JP2003502075A - イネの黄斑病ウイルスに対する新しいタイプの耐性遺伝子及び主要耐性遺伝子の遺伝子座の同定用手段及びその応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 病原性ウイルス特にＲＹＭＶウイルスの感染サイクルにとって不可欠な標的タンパク質を捕捉するための方法を提供し、これらの方法に関与する遺伝子をクローニングする。 【解決手段】 植物内の原形質連絡を介して循環する病原性ウイルスの認識及びターゲティングされた輸送に関与するタンパク質の分離方法において、ウイルス粒子と前記タンパク質の複合体を内含する標本を、抗カプシドタンパクモノクローナル抗体を利用することにより電気泳動及びウェスタンブロット法に付し、免疫検出されなかったバンドを回収することを特徴とする、単離方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明の対象は、イネの黄斑病ウイルス（Ｒｉｃｅ Ｙｅｌｌｏｗ Ｍｏｔｔ
ｌｅ Ｖｉｒｕｓ略してＲＹＭＶ）に対する新しいタイプの耐性遺伝子及び対ウ
イルス耐性主要遺伝子の遺伝子座を同定するための手段、ツール及び方法にある
。

【０００２】 本発明は、より特定的には、ツールとして、感染サイクルのための必須タンパ
ク質ならびにマーカー及びＰＣＲプライマ、及び耐性の物理的マッピングの作成
及び遺伝子クローニングに対するその応用を対象としている。

【０００３】

【従来の技術】

ＲＹＭＶは、アフリカの風土病ウイルスである。これは、その他のソベモウイ
ルスと共通の特徴、すなわち小さいサイズでポリアデニル化されていない正の極
性をもつ唯一の１本鎖ＲＮＡ、及び植物内に非常に大量に産生されるＴ＝３対称
２０面体粒子、といった特徴を示す。ウイルス粒子は同様に、脈管組織そして主
として道管の中に多く存在する。栽培されているアフリカ産イネ種Ｏｒｙｚａ
ｇｌａｂｅｒｒｉｍａのいくつかのめずらしい品種においては、ＲＹＭＶに対す
る非常に高い耐性が同定された。しかしながら、栽培されている２つのイネ種の
間の相互特異的ハイブリッドは不稔性が高く、これまでの研究ではこの耐性のメ
カニズムも遺伝的基礎も説明することができていない。

【０００４】 この分野における発明者らの研究作業は、モザンビーク原産でＡＤＲＡにより
同定された、アジア産栽培イネ種Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａのＧｉｇａｎｔｅと
呼ばれる１品種が、Ｏ．ｇｌａｂｅｒｒｉｍａで見られるものと同じ特徴を示す
ことを明らかにした。発明者らは、ＲＹＭＶ耐性が、考慮対象の２つの耐性源（
Ｏ．ＳａｔｉｖａとＯ．ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）において同一である劣性の耐性
主要遺伝子に結びつけられるということを明らかにすることにより、この耐性を
特徴づけた。

【０００５】 この耐性は、細胞から細胞への運動のレベルで介入し、ウイルスの複製が正常
であるのに感染した細胞レベルでウイルスが遮断されることによって現われる。

【０００６】 ＲＹＭＶに対する発明者らの研究作業により、このウイルスが、感染サイクル
中に異なる形で動きかつ増殖することがわかった。接種された葉の中では（Ｉ．
図１１）、それはウイルスＲＮＡ複合体及びウイルスタンパク質（カプシドタン
パク質、Ｐ１及び場合によってはＰ３）の形で、表皮細胞、葉肉細胞、脈管周囲
葉鞘細胞（管状組織及び葉鞘細胞の原形質連絡を横断して局所的に移動し、脈管
細胞（師部及び木部実質）に達する。これは、より特定的には、木部実質内で増
殖する（II、図１１）。脈管細胞中では、長距離運動と呼ばれる運動の前に、２
価のイオンＣａ_２ ^＋のおかげで、酸性ｐＨにおいて液胞内で緻密な粒子の形でカ
プシド化し安定する（II、図１１）。全身感染は、多数の安定した粒子が産生さ
れる場合にしか起こらない。系統的に感染した葉においては、ウイルスは、伝導
組織から出て、脈管の若い組織か又は葉肉細胞内で増殖する。感染段階で、局所
的運動は、脱カプシド化された形（ＲＮＡとタンパク質のウイルス複合体）又は
カプシド化された形でつねに原形質連絡を横断して行なわれる（III、図１１）
。

【０００７】 感染サイクルのこれらの異なる段階に際し、ウイルス複合体及び／又はビリオ
ンは、１つの細胞からもう１つの細胞まで、又１つの細胞区画からもう１つの細
胞区画まで動くために、植物のタンパク質により識別され輸送される必要がある
。

【０００８】 例えば、ウイルス及びその複合体の輸送に結びつけられる植物のタンパク質は
、類似の機能（輸送）を示すと思われるが、横断される組織（表皮、葉肉、管状
組織、脈管周囲葉鞘、師部、木部）に特異的である。これらのタンパク質が野性
対立遺伝子から翻訳される場合、ウイルスが移動できるようにするのは、罹病性
タンパク質である。反対に、突然変異を受けた対立遺伝子は、より機能性の低い
タンパク質（部分耐性partial resistance）か又は非機能性タンパク質（完全耐
性total resistance）を導くと思われる。

【０００９】 従って、これらのタンパク質は、その共通の細胞機能が基質の再生及び原形質
連絡を横断した輸送となるような遺伝子系統群に属するものの、組織特異性（表
皮、葉肉、管状組織、脈管周囲葉鞘、師部、木部）レベルでは異なるものである
とみなされている。

【００１０】 シンプラスト輸送の調節がこの遺伝子系統群の最も重要な機能である可能性は
、きわめて高い。

【００１１】 ＲＹＭＶは同様に、非常に安定したウイルスであり、細胞の中で、ち密型、膨
張型そして中間型という、見極められた３つのものを含めた複数のイソ型で存在
する。かくして細胞ｐＨに応じて（細胞質７〜８、液胞、小気胞及び道管４．５
〜６．５）、粒子の立体配座及び外部電荷は変化する。この電荷により、ウイル
スは、膜にひっかかりエンドサイトーシスメカニズムにより健康な細胞内に入る
ことが可能となる。最後に、細胞レベルで、発明者らはこのウイルスが主として
細胞の中に蓄積することを示した。３つのイソ型のｉｎ ｐｌａｎｔａでの存在
、区画化そして部分耐性植物内のウイルス蓄積によりかくして、耐性とは全く異
なるＲＹＭＶに対する寛容性のための独創的なメカニズムを提供することが可能
となった。

【００１２】 ＲＹＭＶに対する寛容性（tolerance）は、実際、液胞内での蓄積によっても
たらされると思われる。液胞膜は、細胞からウイルス粒子を物理的に分離して、
細胞機構にとって損傷をひき起こしうるあらゆる相互作用を妨げることになる。
かくして、ウイルスは、細胞を殺すことなく増幅し蓄積する（従って症候無し）
。

【００１３】 宿主細胞とウイルスの間の結びつきは、そのとき植物がタンク植物として挙動
するようなものである。

【００１４】 このモデルでは、ウイルスと宿主細胞の間の共進化は、ウイルスを適応化させ
て、最終的に、植物により産生され網状質及びゴルジ体を介して液胞まで輸送さ
れることになる単なる貯蔵タンパク質とし植物がウイルスを認識するようにした
。液胞膜の強力な陥入（自食作用メカニズム）も同様に、細胞質内で産生された
ウイルスが液胞内に蓄積できるようにする。

【００１５】 同様にして、このメカニズムは、例えば重金属又は塩について細胞を解毒する
ために観察されるメカニズムと類似している。

【００１６】

【発明の構成】

これらの結果を考慮して、発明者らは、植物内の病原性ウイルスの認識及びタ
ーゲティングされた輸送に関与するタンパク質を同定しこれらの方法に関与する
遺伝子をクローニングするための方法を考え出した。

【００１７】 従って本発明は、病原性ウイルス特にＲＹＭＶウイルスの感染サイクルに不可
欠の標的タンパク質を捕捉するための方法を提供することを目的とし、かつかく
して分離されたタンパク質をも目的としている。

【００１８】 本発明は同様に、ＲＹＭＶ耐性遺伝子座の分子マーカーを同定するための方法
を提供することを目的としている。

【００１９】 本発明は同様に、その性質上この方法により顕示されマーカーとして利用可能
なＤＮＡフラグメントをも目的とする。

【００２０】 本発明はさらに、特に耐性遺伝子座に対する高い特異性をもつその他のマーカ
ーを規定するためそして耐性表現型を予測するための、このようなマーカーの応
用を目的としている。

【００２１】 本発明は特に、耐性の物理的マッピングを作成するため及び遺伝子クローニン
グのための前記マーカーの応用を目的とする。

【００２２】 本発明はさらに、新しい産物として、実施されるＰＣＲ技術において利用され
るプライマ配列をも目的とする。

【００２３】 植物内の原形質連絡を介して循環する病原性ウイルスの認識及びターゲティン
グされた輸送に関与するタンパク質の分離方法は、ウイルス粒子と前記タンパク
質の複合体を内含する標本を、抗カプシドタンパクモノクローナル抗体を利用す
ることにより電気泳動及びウェスタンブロット法に付し、免疫検出されなかった
バンドを回収することを特徴とする。

【００２４】 １つの変形形態によると、複合体は、感染を受けた感受性植物から抽出された
ウイルスから得られる。

【００２５】 ウイルスは、より特定的には、ＲＹＭＶウイルスであり、５、２４、４２、４
９、５９、６６、７０、７７及び２１０ｋＤａのタンパク質が回収される。

【００２６】 もう１つの変形形態によると、複合体は、精製されかつ感受性植物の細胞懸濁
液のタンパク質と接触させられたウイルスから得られる。

【００２７】 特にウイルスは、ＲＹＭＶウイルスであり、２４、４５、５１、５７、６３、
８５及び１２０ｋＤａ以上のタンパク質が回収される。

【００２８】 上述の方法によって得られるようなタンパク質も同様に新しい産物として本発
明の範囲内に入る。

【００２９】 本発明は特に、植物中の原形質連絡を介して循環する病原性ウイルスに対する
耐性遺伝子のクローニングのための、これらのタンパク質の応用を目的とする。

【００３０】 本発明はさらにＲＹＭＶ耐性主要遺伝子の遺伝子座のマーカーの同定を目的と
し、ＡＦＬＰ（増幅フラグメント長多型）マーカーの利用を含み、ＰＣＲ技術を
援用している。

【００３１】 この同定方法は、次の段階を含むことを特長とする：すなわち、 − 親品種の子孫である感受性個体そして他方では耐性個体のイネのＤＮＡフ
ラグメントを選択的に増幅する段階であって、該フラグメントが、まずは消化段
階そして次に単数又は複数の特異的ヌクレオチドをその末端に有するプライマ相
補性アダプタを固定するための連結段階（対のプライマのうちの１つは顕示目的
で標識づけされている）に予め付されている段階； − 変性条件下でゲル電気泳動法により増幅産物を分離する段階；及び − 耐性遺伝子座に遺伝的に結びつけられる多型をもつバンドの同定を目的と
して、親品種に由来するフラグメントと、耐性子孫に由来するフラグメントの混
合物及び感受性子孫に由来する混合物を用いて得られた電気泳動プロフィールを
比較する段階であって、該同定の後には場合によっては、有効性確認として各個
体についての確認及びマーカーと耐性遺伝子座の間の遺伝子組換え率の計算が行
なわれる段階。

【００３２】 本発明の１実施形態においては、ＤＮＡフラグメントは、一方では耐性植物の
そして他方では感受性植物のゲノミックＤＮＡ及びそれらの親の、制限酵素を用
いた消化によって得られる。

【００３３】 適切なものであるということがわかっている制限酵素としては、ＥｃｏＲＩ及
びＭｓｅＩがある。

【００３４】 その後アダプタが固定される平滑末端を生成するため短かいヌクレオチド配列
が消化フラグメント（アダプタ）に固定される。

【００３５】 増幅段階で利用されるプライマは、これらのアダプタと相補的であり、その末
端３’には、可変的であってよい１〜３個のヌクレオチドを伴う。

【００３６】 増幅段階は有利には、ＰＣＲ技術に従って行なわれる。

【００３７】 その末端にそれぞれＡＡＣ及びＣＡＧ、ＡＣＣ及びＣＡＧさらにはＡＧＣ及び
ＣＡＧというモチーフを有するプライマ対を用いて、特異的増幅プロフィールが
、得られる。

