PT1276760E - Derivados de ácido poliamida-nucleico, agentes e processos para a sua preparação - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE ÁCIDO POLIAMIDA-NUCLEICO, AGENTES E PROCESSOS PARA A SUA PREPARAÇÃO" A presente invenção refere-se a derivados de ácido poliamida-nucleico (PNA) carboxiterminal- e carboxi-/aminoterminal-fosforilados com propriedades melhoradas, à sua utilização, bem como a agentes e processos para a sua preparação.
Os ácidos poliamida-nucleicos, também chamados ácidos peptidonucleicos (PNA), ligam-se com maior afinidade do que os oligonucleótidos naturais a sequências alvo complementares (ADN ou ARN) e têm além disso em relação ao ADN natural a vantagem de serem muitos estáveis no soro. Os PNA foram inicialmente descritos como análogos de ácido nucleico não naturais, nos quais o esqueleto total açúcar-fosfato se encontra substituído por unidades N-(2-aminoetil)-glicina (M. Egholm et al. (1991) Science 254, 1497-1500; WO 92/20702; M. Egholm et al. Nature (1993) 365, 566-568; P. Nielsen (1994) Bioconjugate Chem. 5, 3-7; E. Uhlmann et al. (1988) Angewandte Chemie Int. Ed. Engl. 37, 2796-2823). Como bases utilizam-se as nucleobases ou suas formas de pró-fármaco usuais na química dos nucleótidos, de origem natural ou ainda de origem não natural, isto é, precursores que só no organismo são convertidos na base livre por biotransformação. Descreveram-se ainda PNA, nos quais nem todas as posições do esqueleto têm resíduos de base (Greiner et al. (1990) Helv. Chim. Acta 82, 2151) e em que a aminoetilglicina se encontra substituída por unidades mais complexas (Uhlmann et al. 1 (1998) Angewandte Chemie Int. Ed. 37, 2796/ Falkiewicz (1999)
Biochem. Pol. 46, 509-529). O carácter de carga neutra do esqueleto de PNA é uma característica importante desta classe de substâncias com numerosas consequências. Atribui-se ao carácter neutro dos PNA e à pouca repulsão de carga a ele associada o facto de o PNA se ligar a ADN e ARN complementares mesmo à baixa concentração salina (p. ex. Peptide Nucleic Acids: Protocols and
Applications; Peter E. Nielsen e Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999, 3), seguindo-se as regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick. Pode por isso, em principio, empregar-se PNA em numerosas utilizações, nas quais se empregam de outro modo oligonucleótidos ou derivados de oligonucleótidos. Resultam ainda além disso numerosas aplicações devido às propriedades de ligação únicas, que não são possíveis com oligonucleótidos naturais (ver por exemplo: Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications/ Peter E. Nielsen e Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999). Por exemplo, verificou-se com o PNA uma invasão de cadeia no ADN de cadeia dupla.
Exemplos típicos para a aplicação de PNA incluem a sua utilização para a inibição da expressão de genes por ligação específica de sequência ao ADN ou ARN celular. Os "agentes antisentido" são derivados de ácido nucleico de cadeia simples curta que se ligam a um ARNm complementar, por emparelhamento de bases de Watson-Crick, cuja tradução na proteína correspondente deverá ser inibida (Uhlmann e Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 543;
Larsen et al. (1999) Biochem. Biophys. Acta 1498, 159). Os "agentes antigene" ligam-se através de emparelhamento de bases de Hoogsteen na cavidade maior da dupla hélice de ADN formando 2 uma hélice tripla, através da qual a transcrição dos genes é inibida de modo específico da sequência (Praseuth et al. (1999) Biochem. Biophys. Acta 1489, 181). A expressão de genes pode também ser inibida especificamente pelos chamados oligómeros de "Chamariz", que imitam as regiões de ligação para o factor de transcrição. Através do tratamento com agentes de chamariz podem captar-se determinados factores de transcrição de modo específico da sequência, impedindo assim uma activação da transcrição (Mischiati et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 33114). Um outro grupo de derivados de oligonucleótido de acção intracelular, os quimeroplastos, utilizam-se para correcção dirigida de genes (Cole-Strauss et al. (1996) Science 273, 1386-1389).
Os PNA podem por isso empregar-se como medicamento e/ou meio de diagnóstico ou para a preparação de medicamentos e/ou meios de diagnóstico.
Assim, o documento WO 00/33867A2 publica derivados de PNA para emprego como sondas de detecção de ácidos nucleicos, que, para a redução de interacção não específicas com ácidos nucleicos, são modificadas de modo que contêm no seu interior pelo menos uma unidade não nucleosídica com um pKa inferior a 3,0. A desvantagem destes derivados de PNA consiste no facto de ser introduzida no interior da molécula, pela modificação interna, uma unidade carregada negativamente, que provoca uma repulsão de carga com os ácidos nucleicos alvo; além disso, a modificação no interior do derivado de PNA pode levar a perturbações da estrutura dos duplexes PNA-ácido nucleico. O documento EP 062677A2 publica oligómeros de PNA-ADN para utilização como medicamento, como sonda de genes ou iniciador, 3 em que a ligação de PNA e ADN é covalente e compreende pelo menos um resíduo orgânico ou uma ligação com pelo menos um átomo de entre a série C, N, 0 ou S.
Do fascículo de patente US 5874553 são conhecidos monoésteres de ácido fosfónico oligoméricos (PMENAs) bem como derivados de ácido fosfónico que se baseiam na ligação de PMENAs com PNAs e que servem como inibidores da expressão de genes, sondas de identificação e análogos. Os resíduos fosfonato, nas moléculas aqui publicadas, encontram-se também exclusivamente no interior das moléculas e servem como pontes para a ligação covalente das unidades monoméricas no interior dos PMENAs ou entre PMENAs e PNAs.
Para fins diagnósticos e na biologia molecular pode empregar-se o PNA, por exemplo após marcação com biotina, fluoresceína ou outros marcadores, como sonda de hibridação específica. Para a introdução dos grupos marcadores encontram-se até agora quatro métodos descritos na literatura (Oerum et al. (1999), em Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, páginas. 81-86; Lohse et al. (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503). O primeiro método baseia-se na marcação dos PNA livres (não protegidos) após a sua síntese em solução. Faz-se reagir neste caso a extremidade do amino terminal do PNA com um ácido carboxílico activado ou com um isotiocianato. Introduzem-se porém frequentemente resíduos lisina adicionais no PNA, que se fazem depois reagir com isotiocianato de fluoresceína (FITC).
No segundo método modifica-se o PNA protegido, ainda em fase sólida, na extremidade do amino terminal com derivados de ácido carboxílico activados ou com isotiocianatos. Este método é adequado para grupos marcadores que são estáveis nas condições 4 da desprotecção do PNA e durante a dissociação do suporte. Como reagentes reactivos empregam-se, em ambos os casos, de modo preferido isotiocianatos (P. Wittung et al. , (1995) FEBS Lett. 375, 27) ou ácidos carboxilicos activados, como por exemplo ésteres de N-hidroxissuccinimida (NHS) (Oerum et al. , 1999). Uma desvantagem da reacção com os derivados de NHS é que esta é conseguida frequentemente apenas com baixos rendimentos. Por isso condensa-se muitas vezes o ácido 8-amino-3, 6-dioxaoctanóico como "ligante" ou "espaçador" entre o PNA e o grupo marcador (Oerum et al., 1999). Ambos os acoplamentos se fazem através de ligações amidina ou tioureia, que, enquanto tais, levam antes à insolubilidade. Em alternativa, fazem-se reagir os ácidos carboxilicos com a ajuda de activadores usuais na quimica peptidica, como por exemplo HBTU, TBTU ou HATU. 5 Β Β Β
Num terceiro método utilizam-se monómeros conjugados de fluoresceina na síntese em fase sólida de ΡΝΆ, em que a marcação de fluorescência se efectua através de uma ligação amida (Lohse et ai. (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503), gue mais uma vez leva a conjugados relativamente pouco solúveis.
Um guarto método utiliza conjugados PNA-péptido, nos guais a parte peptídica forma um substrato para uma proteína quinose (Koch et ai. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 6933). Deste modo não se modifica portanto a parte de PNA, mas o resíduo de serina do 6 segmento peptídico é fosforilada enzimaticamente. Com este método pode introduzir-se portanto apenas fosfato radioactivo, mas não por exemplo, fluoresceina ou biotina no segmento peptidico do conjugado de PNA-péptido.
Parte peptídica Parte de PNA
Serina
B
B
H N-LeirGIy-Ado-Ado-Ado <K_ 'h )— N—AI a-Arg-Arg-Leu-H OH
O
O
-N
N' H
R
Proteína quinase A + ATP
H N-Leu-Gly-Ado-Ado-Ado °=\_
)—N—Ala-Arg-Arg-Leu-H É sabido que o PNA em solução aquosa, portanto também em condições fisiológicas, tende a agregar. 0 PNA é por isso dificilmente solúvel em tampão aquoso e não está assim 7 disponível para a hibridação com sequências complementares. 0 PNA mostra além disso uma elevada afinidade para com vários materiais como Sephadex® (firma Pharmacia), Bond Elut® (firma Varian) ou vários materiais de cromatografia por HPLC, que se empregam na purificação dos oligómeros, de modo que o PNA apenas se pode isolar frequentemente com baixos rendimentos. É por isso necessário conjugar o PNA com lisina ou com outros aminoácidos carregados positivamente (através da extremidade do C terminal) (Egholm et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114, 1895). As sequências de PNA ricas em guanina tendem muito especialmente para a agregação, pelo que se desaconselha a utilização de tais PNA (ver "Guidelines for sequence design of PNA oligomers" em Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications (1999), páginas. 253-255). Especialmente difíceis de dissolver são por exemplo oligómeros de PNA mais longos marcados com fluoresceína, em que se aconselha a adição de um solvente orgânico e aquecimento a 50 °C. A purificação dos derivados de PNA lipofílicos pouco solúveis é particularmente difícil. Por HPLC detectam-se muitas vezes vários picos atribuíveis a agregados de PNA. A técnica de electroforese de gel de poliacrilamida, frequentemente empregada para a purificação e separação de ácidos nucleicos, não é possível para estes derivados de PNA.
