PT90504B

PT90504B - Processo para a preparacao de alcoois peptidicos com actividade anticoagulante

Info

Publication number: PT90504B
Application number: PT90504A
Authority: PT
Inventors: John Leonard Krstenansky
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1988-05-10
Filing date: 1989-05-09
Publication date: 1994-08-31
Also published as: KR0131378B1; AU626070B2; NZ228995A; DE68916850T2; EP0341607B1; PT90504A; FI892222A0; ES2060689T3; AU3451789A; NO891894L; CN1041157A; EP0341607A2; ZA893346B; DE68916850D1; HU202556B; DK226889A; PH26973A; KR900018138A; DK226889D0; FI892222A

Description

MERRELL DOW PHARMACEUTI CALS , INC.

Processo para a preparação de álcoois peptídicos com actividade anticoagulante

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a novos álcoois peptídicos utilizáveis como agentes anticoagulantes.

Antecedentes da invenção

Os anticoagu1 antes são agentes terapêuticos úteis no tratamento farmacológico de, por exemplo, trombose aguda das veias profundas, embolia pulmonar, embolia aguda arterial das extremidades, enfarte miocárdio e coagulação intravascular disseminada Acredita-se que a administração profiláctica de agentes anticoagulantes impessa a ocorrência da embolia nos doentes com doença cardíaca arteriosclerótica ou reumática e impessa certas complicações tromboembό1icas da cirurgia. A administração de agentes anticoagu 1 antes também se têm indicado no tratamento de doença das artérias coronárias e cerebrovascu1 ar . A trombose arterial,

particularmente nas artérias que irrigam o músculo cardíaco e o cérebro é uma causa de morte.

A hirudina é um polipeptido de 65 resíduos isolado das glândulas salivares das sanguessugas. E um agente anticoagu1ante, que constitui um inibidor específico da trombina. Ainda que muito potente o uso clínico da hirudina isolada a partir de extractos de sanguessuga parece pouco provável devida à sua quantidade limitada, custo e reacções alérgicas que correntemente se seguem à administração de qualquer proteína estranha desta dimensão.

Os requerentes descobriram uma região específica de hirudina que é responsável pelo menos em parte, pela sua actividade anticoagulante. Esta região tem sido sintetizada quimicamente e certos dos seus análogos apresentam-se ligados ao sítio de reconhecimento da trombina, mas não ao sítio de cisão enzimatica que está separado especia 1 mente. A ligação dos peptidos sintéticos competitivamente impede a ligação do fibrinogereo ao sítio de reconhecimento da trombina, uma pré-exigêncιa da produção da fibrina e da formação do coágulo. Os requerentes prepararam então certos derivados reduzidos deste peptido. A função ácido carboxílico destes novos derivados foi reduzida para a sua correspondente função álcool. Os álcoois peptidícos da presente invenção possuem uma actividade anticoagu1ante significativa e a sua capacidade pouco comum para se ligarem apenas ao sítio de reconhecimento sem se ligarem ao sitio de clivagem da trombina podem permitir um interessante significado terapêutico e científico como adjuvante da terapêutica antico agu1 ante. Além disso a presença da função álcool pode proporcionar uma potência reforçada e uma duração prolongada de acção.

Resumo da invenção

São agentes anticoagulantes úteis os derivados peptídicos da fórmula geral I

X — A -A^-A^-A^-A^-Ag-A^-Ag-A^-A^g-o1 na qual

X representa um átomo de hidrogénio ou um ou dois grupos alquilo com 1 a 6 átomos de carbono ou um ou dois grupos acilo com 2 a 10 átomos de carbono, carbobenzi1 oxi ou t-butiloxi carbonil;

Arepresenta uma ligação ou um fragmento peptídico com 1 a 11 restos de um amino-ácido qualquer;

A^ representa um grupo Phe, SubPhe, p-(2- e 3-tieni1 )-a 1 a· nina

-(2- e 3 - f u r a n i 1 ) - a 1 a n i n a , - ( 2 - , 3 - e 4-piri d i 1 ) - a 1 an i n a , yS - ( b e η z o t i e n i 1 - 2 - e 3 - i 1 ) - a 1 a n i n a , ^-(1 e 2-nafti1)-a 1 anina, Tyr ou Trp;

representa Glu ou Asp;

A representa um aminoácido qualquer;

Arepresenta lie, Vai, Leu, Nle ou Phe;

A. representa Pro, Hyp, 3,4-desidro Pro, um grupo tiazoli

O dina-4-carboxilato, Sar, Nm e Pgl ou D-Ala;

A? representa um aminoácido qualquer;

A_o representa um aminoácido qualquer; □

Ag representa um aminoácido lipofílico escolhido entre Tyr, Met, Trp, Phe, Leu, Nle, lie, Uai, Cha e Pro ou representa um dipeptido comportando pelo menos um destes aminoácidos lipofílicos;

A^g-ol representa um fragmento peptídico reduzido comportando zero a cinco restos de um aminoácido qualquer no qual o átomo de carbono terminal do aminoácido é reduzido para o derivado álcool correspondente.