【００３８】 アダプタＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩに対応する配列はそれぞれＧＡＣ ＴＧＣ
ＧＴＡ ＣＣＡ ＡＴＴ Ｃ（配列番号１）及びＧＡＴ ＧＡＧ ＴＣＣ ＴＧ
Ａ ＧＴＡ Ａ（配列番号２）である。

【００３９】 このとき、増幅のために用いられるプライマ対は、有利にはＥ−ＡＡＣ／Ｍ−
ＣＡＧ；Ｅ−ＡＣＣ／Ｍ−ＣＡＧ；及びＥ−ＡＧＣ／Ｍ−ＣＡＧの中から選ばれ
、ここでＥ及びＭはそれぞれ配列番号１及び配列番号２に対応する。その他の対
は、例中の表６に記されている。

【００４０】 得られた増幅プロフィールの比較研究によって、例中で報告されているように
感受性品種及びその感受性子孫に特異的に存在しその結果耐性マーカーに対応す
る多型バンドを顕示することが可能となる。

【００４１】 特に、変性条件下での電気泳動ゲル上での顕示は、それぞれ５１０ｐｂ及び１
４０ｐｂの２つのマーカーバンドＭ１及びＭ２の同定を導く。

【００４２】 これら２つのバンドは、分離データの分析に従って、耐性遺伝子座を支持する
１０〜１５ｃＭの染色体セグメントを決定し、この遺伝子座の両側で５〜１０ｃ
Ｍのところに位置づけられている。

【００４３】 本発明の方法の１つの配置に従うと、ＲＹＭＶに対する耐性遺伝子座に特異的
なマーカーとして同定された多型バンドは、ゲルから単離される。有利には、電
気泳動ゲルからの切除によりこれを行なう。この単離段階の後には、従来の技術
に従って進められる精製作業が行なわれる。かくしてＤＮＡフラグメントを得る
。

【００４４】 本発明のもう１つの配置に従うと、前記精製されたフラグメントは、宿主細胞
特にＥ．ｃｏｌｉの細胞といったような細菌細胞の中に導入されたプラスミドな
どの適切なベクターの中でクローニングされる。

【００４５】 本発明のもう１つの配置に従うと、精製されクローニングされたＤＮＡフラグ
メントは、配列決定される。

【００４６】 前記ＤＮＡフラグメントに対応するインサートの配列を利用して、本発明は同
様に、ＲＹＭＶに対する耐性主要遺伝子の遺伝子座に対する高い特異性をもつマ
ーカーの獲得方法をも提供している。この方法は、一定の与えられたインサート
の配列のフラグメントに相補的なＰＣＲプライマ対を規定し、これらのプライマ
対を用いてインサートの特異的増幅に着手し、その後増幅産物を電気泳動ゲル上
での泳動に付すことを特徴とする。

【００４７】 これらのＤＮＡ配列は、例中で記されているように、以下のような異なる方法
に従って研究すべきイネ品種内の耐性遺伝子座に結びつけられた多型を同定する
ために利用可能である： １） 特異的増幅及びアガロースゲル上でのフラグメントの分離の後、これら
のＤＮＡ配列のサイズの多型を直接同定することによる、 ２） アガロースゲル上で消化産物を分離するため制限酵素により増幅産物を
消化することによる、 ３） 制限酵素によって予め消化されたイネの品種のＤＮＡをハイブリッド形
成し制限多型を決定するためのプローブとしてこれらの配列を利用することによ
る。

【００４８】 本発明は、新しい産物として、イネの植物ＤＮＡから上述の方法により同定さ
れ、場合によって精製され配列決定されたとおりの多型ＡＦＬＰバンドをその目
的としている。

【００４９】 これらのＡＦＬＰバンドは、例中に記述されているように、ＲＹＭＶ（ＩＲ６
４）に対する感受性品種内及び耐性Ｇｉｇａｎｔｅとこの品種の交雑に由来する
感受性植物の分画内で特異的に明らかにされる。

【００５０】 本発明は特に、これらの多型バンドに対応し、ＲＹＭＶに対する耐性遺伝子座
を支持する１０〜１５ｃＭの染色体４のセグメントを規定できるようにするＤＮ
Ａ配列を目的としている。

【００５１】 それらの獲得方法を考慮すると、ＡＦＬＰバンドは制限フラグメントに対応し
、特に本発明の方法の１実施形態に従ってフラグメントＥｃｏＲＩ−ＭｓｅＩに
対応する。

【００５２】 このタイプのフラグメントは、マーカーＭ１及びＭ２と呼ばれ、それぞれ変性
条件下の電気泳動ゲル内で５１０ｐｂ及び１４０ｐｂのサイズにより特徴づけら
れる。

【００５３】 これらのフラグメントは、耐性遺伝子座をフランキングし、この遺伝子座の両
側５〜１０ｃＭのところに位置づけされたＤＮＡ配列に対応することを特徴とす
る。

【００５４】 本発明は、前記多型バンドに対応する前記ＤＮＡ配列がＲＹＭＶ耐性遺伝子座
を支持し１０ｃＭ未満のセグメントを規定することを特徴とする前述のようなｃ
ＤＮＡを目的とする。

【００５５】 本発明は同様に、プラスミドといったようなベクター内でクローニングされた
フラグメント、その性質上かかるフラグメントを有していることを特徴とするこ
れらのクローニングベクター自体及びＥ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞といったよう
な、これらのベクターを用いて形質転換された宿主細胞をもその目的としている
。本発明は特に、マーカーＭ１として同定されたフラグメントに対応し以下の配
列番号３の配列を満たすＤＮＡ配列を目的としている：

【配１】

【００５６】 マーカーＭ１のＤＮＡ配列は４７１ｐｂというサイズを呈している。

【００５７】 本発明はさらに、新しい産物として、ＰＣＲで増幅プライマとして利用される
ヌクレオチド配列をも目的としている。

【００５８】 かかるプライマは、Ｅ及びＭが配列番号１及び配列番号２にそれぞれ対応する
ものとして、Ｅ−ＡＡＣ／Ｍ−ＣＡＧ；Ｅ−ＡＣＣ／Ｍ−ＣＡＧ；Ｅ−ＡＣＣ／
Ｍ−ＣＡＧの対を含む。

【００５９】 その他のプライマもさらに、マーカーＭ１により指定されたフラグメントの配
列内で同定された配列と相補的である。これは、特に以下のものの中から選択さ
れた配列（５’、３’）である：

【配２】

【００６０】 本発明は同様に、マーカーＭ２として同定され、

【配３】 という配列番号９の配列を満たすフラグメントに対応するＤＮＡ配列をも目的と
している。

【００６１】 Ｍ２のサイズは１２０ｐｂである。

【００６２】 Ｍ２の配列の中で同定された配列と相補的な特異的プライマが規定された。か
かる配列は、以下の連鎖（５’、３’）を満たしている：

【配４】

【００６３】 さらにもう１つの態様に従うと、本発明は、耐性表現型の同定を可能にする多
型を規定するための、前記プライマで得られたＤＮＡ配列の利用を目的としてい
る。

【００６４】 本発明は同様に、ＲＹＭＶ耐性主要遺伝子を支持するＤＮＡ配列の同定方法に
も関する。この方法は、ＲＹＭＶ耐性遺伝子及び上述のマーカーを内含するバン
クの単数又は複数のクローンを選択するための、細菌内でクローニングされた、
ＢＡＣ（細菌性人工染色体）といったようなＩＲ６４品種その他の１００〜１５
０ｋｂのＤＮＡフラグメントから成るバンクのスクリーニングを特徴とする。

【００６５】 かかるＢＡＣバンクはＩＲＲＩから入手可能である。

【００６６】 選択された単数又は複数のクローンの遺伝子を同定するためには、植物から抽
出された未加工タンパク質液からの分画、そして次に徐々に近づいて精製された
ウイルスの存在下に置かれた状態で耐性品種内での細胞から細胞への運動を可能
にするタンパク質を同定する作業に着手する。そのとき、候補である単数又は複
数のタンパク質は、Ｎ末端からか又は加水分解によって遊離された内部フラグメ
ントから、部分的に配列決定される。かくしてプライマを規定することができ、
これらは、対応するｃＤＮＡを増幅するために利用される。有効性確認を目的と
して、ｃＤＮＡが義務的に、マイクロサテライトマーカー間の間隔の中に置かれ
たＢＡＣクローンをハイブリッド形成するようになっていることを確認する。

【００６７】 変形形態では、遺伝子を含むＢＡＣフラグメントをコスミドの形のより小さな
サイズの要素へとサブクローニングし、これらのコスミドはその後出発ＢＡＣク
ローン全体を網羅するような形で再度順序づけされる。これらのコスミドは、そ
の中に含まれタンパク質接近により分離されたｃＤＮＡに対応する配列の有効性
を確認できるようにする機能的相補性検定を実施するため遺伝子形質転換におい
て利用される。すなわちここで問題となっているのは、細胞から細胞へのウイル
スの運動を担当するタンパク質の合成により耐性品種を感受性あるものにするこ
とができる、ということを立証することである。

【００６８】 かくして本発明は、例えばＢＡＣ（細菌性人工染色体）バンクといった、上述
のようにＩＲ６４のようなイネ品種の１００〜１５０ｋｂのＤＮＡフラグメント
から成るバンクからスクリーニングされたＢＡＣクローンとハイブリッド形成す
る能力をもつｃＤＮＡにおいて、このＢＡＣクローンが、前述の方法によりイネ
から同定されたマーカーのＤＮＡ配列を内含するＢＡＣクローンのｃｏｎｔｉｇ
（つまり重複するＢＡＣクローンアセンブリ）に属しているｃＤＮＡを目的とす
る。

【００６９】 本発明に従うと、耐性遺伝子は、関連づけされた特異的遺伝子マーカーの利用
により、従来の経路で感受性品種にトランスファされ得る。かくして、耐性品種
は、はるかに容易かつはるかに迅速に開発可能である。

【００７０】 その上、有利にも、この遺伝子の配列は、その他の植物の病原体であるものの
同じメカニズム（細胞から細胞への運動）により特徴づけられるその他のウイル
ス（例えばポチウイルス）の耐性遺伝子に対するアクセスを容易にするというこ
とがわかるだろう。かくして本発明は、植物病原体に対する天然の耐性に基づく
植物の改良のためのきわめて有利な手段を提供する。

【００７１】

【発明の実施の形態】

本発明のその他の特徴及び利点は、図１〜１５を参照した以下の例の中で示さ
れることになる。

【００７２】 例１：耐性源品種の同定 耐性の研究において利用された品種、特にＧｉｇａｎｔｅ及びＴｏｇ５６８１
という２つの耐性品種は、遺伝子座の代表的標本採取の時点でマイクロサテライ
トマーカーにより特徴づけされた。

【００７３】 多型は、最も往々にして一定の与えられた品種の特徴である二ヌクレオチドで
あるヌクレオチド短モチーフの反復回数の形で現われる。

【００７４】 遺伝子座全体について、列挙された対立遺伝子により、各品種に特定的な特徴
が利用可能となっている。

【００７５】 これらのマイクロサテライトマーカーは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１）によ
って決定された特異的プライマでのＤＮＡの増幅とそれに続く、同じ著者により
記されたプロトコルに従った変性条件下でのポリアクリルアミドゲル上の泳動に
よって、明らかにされる。

【００７６】 表１は、対照として役立つＩＲ３６品種と比較してモチーフの反復回数により
対立遺伝子を同定する上述のｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，により立証された基準シ
ステムに基づく結果を示している。Ｇｉｇａｎｔｅ及びＴｏｇ５６８１という２
つの品種がかくして、その他全ての品種と対照させて１５の遺伝子座について特
定的に記述されている（マイクロサテライトマーカーは第１欄に記されている）
。