Nos métodos acima descritos para a derivatização de PNA introduz-se sempre o grupo marcador por acoplamento de uma ligação amida ou ligação tioamida, formando-se derivados de PNA relativamente pouco solúveis. Em especial na introdução de resíduos lipofílicos, como por exemplo da fluoresceína, formam-se derivados de PNA pouco solúveis. A introdução de marcadores em ambas as extremidades do PNA é tecnicamente ainda mais difícil e conduz em geral a uma solubilidade ainda pior. Além disso, não se encontram descritos quaisquer métodos eficientes para uma derivatização amino e carboxiterminal simultânea de PNA, em especial por síntese em fase sólida. Uma vez que as reacções de marcação ocorrem além disso muitas vezes com baixos rendimentos, um objectivo a resolver consiste em preparar novos derivados de PNA que se obtenham com altos rendimentos e que apresentem propriedades vantajosas, como solubilidade melhorada, comportamento de ligação melhorado, melhor incorporação celular e que permita além disso o emprego de métodos de purificação efectivos para os oligómeros de PNA. 0 objectivo é resolvido, de acordo com a invenção, com a preparação de derivados de PNA de Fórmula (I)
Terminal-N Terminal-C
Fórmula I em que q é igual a 0 ou 1, D' é igual a hidroxilo, mercapto, amino, alquilamino ou acilamino, de modo preferido acetilamino, V independentemente entre si, é igual a oxigénio, enxofre, NRi, 9 V' independentemente entre si, é igual a oxigénio, enxofre, NRi, um grupo U- (CR3R4) u--C (0) -NH ou um grupo U- (CH2CH2O) u--C(0)-NH, U independentemente entre si, é igual a oxigénio, enxofre ou NH, u' independentemente entre si, é igual ala 10, de um modo preferido 1 a 4, de um modo particularmente preferido 1, W e W' independentemente entre si, são iguais a oxigénio, enxofre, NRi, Y e Y' independentemente entre si, são iguais a hidroxilo, mercapto, anião oxi, tioato ou NRiR2, X e X' independentemente entre si, são iguais a um grupo U-(alcanodicloC2-C22)-U ou um grupo U- (CH2CH2-0) U', ou igual a um grupo marcador, ou um grupo para reticulação, ou um grupo que facilita a incorporação intracelular, ou um grupo que aumenta a afinidade de ligação do derivado de PNA a ácidos nucleicos, por exemplo um resíduo bifuncional fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, corante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G ou digoxigenina, Z e Z' independentemente entre si, significam hidroxilo, mercapto, anião oxilo, tioato ou NRiR2, alquiloCi-C22/ arilalquiloCi-Cs, alquiloCi-C22“U, arilalquiloCi-Cs-U, hidroxi-Ci-Cis-U, aminoalquilo-U, mercaptoalquilo-U, ou um grupo de fórmula R7 (CH2CH2-O) m, em que R7 é igual a hidroxilo, amino ou alcooxilo-Ci-C22 e m igual ala 100, de um modo preferido 2 a 10, ou são iguais a um grupo marcador, ou um grupo para reticulação, ou um grupo que facilita a incorporação intracelular, ou um grupo que aumenta a afinidade de ligação do derivado de PNA a ácidos nucleicos, por exemplo um resíduo monofuncional ou 10 bifuncional fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, corante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G ou digoxigenina,
Ri e R2 independentemente entre si, significam um resíduo constituído por hidrogénio ou alquilo-Ci-C6, de um modo preferido hidrogénio, R3 e R4 independentemente entre si, significam um resíduo constituído por hidrogénio ou alquilo-Ci-C6 ou o resíduo de uma cadeia lateral de aminoácido, de um modo preferido hidrogénio, em que resíduos R3 e R4 vizinhos em V' também podem formar um anel cicloalquilo-Cs-Cs, n é igual a 0 a 10, de um modo preferido 0 a 3, m é igual a 0 a 10, de um modo preferido 0 a 3, com a condição de pelo menos um resíduo Y, Y', Z ou Z' ser igual a hidroxilo, mercapto, anião oxilo ou tioato. O grupo {POLI} é descrito pela Fórmula II, {BLOCO}
N- H JZ" -{BLOCO}
Fórmula II em que {BLOCO}, independentemente entre si, é um grupo escolhido de entre a Fórmula IIIA, 11 Β Ο
Α
Fórmula II Α ou a Fórmula ΙΙΙΒ (Greiner et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82, 2151) ,
H
Fórmula II B A- ou as Fórmulas IV A a IV G (Uhlmann et al. (1998) Angewandte Chem. Int. Ed. 37, 2796; Falkiewicz (1999) Biochim. Pol. 46, 509-529),
12
em que cada unidade {BLOCO} pode ser diferente, e em que ainda á válido que z'' é igual a 0 a 100, de um modo preferido 1 - 20, de um modo particularmente preferido 4 - 15, G é escolhido de entre os grupos (CR5R6)uw C (O) NH- (CR^) ou C (O) NH- (CH2CH2O) U'-CH2CH2, em que u' possui o significado anterior e t' é igual a 2 a 10, de um modo preferido 6, A independentemente entre si, é um grupo (CR1R2S), em que s é igual a 1 a 3, de um modo preferido 1, B independentemente entre si, é um residuo aromático que também pode ter carácter heteroaromático, ou hidrogénio, ou hidroxilo ou alquiloCi-Cis, ou é uma base nucleotídica usual na química de nucleótidos, de origem natural ou não natural, ou a sua forma de pró-fármaco, 13 com a condição de pelo menos um resíduo B ser uma nucleobase, D independentemente entre si, significa um grupo (03¾]¾)^ em que t é igual a 2 a 10, de um modo preferido 2 a 4, de um modo particularmente preferido 2, E independentemente entre si, é um grupo (CRsR6)U'/ em que resíduos Rs e R6 vizinhos também podem formar um anel cicloalquilo-C5-C8 ou um composto espiro, R5 e R6 independentemente entre si, significam um resíduo constituído por hidrogénio ou alquiloCi-C6 ou o resíduo de uma cadeia lateral de aminoácido, de um modo preferido hidrogénio, e em que u' , Ri, R2, R3 e R4 possuem o mesmo significado acima descrito, bem como os sais fisiologicamente toleráveis dos derivados de PNA de Fórmula I. Sais fisiologicamente toleráveis encontram-se descritos, entre outros, em Remingtons Pharmaceutical Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA, USA, página 1418. São preferido sais de amónio, sais de trialquilamónio, sais de metais alcalinos (como sais de sódio e de potássio) e sais de metais alcalino-terrosos (como sais de magnésio e de cálcio). São particularmente preferidos os sais de sódio.
Por grupos marcadores (labels) entende-se neste caso grupos que permitem uma valorização qualitativa ou quantitativa da actividade química ou biológica dos derivados de PNA, por exemplo biotina ou fluoresceína. Por reticulação (cross-linking) entende-se a formação de ligações intra- ou inter-moleculares entre funcionalidades próximas no espaço. Um grupo para reticulação é por exemplo o grupo psoraleno. 14
Como efeito positivo surpreendente verificou-se que a introdução de um resíduo fosforilo em posição terminal, por exemplo como fosfato ou ainda na forma de uma derivatização lipófila (por exemplo como fosfodiéster de hexadecilo), aumenta a afinidade do PNA para o ADN ou ARN complementares. Este efeito não era esperado, uma vez que a forte ligação de PNA a ADN ou ARN complementares é atribuída ao carácter neutro do PNA e a reduzida repulsão de carga a ele associado (por exemplo Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications; Peter E. Nielsen e Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999,3).
Particularmente eficaz foi a introdução da biotina através de um resíduo fosforilo. Os PNA biotinilados de Fórmula I (X, X' , Z e/ou Z' = resíduo biotina) apresentaram como sondas de hibridação melhores propriedades de ligação e menos efeitos de fundo perturbadores não específicos do que as sondas de ADN biotinilado correspondentes.
Ao contrário dos PNA não carregados, os derivados de PNA de Fórmula I de acordo com a invenção podem também deslocar-se num campo eléctrico, através do que é possível uma microlocalização e uma concentração em derivados de ácidos nucleicos complementares imobilizados. Para os oligonucleótidos polianiónicos já se encontra descrito este método para a determinação rápida de erros de emparelhamento de bases por meio do campo eléctrico (Sosnowski et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 1119).
Os substituintes hidroxilo ou mercapto dos resíduos fosforilo dos derivados de PNA de acordo com a invenção podem desprotonar numa gama de pH de 4,5 a 14, de um modo preferido 6,5 a 12, de um modo particularmente preferido 6,5 a 9. A 15 propriedade da capacidade de ionização dos resíduos fosforilo pode aproveitar-se vantajosamente para a purificação dos compostos de Fórmula I. Por um lado, podem purificar-se os compostos de Fórmula I por electroforese, por exemplo electroforese de gel de poliacrilamida. Por outro lado, é possível uma purificação por meio de permutadores aniónicos. Neste caso eluem-se os produtos desejados de um modo preferido por utilização de um gradiente de sais, por exemplo um gradiente cloreto de sódio, ou um gradiente de pH. É particularmente fácil e eficaz purificar os derivados de PNA de Fórmula I de acordo com a invenção através de permutadores aniónicos. Verificou-se que os produtos secundários não carregados não são retardados no permutador aniónico, enquanto que o produto carregado fica retido na coluna. Após lavagem com água pôde isolar-se o produto desejado na forma pura com ácido acético ou com uma solução de cloreto de sódio. Como permutadores aniónicos utilizam-se de um modo preferido permutadores aniónicos fortes, ou fases de modo misto, como por exemplo ®Oasis MAX (Waters GmbH, Eschborn).
Verificou-se ainda que os compostos de Fórmula I de acordo com a invenção são em geral mais solúveis em meio aquoso do que os oligómeros de PNA correspondentes sem o resíduo fosforilo. Isto reflecte-se, muito em especial no caso dos derivados lipofílicos, como por exemplo os derivados de fluoresceína ou os derivados de hexadecilo, numa solubilidade fortemente melhorada em meio aquoso. A invenção refere-se em especial a derivados de PNA, nos quais A e E são iguais a CH2. A invenção refere-se ainda em especial a derivados de PNA, nos quais D são iguais a (0¾) 2. São 16 preferidos ainda os derivados de PNA de Fórmula I, nos quais W e W' são iguais a oxo e ainda aqueles, nos quais Y e Y' são iguais a hidroxilo ou anião oxilo, e aqueles, nos quais V e V' são iguais a oxilo.
Exemplos de bases naturais são adenina, citosina, 5-metilcitosina, guanina, timina e uracilo. Exemplos de bases não naturais são purina, 2,6-diaminopurina, N4N4-etanocitosina, N6N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-alcinil(C3-C6)-uracilo, 5-alcinil(C3-Ce)-citosina, 5-(1-propargilamino)-uracilo, 5-(1-propargilamino)-citosina, fenoxazina, 9-aminoetoxifenoxazina, 5-fluorouracilo ou pseudoisocitosina, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, di-hidrouracilo, 5-alquil(Οι-Οε)-uracilo, 5-alquil (Ci-C6) -citosina, 5-alcenil (C2-C6) -citosina, 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina, 7-desazaadenina, 7-desazaguanina, 8-azapurina ou purina-7-desaza-7-substituida.
