PT904390E - Genoma vegetal recombinado, comportando genes específicos das chicórias e uma sequência nucleotídica conferindo uma esterilidade masculina e sua utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

GENOMA VEGETAL RECOMBINADO, COMPORTANDO GENES ESPECÍFICOS DAS CHICÓRIAS E UMA SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA CONFERINDO UMA ESTERILIDADE MASCULINA E SUA UTILIZAÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de sequências nucleotidicas que permitem conferir uma esterilidade masculina de tipo citoplasmática a plantas do género Cichorium. O género Cichorium engloba plantas que apresentam um grande interesse agro-alimentar, como os diversos tipos de chicória ou as endivias.

Trata-se de plantas que possuem simultaneamente sistemas de reprodução macho e fêmea e que têm portanto uma capacidade de se auto-fecundar. Esse acontecimento é indesejável quando se deseja efectuar cruzamentos com uma planta de uma outra variedade com vista à obtenção de híbridos.

No Cichorium intybus, foram já propostas plantas com esterilidade masculina nuclear. No entanto a esterilidade masculina citoplasmática constitui uma solução de interesse para a produção de espécies híbridas. A esterilidade masculina citoplasmática é uma característica transmitida pelo progenitor fêmea de uma planta (herança materna) e que previne a formação de pólen viável. Uma esterilidade masculina de boa qualidade não deve afectar a fertilidade feminina da planta, para permitir o seu cruzamento com plantas masculinas férteis. Rambaud et al., C. R. Acad. Agric. Fr., 80 (7), 1994 parte de resultados 1 preliminares de uma fusão de protoplastos chicória / girassol com vista a preparar chicórias masculinas estéreis citoplasmáticas. É portanto desejável poder dispor de um sistema que confere essa esterilidade masculina citoplasmática que seja estável. É igualmente desejável dispor de um marcador fiável dessa esterilidade masculina citoplasmática que permita a selecção das células vegetais antes mesmo do desenvolvimento de uma planta completa apresentando o conjunto dos caracteres fenotipicos. É por esta razão que a presente invenção tem por objecto um genoma vegetal recombinado, caracterizado por comportar genes específicos das chicórias e uma sequência nucleotidica conferindo uma esterilidade masculina, transportada pela sequência orf 522 do girassol, delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2, ou por uma sequência apresentando pelo menos 90% de homologia com a referida sequência orf 522 delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2. A sequência orf 522 é uma sequência evidenciada no Girassol (Helianthus), nomeadamente H. Annuus, onde parece associada a uma esterilidade masculina citoplasmática (Kõhler et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 227:369-376). A Requerente descobriu que a presença desta sequência orf 522 no genoma de uma planta do género Cichorium estava ligada a uma esterilidade masculina citoplasmática. 2

Sequências que convêm à realização da invenção compreendem sequências transportadas pela sequência orf 522 tal como foi previamente descrita. Sequências apropriadas apresentam vantajosamente 90% de semelhança com a referida sequência orf 522, delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2, e compreendem em particular sequências codificantes para a mesma proteína, tendo em conta a degenerescência do código genético, ou para uma proteína na qual certos aminoácidos foram substituídos por aminoácidos equivalentes. Por aminoácidos equivalentes, entende-se aminoácidos que apresentam um comportamento químico análogo e/ou massas moleculares próximas. Elas compreendem igualmente sequências codificantes para uma proteína na qual um ou vários aminoácidos não essenciais à actividade foram deletados ou substituídos. O genoma pode ser de tipo nuclear ou mitocondrial.

Quando a sequência está presente no genoma nuclear, este comportará também uma pré-sequência que permite a incorporação nas mitocondrias do produto de tradução da referida sequência.

De preferência, o genoma recombinado é um genoma mitocondrial. A invenção tem portanto igualmente por objecto uma mitocondria comportando um genoma recombinado tal como definido anteriormente.