【００７７】

【表１】

【００７８】 例２：耐性の特徴づけ 耐性を、きわめて感受性の高い対照品種ＩＲ６４と比較して、ウイルスを用い
た若い実生の人工的接種に基づいて特徴づけした。

【００７９】 発出した最後の葉についてのＥＬＩＳＡ試験により、接種６０日間ウイルス含
量を追跡調査した。

【００８０】 これらの試験は、ウイルス接種を受けていない対照植物と有意な形で異なって
いるシグナルを明らかにすることが全くできなかった。

【００８１】 ２つの品種Ｔｏｇ５６８１及びＧｉｇａｎｔｅから分離された原形質体を接種
することによって、もう１つの実験が実施された。両方のケースにおいて、ウイ
ルスタンパク質の存在（カプシドタンパク質及び運動タンパク質Ｐ１）、ならび
に、ＩＲ６４といったような感受性品種の原形質体と同じ要領でウイルスを増殖
させるこれらの原形質体の能力を証明するウイルスＲＮＡの蓄積を検出すること
が可能である。

【００８２】 かくして、複製、細胞から細胞への運動及び道管を通しての長距離輸送が、植
物内の感染サイクルの展開の主要３段階であると考えると、これら２つの品種の
耐性は、最も論理的には、感染を受けた細胞のレベルでのウイルスの遮断にある
。

【００８３】 例３：耐性の遺伝学 耐性０．ｓａｔｉｖａ品種（Ｇｉｇａｎｔｅ）、耐性０、ｇｌａｂｅｒｒｉｍ
ａ品種Ｔｏｇ５６８１（ＡＤＲＡＯによっても同様に同定されるもの）及び非常
に感受性の高い基準品種ＩＲ６４（ＩＲＲＩで選択されるもの）の間で、異なる
交雑Ｆ１を実施した。

【００８４】 植物性材料の栽培、交雑そして子孫の産生をモンペリエのＩＲＤの温室内で実
施した。

【００８５】 感受性品種と耐性品種の間で得たハイブリッドＦ１を、ＥＬＩＳＡ試験及び症
候追跡調査によりＲＹＭＶウイルス耐性について試験した。

【００８６】 これらのハイブリッドＦ１は全て感受性のある親と同じ位感受性があることが
判明し、従って耐性という性質は劣性であることが示された。

【００８７】 これに対して、２つの耐性源Ｇｉｇａｎｔｅ及びＴｏｇ５６８１間のハイブリ
ッドは、これら２つの耐性源における唯一かつ独自の耐性遺伝子座に有利な耐性
ハイブリッドＦ１しか与えなかった。

【００８８】 これらの結果は、以下の表２にまとめられている。

【００８９】 この表は、ハイブリッドＦ１、戻し交雑及び感受性品種ＩＲ６４と２つの耐性
栽培品種Ｇｉｇａｎｔｅ及びＴｏｇ５６８１の間の戻し交雑から得た子孫Ｆ２の
全身経路で感染させられた葉におけるＥＬＩＳＡ応答（Ａ４０５ｍｍ）の分布を
示している。

【００９０】

【表２】

【００９１】 Ｇｉｇａｎｔｅに関しては、耐性の遺伝は、交雑（ＩＲ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ
）の５５のＦ３系統群についての耐性試験によって確認された。結果は表３に記
されている。

【００９２】

【表３】

【００９３】 この表を検討すると以下のことがわかる： − 植物Ｆ２の１／４は子孫Ｆ３に耐性植物しか与えず、耐性について同型接
合体である。 − 植物Ｆ２の１／４は、子孫Ｆ３に感受性植物しか与えず、感受性について
同型接合体である。 − 植物Ｆ２の１／２は、耐性について分離状態にあり、子孫Ｆ３において同
じ割合（３：１）で感受性及び耐性植物を与える。 結果全体は、２つの品種Ｇｉｇａｎｔｅ及びＴｏｇ５６８１に存在する唯一の
劣性耐性遺伝子と完全に合致する。

【００９４】 例４：プロトコルＡＦＬＰに従った耐性マーカーＭ１及びＭ２の同定 ａ−ＤＮＡプールの獲得 Ｆ２（ＩＲ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ）に由来する１０本の感受性植物と１０本の
耐性植物の葉を、そのＤＮＡを抽出するために採取した。

【００９５】 その後、混合物の最終濃度を５０ｎｇ／μｌとして感受性又は耐性の１０本の
植物Ｆ２にそれぞれ対応する２つのＤＮＡプールを構築するため、化学量論的に
ＤＮＡを混合した。これらの混合物は、Ｚａｂｅａｒ ｅｔ ａｌ（４）、及び
Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（５）によって開発された増幅フラグメント長多型につい
てのＡＦＬＰ（増幅フラグメント長多型）方法による耐性マーカーの同定の基礎
として役立った。利用された製品は、Ｋｅｙｇｅｎｅ＆Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓにより納入される市販のキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の形を呈し
ている。

【００９６】 ｂ−制限フラグメントの獲得 ５０ｎｇ／μｌのＤＮＡプール及び親の各々を２５０ｎｇずつ、２つの制限酵
素（ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ）により同時に消化させる。

【００９７】 消化反応（２５μｌ） ＤＮＡ５μｌ（５０ｎｇ／ｍｌ） ＥｃｏＲＩ（１０Ｕ／μｌ） ０．２μｌ（２Ｕ） ＭｓｅＩ（５Ｕ／μｌ） ０．２μｌ（２Ｕ） 緩衝液Ｔ４リガーゼ５Ｘ ５μｌ Ｈ_２Ｏ １４．５μｌ

【００９８】 消化反応は３７℃で２時間行ない、次に７０℃で１５分間制限酵素を不活性化
させる。消化の後、連結反応が着手される。

【００９９】 連結反応 （５０μｌ）： ２重消化用反応培地 ２５μｌ ＥｃｏＲＩアダプタ １μｌ ＭｓｅＩアダプタ １μｌ 緩衝液Ｔ４リガーゼ５Ｘ ５μｌ リガーゼ（１０Ｕ／μｌ） １μｌ（１Ｕ） Ｈ_２Ｏ １７μｌ

【０１００】 連結反応は３時間３７℃で行なわれ、その後１０分間６０℃で酵素の不活性化
が行なわれる。

【０１０１】 ｃ−増幅 いわゆる増幅は、予備増幅と特異的増幅という２段階で行なわれた。

【０１０２】 ｃ１−予備増幅反応（５０μｌ） 消化されアダプタに固定されたＤＮＡを内含する、１／１０希釈反応培地５μｌ ＥｃｏＲＩプライマ ０．５μｌ（１５０ｎｇ／μｌ） ＭｓｅＩプライマ ０．５μｌ（１５０ｎｇ／μｌ） ５ｍＭのヌクレオチド混合物 ２μｌ Ｐｒｏｍｅｇａ の１０×緩衝液 ５μｌ ２５ｍＭのＭｇＣｌ_２ ５μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） ０．２μｌ（１Ｕ） Ｈ_２Ｏ ３１．８μｌ

【０１０３】 ＰＣＲによる予備増幅の特性は以下の通りである： 変性： ９４℃で３０秒 ハイブリダイゼーション： ５６℃で３０秒 延長： ７２℃で１分 で２０サイクル。

【０１０４】 選択増幅は、３’末端に３つの選択的ヌクレオチドをもつプライマを利用し、
オートラジオグラフィフィルム上にバンドを顕示させるためのプライマのうちの
１つを標識づけすることによって、１／３０希釈した第１の増幅のアリコートか
ら行なわれる。

【０１０５】 次のようなプライマ対を利用する： Ｅ−ＡＡＣ／Ｍ−ＣＡＧ Ｅ−ＡＣＣ／Ｍ−ＣＡＧ Ｅ−ＡＧＣ／Ｍ−ＣＡＧ なおここで、Ｅは、ＧＡＣ ＴＧＣ ＧＴＡ ＣＣＡ ＡＴＴ Ｃ（配列番号
１）という配列を満たし、Ｍは、ＧＡＴ ＧＡＧ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＴＡ Ａ
（配列番号２）という配列を満たす。

【０１０６】 ハイブリダイゼーション温度を次の１１サイクルの間、１サイクルあたり０．
７℃ずつ低下させる： 最後の２０サイクル 変性： ９０℃で３０秒 ハイブリダイゼーション： ５６℃で３０秒 延長： ７２℃で１分。

【０１０７】 ＥｃｏＲＩプライマの（０．５μｌの試験管に戻された）標識づけに着手する
： ＥｃｏＲＩプライマ（５ｎｇ） ０．１８μｌ γ^３３Ｐ ＡＴＰ（１０ｍＣｕ／μｌ） ０．１ μｌ キナーゼ１０×緩衝液 ０．０５μｌ Ｔ４キナーゼポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ） ０．０２μｌ（０．２Ｕ） Ｈ_２Ｏ ０．１５μｌ

【０１０８】 標識づけ反応は１時間３７℃で行なわれ、１０分間７０℃で停止させられる。

【０１０９】 Ｃ２−特異的増幅反応（２０μｌ） 標識づけされたＥｃｏＲＩプライマ ０．５μｌ １／３０に希釈された予備増幅反応培地 ５μｌ ＭｓｅＩプライマ（１００ｎｇ／μｌ） ０．３μｌ ５ｍＭのヌクレオチド混合物 ０．８μｌ Ｐｒｏｍｅｇａ １０×緩衝液 ２μｌ ２５ｍＭのＭｇＣｌ_２ ２μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ） ０．１μｌ（０．５Ｕ） Ｈ_２Ｏ ９．３μｌ

【０１１０】 増幅の特性は以下の通りである： ・ 全３２サイクルの内訳 ・ 最初のサイクル： 変性： ９４℃で３０秒 ハイブリダイゼーション： ６５℃で３０秒 延長： ７２℃で１分 ・ 次の１１サイクル： 前述のものと同じ条件。 ただし、ハイブリダイゼーション温度は各サイクル毎に０．７℃ずつ低下させ
る。 ・ 最後の２０サイクル： 変性： ９０℃で３０秒 ハイブリダイゼーション： ５６℃で３０秒 延長： ７２℃で１分

【０１１１】 ｄ−電気泳動とオートラジオグラフィ 増幅反応の終わりで、２０μｌのローディング緩衝液を添加する（ホルムアミ
ド９８％、キシレンシアノール０．００５％、ブロモフェノールブルー０．００
５％）。増幅産物を、５０ワットの出力で３時間の泳動中、泳動緩衝液ＴＢＥ（
トリス１８ｍＭ、ＥＤＴＡ０．４ｍＭ、ホウ酸、１８ｍＭ、ｐＨ８．０）を伴う
変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド６％、尿素８Ｍ）上の電気泳動に
よって分離する。泳動後、ゲルを２０分間、無水エタノール２体積／酢酸１体積
溶液中で固定させる。ゲルをＷａｔｔｍａｎ ３Ｍ紙上に移し、ゲルドライヤで
８０℃で４５分間乾燥させる。ゲルを超感光フィルムと共にカセット内に入れる
。オートラジオグラフィを、２日間の露出後に現像する。親及び感受性植物又は
耐性植物プールで得られたプロフィールを比較することにより、１方のプールに
は存在するもののもう１つのプールでは存在しないバンドを同定することが可能
となる。その後、耐性の標識づけ候補であるこれらのバンドを、ＤＮＡプールを
構成する植物の各々について個別に確認する。

【０１１２】 ｅ−結果 得られた結果を検討すると、Ｍ１及びＭ２と呼ばれる２つのマーカーが、感受
性ある親（ＩＲ６４）ならびに感受性植物プールを構成する全てのＦ２植物（Ｉ
Ｒ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ）において存在する一方で、耐性の親（Ｇｉｇａｎｔｅ
）ではこのバンドは存在しないこと、そして耐性プールのただ１つの個体だけが
このバンドを示す、ということがわかる。同じタイプの変動は、再交雑（ＩＲ６
４×Ｔｏｇ５６８１）×Ｔｏｇ５６８１においても見られる。この分析（Ｍ３〜
Ｍ６）で同定されたその他のマーカーも同じ変動を示している： すわなち、 − 感受性の親及び感受性植物Ｆ２（ＩＲ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ）のプール、
ならびに再交雑（ＩＲ６４×Ｔｏｇ５６８１）×Ｔｏｇ５６８１の感受性植物に
おけるバンドの存在。 − 耐性の親Ｇｉｇａｎｔｅ 及びＴｏｇ５６８１、耐性植物Ｆ２（ＩＲ６４
×Ｇｉｇａｎｔｅ）のプール、ならびに再交雑（ＩＲ６４×Ｔｏｇ５６８１）×
Ｔｏｇ５６８１の耐性植物におけるバンドの不在。