Para os derivados de PNA que têm apenas um residuo fosforilo C-terminal (para os quais q é igual a 0), a extremidade do N terminal pode estar ligado a uma sequência peptidica. Como sequências peptidicas consideram-se de um modo preferido aquelas que optimizam a distribuição por órgãos ou a localização celular do PNA, como por exemplo transportano, factor de crescimento análogo à insulina, sinais de localização nuclear ou outras sequências de transporte (Larsen et al. (1999) Biochem. Biophys. Acta 159-166). O péptido pode também servir como "etiqueta" de afinidade, como por exemplo uma cadeia (His)6. A presente invenção permite uma larga variação dos residuos X, X', Z e Z' (estão indicados exemplos na Figuras la, lb, 2a, 17 2b, 3a e 3b) , possibilitando assim a introdução de várias caracteristicas funcionais específicas no PNA.
Uma forma de concretização preferida de Z ou Z' é um resíduo alquilo Ci a C22 · São preferidos ainda resíduos alcooxilo Ci a C22, em especial resíduos alcooxilo Ci6. Outros resíduos preferidos são resíduos hidroxi-(alcooxiloCi-Cis), em especial HO (CH2) 3-12O. São preferidos ainda resíduos aminoalcooxilo, em especial resíduos β-amino-hixoxilo e 5-aminopentoxilo. São preferidos ainda resíduos de Fórmula R7-(CH2CH2-0)m, em que R7 é igual a hidroxilo, amino ou alcooxiloCi-C22, mas de um modo preferido hidroxilo, e m é igual a 0 a 100, de um modo preferido 2 a 10. Particularmente preferidos são HO (CH2CH2-0) 2, HO(CH2CH2-0)ε e H2N- (CH2CH2-0) 2. Outros exemplos preferidos de Z ou Z' incluem resíduos mercaptoalcooxilo, em especial 6-mercapto-hexiloxi.
Numa outra forma de concretização preferida Z ou Z' compreende um grupo fluorescente como fluoresceína, rodamina, TAMRA ou um corante cianina. Grupos fluorescentes preferidos encontram-se nas Figuras la a 3b. A biotina é também muito preferida para Z. Outros grupos preferidos para Z incluem dabcilo, psoraleno, acridina, DNP e colesterol (Figuras lb e 2b), resíduos BODIPY, ROX ou R6G (Su-Chun Hung et al. (1998) Analytical Biochemistry 255, 32-38) e digoxigenina (Tarrason et al., Methods in Enzyology (1999) Vol. 313, 257-268).
Além disso, Z ou Z' pode ser igual a um grupo constituído por um resíduo monofuncional ou bifuncional de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, corante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina ou psoraleno. Grupos terminais 18 monofuncionais estão indicados a titulo de exemplo nas Figuras la, lb, 2a e 3a, grupos em ponte bifuncionais estão indicados nas Figuras 2b e 3b. Numa outra forma de concretização preferida n e/ou m, independentemente entre si, é igual a 0, isto é, a parte PNA tem no terminal N e/ou C em cada caso apenas um resíduo fosforilo.
Uma forma de concretização preferida de X ou X' é U-(alcanodiiloC2-C22) -U, em especial O- (alcanodiiloC2-C22) -O, de um modo particularmente preferido O-(CH2) 2-6_0. Uma outra forma de concretização preferida de X ou X' é um grupo de fórmula U-(CH2CH2-0) U', em que u' é igual ala 10, de um modo preferido 1 a 6, e em que U é de um modo preferido oxilo. Numa outra forma de concretização preferida X ou X' compreende um grupo fluorescente como fluoresceína, rodamina, TAMRA ou um corante de cianina, por exemplo Cy3® (firma Amersham Pharmacia Biotech). Grupos bifuncionais preferidos encontram-se nas Figuras 2a e 3a. Biotina é também muito preferida para X ou X' . Outros grupos preferidos são resíduos dabcilo, psoraleno, acridina, DNP, colesterol, BODIPY, lexitropsina, digoxigenina, ROX e R6G.
Os diferentes resíduos para X, X', Z e Z' na Fórmula I podem preencher diferentes funções. Os resíduos fluoresceína têm numerosas aplicações na sequenciação de ADN, amplificação de sinal ou como marcadores para a determinação da incorporação celular de PNA. Os resíduos corante de cianina (Cy3® e Cy5®) dão um sinal de fluorescência significativamente mais intenso e mais duradouro do que a própria fluoresceína. O resíduo psoraleno emprega-se para a reticulação (cross-linking) com ácidos nucleicos complementares. O resíduo acridina é um intercalador mais efectivo e pode por isso reforçar a afinidade de ligação do PNA. Derivados de biotina, acridina e psoraleno podem também 19 empregar-se para experiências antissentido. Além disso, podem utilizar-se derivados de hexadeciloxilo e de colesterol para aumentar a acessibilidade membranal dos PNA. Compostos de Fórmula I marcados com DNP podem identificar-se com anticorpos anti-DNP. Resíduos aminoalcooxilo utilizam-se para o acoplamento de outros grupos, como por exemplo lexitropsina (ver Exemplo 17; PNA-16). De modo análogo podem utilizar-se também grupos mercaptoalcooxilo para posterior derivatização. A invenção refere-se ainda à utilização dos derivados de PNA de Fórmula I como medicamentos. Estes medicamentos podem empregar-se para a prevenção e/ou tratamento de doenças relacionadas com a expressão ou uma sobreexpressão de determinados genes. A invenção refere-se ainda à utilização de derivados de PNA como meio de diagnóstico. Estes meios de diagnóstico podem empregar-se para o reconhecimento precoce das doenças acima referidas. Como medicamento ou meio de diagnóstico os derivados de PNA de Fórmula I podem ser utilizados em função da sua sequência, como agentes antissentido, antigene, de chamariz e de quimeroplastia.
Os derivados de PNA de acordo com a invenção utilizam-se em especial para a preparação de medicamentos para o tratamento de doenças que têm origem ou em que está envolvido um determinado gene por sobreexpressão.
Estes medicamentos podem empregar-se por exemplo para o tratamento de doenças provocadas por vírus, por exemplo por vírus CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, gripe, VSV, hepatite B ou papiloma, sendo o alvo a respectiva sequência do vírus. 20
Os derivados de PNA antissentido de acordo com a invenção, que são eficazes contra tais alvos, têm por exemplo a seguinte sequência de base: a) Contra CMV, p. ex. SEQ ID NO: 1 5’-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3’ b) Contra HIV, p. ex. SEQ ID NO: 2 5’-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3’ SEQ ID NO: 3 5’-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3’ a) Contra HSV-1, p. ex. SEQ ID NO:4 5’-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3’
Tais medicamentos são também adequados por exemplo para o tratamento do cancro. De um modo preferido, podem empregar-se nesse caso sequências dirigidas contra alvos responsáveis pelo estabelecimento ou pelo desenvolvimento do cancro, em especial através da inibição da telomerase (E. Matthes et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 1152) . Tais alvos são ainda: 1) Oncoproteinas nucleares, como por exemplo c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, pl20, 2) Oncoproteinas associadas a citoplasma/membrana, como por exemplo EJras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets, 3) Receptores celulares, como por exemplo receptor EGF, Her-2, c-erbA, receptor VEGF (KDR-1), receptores retinoide, subunidade reguladora da proteinaquinase, c-fms, Tie-2, c-raf-1 quinase, PKC-alfa, proteina quinase A (RI alfa), 21 4) Citoquinas, factores de crescimento, matriz extracelular como por exemplo CSF-1, IL-6, IL-la, Il-lb, IL-2, IL-4, IL- 6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastina, fibronectina.
Os derivados de PNA antissentido, que são eficazes contra tais alvos, têm por exemplo a seguinte sequência de bases: a) Contra c-Ha-ras, p. ex. SEQ ID NO: 5 5’-CAGCTGCAACCCAGC-3’ SEQ ID NO: 6 5’-TATTCCGTCAT-3’ SEQ ID NO: 7 5’-TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3’ bjbFGF, p. ex. SEQ ID NO:8 5’-GGCTGCCATGGTCCC-3’ c) c-myc, p. ex. SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 d) c-myb, p. ex. SEQ ID NO: 1 e) c-fos, p. ex. SEQ ID NO:12 SEO ID NO:13 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15 f) pl20, p. ex. SEQ ID NO: 16 5’-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3’ 5’-AACGTTGAGGGGCAT-3’ 5’-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3’ 5’-CGAGAACATCATCGTGG-3’ 5’-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3’ 5’-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3’ 5’-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3’ 5’-CACCCG CCTTGG CCT CCCAC-3’ 22 g) Receptor EGF, p. ex SEQ ID NO: 17 5’-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3’ SEO ID NO: 18 5’-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3’ h) Supressor de Tumor p53, SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 p. ex. 5’-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3’ 5 ’-G G C AGT C AT CC AG CTT CG G AG -3 ’ i) bcl-2, p. ex. SEQ ID NO: 21 5’ -TCTCCC AG CGTG CG CC AT-3 ’ k) VEGF, p. ex. 5’-GCGCTGATAGACATCCATG-3’ 5’-GGAGGCCCGACC-3’ 5’-GGTTTCGGAGGC-3’ 5’-TGGTGGAGGTAG-3’ 5’-GCATGGTGGAGG-3’ 5’-TTGGCATGGTGG-3’ 5’-GCCTGGGACCAC-3’ 5’-CAGCCTGGGACC-3’ 5’-TGCAGCCTGGGA-3’ 5’-GTGCAGCCTGGG-3’ 5’-GGTGCAGCCTGG-3’ 5’-ATGGGTGCAGCC-3’ 5’-GGCTTGAAGATG-3’ 5'-GCAGCCCCCGCA-3’ 5’-GCAGCAGCCCCC-3’ 5’-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3’ 5’-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3’ SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 1) c-raf quinase, p. ex. SEQ ID NO: 37 m) PKC-alfa, p. ex. SEQ ID NO: 38 23 n) Proteína quinase A, p. ex. SEQ ID NO: 39 5’-GCGTGCCTCCTCACTGGC-3’
Os medicamentos contendo derivados de PNA de Fórmula I são ainda adequados por exemplo para o tratamento de doenças que são influenciadas por integrinas ou por receptores de adesão célula-célula, por exemplo por VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM ou ELAM.
Os derivados de PNA antissentido que são eficazes contra tais alvos, têm por exemplo a seguinte sequência de bases: a) VLA-4, p. ex. SEQ ID NO: 40 5’-GCAGTAAGCATCCATATC-3’ b) ICAM-1, p. ex. SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44 5’-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3’ 5’-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3’ 5’-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3’ 5’-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3’ c) ELAM-1, p. ex. SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46 5’-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3’ 5’-CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3’ d) Integrina-alfa, p. ex. 5’-GCGGCGGAAAAGCCATCG-3’ SEQ ID NO: 47
Os medicamentos contendo derivados de PNA de Fórmula I são também adequados por exemplo para impedir a reestenose. Neste caso podem empregar-se sequências de PNA que são dirigidas contra alvos que são responsáveis pela proliferação ou migração. Tais alvos são por exemplo: 24 1) Proteínas transactivadoras nucleares e ciclinas, como por exemplo c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, ciclinas e cdc-2-quinase, 2) Mitogenes ou factores de crescimento como por exemplo PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF e TGF-β, 3) Receptores celulares, como por exemplo receptor bFGF, receptor EGF e receptor PDGF.
