PT89631B

PT89631B - Processo para a preparacao de camunocina e de composicoes farmaceuticas que a contem

Info

Publication number: PT89631B
Application number: PT89631A
Authority: PT
Inventors: Christopher Milton Math Franco; Sugata Chatterjee; Bimal Naresh Ganguli; Richard Helmut Rupp; Erra Koteswara Satya Vijakumar
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-02-05
Filing date: 1989-02-03
Publication date: 1994-01-31
Also published as: HUT50361A; JPH01273592A; HU203256B; AU622145B2; PT89631A; DK51089D0; EP0327045A1; DK51089A; AU2958989A; ZA89853B; KR890013193A; IN166209B

Description

DE CAHUEOCINA E DE COP.PCSIÇOES

FARMACÊUTICAS QUE A CCNTÊI-1 .

Descrição

GE PP

A presente invenção refere-se a um novo antibiótico designado por camunocina e a um processo para a sua preparação a partir de Streptomyces species Y-84, 36210 (depositado na Deutschen Sammlung fllr

Eilroorganismen em 23.12.1987 sob ο N2. DSM 4329) ou dos seus variantes ou mutantes bem como à utilização de camuno cina como medicamento.

A estirpe Str. sp, Y-84, 3621c foi isolada a partir de uma amostra de solo recolhida em Pune, Maharashtra, índia. É possível obter variantes e mutantes da cultura n®. HIL Y-84, 36210 de modo conhecido por utilização de um agente mutagénico como por exemplo a

- 1 ο

N-meti1-Ν¹-nitrosoguanidina ou a luz ultravioleta, microorganismo S t r. sρ, Y-84, 3621C pertence à ordem dos

Ac t inomycet ales, família dos Streptomycetaceae e género dos Streptomyces.

A estirpe Str. sp. Y-84, 36210 é considerada uma nova estirpe, uma vez que se diferencia por algumas das suas propriedades morfológicas, de cultura e fisiológicas das estirpes conhecidas, conforme se po de verificar através da presente memória descritiva. Uma outra razão para considerar esta uma nova estirpe baseia-se em que esta estirpe produz um novo complexo antibióti co. Sm seguida caracterizado na presente memória descritiva e que é designado por carnunocina, no que constitui o objectivo da presente invenção.

Conforme resulta evidente aa descrição em pormenor da presente invenção apresentada em seguida, a carnunocina é um antibiótico peptídico, diferente no entanto de todos os antibióticos peptídicos conhecidos como a actinomicina, a viridogriseína, a valinomicina, a quinomicina, a ciclosporina, a polimixina ou a anfomici na. Ao contrário dos outros antibióticos peptídicos, ou contendo peptídeos conhecidos, a carnunocina necessita de uma concentração de iões cálcio de pelo menos 10 ml·; a fim de exercer uma acção antibacteriana. Neste aspecto dife rencia-se nitidamente de outros antibióticos conhecidos como anfomicina, glumamicina, zaomicina e do complexo A 21978 C, o qual, com 1,0 mM, apresenta uma necessidade de iões cálcio mais reduzida para apresentar a sua acção antibiótica. A anfomicina, a glumamicina e a zaomicina pertencem à classe dos antibióticos lipopeptídicos cíclicos, que são apresentados no CRC - Handlook of Antibitic compounds, Volume IV, Parte 1, pág. 313-327, Janos Berdy (editor), CRC Press, Boca Raton, Florida (1981). Em J. Antibiotics 4ç, 761-777 (1987) descreve-se um complexo

C 21978 que é igualmente um antibiótico lipopeptídico cí, c1ico.

objectivo da presente invenção é um processo para a preparação do novo complexo antibiótico camunocina, sendo este processo caracterizado por se cultivar a espécie Str, sp. Y-cí4, 3 bz 10 ou um seu variante ou mutante sob condições aeróbicas a uma temperatura de preferência entre cerca de 18 e 37°c num meio nutriente aquoso que contém fontes de carbono e de azoto e substâncias minerais a um pH de preferência entre cerca de 6 e cerca de 9 e por se separar o complexo antibiótico do caldo de cultura.

novo antioiótico da presente invenção é activo in vitro contra um espectro ce microor ganismos Gram-positivos mas apenas na presença de iões cálcio. á igualmente activo como substância imunomocula dora e pode por consequência ser utilizado em medicina humana.

É igualmente um objectivo da presente invenção um processo para o isolamento da espécie Str. sp. Y-84, 3b21O a partir do solo utilizando de modo conhecido uma solução nutriente de preferência com um pH entre cerca de ó, b e cerca de 8,5.

A solução nutriente utilizada para o isolamento dos microorganismos a partir do solo é constituída por fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e agentes de solidificação. As fontes de carbono utilizadas podem ser de preferência por exemplo glucose, amido, dextrina, glicerina, sacarose ou melaços. São fontes de azoto preferidas peptona, extracto de leve dura, extracto de carne de bovino, extracto de malte, ce seína ou ácicos aminados, como por exemplo arginina ou asparagma. O age nte de solidificação util iz ado pocie sei por exemplo agar. Os sais nutrientes inorgânicos podem ser sais de sódio, de potássio, de magnésio ou de cál. cio de ácido fosfórico ou sulfúrico.