【０１１３】 ＡＦＬＰマーカーＭ１〜Ｍ６と、Ｆ２プール（ＩＲ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ）及
び種間戻し交雑（ＩＲ６４×Ｔｏｇ５６８１）×Ｔｏｇ５６８１の間の分離デー
タは、表４及び５にまとめられている。分離データ及び２つの交雑において観察
されるめずらしい組換え体を分析することによって、これらの異なるマーカーと
耐性遺伝子座の間の組換え率を評価することができる。特に、一方ではマーカー
Ｍ１そして他方ではマーカーＭ２〜Ｍ６は、耐性遺伝子座を支持する１０〜１５
ｃＭ未満のセグメントを決定する。Ｍ１及びＭ２はかくして５〜１０ｃＭ未満に
あり、この遺伝子座の両側に置かれている。

【０１１４】

【表４】

【０１１５】

【表５】

【０１１６】 例５：マーカーＭ１の単離 同じプライマ対を用いた新たな増幅を実施し、その後上述のものと同じ条件で
ポリアクリルアミドゲル上での泳動を行なった。ゲル上でバンドを直接視覚化す
るため、シルバースティニングキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）での硝酸銀染色により
、顕示を行なった。顕示後、バンドＭ１をゲルから切除し、次に一晩４℃の水５
０μｌ中でＤＮＡを溶出させた。

【０１１７】 ５μｌのアリコートを採取し、Ｐ^３３での標識づけを伴う同じプライマ対で再
度増幅させた。増幅産物を、６％の変性アクリルアミドゲル上で新たに分離し、
感受性及び耐性のプール及び親と比較した。この増幅産物に対応するレーンは、
切除されていたオリジナルのバンドと正に同じレベルで泳動する５１０ｐｂの唯
一のバンドを示している。５μｌのもう１つのアリコートを同じプライマで増幅
し、１．８％のアガロースゲル上で分離させた。期待されたサイズ（５１０ｐｂ
）に対応するバンドを新たに切除し、ジーンクリーンキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）
で精製した。

【０１１８】 例６：マーカーＭ１のクローニングと配列決定クローニング ３７℃で一晩クローニング反応のために３μｌの精製産物を利用した。 精製産物 ３μｌ ベクター ＰＧＥＮＴ ｅａｓｙ １μｌ Ｔ４ リガーゼ １０×緩衝液 １μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １μｌ Ｈ_２Ｏ ４μｌ

【０１１９】 Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＭ１０９のコンピテント細胞１００μｌにＣＬＮ産物５μｌ
を添加することにより、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＭ１０９菌を用いて形質転換を行なっ
た。３７℃で１時間、ＬＢ培地上で予備培養を実施した。その後、アンピシリン
１／１０００を伴う寒天を含むペトリ皿上で細菌を展延させた。形質転換された
細菌を選択するため、細菌の展延の直前に５０μｌのＩＰＴＧ−ＸＧａｌを添加
した。白色コロニー（形質転換されたもの）を選択し、同じ条件下で（寒天プラ
スアンピシリン）再度培養した。

【０１２０】 この培養から、Ｗｉｚａｒｄプラスキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、プラ
スミドＤＮＡミニ調製物を作製した。インサートを含むプラスミドＤＮＡを、マ
ーカーＭ１の存在の確認のため、ＥｃｏＲＩ酵素で消化させた。１．８％のアガ
ロースゲルにより、マーカーＭ１に対応する５１０ｐｂのバンドとプラスミドに
対応する３ｋｂのバンドの存在を確認することができた（写真１）。

【０１２１】 配列決定 インサートの配列（配列番号３）は以下のとおりである（５′、３′）： 配列番号３

【配５】

【０１２２】 ＡＦＬＰ増幅のために利用されたプライマに対応する配列が再び見い出されて
おり、これは、バンドが制限フラグメント（ＥｃｏＲＩ−ＭｓｅＩ）に対応して
いることを示している。

【０１２３】 プライマに対応する配列を演繹すると、クローニングされたイネのＤＮＡフラ
グメントの実際のサイズは４７１ｐｂである。

【０１２４】 一方ではプライマ対（１−３）、（１−４）、（１−５）そして他方では（２
−３）、（２−４）、（２−５）という異なるプライマ対を利用することにより
、ＡＦＬＰ Ｍ１バンドのクローニングの有効性を確認することができる。これ
らのプライマとの交雑において利用される品種のＤＮＡの増幅は、唯一のバンド
しか示さない。Ｔｏｇ５６８１品種に対応するフラグメントは、その他の品種の
ものよりもわずかに大きいものである（図２）。

【０１２５】 例７：配列Ｍ１から多型マーカーへの形質転換 マーカーＭ１についての多型を、２重半数体個体群（ＩＲ６４×Ａｚｕｃｅｎ
ａ）の親の間で見極めた。この個体群には、イネの１２の染色体上に分布した３
００以上のマーカーが数え上げられる。そのために、親ＩＲ６４上で決定された
マーカーＭ１の配列の制限部位を支えとした（図３）。その後制限酵素により消
化される交雑の親のＤＮＡを増幅するために、プライマ（１−３）、（１−４）
及び（１−５）を利用した。制限部位ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩは、プライマ１が利
用される場合８６ｐｂのフラグメントを放出する。この部位は、Ｇｉｇａｎｔｅ
及びＡｚｕｃｅｎａ品種には存在しない（図４）。

【０１２６】 マーカーを、交雑（ＩＲ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ）の感受性プール及び耐性プー
ルの個体Ｆ２上で体験した。耐性個体は全て、個体（５、１１）を除いて、Ｇｉ
ｇａｎｔｅ品種のプロフィールを有する（制限部位ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩの不在
に結びつけられるＡＦＬＰ Ｍ１マーカーの不在）。感受性個体は、組換えされ
ている２つの異種接合体個体を除いて、品種ＩＲ６４と同様に同型接合体状態で
制限部位ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩを提示する（図５）。

【０１２７】 特異的プライマにより増幅できるマーカーＭ１の配列は、ＡＦＬＰ Ｍ１マー
カーに充分対応する。ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩ酵素による消化は、感受性の親（Ｉ
Ｒ６４）由来の対立遺伝子を耐性の親（Ｇｉｇａｎｔｅ）と区別できるようにす
る。

【０１２８】 これらの新たなデータにより、マーカーＭ１とＭ２の間の耐性遺伝子座の位置
を堅固にし、Ｍ１と耐性遺伝子座の間の距離については０．０６５±０．０４５
そしてマーカーＭ１とＭ２の間の距離については０．１１±０．０４７で組換え
率を見積もることが可能となる。

【０１２９】 例８：マーカーＭ１のマッピング 個体群（ＩＲ６４×Ａｚｕｃｅｎａ）の６０の個体をマーカーＭ１について、
プライマ（１−３）での増幅及び酵素ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩによる消化とそれに
続く２．５％のアガロースゲル上のフラグメントの分離に付した。マーカーＭ１
の分離はひずみのないものである（図６）。結果から、染色体４上でマーカーＰ
Ｇ１６３とＲＧ２１４（図７）の間にマーカーＭ１を置くことができるようにす
るマッピングソフトウェア（ＭａｐｍａｋｅｒＶ３）を利用したマーカーＭ１の
マッピングが可能となる。この間隔は、ＲＹＭＶ耐性遺伝子座があるゾーンを表
わしている。

【０１３０】 イネの遺伝地図の染色体４上のＲＹＭＶ耐性遺伝子のマッピングは、耐性遺伝
子座に最も近いマーカーの同定を可能にする。ここで問題となっているのは特に
、マイクロサテライトマーカーＲＭ２５２及びＲＭ２７３又は、親ＩＲ６４とＧ
ｉｇａｎｔｅの間の多型を同定できるようにするこれらのマーカーによって規定
された間隔（４−５ｃＭ）の内部の他のあらゆるマーカー、例えばゲノミックバ
ンク又はｃＤＮＡに由来するＲＦＬＰマーカー、マイクロサテライト、ＡＦＬＰ
マーカー又はクローンＢＡＣ、ＹＡＣ又はそれらのコスミドといったような領域
の物理的マッピングから誘導されたマーカー、である。

【０１３１】 本発明に従って同定されたマーカー又は、ＲＹＭＶに対し感受性あるイネの品
種とＧｉｇａｎｔｅ又はＯ．ｇｌａｂｅｒｒｉｍａといったような耐性品種間の
多型の同定を可能にするこの間隔内にある他のあらゆるマーカーは、連続的な再
交雑とそれに続くマーカーにより補助される選択による感受性品種内のＲＹＭＶ
耐性のトランスファのために、利用することができる。

【０１３２】 例９： 品種Ｔｏｇ５６８１の耐性遺伝子座の標識づけ 品種Ｔｏｇ５６８１内に制限部位ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩが存在すると、マーカ
ーＭ１が、Ｔｏｇ５６８１に由来する耐性マーカーでもあることを確認するため
に例８の戦略を利用することができない。同様に、プローブとしてマーカーＭ１
のＤＮＡ配列を利用することにより制限多型を同定するために、１２の制限酵素
（Ｂａｍ ＨＩ、 Ｂｇ／ＩＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｈｉｒｄ
ＩＩＩ、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩ、ＳｃａＩ、ＸｂａＩ、ＨａｅＩＩＩ）
で４つの品種Ａｚｕｃｅｎａ、 Ｇｉｇａｎｔｅ、ＩＲ６４及びＴｏｇ５６８１
を消化させた。酵素ＳｃａＩは、ＩＲ６４とＴｏｇ５６８１の間の多型の同定を
可能にする（図８）。この多型は、耐性について分離状態の再交雑（ＩＲ６４×
Ｔｏｇ５６８１）×ＩＲ６４に対しマーカーＭ１の有効性を確認するために利用
された。９つの耐性個体は、組換え型である唯一のものを除いてＴｏｇ５６８１
バンドしか示さない（図９）。従ってプローブとしてマーカーＭ１を利用するこ
とにより酵素ＳｃａＩによって明らかにされる制限多型は、Ｔｏｇ５６８１の耐
性遺伝子座に充分関係づけられる。遺伝子分析と耐性マーカーの同定は、マーカ
ーＭ１が２つの品種ＧｉｇａｎｔｅとＴｏｇ５６８１において同じ耐性遺伝子座
を充分マッピングするとみなすべく、一貫性あるものである。

【０１３３】 例１０：マーカーＭ２からＰＣＲ特異的マーカーへのクローニング及び配列決
定 プライマ対Ｅ−ＡＣＣ／Ｍ−ＣＡＧで得られ、かつ感受性の親（ＩＲ６４）に
おいて可視的で感受性プールを構成するすべての個体に存在するバンドＭ２に対
応するＡＦＬＰバンドを、マーカーＭ１の場合と同じプロトコルに従ってクロー
ニングした。このバンドに対応する配列を決定し、このマーカーをＰＣＲ特異的
マーカーに形質転換できるようにするため３つのプライマを規定した（順方向１
−逆方向２）。

【０１３４】 マーカーＭ２の配列（１２０ｐｂ）（配列番号９）：

【配６】

【０１３５】 プライマ：

【配７】

【０１３６】 マーカーＭ１及びＭ２を同時に増幅するため以下の条件が利用される： − Ｐｒｏｍｅｇａ １０×緩衝液 １．５μｌ − Ｐｒｏｍｅｇａ ＭｇＣｌ_２ １．５μｌ − ｄＮＴＰ（５ｍＭ） ０．６μｌ − プライマＭ１−１（１０μＭ） ０．１５μｌ − プライマＭ１−４（１０ｍＭ） ０．１５μｌ − プライマＭ２−１（１０ｍＭ） ０．１５μｌ − プライマＭ２−２（１０ｍＭ） ０．１５μｌ − Ｈ_２Ｏ ７．７４μｌ − Ｔａｑポリメラーゼ ０．０６μｌ − ＤＮＡ（５ｎｇ／μｌ） ３μｌ ＰＣＲプログラム − ９４℃で５分 − ９４℃で１分 − ５９℃で３０秒 − ７２℃で１分 − ３５サイクル − ７２℃で５分 − ４℃で１０分

【０１３７】 マーカーＭ２は、その他のパラメータが不変の状態で、６０．５℃のハイブリ
ダイゼーション温度で唯一増幅可能である。これらの増幅条件で、マーカーＭ２
は、感受性の親（ＩＲ６４）におけるバンドの存在及び親（Ｇｉｇａｎｔｅ）に
おけるバンドの不在により特徴づけされる優性マーカーとして現われる。