Os derivados de PNA antissentido que são eficazes contra tais alvos, têm por exemplo a seguinte sequência de bases: a) c-myb, p. ex. SEQ ID NO: 48 5’-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3’ b) c-myc, p. ex. SEQ ID NO: 49 5’-CACGTTGAGGGGCAT-3’ c) cdc2-quinase, p. ex. SEQ ID NO: 50 5’-GTCTTCCATAGTTACTCA-3’ d) PCNA(antigene nuclear de proliferação celular do rato), p. ex. SEQ ID NO: 51 5’-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3’
Os derivados de PNA podem também utilizar-se para o tratamento de vitiligo e outras doenças de despigmentação ou perturbações de despigmentação (por exemplo da pele, cabelos, olhos), como por exemplo albinismo e psoríase, ou para ao tratamento da asma, em que se inibe a expressão do receptor de adenosina-Al, do receptor de adenosina-A3, do receptor de 25 bradiquinina ou de IL-13 por meio de agentes antissentido adequados. Uma tal sequência de bases é por exemplo: SEQ ID NO:52 5’-GATGGAGGGCGGCATGGCGGG-3’
Os medicamentos contendo um derivado de PNA de Fórmula I podem utilizar-se por exemplo na forma de preparados farmacêuticos, que se podem administrar por via oral, por exemplo na forma de comprimidos, drageias, cápsulas de gelatina dura ou mole, soluções, emulsões ou suspensões. Podem também administrar-se por via rectal, por exemplo na forma de supositórios, ou parenteral, por exemplo na forma de soluções injectáveis. Para a preparação de preparados farmacêuticos podem incorporar-se estes compostos em veiculos orgânicos e inorgânicos terapeuticamente inertes. Exemplos de tais veiculos para comprimidos, drageias e cápsulas de gelatina dura são lactose, amido de milho ou seus derivados, talco e ácido esteárico ou seus sais. Veiculos adequados para a preparação de soluções são água, polióis, sacarose, açúcar invertido e glucose. Veiculos adequados para soluções injectáveis são água, álcoois, polióis, glicerol e óleos vegetais. Veiculos adequados para supositórios são óleos vegetais e endurecidos, ceras, gorduras e polióis semi-liquidos. Os preparados farmacêuticos podem também conter agentes conservantes, solventes, estabilizadores, humectantes, emulsionantes, adoçantes, corantes, correctores de sabor, sais para alteração da pressão osmótica, tampões, meios de revestimento, antioxidantes, bem como, conforme o caso, outros ingredientes activos terapêuticos. As formas de administração preferidas são aplicações tópicas, aplicações locais como por exemplo por meio de um cateter ou por inalação, injecções ou infusões e a administração oral. Para 26 injecção formulam-se os derivados de PNA de Fórmula I numa solução líquida, de um modo preferido num tampão fisiologicamente tolerável, como por exemplo solução de Hank ou solução de Ringer. Os oligonucleótidos podem no entanto também formular-se em forma sólida e dissolverem-se ou suspenderem-se antes da utilização. As dosagens preferidas para a administração sistémica são de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg de peso corporal por dia. A invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas que contêm derivados de PNA de Fórmula I e/ou seus sais fisiologicamente toleráveis para além de veículos e/ou aditivos farmaceuticamente inofensivos. Os derivados de PNA de Fórmula I e/ou seus sais fisiologicamente toleráveis podem administrar-se a animais, de um modo preferido a mamíferos, e em especial ao ser humano, como medicamentos isoladamente, em misturas entre si, e na forma de composições farmacêuticas, que permitam uma aplicação tópica, percutânea, parentérica ou entérica, e que contêm como componente activo uma dose efectiva de pelo menos um derivado de PNA, para além de veículos e aditivos usuais farmaceuticamente inofensivos. As composições contêm normalmente cerca de 0,1 a 90% em peso do composto terapeuticamente activo. Para o tratamento de doenças da pele é preferida uma aplicação tópica, por exemplo na forma de pomadas, loções ou tinturas, emulsões, suspensões. A preparação dos preparados farmacêuticos efectua-se de modo em si conhecido (por exemplo Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA), em que se empregam veículos inorgânicos e/ou orgânicos farmaceuticamente inertes. Para a preparação de pílulas, comprimidos, drageias e cápsulas de gelatina dura pode utilizar-se por exemplo lactose, amido de 27 milho e/ou seus derivados, talco, ácido esteárico e/ou seus sais, etc. Veiculos para cápsulas de gelatina mole e/ou suspensões são por exemplo gorduras, ceras, polióis semi-sólidos e líquidos, óleos naturais e/ou endurecidos, etc. Como veículos para a preparação de soluções e/ou xaropes são adequados por exemplo água, sacarose, açúcar invertido, glucose, polióis, etc. Como veículos para a preparação de soluções injectáveis são adequados água, álcoois, glicerina, polióis, óleos vegetais, etc. Como veículos para microcápsulas, implantes e/ou "rods" são adequados polimerizados mistos de ácido glicólico e ácido láctico. Além disso, são adequadas formulações de liposomas, que são conhecidas do especialista (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523; Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992), por exemplo liposomas HJV (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) 878) . A aplicação dermal pode efectuar-se também por exemplo com a ajuda de métodos ionoforéticos e/ou por meio de electroporação.
Uma composição farmacêutica pode ainda conter, para além dos ingredientes activos e dos veículos, aditivos como por exemplo agentes de enchimento, dilatadores, desintegradores, ligantes, lubrificantes, humectantes, estabilizadores, emulsionantes, conservantes, adoçantes, corantes, correctores de sabor ou aromatizantes, espessantes, diluentes, substâncias tampão, e ainda solventes e/ou solubilizantes e/ou meios para a obtenção de um efeito de depósito, bem como sais para alterar a pressão osmótica, agentes de revestimento e/ou antioxidantes. Podem também conter dois ou mais derivados de PNA de Fórmula I diferentes e/ou seus sais fisiologicamente toleráveis, bem como ainda para além de pelo menos um derivado de PNA de Fórmula I um ou mais outros ingredientes terapeuticamente activos . A dose pode variar dentro de uma larga gama e deve ajustar-se em cada caso às condições individuais. 28 A invenção refere-se ainda à utilização de derivados de PNA de Fórmula I como meio de diagnóstico, em especial como auxiliar no diagnóstico de ADN e na biologia molecular (ver por exemplo: Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications; Peter E. Nielsen e Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999) . No diagnóstico de ADN as sondas de genes, também designadas por sondas de ADN ou sondas de hibridação, desempenham um papel importante para a identificação especifica da sequência de determinados genes. Uma sonda de genes consiste em geral numa sequência de reconhecimento e num ou mais grupos marcadores adequados (labels). A especificidade da determinação de uma sequência alvo numa amostra para análise por meio de hibridação com uma sonda de genes complementar é determinada pela sequência de reconhecimento e pela sua estrutura química. Esta técnica pode ser transferida para PNA. 0 PNA tem em relação aos oligonucleótidos de estrutura natural a vantagem de apresentar uma maior afinidade para a sequência alvo e uma maior capacidade para a discriminação de bases. A aplicação dos compostos de Fórmula I refere-se por isso também à hibridação in situ e à fluorescência-hibridação in situ (FISH). A hibridação in situ pode também servir por exemplo para a identificação de microorganismos e virus (Just et al. (1998) J. Vir. Method. 73, 163-174). Uma outra aplicação dos compostos de acordo com a invenção refere-se à identificação e quantificação de ácidos nucleicos. Para tal utiliza-se de um modo preferido também a tecnologia "array" (Strother et al. J. Am. Chem. Soc. (2000) 122, 1205-1209; Niemeyer et al. Angew. Chem. (1999) 111, 3039-3043; Pirrung (1997) Chem. Rev. 97, 473-488), que apresenta um elevado rendimento de amostra e uma grande sensibilidade. Neste caso fixam-se as sondas de PNA sobre 29 um suporte adequado ou um chip de PNA. Para tal pode sintetizar-se o PNA como descrito nos Exemplos e fixar-se em seguida sobre o suporte ou o chip de PNA. Em alternativa, pode preparar-se o PNA directamente sobre o suporte. Uma outra aplicação é o emprego dos compostos de Fórmula I como biossensores para a detecção de ácidos nucleicos (Wang et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118, 7667). O emprego de PNA de Fórmula I com um "label" de afinidade, como por exemplo histidil-PNA, é uma outra aplicação para a purificação de ácidos nucleicos (Oerum et al. (1999), em
Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications).
Os dois resíduos fosforilo no terminal amino e carboxilo podem desempenhar funções diferentes. Por exemplo, o terminal amino pode ser substituído por grupos lipofílicos para aumentar a incorporação celular, enquanto que no terminal carboxilo se encontra um residuo fluoresceína para identificar a melhoria da incorporação celular (ver PNA-6 no Exemplo 7).
Os derivados de PNA de acordo com a invenção são por isso também adequados como agentes antissentido, antigene, de chamariz ou de quimeroplastia.
Os compostos de fórmula I duplamente derivatizados são por isso adequados como os chamados "Guias moleculares" (Li et al. (2000) Angew. Chem. 112, 1091-1094), que só dão um sinal de fluorescência na ligação a um ácido nucleico complementar. Nestes guias uma extremidade do PNA, por exemplo a extremidade do amino terminal está provido de um label de fluorescência, enquanto que a outra extremidade, por exemplo a extremidade do carboxilo terminal está provido de um agente de extinção. Também é possível o caso contrário, tendo um agente de extinção na extremidade N terminal e na extremidade C terminal um label de 30 fluorescência. Ocorre assim uma diminuição do sinal de fluorescência enquanto o derivado de PNA duplamente marcado não se liga ao ácido nucleico complementar. Só na ligação se separam entre si, no espaço, o resíduo de fluorescência (por exemplo edans) e o agente de extinção (por exemplo dabcilo), de modo que é emitido um sinal de fluorescência (Sokol et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. 95, 11538). A síntese do esqueleto de PNA efectua-se de acordo com os métodos descritos na literatura, por exemplo segundo a estratégia dos grupos protectores terc-butiloxicarbonilo (BOC) , 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) ou monometoxitritilo (Mmt) (Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications; Peter E. Nielsen e Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999) . De um modo preferido, utiliza-se o grupo protector Mmt para a protecção temporária da função amino da aminoetilglicina e grupos protectores lábeis em meio básico nas nucleobases heterocíclicas (D. Will et ai. (1995) Tetrahedron 51, 12069; Breipohl et al. (1997) Tetrahedron 53, 14671-14686). Exemplos para unidades monoméricas são compostos de Fórmulas V a VD, em que A, B, D, E, u' e V' possuem o significado anterior, PG é um grupo protector de aminoácido como por exemplo benzoilo, anisoilo, isobutiroilo, acetilo, terc-butilbenzoilo (Breipohl et al. (1977) Tetrahedron 53, 14671-14686), TR é um grupo protector lábil em meio ácido como dimetoxitritilo (Dmt) (para V' = O e S) ou Mmt (para V' = NH). 31
PG °^AT 0
T /v’\ /V TR D E
OH
Fórmula V
PG
B
TR
OH
TR
V
^C^CHgCN O N. p.