Descrição detalhada da invenção

As abreviações correntes seguintes dos aminoácidos são utilizadas durante esta memória descritiva:

Ac - acetilo

Ala	( 0 u	A)	- alanina
DAla	( ou	a )	) - D-alanina
A r g	( ou	R )	- arginina
A s n	( 0 u	N )	- asparagina
A s p	( 0 u	D)	- ácido aspártico

pCIPhe - para-cloro-lenilalanina

Cha - cic 1 ohexi1 a 1 a 1ina

Cys (nu C) - cisteina

3,4 - ch-h i d r o P r o - 3,4 - d e h i d r o p r o 1 i n a

Gly (ou G) - glicina

Glu (ou E) - ácido glutamínico D-Glu (ou e) - ácido D-glutamico Gin (ou Q) - glutamina

Glt - glutarilo

His (ou H) - histidina

Hyp - hidroxiprolina

Ile	( ou	I)	- isoleucina
Leu	( ou	L)	- leucina
L y s	( ou	K)	- 1 i s i n a

Mal - maleilo

Met (ou M) - metionina

NMePgl - N-meti1-feni1g1icina

Npa - -(nafti1)a 1anina pN02Phe - para-nitro-feni1 a 1anina

Nle - norleucina

Orn - ornitina pSubPhe - para-fenilalanina substituída

Phe (ou E) - fenilalanina

Pgl - fenilglicina

Pro (ou P ) - prolina

Sar - sarcocina (N-meti1g1icιna )

Ser (ou S) - serina

SubPhe - orto, meta, ou para, mono^- ou di-substituído fenilalanina substituída.

Suc - succinilo

Thr (ou T) - treonina

T r p	( 0 u	W)	- triptofano
T y r	( 0 u	Y)	- tirosina
Vai	( 0 u	V)	- v a 1 i n a

Pela expressão fragmento peptídico reduzido contendo um a 5 resíduos de aminoácidos em que o átomo de carbono do aminoácido terminal é reduzido para o derivado álcool correspondente entende-se que o átomo de carbono do grupo ácido carboxílico do aminoácido terminal é substituído por um grupo hidroximetilíco-(C H 2 ) 0 H. Enquanto o grupo representado por A g dos polipeptidos da presente invenção pode conter até cinco aminoácidos, entende-se que apenas o átomo de carbono do aminoácido terminal pode ser reduzido ao seu derivado álcool correspondente. De facto não é evidentemente possível que outro qualquer átomo de carbono de aminoácido além do átomo de carbono do aminoácido terminal se possa reduzir devido à ligação peptídica o tornar impossível. Evidentemente nestas circunstâncias em que Aθ representa um único aminoácido este aminoácido é o ácido reduzido para o derivado álcool. A fórmula de estrutura para estes aminoácidos reduzidos pode ser representada como:

H

I

R — C — CH₂ — OH nh₂ em que R representa um grupo característico de cada aminoácido.

Por exemplo no caso da glicina R representa um átomo de hidrogénio no caso da alanina R representa um grupo metilo, no caso da valina um grupo isopropilo, no caso da fenilanina um grupo benzilo e no caso da cisteína um grupo mercaptometilo. A forma reduzida da prolina é um álcool com a fórmula de estrutura seguinte:

Aqui, um aminoácido que é reduzido para o seu derivado álcool será abreviado utilizando-se o código de três letras, (ou outra forma encurtada), ou o código de uma letra seguida por -ol, por exemplo, Ala-ol ou A-ol significa uma alanina em que o radical ácido carboxílico foi reduzido para o correspondente álcool e Leu-ol ou L-ol representa uma leucina em que o radical ácido carboxílico se reduziu para o álcool correspondente.

Um grupo alquilo e uma fracção alquílica de um grupo alcoxi é considerado como incluindo grupos alquilo de cadeia linear ramificada ou cíclica, por exemplo, metilo, eti1 o , propi1 o , isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, sec-pentilo, cic 1 openti 1 o, hexilo, iso-hexilo, ciclo-hexilo e ciclope nti 1 meti 1 o . Considera-se que um grupo acilo de 2 a 10 átomos de carbono inclui os grupos acilo saturados ou insaturados de cadeia linear ramificada ou cíclica com 1 a 2 radicais carboniio por grupo, por exemplo, acetilo, succinilo benzoilo, maleílo e

glutarilo. Um grupo halogeneo considera-se cloro, bromo ou iodo.

