado a partir do grupo constituído por Li⁺, Na⁺ e K⁺, é mantida num nível redutor de dissulfureto eficaz, e (ii) a proporção da con69 270

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Λ -20centração molar, na referida primeira solução, do composto de fójç mula IV hs(r₁₂)nh₂ IV para a concentração molar, na referida primeira solução, de todos os derivados do referido primeiro ácido nucleico, e a razão da concentração molar, na referida primeira solução, do composto de fórmula V hs(r₂₂)nh₂ V para a concentração molar, na referida primeira solução, de todos os derivados do referido segundo ácido nucleico, diminuir.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por cada um de R^^, ^21 θ ^22 ^{SBr um} 9^ruP° n-alcil⁰¹ ¹⁰ de

2-B átomos de carbono, e por o agente redutor presente na referida primeira solução aquosa numa concentração redutora de dissulf£ reto eficaz, ser mantido antes da referida diálise numa concentra ção redutora de dissulfureto eficaz durante a referida diálise, e ser seleccionado a partir do grupo constituído por ditiotreitol e ditioeritritol.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por a referida diálise baixar a concentração molar do composto de fórmula IV hs(r₁₂)nh₂ IV na referida primeira solução, para menos de 10% da concentração molar de todos os derivados do referido primeiro ácido nucleico na referida primeira solução, e baixar a concentração molar do composto de fórmula V hs(r₂₂)nh₂ V na referida primeira solução, para menos de 10% da concentração molar de todos os derivados do referido segundo ácido nucleico na referida primeira solução, e por, após a referida diálise contra a referida segunda solução, ser introduzido 0₂ na referida

69 270

File 47100 primeira solução para oxidar tióis a dissulfuretos incluídos, enquanto a referida primeira solução é dialisada contra uma terceira solução aquosa com uma composição tal que a concentração do agente redutor na referida primeira solução é reduzida para menos da con centração redutora de dissulfureto eficaz.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza do por o 0₂ introduzido na referida primeira solução ser introduzido a partir do ar.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza, do por o referido primeiro ácido nucleico derivado terminalmente ser um ARN replicativo derivado no carbono 5’ do seu nucleótido 5', e o referido segundo ácido nucleico derivado terminalmente ser um ácido nucleico com 10-100 bases que tem a sequência de uma molécula com afinidade para um analito de ácido nucleico e ser d£3 rivada no carbono 5' do seu nucleótido 5'.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por o referido primeiro ácido nucleico derivado terminalmente ser um ARN replicativo derivado no carbono 5' do seu nucleótido 5', e o referido segundo ácido nucleico derivado terminal mente ser um ácido nucleico com 10-100 bases que tem a sequência de uma molécula com afinidade para um analito de ácido nucleico e ser de, rivada no carbono 5' do seu nucleótido 5'.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza. do por o referido primeiro ácido nucleico derivado terminalmente ser um ARN replicativo derivado no carbono 5* do seu nucleótido 5', e o referido segundo ácido nucleico derivado terminal mente ser um ácido nucleico com 10-100 bases que tem a sequência de uma molécula com afinidade para um analito de ácido nucleico e ser d_e rivada no carbono 5’ do seu nucleótido 5’.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteriza do por o referido primeiro ácido nucleico derivado terminalmente ser um ARN replicativo derivada no carbono 5' do seu nucleótido 5', e o referido segundo ácido nucleico derivado terminalmente ser um ácido nucleico com 10-100 bases que tem a sequência de uma molécula com afinidade para um analito de ácido nucleico e ser de, rivada no carbono 5' do seu nucleótido 5'.

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-229 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteriza do por cada um de R^^, ^12’ ^21 ^θ ^22 ^Ser “^^2^2”*
10 - Processo de acordo com a reivindicação 6, zado por cada um de R^, R^» ^21 ^B ^22 ^{Ser -}^⁸^2^2^-‘
11 - Processo de acordo com a reivindicação 7, zado por cada um de Rj_j_» Rj.2’ ^21 θ ^22 ^ser ~^^2^2~’ carac te ricaracterizado
12 - Processo de por cada um de Rj_j_» acordo com a reivindicação 8, ^R12» ^R2i ® ^R22 ^ssr caracteri-