E-G
N
Fórmula V C
Fórmula V D
Após a construção do esqueleto de PNA pode fazer-se reagir directamente a função amino livre na extremidade do N terminal com um reagente de fosforilação adequado, obtendo-se por exemplo um fosforamidato (V' = NRi na Fórmula I).
Os resíduos fosforilo podem ser introduzidos por meio de reagentes habitualmente utilizados na química de nucleótidos. 32
Existem à disposição numerosos reagentes de fosforilação que se podem utilizar para a preparação dos compostos de Fórmula I. Apresenta-se nas Figuras 4a a 4d uma selecção dos reagentes, não estando contudo a invenção limitada a estes derivados especiais. Para a modificação carboxiterminal empregam-se suportes correspondentemente modificados, em especial suportes CPG, para a sintese em fase sólida. Exemplos de tais suportes estão indicados na Figura 6.
Como reagentes de fosforilação podem empregar-se os reagentes usuais na química de nucleótidos (Glen Research Corporation, Sterling, VA 20164, USA; Figuras 4a a 4d) , que reagem por exemplo segundo o método da fosforamidito, o método do H-fosfonato ou o método do fosfotriéster (E. Sonveaux (1986) Biooorganic Chemistry 14, 274; S.L. Beaucage e R.P. Iyer (1993) Tetrahedron 49, 1925; E. Uhlmann e A. Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 534). A variedade das possíveis modificações resulta do grande número de reagentes de fosforilação possíveis e suportes correspondentemente derivatizados, em especial suportes de "controlled pore glass" (CPG). Como suportes sólidos utilizam-se além disso de um modo preferido tentagel® (firma Rapp Polymers GmbH, Tubingen) e aminometilpoliestireno.
Para a introdução da função fosforilo consideram-se em princípio todos os reagentes conhecidos na química de nucleótidos, mas em especial os reagentes seguintes de Fórmula VI A, Fórmula VI B, Fórmula VI C e Fórmula VI D, 33
Fórmula VI A Fórmula VI B Fórmula VI C Fórmula VI D em que K é igual a halogéneo, de um modo preferido Cl, triazolilo, imidazolilo ou dialquilamino, W pode possuir o significado acima mencionado ou o significado de W' , Z pode possuir o significado acima mencionado ou o significado de X, X' ou Z', em que os grupos reactivos se encontram correspondentemente protegidos.
Por exemplo, os grupos hidroxilo da fosforamidito 3 de fluoresceina (Figura 4a) encontram-se protegidos por esterificação com ácido piválico.
Os compostos de Fórmula I devem apenas encarar-se como exemplos de tais reagentes, que reagem conforme o caso sob adição de outros reagentes auxiliares como bases, ácidos ou reagentes de condensação. Particularmente preferidos são os reagentes de Fórmula VI A, que reagem segundo o método do fosforamidito (Beaucage e Iyer, 1993). Estes fazem-se reagir como composto de fósforo (III) e oxidam-se em seguida. Se se efectuar a oxidação por exemplo com iodo/água/piridina ou hidroperóxido de terc-butilo, obtém-se o derivado fosforilado (W = 0) . Se, pelo contrário, se efectuar a oxidação com enxofre elementar ou reagente de Beaucage, obtém-se o respectivo composto tiofosforilado (W = S). 34
Entre os reagentes (Figuras 4a a 4d) encontram-se também "reagentes bifuncionais", que devido a uma segunda função, que se encontra protegida de inicio, se podem fazer reagir várias vezes. Exemplos de tais reagentes bifuncionais são as f osf oramiditos 4, 6, 8 a 13. Pode tratar-se nesse caso da conjugação múltipla de um reagente ou então da reacção sucessiva com diferentes reagentes. Pode assim, por exemplo, fazer-se reagir a fosforamidito de fluoresceína 3 apenas uma vez. Pelo contrário, a fosforamidito de fluoresceína 4 possui uma função hidroxilo protegida por um grupo Dmt, que após remoção do grupo Dmt se pode fazer reagir novamente com um regente de fosforilação. Deste modo pode introduzir-se várias vezes o mesmo grupo ou então grupos diferentes. PNA6 é um exemplo de uma conjugação múltipla na extremidade do carboxilo terminal e de uma modificação adicional na extremidade do amino terminal. Em primeiro lugar introduziram-se sucessivamente no terminal carboxilo a fluoresceína e o ligante amino. Após a síntese da parte de PNA, acoplou-se no último ciclo uma unidade de hidroxietilglicina, que se fez reagir com o reagente de fosforilação-Cl6 7. PNA-1 e PNA-2 são compostos de Fórmula I que estão modificados apenas no carboxilo terminal com um resíduo fosforilo (q = 0) . Esta classe de substâncias também é nova e objecto da invenção.
Nas Figuras 5a e 5b apresentam-se alguns exemplos de tipos de compostos para a modificação N-terminal dos compostos de Fórmula I. O tipo de composto A obtém-se por reacção do grupo hidroxilo em posição terminal do PNA com o reagente de fosforilação 1. O tipo de composto B obtém-se por reacção do grupo amino em posição terminal do PNA com a biotina-fosforamidito 5. O tipo de composto C obtém-se por reacção sucessiva do PNA com um grupo hidroxilo em posição terminal com 35 o spacer-18 fosforamidito 19, o amino-modificador 5 fosforamidito 12 e lexitropsina. 0 tipo de composto D obtém-se por reacção sucessiva do PNA com um grupo hidroxilo em posição terminal com o spacer-9 fosforamidito 8 e a cianina-3 fosforamidito 10. O tipo de composto E obtém-se por reacção sucessiva do PNA com um grupo hidroxilo em posição terminal com a fosforamidito 4 de fluoresceina bifuncional, o spacer-9 fosforamidito 8 e o reagente de fosforilação-C16 7. Os passos a efectuar adicionalmente, como oxidação e dissociação de grupos protectores, encontram-se descritos nos Exemplos.
Um exemplo de uma modificação carboxiterminal de PNA por meio de um fosforamidito de Fórmula V D encontra-se apresentado na Figura 7. Neste caso parte-se de um suporte bis-hidroxietilsulfona 1 (Figura 6) que, após remoção do grupo Dmt com ácido tricloroacético a 3%, se faz reagir com a fosforamidito de Fórmula VD sob catálise com tetrazole. Após oxidação com água de iodo dissocia-se o grupo Mmt aminoterminal com ácido tricloroacético a 3% e sintetiza-se depois a parte de PNA segundo métodos conhecidos da literatura, por exemplo segundo o método Mmt abaixo exemplificado. Um método alternativo para a modificação carboxiterminal utiliza suportes CPG®, adequadamente modificados em relação ao resíduo a introduzir, portanto por exemplo contendo o resíduo fluoresceina (Figura 8). Este método será exemplificado no exemplo de um derivado de PNA que se encontra modificado no extremo amino terminal com um resíduo hexadecilfosfato e no extremo carboxilo terminal com um fosfato de fluoresceina. Em primeiro lugar destritila-se o suporte de fluoresceina 3 (Figura 6) com ácido tricloroacético e condensa-se depois com o amino-modificador-C6 fosforamidito 13 (Figura 4d) com a ajuda de tetrazole. Após oxidação com água de iodo e dissociação do grupo Mmt pode sintetizar-se a parte de 36 PNA segundo métodos usuais. No último ciclo acopla-se uma unidade de PNA baseada em hidroxietilglicina (Fórmula VA, u' = 2, V' = oxigénio) que, após dissociação do grupo protector Mmt por meio do reagente de fosforilação C16 7, se faz reagir como indicado na Figura 9. Após remoção de todos os grupos protectores e separação do suporte CPG obtém-se o derivado de PNA duplamente modificado.
Exemplos: A preparação dos compostos seguintes encontra-se descrita exemplificativamente: PNA-1:
PNA-2:
37 ΡΝΑ-4: Ο ΗΝ^ΝΗ & H2N-(CH2)6-0
οJL ΡΝΑ-3:
Ο (CH2)^N-(CH^° ά-°
N-(CH2)2-o^ ο II Ρ> I ο ΡΝΑ-5:
38 ΡΝΑ-6:
ΡΝΑ-7:
em que a sequência das bases B é descrita em cada caso por SEQ ID N°: 53, e z" é em cada caso iqual a 10: SEQ ID NO: 53 5’-TATTCCGTCAT-3’ (PNA-1 a ; PNA-7) 39
Exemplo 1:
Síntese da cadeia de PNA
Para a preparação da parte do PNA utilizaram-se os seguintes reagentes: 1. Reagente de fosforamidito (0,1 M em acetonitrilo (ACN)) 2. Monómeros Mmt-PNA ou monómeros Dmt-oeg-PNA (0,2 M em DMF:ACN (1:1, v:v)) 3. ACN anidro (< 30 ppm de água) 4. Ácido tricloroacético (3%) em diclorometano (DCM) 5. Anidrido acético, 2,6-lutidina em THF (1:1:8/ v:v:v); (Cap A) 6. N-metilimidazole (16%) em THF; (Cap B) 7. Solução de iodo (0,05 M) em THF, água, piridina (7:2:1; v: v: v) 8. Solução de lavagem (THF, água, piridina (7:2:1; v:v:v))
9. Tetrazole (0,3 M) em ACN 10. HBTU; 0,2 M em DMF:ACN (1:1; v:v) 11. DlPEA; 0,2 M em DMF:ACN (1:1; v:v) 12. DMF (> 99,5%) 13. Suporte da fase sólida: aminopropil-CPG® (550 À) carregado com hemissuccinato de Mmt-amino-hex-l-ilo (para hexilamidas de PNA).
Os monómeros oeg Mmt/acil-protegidos ou Dmt/acil-protegidos prepararam-se como já descrito (Breipohl et al. (1997)
Tetrahedron 53, 14671-14686). A carga de aminopropil-CPG® com o hemissuccinato de Mmt-amino-hex-l-ilo foi também já descrita (Will et al. (1995) Tetrahedron 51, 12069-12082). Os suportes de CPG® derivatizados encontram-se disponíveis comercialmente (Glen 40
Research Corporation, Sterling, VA 20164, USA). As sínteses de PNA efectuaram-se em geral numa escala de 2 a 5 μιηοΐ.