ser um grupo fluoro,

A designação aminoácido qualquer é aqui utilizada não para significar um aminoácido qualquer com um substituinte amino, mas para ser utilizado como correntemente para os derivados polipeptídicos e inclui os aminoácidos de ocorrência natural assim como outros X -aminoácidos não proteicos correntemente utilizados pelos técnicos na química de peptidos quando preparam análogos sintéticos dos peptidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são a glicina, alanina, valina leucina, isoleucina, serina, metionina, treonina, feni1 a 1 anina, tirosina, triptofano, cisteína, prolina, histidina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, arginina, ornitina e lisina. Exemplos deX-aminoácidos não proteicos são:

norleucina, norualina, a 1 oiso 1eucina, homo-arginina, tiaprolina, desidropo 1ina, hidroxipro 1ina (Hyy), homoserina, cic 1 o-hexi1g1icina (Chg), ácido -amiηo-n-butirico (Aba), cic 1 o-hexi 1 a 1 anina (Cha), ácido aminofenilbutírico (Pba), feni1 a 1 aηinas substituídas nas posições orto, meta ou para no radical fenilo com um ou dois dos seguintes grupos, alquilo (C^-C^), alcoxi (C^-C^), átomos de halogéneo ou grupos nitro ou grupos substituídos com um grupo me t i 1 e n od i o x i , j^-2- e 3 - t i en i 1 a 1 a n i n a , ^-2- e 3-furani1 a 1 anina ,

-2-, 3-, e 4 - p i r i d i 1 a 1 a n i n a , ( b e η z o t i e n i 1 - 2 - e 3 - i 1 ) - a 1 a η i n a

P - ( 1 - θ 2-nafti1)-a 1 anina, derivados orto - a 1qui1 ados de serina, treonina ou tirosina, cisteína S-alquilada, éster O-sulfato de tirosina, 3,5 - diio do11rosina e D-isómeros dos aminoácidos de ocorrência natural.

A designação aminoácido lipofílico inclui Tyr, Phe, Leu, Met, Nle, Ile, Vai, His e Pro.

Os aminoácidos naturais com excepção de glicina contém um átomo de carbono quirálico. A menos que especificado de outro modo, os aminoácidos opticamente activos, aqui referidos são os de configuração L-. Por exemplo, qualquer dos aminoácidos representados por A^ ou A^g podem apresentar a configuração D- ou L-. Como é habitual a estrutura de péptidos aqui indicada é a que apresenta uma extremidade amino terminal no lado esquerdo de cadeia e uma extremidade carboxi terminal no lado direito da cadeia

Os polipéptidos de fórmula geral I podem formar sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico com quaisquer ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Ácidos inorgânicos representativos que formam sais apropriados incluem o ácido clorídrico, o ácido bromídrico, o ácido sulfúrico e o ácido fosfórico e sais de metal ácidos tais como o mοη o-hidrogeno-ortofosfato de sódio e o hidrogeno-su1fa to de potássio. Ácidos orgânicos representativos que formam sais apropriados incluem os ácidos mono, di e tricarboxί 1 icos. São representativos destes ácidos por exemplo o ácido acético, o ácido glicólico, o ácido láctico, o ácido pirúvico, o ácido malónico, o ácido succínico, o ácido glutárico, o ácido fumárico, o ácido málico, o ácido tartárico, o ácido cítrico o ácido ascórbico, o ácido maleico, o ácido hidroxima 1eico , o ácido benzoico, o ácido hidroxibenzoico , o ácido feni1 acético , o ácido cinâmico, o ácido salicílico, os ácidos 2-feηoxibeηzoico e ácidos sulfónicos tais como o ácido metano-sul fónico e o ácido

2-h i d r o x i e t a η ο - s u 1 f ó n i c ο . Sais de radicais de aminoácidos de carboxi terminal incluem os sais de ácidos carboxílicos não tóxicos formados com bases orgânicas ou bases inorgânicas apropriadas. Representativamente, estes sais incluem os sais de metais alcalinos como por exemplo, os sais de sódio e de potássio; os sais de metais alcalino-terrosos tais como os de cálcio e magnésio; 0 grupo dos metais leves, IIIA incluindo o alumínio; e aminas orgânicas primárias, secundárias e terciárias, como por exemplo, trialquilaminas, incluindo trieti1aminas , procaína, dibenzi1 amina, 1-etenamina, N , N ' - dibeηzi1eti1eηodiamina, di-hidroabieti1amina, N-(alquil inferior) piperidina e outras aminas quaisquer apropriadas.

Como com outro qualquer grupo genérico de compostos químicos são preferidos certos grupos. Os requerentes preferem os derivados peptídicos de fórmula geral I em que

X representa um átomo de hidrogénio, um grupo acetilo ou succinilo.