Em particular, a invenção tem por objecto uma mitocondria caracterizada por conter pelo menos um fragmento nucleótico de 347 pb, transportado pela sequência orf 522 delimitada pelos iniciadores das sequências SEQ ID N° 1 e 2, ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de homologia com o 3 referido fragmento delimitada pelos iniciadores das sequências SEQ ID N° 1 e 2. A sequência de 347 pb é delimitada, no interior da sequência orf 522 (Kõhler et al., Mol. Gen. Genet., 1991), pelos iniciadores de sequências: SEQ ID N° 1: 5'CCCCCTCCCTGGTGGATCCGGG 3' SEQID N° 2: 5'CCCTCTATGAGTACCGTICTCTCACG 3' A invenção refere-se a um citoplasma vegetal recombinado, caracterizado por conter um núcleo comportando o genoma do género Cichorium, e a um genoma recombinado definido acima, em particular um citoplasma que contem mitocondrias comportando uma sequência nucleotídica transportada pela sequência orf 522 delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2 de Helianthus annuus ou por uma sequência apresentando pelo menos 90% de homologia delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2. Células vegetais recombinadas contendo esse citoplasma estão compreendidas na invenção e, nomeadamente, uma célula vegetal que contem um núcleo comportando substancialmente o genoma de uma espécie escolhida entre Cichorium intybus e Cichorium endivia.

Entre estas espécies, podem citar-se, sem de modo algum limitar a invenção os grupos de cultura seguintes:

Cichorium intybus L: - chicórias "selvagens melhoradas" - chicórias "Barba de Capuchinho" - chicórias "Pão de Açúcar" - chicórias "Chioggia" 4 - chicórias "Verona" - chicórias "Catalunha" - chicórias "Vermelha " - chicórias "Variegato di Castelfranco" - chicórias "Witloof" (ou "de Bruxelas" ou "endívia") - chicórias "Soncino" chicórias "Industriais" (para torrefacção e para açúcares) - chicórias "de forragens" ou "de caça " ...

Cichorium endivia L: - chicórias "escarolas" - chicórias "frisadas"... São chicórias ditas de raizes grossas (industriais de forragem e Witloof) ou chicórias ditas de salada (verdes, vermelhas, mosqueadas, intensiva ou não). 0 perito poderá adaptar sem dificuldade a invenção, nomeadamente referindo-se a "Génétique et Amélioration de la Chicorée industrielle"; DESPREZ et al., Sessão especializada de 30 de Novembro de 1994 na Academia de Agricultura de França n° 80 (7) 48-49.

De acordo com um outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para produzir uma planta do género das Chicórias ou do material de reprodução desta planta, apresentando uma esterilidade masculina citoplasmática, caracterizado por se integrar no genoma celular desta planta uma sequência nucleotidica transportada pela sequência orf 522 do girassol, delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ id No 1 e 2, ou por uma sequência apresentando pelo menos 90% de homologia com a referida sequência orf 522 delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2. A planta (ou o material de 5 reprodução), com excepção das variedades vegetais, está incluída na invenção.

Ela refere-se igualmente a um processo essencialmente não biológico de preparação de plantas híbridas, caracterizado por se cruzar uma planta susceptível de ser obtida pelo processo descrito acima com uma planta da mesma espécie, desprovida da sequência orf 522 de Helianthus annuus ou de uma sequência apresentando pelo menos 90% de homologia com a referida sequência orf 522.

De acordo ainda com um outro aspecto, a invenção refere-se a um processo de selecção de uma esterilidade masculina citoplasmática numa planta do género Cichorium, caracterizado por se colocar em contacto o ácido nucleico mitocondrial da planta com uma sonda marcada compreendendo pelo menos 10 nucleótidos da sequência orf 522 delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2.

Outras variantes e características da invenção surgirão na leitura dos exemplos que se seguem.

Exemplo 1: Preparação do material vegetal

Foram fornecidas sementes de Cichorium intybus L cv Pévèle pelos Estabelecimentos Florimond Desprez e compraram-se sementes de Helianthus annuus (com esterilidade masculina citoplasmática ou SMC) no comércio.