Utilizou-se o seguinte ciclo para a síntese do PNA:
1. Passo de lavagem com ACN 2. Desprotecção do grupo Mmt ou do grupo Dmt por tratamento com TCA a 3% em DCM; 110 seg. 3. Passo de lavagem com DMF/ACN (1:1) 4. Neutralização com DIPEA em DMF/ACN (1:1) 5. Acoplamento da unidade monomérica por pré-activação (15 min) com monómero de HBTU/DIPEA/PNA (proporção 1:1:1; volume total 450 μΐ), revestimento da fase sólida e acoplamento (45 min)
6. Passo de lavagem com ACN 7. Adição do terminal CAP com anidrido acético / N-metilimidazole
8. Passo de lavagem com ACN 9. Novo ciclo
Exemplo 2: Síntese de acetil-tat tcc gtc at-amino- hexil-p (PNA 1)
Em primeiro lugar dissocia-se o grupo protector Dmt do suporte bis-hidroxietilsulf onilo (1 μιηοΐ, Figura 6) por tratamento com ácido tricloroacético a 3%. Faz-se reagir depois a função hidroxilo livre com o amino-modificador C16 fosforamidito 13 (Figura 4d) sob catálise com tetrazole. Neste caso empregam o reagente de fosforilação 13 em excesso (cerca de 25 vezes) como solução 0,3 M em acetonitrilo/tetra-hidrofurano 41 (1:1; v:v) e ο tetrazole (cerca de 50 vezes; 0,5 M em acetonitrilo) . Após efectuada a condensação oxida-se com uma solução de iodo (0,05 M em tetra-hidrofurano / água, piridina (7:2:1; v:v:v) ) . Prepara-se em seguida a parte de PNA, como descrito no Exemplo 1, por síntese em fase sólida. No último ciclo acetila-se a função amino livre por tratamento com o reagente de adição do terminal CAP. Isto evita, na desprotecção com amoníaco concentrado, a degradação aminoterminal do PNA. Finalmente, dissocia-se o PNA do suporte por tratamento com amoníaco concentrado a 50 °C durante a noite e, ao mesmo tempo, removem-se os grupos protectores. Obtém-se 103 OD (260) do produto bruto desejado, que se purificou por electroforese de gel de poliacrilamida (PAA) preparativa. A banda de produto desejado elui-se com 0,2 M de tampão de bicarbonato de tetrametilamónio e dessaliniza-se através de uma coluna Bond-Elut C18 (1 g) . Obtêm-se 23,3 OD. Analisou-se o produto através de espectrometria de massa de iões negativos, que confirmou a massa calculada (calculada 3166,2; encontrada 3166,8).
Exemplo 3: 2)
Síntese de acetil-tat tcc gtc at(eo)-p (PNA A preparação efectua-se de modo análogo, como descrito no Exemplo 2, numa síntese de 1 μιηοΐ. Após dissociação do grupo protector Dmt do suporte 1 (Figura 6) faz-se reagir a função hidroxilo livre com a fosforamidito de Fórmula V D sob catálise com tetrazole. Empregam-se neste caso a fosforamidito em excesso (cerca de 20 vezes) como solução 0,1 M em acetonitrilo/tetra-hidrofurano (1:1; v:v) e o tetrazole (cerca de 50 vezes; 0,5 M em acetonitrilo) . Após efectuada a condensação oxida-se com uma solução de iodo (0,05 M em tetra-hidrofurano/água, piridina 42 (7:2:1; v:v:v)). Após a dissociação com amoníaco obtém-se 50 OD de produto bruto. Destes purificaram-se 45 OD por electroforese num gel de PAA a 15%. Obtém-se 13,2 OD de produto com o peso molecular de 3052,9 (calculado 3052,9).
Exemplo 4: Síntese de amino-hexil-p-(oeg) at tcc gtc at-amino-hexil-p (PNA 3) A preparação efectua-se de modo análogo, como descrito no Exemplo 2, numa síntese de 1 μπιοΐ. Após construção da extremidade do carboxilo terminal e síntese da parte de PNA faz-se o acoplamento com timina como base nucleotídica (oegT), no último ciclo, no entanto numa unidade à base de hidroxietilglicina. Após dissociação do grupo Dmt acopla-se a função hidroxilo livre com o amino-modificador C6 fosforamidito 13 (Figura 4d) sob catálise com tetrazole e oxida-se em seguida com água de iodo. Por tratamento com amoníaco concentrado a 50 °C dissocia-se o oligómero do suporte e removem-se ao mesmo tempo todos os grupos protectores lábeis em meio básico. Remove-se depois o grupo protector terminal Mmt por tratamento com ácido acético a 80%. Obtém-se 130 OD de produto bruto, que se purificou por electroforese de gel. Obtém-se 22,5 OD de produto com o peso molecular de 3303,8 (calculado 3305,0).
Exemplo 5: Síntese de biotina-p-t(oeg) at tcc gtc at- amino-hexil-p (PNA-4) A preparação efectua-se de modo análogo, como descrito no Exemplo 2, numa sintese de 0,5 μιηοΐ. Após construção do terminal 43 carboxilo e síntese da parte de ΡΝΆ faz-se o acoplamento com timina como nucleobase (oegT), no último ciclo, no entanto numa unidade à base de hidroxietilglicina. Após dissociação do grupo Dmt acopla-se a função hidroxilo livre com biotina-fosforamidito 5 (Figura 4b) sob catálise com tetrazole e oxida-se em seguida com água de iodo e destritila-se com ácido tricloroacético. Por tratamento com amoníaco concentrado a 50 °C dissocia-se o oligómero do suporte e removem-se ao mesmo tempo todos os grupos protectores. Obtém-se 37 OD de produto bruto, que se purificou por electroforese de gel. Obtém-se 22,5 OD.
Exemplo 6: Síntese de p-t(oeg) at tcc gtc at-amino- hexil-p-fluoresceína (PNA-5) A síntese efectua-se de modo análogo ao do Exemplo 2, a partir da fluoresceína-suporte 3 (Figuras 6a e 8). Dissocia-se o grupo protector Dmt da fluoresceína-suporte 3 por tratamento com ácido tricloroacético a 3%. Faz-se reagir depois a função hidroxilo livre com o amino-modificador C6 fosforamidito 13 (Figura 4d) sob catálise com tetrazole. Após efectuada a condensação oxida-se com uma solução de iodo (0,05 M em tetra-hidrofurano/água, piridina (7:2:1; v:v:v)). Em seguida prepara- se a parte de PNA, como descrito no Exemplo 1, por síntese em fase sólida. No último ciclo acopla-se com timina como nucleobase ((t)oeg) numa unidade à base de hidroxietilglicina. Após dissociação do grupo Dmt acopla-se a função hidroxilo livre com o reagente de fosforilação 1 (Figura 4a) sob catálise com tetrazole e oxida-se em seguida com água de iodo. Finalmente dissocia-se o PNA do suporte por tratamento com amoníaco concentrado a 50 °C durante a noite. Obtém-se 61 OD (260) de produto bruto, que se purificou por electroforese de gel de 44 poliacrilamida (PAA) preparativa. A banda de produto desejado elui-se com tampão de bicarbonato de trietilamónio 0,2 M e dessaliniza-se através de uma coluna de Bond-Elut C18 (1 g).
Obtém-se 5,6 OD. Analisou-se o produto por espectrometria de massa de iões negativos, que mostrou a massa calculada (calculada: 3709,5/ encontrada: 3706,3).
Exemplo 7: Sintese de C16-p-t(oeg) at tcc gtc at-amino- hexil-p-fluoresceína (PNA-6) A sintese efectua-se de modo análogo ao do Exemplo 6, a partir de 1 μιηοΐ de fluoresceina-suporte 3 (Figuras 6a e 8) . No último ciclo acoplou-se com timina como nucleobase ((t)oeg) numa unidade à base de hidroxietilglicina. Após dissociação do grupo Dmt acopla-se contudo a função hidroxilo livre com o reagente de fosforilação C16 7 (Figura 4c) sob catálise com tetrazole e oxida-se em seguida com água de iodo. Finalmente dissocia-se o PNA do suporte por tratamento com amoníaco concentrado a 50 °C durante a noite e removem-se ao mesmo tempo os grupos protectores. Obtém-se 61 OD (260) de produto bruto desejado, que se purificou por electroforese de gel de poliacrilamida (PAA) preparativa. A banda de produto desejado elui-se com tampão de bicarbonato de trietilamónio 0,2 M e dessaliniza-se através de uma coluna de Bond-Elut C18 (1 g) . Obtém-se 4,6 OD. Analisou-se o produto por espectrometria de massa de iões negativos, que mostrou a massa calculada (calculada: 3934; encontrada: 3931). 45
Exemplo 8:
Determinação das temperaturas de fusão A determinação das temperaturas de fusão efectuou-se por meio de um espectrofotómetro de matriz de diodos HP 8452A, de um elemento Peltier HP 89090A e o software de controlo de temperatura HP Rev. B5.1 (firma Hewlett Packard). Efectuam-se as medições em passos de 0,5 °C/min em tampão 140 mM KC1, 10 mM di-hidrogenofosfato de sódio, 0,1 mM EDTA (pH 7,4). A concentração de oligómero é de 0,5 a 1 OD26o por mL.
Surpreendentemente, os derivados PNA-5 e PNA-6 duplamente fosforil-modifiçados, com duas ou três cargas negativas, apresentaram uma igualmente boa ou melhor ligação em relação a ADN e ARN complementares comparados com o PNA não carregado (substância de referência).
Derivado de PNA Tm (ADN) Tm (ARN) Referência Ac-HN-tat tcc gtc at-hex 41,9 °C 56,6 °c PNA-5 p-t(oeg) at tcc gtc amino-hexil-p-fluoresceína 41,8 °C 56,9 °C PNA-6 C16-p-t(oeg) at tcc gtc amino-hexil-p-fluoresceína 44,1 ° c 56,9 °C
Exemplo 9: Determinação da incorporação celular por marcação de fluorescência
Deixam-se crescer as células COS até à confluência em MEM de Dulbecco, suplementado com 10% de FCS, em caixas de Petri de 5 cm. Lavam-se as células duas vezes com DMEM isento de soro. Por meio de uma agulha esterilizada desenha-se uma área de cerca de 1 cm2 no centro da caixa de Petri. Nesta área aplica-se a 46 solução de PNA a testar (10 μΜ). Incuba-se a 37 °C sob atmosfera de CO2. Após 2, 4 e 16 horas testam-se as células por microscopia de fluorescência. Para tal lavam-se as células quatro vezes com DMEM isento de soro, tapam-se com um suporte de vidro e avaliam-se ao microscópio de fluorescência ou por contraste de fases. Testam-se o PNA-5 e o PNA-6 por microscopia de fluorescência.
Verificou-se neste caso que o derivado hexadecil-PNA (PNA-6) foi mais eficientemente incorporado nas células do que o PNA sem residuo hexadecilo.