Também são preferidos os compostos de fórmula geral I em que

A^ representa T h r - P r o-L y s-P r o-G 1 n - Se r-H i s - A sn - As p-G 1 y - A sp , -Ser-Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-GlyAsp- ,

-His-Asn-Asp-Gly-Asp-,

-Asn-Asp-Gly-Asp-,

-Asp,Gly,Asp-,

1

Gly-Asp-,

-Asp-, ou uma ligação;

A^ representa	Phe ,	3-2-	ou 3-1 i	enilalanina, Tyr, Trp,
ou pCIPhe;
A^ , representa	Glu ;
A^ , representa	Glu ,	Asp ,	Pro ou	Ala ;
A^ , representa	Ile,	Leu;
A. , representa O	Pro,	S a r ,	D-Ala,	Hyp ou NMePgl;
A-, , representa	Glu ,	Gin ,	Asp ou	Ala ;
A _o , representa O	Glu ,	Asp	ou Ala;
Ag,representa	Pro,	Ala-	T y r , Ala	-Cha, Tyr-Cha, Tyr-Leu
	Phe ,	T y r -	Ty r ;

N p a

Al

A^g-ol, representa Glu-ol, Asn-ol, Pro-ol, Gln-ol, Ala-ol D-Lys-ol, Lys-ol, D-Asp-ol, Orn-ol ou Asp-Glu-ol.

Especialmente mula geral I preferidos são os derivados peptidos de fór

em	que
X	representa Asp ou	um
X	representa ção , em que	um
^A2	representa	Phe
^A3	representa	Glu
^A4	representa	Glu
^A5	representa	Ile

grupo acetilo e A grupo succinilo e A ou Pro;

representa Gly-Asp ou representa uma liga

-(2

-tienilaiamina

2

A representa Pro;

O

A 7 representa Glu;

Αθ representa Glu ou Asp;

Α^ representa Tyr-Leu, Ala-Tyr. Tyr-Tyr, Ala-Phe, Ala-Cha ou Pro; e

A^g-ol representa Ala-ol, Gln-ol, Asp-ol, Pro-ol, D-Asp-ol, D-Lys-ol, D-Glu-ol ou Asp-Glu-ol.

As proteínas da presente invenção podem-se preparar por uma diversidade de processos facilmente conhecidos para os técnicos. Estes processos incluem a síntese sequencial de fase sólida e de bloco, colunagem de genes e combinação destas técnicas. 0 processo sequencial de fase sólida pode realizar-se uti1izand0-se métodos automatizados estabelecidos tais como os que usam um sintetizador peptídico automático. Neste processo os peptidos foram construídos sobre resina iniciando-se com o penúltimo C-terminal de aminoácido protegido. Pode-se utilizar como suporte de resina qualquer resina apropriada utilizada de modo convencional na preparação de fase sólida de p01ipéptidos, de preferência polistireno reticulado com cerca de 0,5 a 3% de divini1benzeηo , que foi o clorometilado ou hidroximeti1 ado para proporcionar sítios de formação éster com 0 aminoácido introduzido inicialmente na forma !\_-amino protegida. Após completar-se a ligação de acoplamento ou o grupo de protecção Boc permanece ou é eliminado e o grupo amino N-terminal acilado. 0 deslocamento do fragmento protegido da resina é realizado uti1izando-se 0 amino álcool apropriado.

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Um exemplo de uma resina hidroximeti1 ada está descrito por Bodanszhy et al., Chem. Ind. (London) 38,1597-98 (1966). Uma resina clorometilada é comercializada pelo Bio Rad Laboratories, Richmond, Califórnia e a preparação desta resina está descrita por Stewart et al, em Solid Phase Peptide Synthesis capítulo 1 páginas 1 a 6, (1969, Freeman & Co., San Francisco). 0 aminoácido protegido pode ligar-se à resina pelo processo de Gisin, H e 1 v . Chem. Acta , 56 , 1476 ( 1 973 ). Muitas das resinas de ligação do aminoácido protegidas estão comercializadas. Como exemplo, para se preparar um polipeptido desta invenção em que o terminal carboxilo é um resíduo Thr, pode utilizar-se Thr protegido por terc-buti1 oxicarboni1 o (Boc) ligado a uma resina benzilada, hidroximetilada de feni1 acetamidorneti1 o (Pam) que está comercializada.

A seguir ao acoplamento do aminoácido Q(_-amino protegido ao suporte resina, elimina-se o grupo de protecção uti1izando-se qualquer processo adequado tal como o processo que utiliza o ácido trif1uoro - acético em cloreto de metileno, ácido trif1uoro - acético apenas, ou ácido clorídrico em dioxano. Realiza-se a desprotecção a uma temperatura entre 0°C e a temperatura ambiente. Podem utilizar-se outros reagentes de separação e condições padrão para a eliminação dos grupos de protecçãoamiηo específicos. Após a eliminação do grupo de protecção CC-amino os outros aminoácidos amino protegidos são ligados passo a passo na ordem desejada. Alternativamente grupos de aminoácidos múltiplos podem ser ligados pelo método de solução antes da ligação com a resina que serve de suporte à sequência de aminoácidos.