As sementes de Cichorium intybus foram esterilizadas em superfície com uma solução de 0,1% (p/v) de HgCl2, lavados três vezes em água destilada e colocadas em caixas de Pétri sobre um meio de cultura Heller (1953) (sais maiores e 6 menores isentos de FeCl3) suplementadas com 19,5 mg/1 de Fe-EDTA, 20 g/1 de sacarose e 6g/l de Agar (Bioakar tipo E) e cultivadas em condições de cultura descritas por Rambaud et al. (1990). Transferiram-se em seguida as sementeiras assépticas para tubos de cultura sobre o mesmo meio. Esterilizaram-se as sementes de Helianthus annuus com uma solução de hidrocloreto de cálcio a 50 mg/1, depois lavaram-se três vezes em água destilada e transferiram-se para uma solução de sacarose (10 g/1) / agar (0,6%).

Recolheram-se as folhas de chicória nas plantas de 12 a 14 dias. Cortaram-se as folhas em pedaços e incubaram-se numa solução contendo 15 g/1 de cailase 345, 0,5 g/1 de cailase M2 (Cayla, Toulouse, Trança) e 90 g/1 de manitol.

Nas sementeiras de girassol, retiram-se os hipocotilos 6 a 10 dias após a germinação e incubaram-se na mesma solução de maceração.

Incubaram-se os protoplastos durante 5 h 30 min a 30°C na obscuridade sem agitação, purificaram-se por filtração através de peneiros de malhas de 50 μιη, recolheram-se e lavaram-se três vezes por centrifugação a baixa velocidade (100 x g) durante 15 min.

Após eliminação da camada superior com uma pipeta de Pasteur, misturaram-se os protoplastos na razão 1:3 (girassol/chicória) a fim de obter uma suspensão contendo entre 7 e 11.106 protoplastos/ml).

Fusionaram-se os protoplastos segundo o método de Kao (Wetter LRL e Constabel F (eds) Plant Tissue Culture Methods, cap 7, pp 49-56, 1982) com as seguintes modificações: colocou-se um 7 volume de uma solução de mistura de protoplastos numa caixa de Pétri e adicionaram-se gota a gota três volumes de solução a 30% de polietilenoglicol (PEG 4000 Serva) com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Após uma homogeneização suave, deixou-se a solução repousar durante três minutos. Um minuto mais tarde, adicionam-se de novo 3,5 volumes da solução número 3 de Kao (1982). Depois adicionam-se 3,5 volumes da solução número 3 de Kao (1982) e 3 min mais tarde adicionam-se 6 x 3,5 volumes de meio de lavagem (Saksi N et al. CR Acad. Sei. Paris 302:165-170, 1986). Recuperam-se os protoplastos após 10-15 min por centrifugação (8 min, 100 x g); lavam-se em seguida 3 vezes com aliquotas de 8 ml do meio e lavagem e repõem-se em suspensão no meio de cultura MCI (Saksi et al., 1986) no qual a concentração de ácido 1-naftilacético (NAA) é de 2 mg/1, a do inositol 250 mg/1 e a do KNO3 144 mg/1.

Após um ou dois dias de cultura neste meio a uma densidade de 2.104 protoplastos/ml, cultivam-se os heterocariócitos isolados a baixa densidade (12/100 μΐ) a 30°C num meio MCI modificado (0,5 mg/1 NAA) aos quais se adicionam ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico (MES) (5 mM), hidrolisato de caseína (150 mg/1) e leite de coco (2%; v/v).

Um mês mais tarde, as colónias derivadas das fusões de protoplastos heteroplasmídicos são transferidas para um meio de proliferação, depois para um meio de regeneração (Rambaud et al., 1990). Após enraizamento, as plantas são transferidas em estufa por algumas semanas, depois transplantas para os campos.

As plantas obtidas apresentam um fenótipo de chicória. Entre estas, a linhagem designada por CT 52/3 apresenta uma esterilidade masculina por defeito de deiscência dos anteros; a linhagem CT 41/1 apresenta uma esterilidade masculina por ausência completa de antero.

Exemplo 2

Materiais e métodos Material vegetal

Dezasseis populações de chicórias industriais com citoplasma normal numeradas FDl a FD16, a chicória industrial cv. Pévèle e uma familia de chicória industrial (CT 41/1) 20540 U com esterilidade masculina citoplasmática (SMC) fornecidas pela sociedade Florimond-Desprez, uma chicória CT 52/3 (SMC), o girassol cv. Mirasol (SMC). Retiraram-se as jovens folhas de plantas criadas em estufa e conservadas a -80°C.