【０１３８】 例１１： 耐性の標識づけ候補であるＡＦＬＰマーカーをその間隔内で順序づ
けするためのマーカーＭ１とＭ２の間の組換え型耐性植物個体群の創作 ＲＹＭＶウイルス（菌株ＢＦ１）で人工的に７５０の個体Ｆ２（ＩＲ６４×Ｇ
ｉｇａｎｔｅ）を接種した。症候のない植物、つまり１８８の個体を温室内で床
替えした。その後、ＥＬＩＳＡ試験及び子孫試験に基づく補足的試験により、５
０の感受性植物の最後の分画を除去することができた。残りの１３８の植物及び
耐性についての同型接合体を、前述のように２つのマーカーＭ１及びＭ２につい
て遺伝子型を系統的に特定した。かくして４５の個体（Ｍ１に対する組換え体３
８；Ｍ２に対する組換え体７）及び２つの２重組換え体を選択した。これらの組
換え型個体は、Ｍ１とＭ２の間の間隔内のＡＦＬＰマーカーの順序づけに役立っ
た。

【０１３９】 結果は下表６にまとめられている：

【表６】

【０１４０】 例１２：耐性に対する新しい候補マーカーを選択するためのＡＦＬＰマーカー
のスクリーニング ３つのヌクレオチドによって各々規定される合計３２８のＥｃｏＲＩ／Ｍｓｅ
Ｉプライマ対を、以前に規定されたプロトコルに従って利用した。これらのプラ
イマは下表７に記されている。

【０１４１】

【表７】

【０１４２】

【表８】 このスクリーニングにより、単数又は複数の多型バンドを、感受性の親及び／
又は耐性の親におけるそれらの出現に応じて同定することができた。２３のプラ
イマ対が、感受性又は耐性Ｆ２のＤＮＡプールにより確認された親の間の多型の
同定を可能にした。表は、イネの黄色斑入りウイルスに対する高い耐性の遺伝子
座に結びつけられたＡＦＬＰマーカーのＭ１−Ｍ２間隔内の位置を要約し、示し
ている。

【０１４３】

【表９】

【０１４４】 プールを構成する個体の各々についての個別の確認後、親ＩＲ６４に存在する
バンドに対応する候補マーカーを、例１１で同定された組換え体について試験す
ることができる。かくして、間隔Ｍ１−Ｍ２に属するものとして９つのマーカー
を確認した。表９は、Ｆ２（ＩＲ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ）の耐性下位個体群から
の感受性及び及び耐性ＤＮＡプールの比較により同定されたＡＦＬＰマーカーの
間隔Ｍ１−Ｍ２内の順序づけを示している。

【０１４５】

【表１０】

【０１４６】 耐性の親に由来する１４のバンドも同様に同定され、個体群Ｆ２（ＩＲ６４×
Ｇｉｇａｎｔｅ）内で生成される組換え型について確認されるか又はされないこ
とになる。

【０１４７】 例１３：マイクロサテライトマーカーを用いたＲＹＭＶ耐性の遺伝子座の定着 マーカーＭ１が遺伝子地図（ＩＲ６４×Ａｚｕｃｅｎａ、例９）の染色体４上
に置かれた時点で、（６）で規定されこの染色体に属するマイクロサテライトマ
ーカーを、ＲＹＭＶに対する耐性遺伝子座のマッピングを練成するために利用し
た。（１）及び（６）で規定した実験条件下で、ＲＭ２４１、ＲＭ２５２（１）
、ＲＭ２７３及びＲＭ１７７（６）といったマイクロサテライトマーカーを試験
した。親ＩＲ６４とＧｉｇａｎｔｅの間で多型でないマーカーＲＭ１７７を除い
て、マーカーＲＭ２４１、ＲＭ２５２、ＲＭ２７３を、ＲＹＭＶに対する耐性に
ついて並行して評価される個体群Ｆ２（ＩＲ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ）についてマ
ッピングした。１８３のＦ２個体についての結果により、ＲＹＭＶ耐性遺伝子を
枠取りする２つのマイクロサテライト遺伝子座ＲＭ２５２及びＲＭ２７３で限定
された約３．６ｃＭの間隔を特徴づけすることができた。

【０１４８】 例１４： 耐性遺伝子座を支持する間隔のファインマッピング及び間隔Ｍ１−
Ｍ２内の耐性マーカーの順序づけ マーカーＭ１及びＭ２のための４２の耐性及び組換え型個体Ｆ２（ＩＲ６４×
Ｇｉｇａｎｔｅ）を、例１３に同定されたマイクロサテライトマーカーについて
特徴づけした。利用可能な個体Ｆ２（ＩＲ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ）の合計数（３
２１）についての分離状態のマーカーのマッピングにより、間隔Ｍ１−Ｍ２特に
３．６ｃＭと評価されている間隔ＲＭ２５２−ＲＭ２７３のマーカー間の距離及
び順序が確認される（図１０（ｂ））。マーカーＭ１及びＭ２のための４５の耐
性及び組換え型個体ＦＦＦ２（ＩＲ６４×ＧＩＧＡＮＴＥ）は、例１２で同定さ
れたＡＦＬＰマーカーの順序の確認を可能にする。マーカーＡＦＬＰ ＥＡＣＧ
／ＭＡＣＡは、間隔ＲＭ２５２−ＲＭ２７３内に含まれた状態にとどまり、ＲＹ
ＭＶ耐性遺伝子座に最も近いマーカーを表わす（表９）。合計して試験対象の３
２１の個体Ｆ２のうち、ＲＹＭＶに対する耐性遺伝子座のいずれかの側で組換わ
された２０の個体が残っており、これらは、有利には、最も近いマーカーを同定
するため及び／又は耐性遺伝子をクローニングするために利用することができる
。

【０１４９】 例１５： マーカーにより補助される耐性のトランスファ 耐性遺伝子座に近いマーカーを、ＲＹＭＶのウイルスにきわめて高い感受性を
もつ灌漑品種について試験した（品種ＢＧ９０−２、Ｂｏｕａｋｅ１８９、Ｊａ
ｙａ）。３つのマーカー（Ｍ１、ＲＭ２４′、ＲＭ２５２）はこれら３つの品種
とＧｉｇａｎｔｅ品種の間の多型を提示し、このため、感受性遺伝子型の中に耐
性をトランスファするためのこれらのマーカーの利用を考慮することが可能とな
る。これらの品種内での耐性の実験的トランスファは、第２の再交雑レベルまで
実施した。各交雑時点で、植物を、Ｇｉｇａｎｔｅ品種由来のマーカーの存在に
ついて確認し、Ｆ２についての子孫試験により耐性を検査する。結果は表１０に
記されている。

【０１５０】

【表１１】

【０１５１】 例１６：ＲＹＭＶの感染サイクルに不可欠な標的タンパク質を捕捉するための エサとしてのＲＹＭＶウイルス又はウイルス／リボヌクレオタンパク質の利用
Ｉ．独立したｐＨ及びカルシウムＲＹＭＶの３つのイソ型のｉｎ ｖｉｔｒｏ及
びｉｎ ｖｉｖｏ での特徴づけ イオン交換クロマトグラフィを用いて３つのイソ型が記述され、この分離の原
理は、粒子の安定性に基づいている。

【０１５２】 緻密な型は、カルシウム２価イオンにより遮断され粒子をｐＨに対し感受性の
ないものにするため、最も安定している。この型はイオン交換樹脂をひっかけず
、損傷なくカラム内を横断する。これらの過渡的な型は初めて記述されたもので
あり、緻密な粒子又は膨張した粒子の結果として得られる。これらの粒子はカル
シウムが無く、そのためｐＨに対し感受性あるものとなっている。かくして酸性
ｐＨでは、これらの粒子は緻密に保たれ、一方塩基性ｐＨでは膨張する。クロマ
トグラフィ緩衝液中のｐＨの修正により、これら２つのイソ型（緻密及び過渡的
）を区別することができる。塩基性ｐＨでは、過渡的粒子はクロマトグラフの圧
力（約１０００〜１５００ｐｓｉ）に耐えられないことから、瞬間的に膨張し、
カラム内で爆発する。この解離から結果としてもたらされるカプシドタンパク質
はイオン交換樹脂にひっかかる。かくして緻密型は塩基性ｐＨで精製される。膨
張型は、不安定であることから分離が非常に困難であるが、２価イオンキレート
化剤（ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ）の存在下でそして塩基性ｐＨでは緻密粒子から生
成され得る。かくしてこの処理の後、全ての粒子は不安定となり、カラム内で爆
発する。

【０１５３】 本発明に従うと、標的タンパク質を捕捉するために以下のものを利用する。 Ｉ．約６時間３ｍＭのＣａＣｌ_２とｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中で
遮断しｐＨ８．０でクロマトグラフィにより精製した後に得られる緻密な粒子。
感染した植物からウイルスを抽出した後又は（Ｂｉｏｃａｄにより精製された）
緻密粒子の露呈の後に分離された標的タンパク質、及びウイルス感受性品種（Ｉ
Ｒ６４）の細胞懸濁液から抽出されたタンパク質。 ＩＩ．過渡的粒子は、ＥＤＴＡ及び酸性ｐＨの存在下で緻密粒子から得られる。
ＩＩＩ．膨張粒子及びリボ核複合体は、塩基性ｐＨで過渡的粒子から得られる。
このｐＨで、リボヌクレオタンパク質複合体は、膨張した粒子（きわめて不安定
）から自発的に得られる。

【０１５４】 ＩＩ／ 標的タンパク質を捕捉するための方法 − 感染した感受性植物（ＩＲ６４）から抽出されたウイルスから 結果は図１２に提示されている。図１２Ａ：ｐＨ８．５での注入無しの対照ク
ロマトグラム； 図１２Ｂ：方法１（０〜２５５０ｍＭのＮａＣｌ勾配）、ｐＨ
８．５，１．７μｇ／μｌでの１００μｌのウイルス注入後のクロマトグラム；
図１２ｃ：１０ｍＭのｐＨ５の酢酸ナトリウム及び３ｍＭのＣａＣｌ_２中で約
１４時間透析された１００μｌのウイルスの注入後のクロマトグラム； 図１２
Ｄ：方法２（０〜１５００ｍＭ及び１５００〜２５５０ｍＭで０のＮａＣｌ勾配
、例の後の方法参照）、ｐＨ８．５，１．７μｇ／μｌで（未透析の）ウイルス
１００μｌの注入後のクロマトグラム。分画の収獲（１ｍｌ），４℃で２時間８
００μｌのアセトン沈降、１３０００回転／分で２０分の遠心分離、５分間Ｓｐ
ｅｅｄ−ｖａｃｋでの沈渣乾燥、そしてｐＨ７．４，１０ｍＭのＴｒｉｓ−ｂａ
ｓｅ緩衝液約４０μｌ中での再懸濁。標本は、冷凍庫に−２０℃で保存される。

【０１５５】 方法１（図１３Ａ），ｐＨ：８．０でＢｉｏｃａｄ中でウイルス１７０μｇを
注入した後、異なる分画を収獲し、アセトンで沈降させ、Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ１
０ｍＭの緩衝液、ｐＨ７．４中に再度とり込み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル上に
被着させ、その後、非判別ＭａｂＥ．５（Ｄｅｎｉｓ Ｆａｒｇｅｔｔｅ，ＩＲ
Ｄ）抗カプシドタンパク質モノクローナル抗体を用いてゲルを、硝酸銀（Ｂｉｏ
ｒａｄ）（図１３Ｂ）及びウェスタンブロット法（図１３Ｃ）で顕示させる。

【０１５６】 免疫検出されなかったバンドは、潜在的に有利である植物タンパク質に対応し
ている。すなわち、５，２４，４２，４９，５９，６６，７０，７７及び２１０
ｋＤａのタンパク質である。

【０１５７】 − 抽出され、（１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０及び３ｍＭのＣａＣｌ _２ 中で約１４時間）透析された次に、Ｂｉｏｃａｄ＝分画２（Ａ２）上で精製され たウイルスから 、標的タンパク質を捕えるためイネの細胞懸濁液タンパク質（Ｉ
Ｒ６４）とウイルスを接触させる。