- 14 0 grupo protector CX.-amino utilizado para cada aminoácido introduzido na sequência peptídica pode ser um qualquer grupo de protecção conhecido. Entre as classes de grupo de protecção amino considerados estão:

(1) grupos de protecção acilo tais como: formilo, trif1uoroaceti1 o , ftalilo, to 1uenosu1foni1 o (tosilo), benzenosulfonilo, nitrofenilsulfenilo, tritilsu1fenilo , D-nitrofenoxiaceti1 o e 1 orobutirilo; (2) grupos de protecção tipo uretano aromáticos tais como beηzi1 oxicarboni1 o e benzi1 oxicarboni1 o substituído, tais como p-c1 orobeηzi1 oxicarboni1 o, p-nitrobenzi 1 -carboni 1 o , p-bromobenziloxicarbonilo, p-metoxibenziloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metil-etoxicarbonilo,Cy , -dimetil-3,5-dimetoxibenziloxi-carboniio e benzidri 1 oxicarbοηi1 o; (3) grupos de protecção uretano alifáticos tais como terc-buti1 oxicarboni1 o (Boc), diisopropi1metoxicarbonilo, isopropi1 oxicarboni1 o , etoxicarboni1 o e a 1i1 oxicarboni1 o ; (4) grupo de protecção tipo uretano cic1 oa 1quί1icos tais como ciclope nti 1 oxicarboni1 o, adamantiloxicarbonilo e ciclohexiloxicarbonilo; (5) grupos de protecção tipo tio uretano tais como feniltiocarboni 1 o ; (6) grupos de protecção alquílicos tais como trifenilmetilo (tritilo) e benzilo; e (7) grupos de t r i a 1 q uies i 1 a no tais como trimeti1si1 aηo. 0 grupo de protecção CX_-amino preferido é o grupo terc-buti1 oxicarboni1 o.

A selecção de o reagente de ligação apropriado é própria do técnico. Um reagente de ligação particu 1 armente apropriado em que o aminoácido a adicionar é o aminoácido Gin, Asn ou Arg, são os grupos N-N'-diisopropi1carbodiimid a e 1 -hidroxibenzotriazo 1 .

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uso destes reagentes impede a formação de nitrilo ou de lactama Outros agentes de acoplamento sao (1) as carbo diimidas (por exemplo, N , N ' - dicic1 o-hexi1 carbodiimid a) e N-eti1-N '-( -dimeti1aminopropi1carbodiimid a ) ; (2) as cianamidas (por exemplo, N, N-dibenzi1cianamid a ) ; (3) as ceteniminas; (4) os sais de isoxazólio (por exemplo, N-eti1-5-feni1-isoxazo 1io - 3'-su1fonato; (5) azoto monocíclico contendo amidas heterocíclicas de carácter aromático que contém um a quatro átomos de azoto no núcleo tais como imidazólidos, pirazólidos e 1 , 2,4-1riazó1idos. Amidas heterocíc1icas específicas que são utilizáveis incluem a N,N'-carbοπi1 diimid azo 1 e o N, N - c a r b o n i 1 - d i - 1 , 2,4 - t r i a z o 1 ; (6) acetileno alcoxilado (por exemplo, etoxiaceti1eηo ) ; (7) reagentes que formam um anidrido misto com o radical carboxil do aminoácido, (por exemplo o cloroformato de etilo e o cloroformato de isobutilo ou o anidrido simétrico do aminoácido a ligar-se (por exemplo, Boc-A 1 a-0-A 1 a-Boc) e (8) compostos heterocíclicos contendo azoto que apresenta um grupo hidroxi ou um núcleo azotado (por exemplo, N-hidroxifta 1imída, N-hidroxisuccinimida e 1 -hidroxibeηzotriazo 1 ) . Outros reagentes de activação e sua utilização na ligação peptídica estão descritos por Kapoor, J. Pharm. Sei. ,59, pp. 1 -27 ( 1 970). Os requerentes preferem a utilização do anidrido simétrico como um reagente de acoplamento paar todos os aminoácidos excepto para Arg, Asn e Gin.

Cada aminoácido ou a sequência de aminoácidos protegidos é introduzido num reactor de fase sólida num excesso de cerca de quatro vezes e rea 1izando-se a ligação num meio de dimetilformamida

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cloreto de metileno (1:1) ou apenas em dimeti1formamida ou de preferência apenas em cloreto de metileno. Nos casos em que ocorre ligação incompleta, o processo de ligação é repetido antes da eliminação dos grupos de protecção Ύ-amino, antes de se ligar o aminoácido seguinte no reactor de fase sólida. 0 sucesso da reacção de ligação em cada estádio da síntese é controlado pela reacção da ninidrina como descrito por E. Kaiser et al., Analyt. Biochem 34, 595 (1970).

Após a obtenção da sequência de aminoácidos desejada, retira-se da resina o peptido. Isto pode ser feito por meio de hidrólise, como por exemplo, por tratamento do peptido ligado à resina com um resíduo de aminoálcool de C-terminal, ácido acético ou diclorometano (DCM).