ADN

Adaptação dos protocolos do Laboratório de Dellaporta (Plant. Mol. Report., 1983) para a mini-extracção de ADN total: as operações realizaram-se a 4°C. Triturar finamente com azoto liquido um fragmento foliar de 150 a 200 mg em peso fresco. Transferir para um microtubo de 2 ml. Adicionar 940 μΐ de solução tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,0, EDTA 50 mM, NaCl 0,5 M, β-mercaptoetanol 10 mM. Adicionar 62 μΐ de SDS 20% e aplicar vórtice vigorosamente. Incubar a 65 °C durante 15 min. Adicionar 310 μΐ de acetato de potássio 5 M e aplicar vórtice vigorosamente. Deixar precipitar durante 30 min. Centrifugar 15 min a 17500 g. Transferir 1 ml do sobrenadante para um microtubo de 2 ml. Adicionar 0,5 ml de isopropanol e misturar. Deixar precipitar durante 15 min. Centrifugar 10 9 min a 12000 g. Decantar o sobrenadante com uma micropipeta. Secar os depósitos num aparelho Speed-Vac durante 10 min em posição de baixa temperatura. Voltar a dissolver os depósitos em 100 μΐ de solução tampão Tris-HCl 50 mM pH 8,0, EDTA 10 mM, ribonuclease A 0,2 mg/ml e incubar 2 h a 37°C. Realizar três extracções fenólicas seguidas de uma extracção com clorofórmio. Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e dois volumes de etanol absoluto a 4°C. Deixar precipitar 15 min a 4°C. Centrifugar 10 min a 12000g. Enxaguar o depósito com etanol a 70% a 4°C. Centrifugar 3 min a 12000g. Decantar com uma micropipeta e secar no Speed-Vac durante 10 min a baixa temperatura. Retomar o depósito numa solução tampão Tris-HCl 1 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM.

Quantificação a partir de uma aliquota de 5 μΐ por electroforese horizontal em gel de agarose a 0,8%, TEB lx. BET 0,5 pg/ml.

PCR

Dois iniciadores de 23 e 26 bases que delimitam um fragmento de 347 pb interno na sequência orf 522 (Kõhler et al., Mol. Gen. Genet., 1991) .

Sequências de iniciadores: SEQ ID N° 1: 5'CCCCCTCCCTGGTGGATCCGCG 3' SEQ ID N° 2: 5'CCCTCTATGAGTACCGTTCTCTCACG 3'

Programação do termociclador 60 Bio-Med: primeiro ciclo: 3 min, 92°C; 30 ciclos: 1,30 s, 92°C; 2,30 s, 55°C; 3,1 min, 72°C; último ciclo: 5 min, 72°C. Meio reaccional: Tampão Appligène lx: Tris-HCl 10 mM pH 9,0, Triton X-100 0,1%, MgCl2 10 1,5 mM, BSA 0,2 mg/ml; dNTP 100 μΜ; iniciadores 0,2 μΜ cada um; Taq polimerase Appligène 2 U/100 μΐ; matriz de ADN 50 ng/100 μΐ; H20 QSP 10 μΐ; óleo mineral: 50 μΐ. Análise dos produtos por electroforese horizontal em gel de agarose a 1,6 %, TEB lx, BET 0,5 μg/ml.

Hibridações Técnica clássica de transferência pelo método de Southern ("Maniatis") . Marcação química da sonda orf 522 com o kit Dig-High-Prime (Bõehringer-Mannheim). Revelação segundo o protocolo Bõehringer-Mannheim com o CSPD (Tropix) como substrato quimioluminescente. Duração de exposição das membranas: de uma hora a uma noite para os fragmentos muito fracamente amplificados.