【０１５８】 分画２の精製と純度の確認（図１４Ａ）。分画２では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
及び硝酸銀での顕示の後に検出されたサブバンドがもはや存在しないため、ウイ
ルスは純粋である（図１４Ｂ及び１４Ｃ，分画Ａ２；図１３Ｂ及び１３Ｃ内のＢ
２と比較のこと）。３５０μｇのウイルス及び８６０μｇの細胞懸濁液（ＩＲ６
４）から抽出された８６０μｇのタンパク質を１２時間４℃で異なるインキュベ
ーション溶液内でインキュベートした後（図１５），標本をＮａＣｌを用いて又
はＮａＣｌ無しで抽出する。その後標本をＢｉｏｃａｄ上で精製し、アセトンで
の沈殿後のウイルス分画（分画２及び３）を硝酸銀で着色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ
大ゲル上で分析し（図１５Ａ），Ｍａｂ Ｅ．５で免疫検出する（図１５Ｂ）。

【０１５９】 標的タンパク質（ＭａｂＥ．５で免疫検出されなかったもの）は、感染した葉
から分離された細胞と類似した分子量を有する：これらのタンパク質は、条件Ｄ
２（１０ｍＭのＤＴＴ及び０．３ＭのＮａＣｌでｐＨ８．０）内で特に目に見え
る。すなわちこれは、２４，４５，５１，５７，６３，８５のタンパク質及び１
２０ｋＤａより上にあるタンパク質である。

【０１６０】 ＩＩＩ／ 標的タンパク質のクローニング及び新しいタイプの耐性遺伝子の同
定のための利用 分離された標的タンパク質を、そのＮ末端部分において配列決定する（２４，
４２−４５ｋＤａのタンパク質，５７，６３及び８５ｋＤａ前後のタンパク質及
び１２０ｋＤａ以上のタンパク質）。変性された５′プライマを同定する。ｃＤ
ＮＡのクローニングを、ｉｎｄｉｃａ（ＩＲ６４及びＧｉｇａｎｔｅ）、温暖ｊ
ａｐｏｎｉｃａ（０２４２８）、熱帯Ｊａｐｏｎｉｃａ（Ａｚｕｃｅｎａ）及び
ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ（ＴＯＧ５６８１及びＴＯＧ５６７３）の各品種のバンク
内で実施する。その後、従来の技術（相同性、推定上の機能及び多型）を利用し
て配列分析を行なう。

【０１６１】 ＩＶ／ 材料と方法 ウイルスの抽出： 抽出は、以下の作業から成る段階を用いて実施される： − ウイルス感染を受けた植物（症候がはっきりしていなければならない）の新
鮮な葉（又は−８０℃で保存されたもの）を収穫する。感染期間は、利用される
イネの品種により左右される（寛容な品種によると、より大量のウイルスを獲得
することが可能となる）。 − 細かい粉末を得るため液体窒素中で葉を粉砕し、低温保存する。 − ０．２％のβ−メルカプトエタノールを加えた抽出用緩衝液（酢酸ナトリウ
ム^＊０．１Ｍ ｐＨ：５．０）（≒粉砕した葉１００ｇに対し１リットルの緩衝
液）を添加し、２分間撹拌する。 − 得られた懸濁液を「寒冷紗」タイプの布を用いてろ過し、布の中に残った沈
渣を手で圧搾する。 − クロロホルム１体積を添加し、２分間撹拌する。 − ４℃で１０分間１００００ｇで遠心分離し、上部水相を回収する。 − 水相の体積を評価し、最終濃度が０．３ＭとなるようにＮａＣｌを添加する
。（低温室で）溶解させ、最終濃度が６％となるようＰＥＧ８０００を添加する
。 − 一晩攪拌下で放置する（ウイルスの沈殿）。 − ２５０ｍｌ入りジャー内で４℃で３０分間２２０００ｇで懸濁液を遠心分離
に付す。 − 上清を廃棄し、ウイルス沈渣を数分間空気乾燥させる。１ｍｌの抽出用緩衝 液 （１）により各ジャーの沈渣を再び取り出し、低温で再度懸濁状態にする。
− 得られた分画をまとめ、０．５ｍｌの緩衝液でジャーを洗い流し、この緩衝
液を先行する分画に再び添加する。 − 固形不純物を除去し上清を回収するために１２０００ｇで１０分間遠心分離
する。 − 希釈後に、２５９ｎｍの分光光度計で秤量し、ウイルス濃度を計算する。 μｇ／μｌ単位の Ｄ．０．２５９ｘｄｉｌｕｔｉｏｎ／６．５ なお式中６．５は、１μｇ／μｌでのウイルス懸濁液のＤ．０．２５９に対応
する。

【０１６２】 Ｄ．０．２５９／Ｄ．０．２８０比≧１．５は、ウイルスの優れた精製を示す
。そうでなければスクロース勾配による精製を実施する。

【０１６３】 ^＊溶液Ａ：酢酸２Ｍ（１０００ｍｌ中１１５．５）及び溶液Ｂ：酢酸ナトリウ
ム２Ｍ（１０００ｍｌ中１６４ｇのＣ_２Ｈ_３Ｏ_２又は２７２ｇのＣ_２Ｈ_３Ｏ_２Ｎ
ａ，３Ｈ_２Ｏ）。 合計１０００ｍｌ中１４．８ｍｌの溶液Ａ＋３５．２ｍｌの溶液Ｂ。まず第１
に溶液Ｂを添加し、次にｐＨ５となるまで漸進的に溶液Ａを添加する： 必要と
あらば溶液ＡでｐＨを調製する。

【０１６４】 イオン交換クロマトグラフィ 分画収集装置Ｇｉｌｓｏｎ Ｆ−２５０を伴うクロマトグラフＰｅｒＳｅｐｔ
ｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＢＩＯＣＡＤ ７００Ｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａ
ｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）。１００μｌのウイルス標本を、１０μｍのＰＯＲＯＳ粒子
を含むカラムである予めパッケージングされたＰＯＲＯＳイオン交換アニオン
カラム（ＨＱ／Ｈ，４．６ｍｍＤ／１００ｍｍＬ，ＣＶ＝１．７ｍｌ）上に注入
し精製する。利用する溶出緩衝液は、約１５００ｐｓｉの内部圧について、６ｍ
ｌ／分の流量で、ｐＨ６又はｐＨ８．５の１５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｐｒｏ
ｐａｎｅ： Ｔｒｉｓベース（５０／５０，Ｓｉｇｍａ）で構成されている。注
入に先立ち、カラムを溶出用緩衝液で平衡化する。ウイルス注入後、カラムをま
ずは溶出用緩衝液で、次に３分間０〜２．５５ＭのＮａＣｌ勾配（方法１）又は
４分間０〜１５５０ｍＭのＮａＣｌ勾配そしてその後３０秒間１５００ｍＭ〜２
５５０ｍＭの勾配（方法２）で洗浄する。最後に、２５５０ｍＭのＮａＣｌ濃度
で溶出用緩衝液での最後の段階を実施する。吸光度を２６０〜２８０ｎｍで記録
する。同じ標本の３回の注入後、観察された最大の変動は約３％である。ウイル
スについての最小検出レベルは約７ｎｇ／μｌである。１ｍｌの分画を収集し、
注入に先立ち２０ｍＭのリン酸緩衝液中で４℃で約１４時間透析する。標本を電
子顕微鏡で検査する。

【０１６５】 細胞懸濁液 種子を脱穀し、最初に１分間エタノール７０（ｖ／ｖ）中で除染し、次により
良く接触させるため部分真空を作るながら２．６％の次亜塩素酸ナトリウム溶液
中で４５分間除染する。

【０１６６】 無菌水で４回洗浄した後、（パラフィルムで閉じた）ペトリ皿の中でゲロース
培地（ＭＳ培地）上に種子を被着させ、２５℃の暗所に置く。

【０１６７】 ６カ月後、胚から発達したカルスを、細胞増殖のために利用される液体培地内
で培養する（Ｅｒｌｅｎによる、複数のカルスに由来する複数の小球状形成）。

【０１６８】 ３週間後、液体培地中で培養したカルスは繁殖しており、懸濁液は補充される
。その後１０〜１５日毎に懸濁液を補充し、タンパク質を抽出する。

【０１６９】 イネの細胞懸濁液用培地 ＳＺ培地（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９８）。 多量要素 Ｘ１０（１リットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１００ｍｌの母液 ＫＮＯ_３ ４０．００ｇ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ３．３０ｇ ＭｇＳＯ_４，７Ｈ_２Ｏ ２．４６ｇ ＮａＨ_２ＰＯ_４ ２．７６ｇ （２Ｈ_２Ｏ：３．１２ｇ−無水物：２．４０ｇ） ＣａＣｌ_２，２Ｈ_２Ｏ １．４７ｇ Ｂ５ 微量要素 Ｘ１００（１リットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１０ｍｌの母液 ＭｎＳＯ_４，７Ｈ_２Ｏ １３４９ｍｇ ＺｎＳＯ_４ １１２ｍｇ（７Ｈ_２Ｏ：２００ｍｇ） ＫＩ ７５ｍｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４，２Ｈ_２Ｏ ２５ｍｇ Ｈ_３ＢＯ_３ ３００ｍｇ ＣｕＳＯ_４，５Ｈ_２Ｏ ２．５ｍｇ ＣｏＣｌ_２，６Ｈ_２Ｏ ２．５ｍｇ Ｂ５ ビタミン Ｘ１０００（１００ミリリットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１ｍｌの母液 ニコチン酸 １００ｍｇ チアミン−ＨＣｌ １０００ｍｇ ピリドキシン−ＨＣｌ １００ｍｇ ミオ−イノシトール １０ｇ プロリン 最終１リットル中 ５００ｍｇ グルタミン 最終１リットル中 ５００ｍｇ カゼインの酵素加水分解産物 最終１リットル中 ３００ｍｇ 鉄ＥＤＴＡ Ｘ１０００（１リットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１ｍｌの母液 そうでなければ ＦｅＳＯ_４，７Ｈ_２Ｏ ２．８ｇ Ｎａ_２ＥＤＴＡ ３．７ｇ ホルモン２．４Ｄ Ｘ１０００ 最終溶液１リットルあたり１ｍｌの母液 ２ｍｇ／ｍｌの原液 ３０ｇ／Ｌのマルトース及びスクロース（２４２８について） ｐＨ５．８

【０１７０】 イネのカルス発生誘発培地 Ｍ．Ｓ．（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｔ．＆Ｓｋｏｏｇ Ｆ．１９６２） 多量要素 Ｘ１０（１リットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１００ｍｌの母液 ＫＮＯ_３ １９．００ｇ ＮＨ_４ＮＯ_３ １６．５０ｇ ＭｇＳＯ_４，７Ｈ_２Ｏ ３．７０ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４ １．７０ｇ ＣａＣｌ_２，２Ｈ_２Ｏ ４．４０ｇ 微量要素 Ｘ１００（１リットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１０ｍｌの母液 ＭｎＳＯ_４，Ｈ_２Ｏ １６９０ｍｇ ＺｎＳＯ_４，７Ｈ_２Ｏ ８６０ｍｇ ＫＩ ８３ｍｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４，２Ｈ_２Ｏ ２５ｍｇ Ｈ_３ＢＯ_３ ６２０ｍｇ ＣｕＳＯ_４，５Ｈ_２Ｏ ２．５ｍｇ ＣｏＣｌ_２，６Ｈ_２Ｏ ２．５ｍｇ ビタミン Ｘ１０００（１００ミリリットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１ｍｌの母液 ニコチン酸 ５０ｍｇ チアミン−ＨＣｌ １０ｍｇ ピリドキシン−ＨＣｌ ５０ｍｇ ミオ−イノシトール １０ｇ グリシン ２００ｍｇ 鉄ＥＤＴＡ Ｘ１０００（１リットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１ｍｌの溶液 そうでなければ ＦｅＳＯ_４，７Ｈ_２Ｏ ２．８ｇ Ｎａ_２ＥＤＴＡ ３．７ｇ ホルモン２．４Ｄ Ｘ１０００ 最終溶液１リットルあたり１ｍｌの母液 ２ｍｇ／ｍｌの原液 ３０ｇ／ｌのマルトース又はスクロース ｐＨ５．８ ＰＨＹＴＡＧＥＬ ２．５ｇリットル ＮＢ（カルス誘発及び継代培養用培地） Ｎ６多量要素 Ｘ１０（１リットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１００ｍｌの母液 ＫＮＯ_３ ２８．３０ｇ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ４．６３ｇ ＭｇＳＯ_４，７Ｈ_２Ｏ １．４０ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４ ４．００ｇ ＣａＣｌ_２，２Ｈ_２Ｏ １．６５ｇ Ｂ５ 微量要素 Ｘ１００（１リットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１０ｍｌの母液 ＭｎＳＯ_４，７Ｈ_２Ｏ １３４９ｍｇ ＺｎＳＯ_４ １１２ｍｇ（７Ｈ_２Ｏ：２００ｍｇ） ＫＩ ７５ｍｇ Ｎａ_２ＭｏＯ_４，２Ｈ_２Ｏ ２５ｍｇ Ｈ_３ＢＯ_３ ３００ｍｇ ＣｕＳＯ_４，５Ｈ_２Ｏ ２．５ｍｇ ＣｏＣｌ_２，６Ｈ_２Ｏ ２．５ｍｇ Ｂ５ビタミン Ｘ１０００（１００ミリリットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１ｍｌの母液 ニコチン酸 １００ｍｇ チアミン−ＨＣｌ １０００ｍｇ ピリドキシン−ＨＣＬ １００ｍｇ ミオイノシトール １０ｇ 又は１１．２のガンボーグのビタミン 最終濃度になるよう以下のものを添加する。 プロリン 最終１リットル中 ５００ｍｇ グルタミン 最終１リットル中 ５００ｍｇ カゼイン酵素加水分解産物 最終１リットル中 ３００ｍｇ 鉄ＥＤＴＡ Ｘ１０００（１リットルあたり） 最終溶液１リットルあたり１ｍｌの母液 そうでなければ ＦｅＳＯ_４，７Ｈ_２Ｏ ２．８ｇ Ｎａ_２ＥＤＴＡ ３．７ｇ 又は、４．１５ｇ／ｌの第２鉄ナトリウム塩ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｅ−６７
６０） ホルモン２．４−Ｄ Ｘ１０００ 最終溶液１リットルあたり１ｍｌの母液 ２ｍｇ／ｍｌの原液 ３０ｇ／ｌのマルトース及びスクロース ＰＨＹＴＡＧＥＬ ２．６ｇ／リットル ｐＨ ５．８