Como se sabe a síntese peptídica de fase sólida dos aminoácidos que comportam grupos funcionais requer a protecção durante a preparação da cadeia. A utilização e selecção dos grupos de protecção apropriados é uma capacidade dos técnicos nesta matéria e dependerá do aminoácido a proteger e da presença de outros resíduos de aminoácidos protegidos, no peptido. A selecção de um grupo de protecção da cadeia lateral destes, é crítica porque deverá ser um grupo não removível por clivagem durante a separação do grupo de protecção do radical Ό<_-θΓηίηο. Por exemplo, grupos de protecção da cadeia lateral apropriados para a lisina, são os grupos beηzi1 oxicarboni 1 o e benziloxicarbonilo substituídos, sendo /

referidos substituintes escolhidos entre átomos de halogeneo, (por exemplo, cloro, bromo, fluoro) e grupos nitro, (por exemplo, 2-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenziloxi-carbonilo, 3,4-diclorobenzi1 oxicarboni1 o) , tosilo, t-amiloxicarbonilo, t-buti1 oxicar bonilo e diisopropilmetoxicarbonilo. 0 grupo hidroxil alcoólico da treonina e da serina pode ser protegido com um grupo acetilo, benzoílo, terc-butilo, tritilo, benzilo, 2,6-dic1 orobenzi1 ou benzi1oxicarboni1 o. 0 grupo de protecção preferido é o grupo benzilo.

Estes grupos podem ser eliminados por processos convencionais. Tipicamente, os grupos de protecção são eliminados após a síntese da cadeia peptídica estar completa, mas os grupos de protecção podem ser eliminados em qualquer outro momento apropriado.

A dose antico agu1 ante de um derivado álcool peptídico da presente invenção é desde 0,2 mg/kg até 250 mg/kg de peso do corpo por dia, dependendo do estado do doente, da gravidade da condição trombótica a tratar e do derivado peptídico escolhido. A dose apropriada para um doente particular pode ser determinada facilmente. De preferência deverão ser administradas doses diárias entre 1 a 4 de 5 mg a 100 mg de composto activo por dose. A quantidade de um álcool peptídico da presente invenção necessária para inibir ou impedir a coagulação do sangue num meio extracorpora 1 tais como sangue completo em conservação, pode ser determinada facilmente por um técnico.

A terapêutica anticoagu1 ante está indicada para o tratamento e prevenção de uma diversidade de doenças trombóticas, particularmente na doença da artéria coronária e cerebrovascular . Os téc1 8

rvicos com experiência neste campo avaliam rapidamente as circunstâncias que requerem terapêutica antico agu1 ante . A designação doente aqui utilizada, significa mamíferos tais como primatas, incluindo seres humanos, carneiros, cavalos, gado, suínos, cães, ratos e murganhos. A inibição da coagulação sanguínea é útil não sómente na terapêutica anticoagu1ante dos indivíduos com doenças trombóticas, mas também guando se deseja a inibição da coagulação sanguínea, por exemplo para impedir a coagulação do sangue total armazenado ou para impedir a coagulação de outras amostras biológicas para análise ou armazenagem.

Ainda que alguns dos derivados peptídicos possam sobreviver á passagem através do intestino após a administração oral, os requerentes preferem uma administração por outra via, por exemplo, subcutânea, endovenosa, intramuscular ou intraperitonea 1 ; por preparação de implantação ou por aplicação nas membranas mucosas, tais como no nariz, garganta, ou ramos brônquicos, por exemplo, sob a forma de um aerosol contendo um derivado peptídico da presente invenção em spray ou sob a forma de pó seco.

Para administração parentérica podem-se administrar os compostos em formas injectáveis de uma solução ou suspensão do composto num dissolvente aceitável sob o ponto de vista fisiológico com um veículo farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como a água e óleos ou eventual adição de um agente tenso activo ou doutros adjuvantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico Oleos exemp1ificatiνos que podem ser utilizados nas preparações,

19, são os óleos de parafina, de origem vegetal, animal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. Em geral são veículos líguidos para soluções, em particular para soluções injectáveis, a água, a solução de cloreto de sódio, a dextrose aguosa e soluções de acúcares idênticos, o etanol e os glicois tais como o propilenog1ico1 ou o po1ietilenog1ico1 .

Os compostos podem ser administrados sob a forma de uma injecção depósito ou de uma preparação de implantação gue pode ser formulada de tal modo a permitir a libertação controlada do ingrediente activo. 0 ingrediente activo pode ser comprimido em pellets ou em pequenos cilindros implantado por via subcutânea ou intramuscular sob a forma de injecções de depósito ou de implantes. Os implantes podem utilizar materiais inertes tais como os polímeros biodegradáveis ou silicones sintéticos, por exemplo Silastic, borracha de silicone preparada pela Dow-Corning Corporation.

Exemplos

A presente invenção é ilustrada pelos exemplos seguintes não limitativos.