Exemplo 10: Inibição da proliferação celular pelo PNA-6 A sequência de PNA-6 é dirigida contra o inicio de tradução de Ha-ras ARNm.
Cultivaram-se as células REH (células de pré-leucemia B humanas, DSM ACC 22) ou células tumorais A594 em OptiMEM (Gibco BRL) com soro de vitela fetal (FCS, GIBCO-BRL) a 10%, a 37 °C sob 5% de CO2. A densidade celular para o ensaio era de cerca de 1 x 106/mL. Incubou-se o PNA-6 (10 μΜ) com as células em placas de 24 orifícios. Após 96 h de incubação a 37 °C sob 5% de CO2 determinou-se a densidade celular. Calcularam-se valores médios da densidade celular a partir de 3 orifícios individuais de uma concentração de PNA. Verificou-se que 0 PNA-13 inibe a proliferação das células REH. Após > 4 dias de tempo de incubação a inibição pelo PNA-6 é mais forte do que por um oligonucleótido de fosforotioato correspondente. 47
Exemplo 11: Síntese de amino-hexil-p-spacerl8-p-t(oeg) at tcc gtc at-amino-hexil-p (PNA-7) A preparação efectua-se de modo análogo ao descrito no Exemplo 2, numa síntese de 1 μπιοΐ. Após construção do terminal carboxilo e síntese da parte de PNA, no último ciclo, acopla-se no entanto com timina como nucleobase (oegT) numa unidade à base de hidroxietilglicina. Após cisão do grupo Dmt acopla-se a função hidroxilo livre com a fosforamidito Spacer 18 (Figura 4c) e após nova destritilação com o amino-modificador C6 fosforamidito 13 (Figura 4d), sob catálise com tetrazole, e oxida-se em seguida com água de iodo. Separa-se o oligómero do suporte por tratamento com amoníaco concentrado a 50 °C e removem-se ao mesmo tempo todos os grupos protectores lábeis em meio básico. Remove-se depois o grupo protector Mmt terminal por tratamento com ácido acético a 80%. Obtém-se 57 OD do produto bruto, que se purificou por electroforese de gel. Obtém-se 7,4 OD de produto que apresenta por espectrometria de massa o peso molecular esperado de 3647,5 (calculado: 3648,5).
Lista de abreviaturas: ACN acetonitrilo BOC terc-butiloxicarbonilo C, c pseudoisocitosina COS CV1 origem SV 40 CPG controlled pore glass DCM diclorornetano DIPEA diisopropiletilamina DMEM MEM de Dulbecco DMF dimetilformamida 48
Dmt ADN DNP FITC Fmoc HATU HBTU
hex MEM Mmt OD oeg PAA PG PNA ARN TBTU TCA THF TR dimetoxitritilo ácido desoxirribonucleico dinitroarilo isotiocianato de fluoresceína fluorenilmetoxicarbonilo hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio hexafluorofosfato de 0-(benzotriazol-l-il)-
1.1.3.3- tetrametilurónio -NH- (CH2) 6-OH modified Eagle's minimal essential médium monometoxitritilo densidade óptica N- (2-hidroxietil)glicina poliacrilamida grupo protector ácido poliamida-nucleico ácido ribonucleico tetrafluoroborato de 0-(benzotriazol-l-il)- 1.1.3.3- tetrametilurónio ácido tricloroacético tetra-hidrofurano grupo protector lábil em meio ácido
As Figuras la, lb, 2b e 3b mostram exemplos para residuos Z e Z' terminais.
As Figuras 2a e 3a mostram exemplos para residuos X e X' ligados em ponte.
As Figuras 4a, 4b, 4c e 4d mostram exemplos para reagentes de fosforilação. 49
As Figuras 5a e 5b mostram exemplos para a derivatização simples (A,B) e múltipla (C a E) na extremidade do N terminal de PNA. A Figura 6 mostra exemplos para reagentes ligados a suporte para a síntese em fase sólida.
As Figuras 1, 8 e 9 mostram exemplos para a síntese de PNA modificados no C e N terminais.
PROTOCOLO DE SEQUÊNCIA
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Derivados de ácido poliamida-nucleico, agentes e processos para a sua preparação <130> AVE D-2000/A023 <140> <141 > <150> 10019135.5 <151 >2000-04-18 50 <160?» 53 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211 >21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos o <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(21) <400> 1 gcgtttgctc ttcttcttgc g 21
<210> 2 <211 >20 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400>2 acacccaatt ctgaaaatgg 20
<210> 3 <211 >20 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400>3 aggtccctgt tcgggcgcca 20
<210> 4 <211 >20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> 51 <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400>4 gcggggctcc atgggggtcg 20
<210> 5 <211> 15 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(15) <400>5 cagctgcaac ccagc 15
<210>6 <211> 11 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(11) <400>6 tattccgtca t 11
<210> 7 <211 >22 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(22) <400>7 ttccgtcatc gctcctcagg gg 22
<210> 8 <211 > 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos 52 <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(15) <400>8 cgctaccatg gtccc 15
<210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(21) <400>9 ggctgctgga gcggggcaca c 21
<210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(15) <400> 10 aacgttgagg ggcat 15
<210> 11 <211 > 18 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1) .. (18) <400> 11 gtgccggggt cttcgggc 18
<210> 12 <211 > 17 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> 53 <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(17) <400> 12 cgagaacatc atcgtgg 17
<210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(21) <400> 13 ggagaacatc atggtcgaaa g 21
<210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(22) <400> 14 cccgagaaca tcatggtcga ag 22
<210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400> 15 ggggaaagcc cggcaagggg 20
<210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial 54 <22 Ο > <223>Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400> 16 cacccgcctt ggcctcccac 20
<210> 17 <211 > 18 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(18) <400> 17 gggactccgg cgcagcgc 18
<210> 18 <211 >20 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400> 18 ggcaaacttt cttttcctcc 20
<210> 19 <211> 19 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(19) <400> 19 gggaaggagg aggatgagg 19
<210> 20 <211 >21 <212> DNA 55 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1) .. (21) <400> 20 ggcagtcatc cagcttcgga g 21
<210> 21 <211 > 18 <212> DNA <213> Kunstliche Sequenz <220> <223> Beschreibung der kUnstlichen Sequenz:Oligonukleotide <220> <221 > misc_binding <222> (1)..(18) <400> 21 tctcccagcg tgcgccat 18
<210> 22 <211 > 19 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(19) <400> 22 gcgctgatag acatccatg 19
<210> 23 <211> 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 23 ggaggcccga cc 12 <210> 24 56
<211> 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 24 ggtttcggag gc 12
<210> 25 <211 > 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 25 tggtggaggtag 12
<210> 26 <211 > 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 26 gcatggtgga gg 12
<210> 27 <211> 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1) . . (12) <400> 27 ttggcatggt gg 12 57
<210> 28 <211> 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1) .. (12) <400> 28 gcctgggacc ac 12
<210> 29 <211 > 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 29 cagcctggga cc 12
<210> 30 <211 > 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 30 tgcagcctgg ga 12
<210> 31 <211 > 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1) .. (12) <400> 31 58 12 gtgcagcctg gg
<210> 32 <211 > 12 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 32 ggtgcagcct gg 12
<210> 33 <211> 12 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 33 atgggtgcag cc 12
<210> 34 <211 > 12 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 34 ggcttgaaga tg 12
<210> 35 <211 > 12 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) 59 <40 Ο > 35 gcagcccccg ca 12
<210> 36 <211 > 12 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(12) <400> 36 gcagcagccc cc 12
<210> 37 <211 >20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400> 37 tcccgcctgt gacatgcatt 20
<210> 38 <211 >20 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400> 38 gttctcgctg gtgagtttca 20
<210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista 60 <222> (1)..(18) <400> 39 gcgtgcctcc tcactggc 18
<210> 40 <211 > 18 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(18) <400> 40 gcagtaagca tccatatc 18
<210> 41 <211 >20 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400> 41 gcccaagctg gcatccgtca 20
<210> 42 <211 >20 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(20) <400> 42 cccccaccac ttcccctctc 20
<210> 43 <211 >20 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos 61 <220> <221 > ligação mista <222> (1) .. (20) <400> 43 ctcccccacc acttcccctc 20
<210> 44 <211 > 19 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(19) <400> 44 gctgggagcc atagcgagg 19
<210> 45 <211 >21 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(21) <400> 45 actgctgcct cttgtctcag g 21
<210> 46 <211> 22 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(22) <400> 46 caatcaatga cttcaagagt tc 22
<210> 47 <211 > 18 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> 62 <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1) . . (18) <400> 47 gcggcggaaa agccatcg 18
<210> 48 <211 > 18 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(18) <400> 48 gtgtcggggt ctccgggc 18
<210> 49 <211 > 15 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(15) <400> 49 cacgttgagg ggcat 15
<210> 50 <211 > 18 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(18) <400> 50 gtcttccata gttactca 18
<210> 51 <211 > 18 <212> DNA <213>Sequência artificial 63 <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(18) <400> 51 gatcaggcgt gcctcaaa 18
<210> 52 <211 >21 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(21) <400> 52 gatggagggc ggcatggcgg g 21
<210> 53 <211 > 11 <212> DNA <213>Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: Oligonucleótidos <220> <221 > ligação mista <222> (1)..(11) <400> 53 tattccgtca t 11
Lisboa,18 de Janeiro 2007 64

Claims (42)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Derivado de PNA de Fórmula (I)
    Extremidade do N terminal Extremidade do C terminal Fórmula I em que q é igual a 0 ou 1, D' significa hidroxilo, mercapto, amino, alquilamino ou acilamino, V independentemente entre si, significa oxigénio, enxofre, NRi, V' independentemente entre si, significa oxigénio, enxofre, NRi, um grupo U- (CR3R4) U'-C (O) -NH ou um grupo U- (CH2CH20)U'-C (O) -NH, U independentemente entre si, significa oxigénio, enxofre ou NH, u' independentemente entre si é igual ala 10, de um modo preferido 1 a 4, de um modo particularmente preferido 1, W e W' independentemente entre si, significam oxigénio, enxofre ou NRi, Y e Y' independentemente entre si, significam hidroxilo, mercapto, anião oxilo, tioato ou NRiR2, 1 X e X' independentemente entre si, significam um grupo U-alcanodiilo (C2-C22) “U ou um grupo U- (CH2CH2-0) u-, ou significam um grupo marcador, ou um grupo para reticulação, ou um grupo que facilita a incorporação intracelular, ou um grupo que aumenta a afinidade de ligação do derivado de PNA a ácidos nucleicos, por exemplo um residuo bifuncional fluoresceina, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, corante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G ou digoxigenina, Z e Z' independentemente entre si, significam hidroxilo, mercapto, anião oxilo, tioato ou NR2R2, alquilo-Ci-C22, arilalquilo-Ci-Cs, alquilo-Ci-C22_U, arilalquilo-Ci-Cs-U, hidroxi-Ci-Ci8-U, aminoalquilo-U, mercaptoalquilo-U, ou um grupo de fórmula R7 (CH2CH2-0) m, em que R7 é igual a hidroxilo, amino ou alcooxilo-Ci-C22 e m é igual ala 100, de um modo preferido 2 a 10, ou são um grupo marcador, ou um grupo para reticulação, ou um grupo que facilita a incorporação intracelular, ou um grupo que aumenta a afinidade de ligação do derivado de PNA a ácidos nucleicos, por exemplo um residuo monofuncional ou bifuncional fluoresceina, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, corante de cianina, dabcilo, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G ou digoxigenina, Ri e R2 independentemente entre si, significam um residuo constituído por hidrogénio ou alquilo-Ci-C6, de um modo preferido hidrogénio, R3 e R4 independentemente entre si, significam um resíduo constituído por hidrogénio ou alquilo-Ci-C6 ou o 2 residuo de uma cadeia lateral de aminoácido, de um modo preferido hidrogénio, em que residuos R3 e R4 vizinhos em V' também podem formar um anel cicloalquilo-C5-C8, n é igual a 0 a 10, de um modo preferido 0 a 3, m é igual a 0 a 10, de um modo preferido 0 a 3, e em que {POLI} é descrito pela Fórmula II, {BLOCO} υA. nH— {BLOCO}—G-- H Fórmula II em que {BLOCO}, independentemente entre si, é ainda um grupo escolhido de entre a Fórmula IIIA,