【０１７１】 タンパク質の抽出 細胞懸濁液のタンパク質の抽出 ・ 細胞懸濁液のための抽出用緩衝液：

【０１７２】

【表１２】

【０１７３】 ＨＣｌでｐＨを７．４に再調整する ・ 殺菌済みのフォンテヌブロー砂と共に乳鉢内に５ｇの細胞懸濁液を入れる。 ・ １ｍｌの緩衝液を添加し、粉砕し、その後４ｍｌの緩衝液を添加する。 ・ かくしてイネ品種を変性条件（ＳＤＳを伴う緩衝液）及び非変性条件（トリ
トンを伴う緩衝液）内で抽出する。３℃ １５０００ｇで１５分の遠心分離に付
す。 ・ １．５ｍｌ入り試験管内で１ｍｌの上清アリコートを回収し、これを直ちに
−８０℃で保管する。 全ての段階は、可能な限り氷中でかつできるかぎり高速で行なわれる。

【０１７４】 タンパク質の秤量 ・ 変性及び未変性緩衝液の各々についてＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）を用いて１０
００μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの基準スケールを作る。 ・ ４つの標本をそれぞれの緩衝液中で５倍に希釈する。 ・ 各々の標本及び基準スケール点５０μｌに対して２．５ｍｌのＣｏｏｍａｓ
ｓｉｅ（登録商標）タンパク質検定試薬溶液を添加し混合する。 ・ 使い捨て槽内で、分光計で５９５ｎｍでの読取りを行なう。

【０１７５】 膜作製のための作業様式 アクリルアミドゲル（１９：１又は２９：１）を以下の要領で調製する： １２％のＳＤＳ−Ｐａｇｅアクリルアミドミニゲル １２％のランニングゲル ゲル１つあたり １ｍｍ ４０％のビス−アクリルアミド アクリルアミド １．５ｍｌ トリスＨＣｌ １．５Ｍ ｐＨ８．８ １．３ｍｌ ＳＤＳ ２０％ ２５μｌ 過硫酸アンモニウム １０％ ５０μｌ Ｔｅｍｅｄ ５μｌ Ｈ_２Ｏ ２．２ｍｌ ５％のスタッキングゲル ゲル１つあたり１ｍｍ ４０％のビスアクリルアミド アクリルアミド ２５０μｌ トリスＨＣｌ １Ｍ ｐＨ６．８ ２５０μｌ ＳＤＳ ２０％ １０μｌ 過硫酸アンモニウム １０％ ２０μｌ Ｔｅｍｅｄ ２μｌ Ｈ_２Ｏ １．５ｍｌ

【０１７６】 ・ 平板の高さ２ｃｍのところまでランニングゲルを流し、次にブタノール１で
覆う（空気接触を回避することによって重合を容易にする）。 ・ 重合（１５〜３０分）後、Ｗｈａｔｍａｎｎ紙でブタノールを引き出し、そ
の後スタッキングゲルを流し、コームを設置する。 ・ 重合後、泳動緩衝液でウェルを洗浄し、その後１体積のローディング緩衝液 を用いて９８℃で５分間予め変性させた標本を充てんする。 ・ ブルーがランニングゲル内に戻るまで８０Ｖで泳動させ、その後１００Ｖま
で増大させ；ブルーがゲルから出た時点で泳動を停止させる（約５ｋＤａ）。 ・ トランスファ緩衝液内で１時間１００Ｖでニトロセルロース膜０．４５μ（
ＢＩＯ−ＲＡＤ，参照番号１６２０１１５）上にゲルをトランスファする。 ・ 利用するまで冷蔵庫内に湿潤膜を保存する。

【０１７７】 抗体利用のための作業様式 ポリクローナルＭＡＬＩ（Ｐａｂ Ｍａｌｉ） ・ インキュベーション／洗浄段階は全て、≒２３℃の室温で２０／２５ＲＥＶ
／分の速度でＰｌａｔｆｏｒｍ Ｓｈａｋｅｒ ＳＲＰ６（Ｓｔｕａｒｔ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）タイプのプラットフォームシェーカー上で行なわれる。 ・ インキュベーション／洗浄段階のために利用される溶液体積は２０ｍｌであ
り、１１２ｍｍ×７７ｍｍのプラスチックケース内で行なわれる。 ・ 膜は、遮断溶液で１時間、インキュベートされる。 ・ 同じ遮断溶液中で１０００倍希釈した第１のポリクローナルＭａｌｉ抗体（
抗ＲＹＭＶ）を用いて１時間インキュベーションする（溶液を回収し、抗体を添
加し、撹拌し、膜上に戻す）。 ・ ＴＢＳ ｐＨ７．５中で５分間×６回、洗い流す。 ・ 新しい遮断溶液中で４００００倍希釈された第２のＨＲＰ−抗ウサギ接合抗
体を用いて１時間インキュベートする。 ・ ＴＢＳ ｐＨ７．５中で５分間×６回洗い流す。 ・ Ｓａｒａｎフィルム上に膜を置き、２つの溶液を等量ずつ混合して（小型膜
１枚につき合計３ｍｌ）調製されたＷｅｓｔ Ｐｉｃｏ溶液を均質に注ぎ込む（
膜が充分覆われていなくてはならない）。 ・ ５分間（照明下で）待ち、余剰の基質を除去し、Ｓａｒａｎ内に膜を包み、
次に（暗所で）フィルムを上に置き、１分〜１時間露光する。 ・ ｐＨ６．５及びｐＨ８．０でのハイブリダイゼーションについては、あらゆ
るハイブリダイゼーション及び洗浄段階のためにｐＨ６．５のＭＥＳ緩衝液 及
びｐＨ８．０のＴＡＲＳ緩衝液を利用して同じ要領で作業する。

【０１７８】 抗体の利用のための作業様式 モノクローナルＥ（ＭａｂＥ） ・ インキュベーション／洗浄段階は全て、≒２３℃の室温で２０／２５ＲＥＶ
／分の速度でＰｌａｔｆｏｒｍ Ｓｈａｋｅｒ ＳＲＰ６（Ｓｔｕａｒｔ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）タイプのプラットフォームシェーカーで行なわれる。 ・ インキュベーション／洗浄段階のために利用される。溶液体積は２０ｍｌで
あり、１１２ｍｍ×７７ｍｍのプラスチックケース内で行なわれる。 ・ 膜は、遮断溶液で１時間、インキュベートされる。 ・ 同じ遮断溶液中で１００倍又は１０００倍に希釈した第１のモノクローナル
Ｅ抗体（抗ＲＹＭＶエピトープ）を用いて１時間インキュベーションする（溶液
を回収し、抗体を添加し、撹拌し、膜上に戻す）。 ・ ＴＢＳ ｐＨ７．５中で５分間×６回、洗い流す。 ・ 新しい遮断溶液中で４００００倍希釈された第２のＨＲＰ−抗マウス接合抗
体を用いて１時間インキュベートする。 ・ ＴＢＳ ｐＨ７．５中で５分間×６回洗い流す。 ・ Ｓａｒａｎフィルム上に膜を置き、２つの溶液を等量ずつ混合して（小型膜
１枚につき合計３ｍｌ）調製されたＷｅｓｔ Ｐｉｃｏ溶液を均質に注ぎ込む（
膜が充分覆われていなくてはならない）。 ・ ５分間（照明下で）待ち、余剰の基質を除去し、Ｓａｒａｎ内に膜を包み、
次に（暗所で）フィルムを上に置き、１分〜１時間露光する。 ・ ｐＨ６．５及びｐＨ８．０でのハイブリダイゼーションについては、あらゆ
るハイブリダイゼーション及び洗浄段階のためにｐＨ６．５のＭＥＳ緩衝液 及
びｐＨ８．０のＴＡＲＳ緩衝液を利用して同じ要領で作業する。

【０１７９】 溶液 ・ ローディング緩衝液２Ｘ 溶液２Ｘの濃度 溶液２Ｘ１０ｍｌあたりの製品量 １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １Ｍ ｐＨ
６．８ １ｍｌ ２００ｍＭ ＤＴＴ ０．３０８ｇ ４％ＳＤＳ ２０％のＳＤＳ ２ｍｌ ０．２％ ブロモフェノールブルー ２０ｍｇ ２０％ グリセロール ２ｍｌ Ｈ_２Ｏ １０ｍｌ充分量 ・流動緩衝液 １０Ｘ： 溶液１０Ｘの濃度 溶液１０Ｘ１Ｌあたりの製品量 ２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ ３０．２８５ｇ ２．５Ｍ グリシン グリシン １８７．６７ｇ ・トランスファ緩衝液 Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ ２．４２ｇ グリシン １１．２６ｇ メタノール １００ｍｌ Ｈ_２Ｏ １リットル充分量 ・ ポリクローナル遮断溶液：適切な緩衝液中の３％の脱脂粉乳Ｂ１０−ＲＡＤ
（ｒｅｆ：１７０−６４０４）。 ・ モノクローナル遮断溶液：適切な緩衝液中の０．５％のＢ．Ｓ．Ａ． ・ ＴＢＳ ｐＨ７．５：２．４２３ｇ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ（２０ｍＭ）＋３
．１４６ｇのＮａＣｌ（７５ｍＭ）＋０．５０８ｇのＭｇＣｌ_２，６Ｈ_２Ｏ（２
，ｍＭ）＋０．５ｍｌのＮＰ−４０（０．０５％ Ｔｅｒｇｉｔｏｌ；これは室
温では液体でないため、利用に先立ち加熱要）＋１０００ｍｌ充分量のＨ_２Ｏ。
ＨＣｌでｐＨ７．５に調整 ・ ＭＥＳ ｐＨ６．５：３．９０４ｇＭＥＳ（２０ｍＭ）＋４，９３７ｇＫＣ
ｌ（７５ｍＭ）＋０．５０８ｇＭｇＣｌ_２，６Ｈ_２Ｏ（２．５ｍＭ）＋０．５ｍ
ｌ ｄｅ ＮＰ−４０（０．０５％ Ｔｅｒｇｉｔｏｌ；これは室温では液体で
ないため、利用に先立ち加熱要）＋１０００ｍｌ充分量のＨ_２Ｏ。ＮａＯＨ又は
ＨＣｌでｐＨ６．５に調整する。 ・ ＴＡＰＳ ｐＨ８．０：４，８６６ｇＴＡＰＳ（２０ｍＭ）＋４，９３７ｇ
ＫＣｌ（７５ｍＭ）＋０．５０８ｇＭｇＣｌ_２，６Ｈ_２Ｏ（２．５ｍＭ）＋０．
５ｍｌ ＮＰ−４０（０．０５％ Ｔｅｒｇｉｔｏｌ；これは室温では液体でな
いため、利用に先立ち加熱要）＋１０００ｍｌ充分量のＨ_２Ｏ。ＮａＯＨ又はＨ
ＣｌでｐＨ８．０に調整する。 ・ ポリクローナルＭａｌｉ（Ｐａｂ Ｍａｌｉ）：全ウイルス粒子から得られ
るポリクローナル抗体溶液。１０００倍に希釈要。 ・ モノクローナルＥ（Ｍａｂ Ｅ）：ＲＹＭＶのエピトープから得られたモノ
クローナル抗体溶液。５０倍又は１０００倍に希釈要。 ・ 抗ウサギＨＲＰ接合体： Ｈ_２Ｏ中での復元後０．８ｍｇ／ｍｌの “Ｉｍ
ｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標） Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ，
（Ｈ＋Ｌ），Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ”（ｒｅｆ ＰＩＥ
ＲＣＥ：３１４６０）。４００００倍に希釈要。 ・ 抗マウスＨＲＰ接合体： Ｈ_２Ｏ中での復元後０．８ｍｇ／ｍｌの“Ｉｍｍ
ｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標） Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，（Ｈ
＋Ｌ），Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ”（ｒｅｆ ＰＩＥＲＣ
Ｅ：３１４３０）。４００００倍に希釈要。 ・ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ：“ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標） Ｗｅｓｔ
Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ”（ｒｅｆ ＰＩＥＲＣＥ：３４０８０）。Ｌｕｍｉｎｏ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔ
ｉｏｎとＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを等分量ずつ
混合する（小型膜１枚８ｃｍ×５ｃｍについて合計３ｍｌ）。このように調製し
た溶液は２４時間保存され照明下で利用される。