Exemplo 1

Preparação de álcoois peptídicos de carbono terminal

5intetizaram-se péptidos uti1izando-se uma resina p-nitrobeηzidri1ideηo-isonitrosa (resina de óxima) preparada pelo método

de DeGrado e Kaiser (J. Org. Chem. 45, 1295-1300 (1980). A resina de oxima, (0,54g, 0,52 mmole/0,97 mmo1e/g-substituição), foi colocada num recipiente de um sintetizador de peptidos Applied Biosystems Model 430A. Os aminoácidos Boc-protegidos ligados por sequência simples aos seus anidridos simétricos com um excesso duplo. A protecção da cadeia lateral utilizada foi a seguinte: Asp (Chx), Glu (Bzl), Tyr (2-BrZ). Os programas do sintetizador foram estabelecidos para fornecerem o protocolo seguinte para cada ciclo:

1)	Adição	de 1 mmole de anidrido simétrico	pré-formado
2 )	Adição	de um volume de DIEA adicional a	ς o/ . 9 /0 ,
3)	Vortex	durante 1 hora
4)	Escoamento
5)	L a vagem	(5x/1min.) com DCM;
6 )	Lavagem	(1 min.) com TEA a 20% em DCM;
7)	Tratamento com TEA a 20% em DCM durante	15 minutos
9)	Lavagem	com DCM (3 x/0,5 min.);
9)	Lavagem	(4 min.) com isopropanol;
1 0 )	Lavagem	(3x/0,5 min.);
1 1 )	Lavagem	com isopropanol (4 min.);
1 2 )	Lavagem	com DCM (3 x/0,5 min.);
13)	Lavagem	com isopropanol (4 min.);
14)	Lavagem	(3 x/0,5 min.).

Após a terminação da síntese, secou-se a resina no vácuo.

Em seguida tratou-se a resina com 2 equivalentes (baseado na subs tuição de resiào inicial) de alaninol e 1 equivalente de ácido

acético em DCM àtemperatura ambiente durante 20 horas. Filtrou-se a resina. Liofi1izou-se o filtrado. 0 resíduo foi tratado com HF líquido contendo 2% de anisol à temperatura de -5°C durante 30 minutos. Após a eliminação do ácido flurídrico gasoso no vácuo, extraiu-se o peptido com acetonitrilo a 3 0 % e 1 i o f i 1 i z ou - se . Purificou-se o resíduo por HPLC preparativa (coluna de 21,4x150 mm Dinamax C18 ) utilizando-se um sistema de acetonitrilo/TFA a 0,1 %. 0 peptido obtido por este método forneceu um pico do ião molecular desejado por T AB-MS e apresentou uma análise de aminoácidos de acordo com o peptido desejado. Deste modo prepararam-se os peptidos seguintes com as propriedades estabelecidas.

1) SucFEPIPFYL-ol

MW 1092.6 FAB-MS (MH)+1094.0t_D17.53 F280 1^73 conteúdo peptídico 79.8% Glx(2) Pro(2) Ile(1 ) Tyr(1) Phe(1)

2.08 1.01 0.94 0.99 0.98

2)

SucFEP IPEEYCHaA-ol

MW 1332.7 FAB-MS (MH)⁺ 1333.4 t_R 20,2 min.

E 2 8 o 1755 conteúdo peptídico 73%

Glx(3 ) Pro(2 3.04 2.03

Ile( 1 ) Γ y r ( 1 ) 0.92 1.00

Phe(1) Cha(1) 0.97 0.95

3)

SucFFPIPFEYL-ol

MW 1221.6 FAB-MS (MH)⁺ 1222.8 t_R 16.83

F28O 1686 conteúdo peptídico 7 2.1?ó Glx(3) Pro(2) I le(1 ) Phe(1 )

3.09 1.98 . 96 .00

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de ãlcoois peptídicos de fórmula geral ^X ^Al^-A2^A3”^A4^_A5^A6^A7'^A8“^A9”^A10^_o1 na qual

X representa um átomo de hidrogénio ou um ou dois grupos alquilo com 1 a & átomos de carbono ou um ou dois grupes acilo com 2 a 10 átomos de carbono;

A·^ representa uma ligação ou um fragmento peptídico comportando 1 a 11 restos de um aminoácido qualquer;

A? representa um grupo Phe, SubPhe, jJ-(2- e 3-tienil)-alanina, -( 2 - 3-f uranil)-alanina , ^-(2-,3- e M-piridil)-alanina, - ( benzotienil-2- e 3-il)-alanina, (1- e 2-naftil)-alanina, Tyr ou Trp;

Α₄

Α,

Α,

Α, representa Glu ou Asp;

representa um aminoácido qualquer;

representa Ile, Vai, Leu, Nle, ou Phe;

representa Pro, Kyp , 3 ,4-desidro-Pro, um grupo tiazolidina-b-carboxilato, Sar, NMePgl ou D-Ala; representa um aminoácido qualquer;

representa um aminoácido qualquer;

representa um aminoácido lipofílico escolhido entre

Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, Cha ou Pro ou representa um dipeptido comportando pelo menos um destes aminoácidos lipofílicos;