Resultados

Extraíram-se os ADN totais de 4 indivíduos por população FDl a FD16, de 8 indivíduos da família 20540 U, da chicória CT 52/3 e do girassol "Mirasol", ou seja, num total de 73 indivíduos. Verificou-se a ausência de inibição da PCR pelas impurezas presentes nos extractos de ADN adicionando algumas dezenas de femtogramas do fragmento de 347 pb a cada meio reaccional. As análises PCR do ADN 52/3, do ADN girassol "Mirasol" e dos ADN da família 20540 U permitem todas a amplificação de uma quantidade importante (200 ng aprox.) do fragmento de cerca de 350 pb da orf 522. Este fragmento está ausente em todas as chicórias de citoplasma normal. A análise destes produtos PCR por hibridação molecular com o auxílio de uma sonda orf 522 preparada por PCR a partir de ADN total de 11 girassol Mirasol confirma a homologia entre o fragmento amplificado nas chicórias (SMC) e a sonda.

Conclusão

Os resultados obtidos permitem mostrar que a orf 522 não está presente nas chicórias férteis. A determinação por PCR da presença/ausência da sequência orf 522 pode portanto ser considerada para a análise de rotina. 12

LISTA DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÕES GERAIS (i) DEPOSITANTE:

(A) NOME: FLORIMOND DESPREZ VIÚVA E FILHOS (B) RUA: BP 41

(C) CIDADE: CAPPELLE EN PEVELE

(E) PAÍS: PARIS (F) CÓDIGO POSTAL: 59242

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: GENOMA VEGETAL RECOMBINADO, MITOCONDRIA E CÉLULA QUE A CONTÉM E PROCESSO DE SELECÇÃO DE UMA ESTERILIDADE MASCULINA CITOPLASMÁTICA NUMA PLANTA DO GÉNERO CICHORIUM (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) FORMA DECIFRÁVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: Floppy disk

(B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

(C) SISTEMA DE EXPLORAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWER: Patenln release #1.0, Versão #1.30 (OEB) (vi) DADOS DO PEDIDO DE PATENTE ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE: FR 9606725 (B) DATA DE DEPÓSITO: 31-MAIO-1996 (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) : TIPO: nucleótido 13 (C) NÚMEROS DE RAMIFICAÇÕES: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1 CCCCCTCCCT GGTGGATCCG GCG (2) INFORMAÇÕES PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) : TIPO: nucleótido (C) NÚMEROS DE RAMIFICAÇÕES: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2 CCCTCTATGA GTACCGTTCT CTCACG 11-10-2007 14

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Genoma vegetal recombinado do género Cichorium, caracterizado por comportar genes específicos das chicórias e uma sequência nucleotídica de 347 pb derivada da sequência orf 522 de girassol (Heliantus annuus) e delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e SEQ ID No 2 ou uma sequência apresentando pelo menos 90 % de homologia com a referida sequência nucleotídica de 347 pb derivada da sequência da orf 522 delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2.
2. 2. Mitocondria comportando um genoma recombinado de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Citoplasma vegetal comportando o genoma do género Cichorium e mitocondrias de acordo com a reivindicação 2.
4. 4. Célula vegetal recombinada compreendendo um citoplasma de acordo com a reivindicação 3.
5. 5. Processo para produzir uma planta do género das Cichorium apresentando uma esterilidade masculina citoplasmática, caracterizado por se integrar no genoma celular desta planta uma sequência nucleotídica de 347 pb derivada da sequência da orf 522 de girassol (Heliantus annuus) e delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e SEQ ID No 2 ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de homologia com a referida sequência nucleotídica de 347 pb derivada da sequência da orf 522 delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2. 1
6. 6. Utilização da sequência nucleotídica de 347 pb derivada da sequência da orf 522 de girassol (Heliantus annuus) e delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e SEQ ID No 2 ou uma sequência apresentando pelo menos 90% de homologia com a referida sequência nucleotídica de 347 pb derivada da sequência da orf 522 delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2 para conferir uma esterilidade masculina citoplasmática a uma planta do género das Cichorium.
7. 7. Processo de selecção de uma esterilidade masculina citoplasmática numa planta do género Cichorium, caracterizado por se colocar em contacto o ácido nucleico mitocondrial da planta com uma sonda marcada compreendendo pelo menos 10 nucleótidos consecutivos da sequência nucleotídica de 347 pb derivada da sequência da orf 522 de girassol (Heliantus annuus) e delimitada pelos iniciadores de sequências SEQ ID No 1 e 2. 11-10-2007 2