    Fórmula III A ou a Fórmula IIIB, H I -D E- Fórmula III B 3 ou as Fórmulas IV A a IV G,
    Fórmula IV A Fórmula IV B Fórmula IV C
    em que cada unidade {BLOCO} pode ser diferente, e ainda é válido z'' é igual a 0 a 100, de um modo preferido 1 - 20, de um modo particularmente preferido 4 - 15, G é escolhido de entre os grupos (CR5R6)U'/ C(0)NH- (CRiR2)t' ou C (O) NH-(0Η20Η20) U'-CH2CH2, em que t' é igual a 2 a 10, de um modo preferido 6, 4 A independentemente entre si, significa um grupo (CR1R2S), em que s é igual a 1 a 3, de um modo preferido 1, B independentemente entre si, significa um residuo aromático que também pode ter carácter heteroaromático, ou hidrogénio, ou hidroxilo ou alquiloCi-Cis, ou uma base nucleotídica usual na química de nucleótidos, de origem natural ou não natural, ou a sua forma de pró- -fármaco, D independentemente entre si, é um grupo (CR3R4)t, em que t é igual a 2 a 10, de um modo preferido 2 a 4, de um modo particularmente preferido 2, E independentemente entre si, é um grupo (CR5R6)U'/ em que residuos R5 e Rô vizinhos também podem formar um anel cicloalquilo-C5-C8 ou um composto espiro, R5 e Rg independentemente entre si, significam um residuo constituído por hidrogénio ou alquiloCi~C6 ou o resíduo de uma cadeia lateral de aminoácido, de um modo preferido hidrogénio, e em que u' , Ri, R2, R3 e R4 possuem o mesmo significado como acima descrito, bem como os sais fisiologicamente toleráveis do derivado de PNA de Fórmula I, com as condições de pelo menos um resíduo Y, Y' , Z ou Z' ser igual a hidroxilo, mercapto, anião oxilo ou tioato, e pelo menos um grupo B ser uma nucleobase.
  2. 2. Derivado de PNA de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um resíduo Y, Y', Z ou Z' na Fórmula I, numa gama de pH de 4,5 a 14, de um modo preferido 6,5 a 12, de 5 um modo particularmente preferido 6,5 a 9, é igual a anião oxi ou tioato.
  3. 3. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, em que n e m , independentemente entre si, são iguais a 0 .
  4. 4 . Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que q é i gual a 1.
  5. 5. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que W e W ' são iguais a oxo
  6. • 6. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, em que Y e Y ' são iguais a hidroxilo ou anião oxi.
  7. 7 . Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, em que V e V ' são iguais a oxi
  8. • 8 . Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, em que X e X' , independentemente entre si, são iguais a um grupo U- (alcanodiiloC2_C22) -U, de um modo preferido 0-(alcanodiiloC2-C22)-0, de um modo particularmente preferido 0- (CH2) 2-6_0, ou é igual a um grupo U- (CH2CH2-0) u-, de um modo preferido 0- (CH2CH2-O) u-, em que u' é 1 a 6.
  9. 9. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, em que X, X' , Z e Z' , independentemente entre si, são escolhidos de entre o grupo fluoresceina, rodamina, TAMRA ou corante cianina, biotina, dabcilo, psoraleno, acridina, DNP, colesterol, vitamina E, dabcilo, edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G ou digoxigenina. 6
  10. 10. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, em que X, X' , Z e Z' , independentemente entre si, são escolhidos de entre o grupo monofosfato, derivado de biotina e derivado de fluoresceina.
  11. 11. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, em que Z é um marcador de fluorescência e Z' é um agente de extinção.
  12. 12. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, em que Z é um agente de extinção e Z' é um marcador de fluorescência.
  13. 13. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, em que Z e Z' , independentemente entre si, são um resíduo alquiloCi-C22, ou um resíduo U-C1-C22, de um modo preferido um resíduo alcooxiloCi-C22, de um modo particularmente preferido alcooxiloCi6, ou hidroxi-U-Ci-Cis, de um modo preferido hidroxi-O-Ci-Cis, de um modo particularmente preferido HO- (CH2) 3-12O, ou um resíduo aminoalquilo-U, de um modo preferido um resíduo aminoalcooxilo, de um modo particularmente preferido 6-amino-hexoxilo ou 5- aminopentoxilo, ou um grupo de fórmula R7-(CH2CH2-O) m, em que R7 é de um modo preferido OH ou NH2, e m é igual ala 6, de um modo particularmente preferido HO (CH2CH2-O) 2, HO (CH2CH2-O) 6 e H2N- (CH2CH2-0) 2, ou um resíduo mercaptoalquilo-V, de um modo preferido um resíduo mercaptoalcooxilo, de um modo particularmente preferido 6- mercapto-hexiloxilo.
  14. 14. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que 9 é igual a 0. 7
  15. 15. Derivado de PNA de acordo com a reivindicação 14, em que D' é igual a acilamino, de um modo preferido acetilamino.
  16. 16. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, em que D é igual a (CH2) t, de um modo preferido (CH2) 2
  17. · 17 . Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 16, em que A, E e G são iguais a ch2
  18. • 18. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 17, em que B é igual a adenina, citosina, 5-metilcitosina, guanina, timina e uracilo, ou igual a purina, 2,6-diaminopurina, N4N4-etanocitosina, N6N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-alcinil (C3-C6) -uracilo, 5-alcinil (C3-C6) -citosina, 5-(1-propargilamino)-uracilo, 5-(1-propargilamino)-citosina, fenoxazina, 9-aminoetoxifenoxazina, 5-fluorouracilo ou pseudoisocitosina, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, di-hidrouracilo, 5-alquil(Οχ-Οβ)-uracilo, 5-alquil (Cx-Cô) -citosina, 5-alcenil (C2-C6) -citosina, 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina, 7-desazaadenina, 7-desazaguanina, 8-azapurina ou uma purina-7-desaza-7-substituída.
  19. 19. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 18, em que a sequência de bases é dirigida contra partes de genes supressores de tumores, oncogenes ou telomerases ou seus produtos de transcrição.
  20. 20. Derivado de PNA de acordo com a reivindicação 19, em que a sequência de bases da parte de PNA é dirigida contra o inicio de tradução de HA-ras ARNm.
  21. 21. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1-10 ou 13 - 20 para utilização como medicamento.
  22. 22. Utilização de um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 - 10 ou 15 - 22 para a preparação de um medicamento para a terapia de tumores.
  23. 23. Derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 20 para utilização como meio de diagnóstico.
  24. 24 . Utilização de um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 20 para a identificação de microrganismos e/ou virus.
  25. 25. Utilização de um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 20 para a identificação e/ou quantificação < de ácidos nucleicos.
  26. 26. Utilização de um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 20 como reagente de detecção para a hibridação in situ ou para a hibridação in situ de fluorescência.
  27. 27 . Utilização de um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 0 como agente antissentido, antigene, de chamariz ou de quimeroplastia.
  28. 28. Utilização de um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 11 ou 22 como guia molecular. 9
  29. 29. Reagente de identificação contendo um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 20.
  30. 30. Chip de PNA contendo um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 20.
  31. 31. Biossensor contendo um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 20.
  32. 32. Medicamento contendo um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 - 10 ou 15 - 22 e, conforme o caso, outros aditivos e/ou veículos farmacologicamente toleráveis.
  33. 33. Agente antissentido, antigene, de chamariz ou de quimeroplastia, contendo um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 20.
  34. 34. Processo para a preparação de um derivado de PNA de Fórmula I, em que a) se acopla a extremidade do C terminal de um ácido amida-nucleico com um reagente de fosforilação ligado a uma fase sólida, ou se liga um ácido amida-nucleico fosforilado na extremidade C a um suporte sólido, b) se prolonga o esqueleto do oligómero de PNA por acoplamento sequencial com monómeros de ácido amidonucleico, c) conforme o caso, se faz reagir na extremidade do N terminal com um reagente de fosforilação. 10
  35. 35. Processo de acordo com a reivindicação 34, em que se prepara o PNA utilizando os grupos protectores terc-butiloxicarbonilo (BOC), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) ou monometoxitritilo (Mmt).
  36. 36. Processo de acordo com uma das reivindicações 34 ou 35, em que se prepara o PNA utilizando suportes sólidos.
  37. 37. Processo de acordo com a reivindicação 36, em que se utiliza como suporte sólido CPG®, Tentagel® ou aminometilpoliestireno.
  38. 38. Processo para a preparação de um medicamento, em que a) se prepara um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 - 10 ou 15 - 20, e b) conforme o caso, se mistura com outros aditivos e/ou veiculos farmacologicamente toleráveis.
  39. 39. Processo para a preparação de um chip de PNA, em que se prepara primeiro um derivado de PNA de acordo com uma das reivindicações 1 a 20 e se fixa depois sobre um suporte sólido, ou se prepara directamente o derivado de PNA sobre o suporte.
  40. 40. Processo para a preparação de um derivado de PNA de Fórmula I, de acordo com as reivindicações 34 a 37, caracterizado ainda por se purificar o PNA por meio de cromatografia ou de electroforese, tirando partido do carácter ácido do residuo de fósforo. 11
  41. 41. Processo de acordo com a reivindicação 40, em que 0 derivado de PNA se purifica por cromatografia através de uma fase estacionária básica ou de um gradiente de um eluente ácido ou salino.
  42. 42. Processo de acordo com a reivindicação 41, em que a fase estacionária é um permutador aniónico ou uma fase de modo misto. Lisboa, 18 de Janeiro 2007 12
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