A^g-ol representa um fragmento peptídico reduzido comportando zero a 5 restos de um aminoácido qualquer no qual o átomo de carbono terminal do aminoácido á reduzido para o derivado álcool correspondente, caracterizado pelo facto:

a) de se ligar um aminoácido apropriadamente protegido correspondente ao aminoácido Ag a um suporte de resina activada;

b) de se ligarem, em seguida, os outros aminoácidos alfa-amino-protegidos, em sequência, do terminai carboxilo ao terminal amino, A_n atá A., Dara a extremidade amino-terminal da cadeia

8 ι peptídica em crescimento que entretanto, for exposta por eliminação dos seus grupos amino-protectores ; e

c) de se tratar, finalmente, o páptido ligado à resina com cerca de 2 eauivalentes de amino-ãlcool de terminal· carboxilo correspondente ao símbolo Α^θ-οΐ e com cerca de 1 equivalente de ácido acético em diclorometano, para separar o polipeptido da resina e de se ligar, concomitantemente, o álcool peptídico de termi nal carboxilo ao péptido, obtendo-se assim o álcool peptídico desejado .
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepara ção de álcoois peptídicos de formula geral I na qual A^ representa Phe, p~(2- ou 3-tienil)-alanina ou Tyr, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepara ção de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa Glu, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepara çao de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa Glu, Ala ou Pro, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepara ção de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa Ile, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .
6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual Ag representa Pro, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepara ção de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual R_? representa Glu ou Ala, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepara ção de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual A_o representa

O

Glu ou Asp, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepara çao de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual Ag representa Tyr-Leu, Ala-Tyr ou Ala-Cha, caracterizado pelo facto de se utilizarem comoostos iniciais corresDondentemente substituídos.
10.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula geral I, na qual A^^-ol representa Gln-ol, Asp-ol, Pro-ol, Asn-ol, Asp-Glu-ol, Glu-ol,

Ala-ol, D-Lys-ol, Lys-ol, D-Asp-ol, D-Glu-ol ou Orn-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondente mente substituídos.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual X represent um átomo de hidrogénio ou um grupo acetilo ou succinilo, caracteri zado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual representa uma ligação ou

Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp,

Asn-Asp-Gly-Asp,

Asp-Gly-Asp,

Gly-Asp ou Asp, caracterizado pelo facto de se utilizarem composros iniciais correspondentemente substituídos.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparaçao de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa -Thr- Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente

-27substituídos .
14. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula geral I na qual representa -Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp-, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente subsituídos.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-lle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

15.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula Suc-Phe-Gly-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula H-Gly-Asp-Pb.e-31u-Pro-Ile-Pro-Glu-Asp-AIa-Tyr-Asp-Glu-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula Suc-Pbe-Glu-Pro-Ile-Pror 28

-Glu-Glu-Tyr-Leu-Pro-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
19.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepar ção de álcoois peptídiccsde formula Suc-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Pro-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspodentemente substituídos.
20. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-ProGlu-Glu-Tyr-Leu-Gln-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
21. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula Suc-G/r-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe-D-Lys-oljcaracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
22. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-ProGlu-Glu-Ala-Tyr-Lys-ol , caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
23. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-29-

-Glu-Glu-Ala-Cha-Lys-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
24. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de formula Suo-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-Lys-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos,
25. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de formula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe-Glu-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

25,- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de álcoois peptídicos de formula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-?he-Gln-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.
27,- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparaçao de álcoois peptídicos de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Glu-GIu-Ala-Cha-Asp-ol, caracterizado pelo facto de se utilizarem comoostos iniciais corresoondentemente substituídos.
28.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas para administração a um doente com necessidade de reduzir a coagu-30- lação sanguínea, caracterizado pelo facto de se misturar uma quan dade anticoagulante eficaz, compreendida entre 0,2mg/kg e 250mg/k de peso do corpo de um álcool peptídico preparado pelo processo d acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 27, como ingrecien te activo, com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêu tico ,

Lisboa, 3, de Maio de

1989

RESUMO

Processo para a preparação de álcoois peptídicos con actividade anticoagulante

A invenção diz respeito da um processo para a preparação de álcoois peptídicos de fórmula geral ^X_Al“^A2”^A3”^A4”^A5^_A6^A7^A8'^A9“^A10⁰¹ que consiste

a) em ligar um aminoácido apropriadamente protegido correspondente ao aminoácido Ag a um suporte de resina activada,

b) em ligar em seguida, os outros aminoácidos alfa-amino-protegidos , em sequência, do terminal carboxilo ao terminal amino, A„ até A,, tara a extremidade amino-terminal □ ± dica em crescimento que, entretanto, foi exposta dos grupos amino-protectores , e da cadeia peptipor eliminação

c) em tratar finalmente o péptido ligado a resina com cerca de 2 equivalentes de am.ino-álcool com terminal carboxilo correspondente ao símbolo Α^θ-οΐ e com cerca de 1 equivalente de ácido acético em diclorometano para separar o polipeptido da resina e em ligar, simultaneamente, o álcool peptídico de terminal carboxi-