【参考文献】

（１）Ｃｈｅｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），イネ（Ｏｒｙｚａ Ｓａｔ
ｉｖａＬ）内のゲノム全体を網羅するマイクロサテライト枠組地図の開発。Ｔｈ
ｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ９５：５５３−５６７． （２）Ｐａｎａｕｄ， Ｏ． ｅｔ ａｌ．，（１９９６），マイクロサテライ
トマーカーの開発及びイネ（Ｏｒｚａ ｓａｔｉｖａＬ）内の単純配列長多型（
ＳＳＬＰ）の特徴づけ。Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２５２：５９７−６０７
． （３）Ｗｕ Ｋ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，（１９９３），イネにおけるマイクロサ
テライトの発生量、多型及び遺伝子マッピング。Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ
２４１：２２５−２３５． （４）Ｚａｂｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３），選択的制限フラグメント増
幅：一般的ＤＮＡフィンガプリント法。ＥＰ９２４０２６２９．７． （５）Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５），ＡＦＬＰ，ＤＮＡフィンガプリン
トの最新技術。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２３：４４０７
−４４１４． （６）Ｔｅｍｎｙｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇ
ｅｎｅｔ １００；６９７−７１２．

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドＰＧＥＭＴｅｓｓｙ中のマーカーＭ１のクローニング。 プラスミドの消化により、バンドＭ１に対応する５１０ｐｂのＤＮＡフラグメ
ントが示される。

【図２】 プライマ対（２−４）：２９１ｐｂ；（２−５）：３１０ｐｂ；（１−３）：
２８８ｐｂ；（１−４）：４０６ｐｂ；（１−５）：４２５ｐｂ；（２−３）を
利用することによる、４つのイネ品種（Ａｚｕｃｅｒａ，Ｇｉｇａｎｔｅ，ＩＲ
６４及びＴｏｇ５６８１）におけるマーカーＭ１の増幅。フラグメントＭ１はそ
の他の品種の場合に比べわずかであるがＴｏｇ５６８１でさらに大きくなってい
る。

【図３】 ４つの品種ＩＲ６４，Ａｚｕｃｅｎａ，Ｇｉｇａｎｔｅ及びＴｏｇ５６８１に
おけるマーカーＭ１の配列上の制限部位の同定。

【図４】 ４つの品種（Ａｚｕｃｅｎａ，Ｇｉｇａｎｔｅ，ＩＲ６４及びＴｏｇ５６８１
）についてのプライマ対（１−３），（１−４）及び（１−５）を利用すること
によるＰＣＲ増幅後のＨｐａＩＩ酵素を用いたマーカーＭ１の消化、品種ＩＲ６
４及びＴｏｇ５６８１内に制限部位ＨｐａＩＩが存在することにより、８６ｐｂ
のフラグメントが放出され、それに応じて増幅済みフラグメントのサイズが縮小
される。

【図５】 子孫Ｆ２（ＩＲ６４×Ｇｉｇａｎｔｅ）の感受性及び耐性植物上でのマーカー
Ｍ１の特徴づけ。耐性植物Ｆ２は、唯一の組換え体を除き耐性親のプロフィール
（ＩＲ６４−ＨｐａＩＩ部位の欠如）をもち、２つの組換え体を除いて、感受性
親のプロフィール（ＩＲ６４−ＨｐａＩＩ部位の存在）を有する。

【図６】 ＨＤ個体群（ＩＲ６４×Ａｚｕｃｅｎａ）：ＩＲ６４−Ａｚｕｃｅｎａ−３Ｄ
のＨＤ個体（ＩＲ６４×Ａｚｕｃｅｎａ）におけるマーカーＭ１の分離。

【図７】 マーカーＭ１の位置づけ及び耐性遺伝子座がある間隔の同定を伴う、イネの染
色体４の遺伝子結合地図。

【図８】 ６つの制限酵素ＡｐａＩ，ＫｐｎＩ，ＰｓｔＩ，ＳｃａＩ，ＨａｅＩＩＩによ
り消化される４つの品種（ＩＲ６４，Ａｚｕｃｅｎａ，Ｇｉｇａｎｔｅ及びＴｏ
ｇ５６８１）のＤＮＡを支持する膜上のプローブとして利用されたマーカーＭ１
のハイブリダイゼーション。品種Ｔｏｇ５６８１は、この品種の耐性遺伝子座を
標識づけするために利用され得るＳｃａＩ酵素について、その他の品種とは異な
る制限プロフィールを提示する。

【図９】 再交雑（ＩＲ６４×Ｔｏｇ５６８１）×Ｔｏｇ５６８１に由来しＳｃａＩ酵素
で消化された個体のＤＮＡを支持する膜上でプローブとして利用されるマーカー
Ｍ１のハイブリダイゼーション。この子孫は、ＲＹＭＶに対する耐性について分
離状態にある。感受性個体（５）は、Ｔｏｇ５６８１（異型接合体個体）のバン
ドに結びつけられた全てのＩＲ６４バンドを示す。耐性個体（９）は、組換え型
個体を除いてＴｏｇ５６８１バンドしか示さない。

【図１０】 ＩＲ６４×Ａｚｕｃｅｎａ地図上での、ＲＹＭＶに対する高い耐性をもつ遺伝
子座のマッピング及び定着。

【図１１】 葉の中への接種の後、植物内のＲＹＭＶウイルスの運動。

【図１２】 感染した感受性植物から抽出されたウイルスからのクロマトグラム（図１２の
ＡとＢ）。

【図１３】 ウイルス注入、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル及び抗力プシドタンパク質抗体での免疫
ブロットの後のクロマトグラム。

【図１４】 ウイルス注入、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル及び抗力プシドタンパク質抗体での免疫
ブロットの後のクロマトグラム。

【図１５】 ウイルス注入、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル及び抗力プシドタンパク質抗体での免疫
ブロットの後のクロマトグラム。

【図１６】 感染した感受性植物から抽出されたウイルスからのクロマトグラム（図１２の
ＣとＤ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゲスキエール アラン フランス国 モンペリエ リュ ドゥ ラ ロケチュリエール 1275 Ｆターム(参考） 4B024 AA08 AA11 AA14 BA47 CA04 DA06 EA04 GA17 HA12 4H045 AA10 AA20 AA30 CA01 CA31 EA22 EA53

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物内の原形質連絡を介して循環する病原性ウイルスの認識
   及びターゲティングされた輸送に関与するタンパク質の分離方法において、ウイ
   ルス粒子と前記タンパク質の複合体を内含する標本を、抗カプシドタンパクモノ
   クローナル抗体を利用することにより電気泳動及びウェスタンブロット法に付し
   、免疫検出されなかったバンドを回収することを特徴とする、単離方法。
2. 【請求項２】 複合体が、感染を受けた感受性植物から抽出されたウイルス
   から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ウイルスがＲＹＭＶウイルスであること及び５、２４、４２
   、４９、５９、６６、７０、７７及び２１０ｋＤａのタンパク質を回収すること
   を特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 複合体が、精製されかつ感受性植物の細胞懸濁液のタンパク
   質と接触させられたウイルスから得られることを特徴とする請求項１に記載の方
   法。
5. 【請求項５】 ウイルスがＲＹＭＶウイルスであること及び２４、４５、５
   １、５７、６３、８５及び１２０ｋＤａ以上のタンパク質を回収することを特徴
   とする請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって得られる
   ようなタンパク質。
7. 【請求項７】 植物中の原形質連絡を介して循環する病原性ウイルスに対す
   る耐性遺伝子のクローニングのための、請求項６に記載のタンパク質の応用。
8. 【請求項８】 例えばＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
   Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，細菌性人工染色体）バンクなどの、ＩＲ６４といっ
   たようなイネの品種の１００〜１５０ｋｂのＤＮＡフラグメントから成る１つの
   バンクからスクリーニングされたＢＡＣクローンとハイブリッド形成する能力を
   有する、請求項６に記載のタンパク質に対応するｃＤＮＡにおいて、該ＢＡＣク
   ローンは： − 親品種の子孫である感受性個体そして他方では耐性個体のイネのＤＮＡフ
   ラグメントを選択的に増幅する段階であって、該フラグメントが、まずは消化段
   階そして次に単数又は複数の特異的ヌクレオチドをその末端に有するプライマ相
   補性アダプタを固定するための連結段階（対のプライマのうちの１つは顕示目的
   で標識づけされている）に予め付されている段階； − 変性条件下でゲル電気泳動法により増幅産物を分離する段階；及び − 耐性遺伝子座に遺伝的に結びつけられる多型をもつバンドの同定を目的と
   して、親品種に由来するフラグメントと、耐性子孫に由来するフラグメントの混
   合物及び感受性子孫に由来する混合物を用いて得られた電気泳動プロフィールを
   比較する段階であって、該同定の後には場合によっては、有効性確認として各個
   体についての確認及びマーカーと耐性遺伝子座の間の遺伝子組換え率の計算が行
   なわれる段階、 を含む方法により、イネから同定されたマーカーのＤＮＡ配列を内含するＢＡＣ
   クローンの、マイクロサテライトマーカーＲＭ２５２−ＲＭ２７３間に含まれる
   領域であるｃｏｎｔｉｇ、すなわち重複するＢＡＣクローンアセンブリ、に属し
   ている、ｃＤＮＡ。
9. 【請求項９】 前記多型ＡＦＬＰバンドが、ＲＹＭＶに対する感受性品種内
   及び耐性Ｇｉｇａｎｔｅとこの品種の交雑に由来する感受性植物の分画内で特異
   的に明らかにされていることを特徴とする請求項８に記載のｃＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 前記多型バンドに対抗する前記ＤＮＡが、ＲＹＭＶ耐性遺
    伝子座を支持し、１０ｃＭ未満のセグメントを規定することを特徴とする請求項
    ８又は９に記載のｃＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 前記ＤＮＡ配列が、フラグメントＥｃｏＲＩ−ＭｓｅＩで
    あることを特徴とする請求項１１に記載のｃＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 前記フラグメントが、変性条件下での電気泳動用ゲル内で
    それぞれ５１０ｐｂ及び１４０１ｐｂのサイズをもつことを特徴とする請求項１
    １に記載のｃＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 前記ＤＮＡフラグメントが、耐性遺伝子座をフランキング
    し、この遺伝子座の両側５〜１０ｃＭのところに位置づけされたＤＮＡ配列に対
    応することを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ。
14. 【請求項１４】 配列番号３又は配列番号９を充たすＤＮＡ配列が利用され
    ることを特徴とする請求項１３に記載のｃＤＮＡ。