1. Agar de extracto de levedura

Crescimento

Micélio aéreo

Reverso

P i cj me n t o solúvel : bom, aspecto enrugado, seco : bom, pulvurolento, cinzento azulado claro : negro-púrpura : castanho-púrpura

2. Agar de farinha de aveia

Crescimento

Micélio aéreo

Reverso

Pigmento solúvel

3. Agar de sais inorgânicos

Crescimento

Micélio aéreo

Reverso

Pigmento solúvel abundante, aspecto liso, seco abundante, pulvurolento, cinzento claro castanho escuro-púrpura c as tanho-púrpura

- amico abundante, elevado, seco bom, pulvurolento, castanho azulado claro negro-violeta escuro cor de malva claro

4. Agar de glicerina - asparagina

Crescimento : born, elevado, seco

Micélio aéreo : bom, pulvurolento, cor de rosa cinzento

5. Agar de peptona - ex

Crescimento:

Micélio aéreo:

Reverso:

Pigmento solúvel:

racto de levedura - ferro bom, elevaco, húmido ausente amarelo claro castanho claro

6. Agar de tirosina

Crescimento

Micélio aéreo

Reverso

Pigmento solúvel : abunaante, aspecto enrugado, seco : abundante, pulvurolento, cin zento acastanhado claro : negro-violeta escuro : castanho violetaclaro

Agar de sacarose	- nitrato
Crescimento	: abundante, aspecto liso, se
	co
Micélio aéreo	: bom, pulvurolento, castanho
	azulado claro
Reverso	: amarelo claro
Pigmento solúvel	: violeta claro

O .	Agar de peptona -	extracto de	carne de bovino
	(agar nutriente)
	Crescimento	j tflSCiÇO f	elevado, seco
	Micélio aéreo	: fraco,	pulvurolento, cinzen-

to escuro

Reverso	: cor de rosa cinzento
Pigmento solúvel	: -----

O pigmento solúvel é um indicador do valor do pH: tona-se vermelho rosado em meio acido e violeta azulado em meio alcalino. I

A gama de temperaturas de crescimen to óptimas para o microorganismo da presente invenção si-

tua-se entre cerca de	25 e	3 5°c.	0 microorganismo	flui
difica a	gelat ina	em	meio de	gelatina	de	gluccse-peptona,
hidrolisa	o amido	em	agar de	sais	i nor		icos-amiao	e
provoca a	coagulação	de leite	magro		A	espécie Str	. sp.
Y-tí4, 36210 cresce	bem em so	lução	de a	gar	de Czapck	(ver

i -.'anus 1 Cxo id ) .

ca de pigmento escuro do qualquer formação de trato de levedura, agar

Apenas se nota em agar de tirosina, não ocorrenpigmento de ferro a formação muito fra em calco de peptona, ex triptona-extracto de ou levedur

O esquema de de carbono deste microorganismo é o Pridham-Gottlieb):

assimilação das fontes seguinte (em me i o

Pos itιvo

L-arabinose,

D-xilose,

I-inositose,

D-manitol,

D-frutose, ramnose, galactose, mal tose, celobiose, glutamato de sódio, manose e lactose.

Duvidoso sacarose e salicina

Negativo : rafinose, celulose, dulcite inibida pela

A espécie Str. sd.

estreptomicina em concentrações superiores a suporta concentrações de NaCl de cerca de 7 uma gama de tolerância de pH de cerca de 5,5

Y-tí4 , 3 0 2 10 é a 9,0

Os daóos oescritcs para as proprie daces de crescimento e para as propriedades fisiológicas dos microorganismos conhecidos apresentam diferenças nítidas em comparação com o mícroorganismo da presente in venção .

A espécie Str. sp. Y-o4, 3b21G dá origem por fermentação ao novo complexo antibiótico ca munoc ina.

A partir das observações referidas é possível classificar o mícroorganismo da presente invenção como uma nova espécie de St reptomyces.

É evidente para o especialista na matéria que a presente invenção não se encontra limitada ao organismo particular anteriormente definido, incluindo todos os mutantes e variantes derivados do mícroorganismo referido por via espontânea ou artiticíalmente que possuem a capacidade de produzir o novo complexo antibiótico c amunoc ma.

É ainaa um objectivo da presente invenção um processo para a preparação da camunocina caracterizado por se cultivar a espécie Str. sp. Y-84, 36210 por fermentação de preferência a um valor de pH entre cerca de 6,0 e 9,0 e de preferência a uma temperatu ra entre cerca de 18 e 37°C sob condições aeróbicas num meio nutriente que contém fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e elementos vestigiais e por se isolar o composto do cáldo de cultura de modo conhecido conforme descrito na presente memória descritiva.

Como fontes de carbono para o meio nutriente para a preparação dos novos antibióticos usam-se de preferência por exemplo glucose, amido, dextri na, glicerina, sacarose, melaços ou óleos. As fontes de azoto apropriadas paraçao dos novos extracto de malte caseína preparação nutrientes

levedura, extracto de carne de bovino, peptona ou utilização num meio nutriente para a dos novos antibióticos oodem referir-se sais tara a / sais minerais, de preferência cio de magnésio, sulfato de amónio ou carbonato de cálcio vestigiais preferidos são o terro, manganês, cobre, zinco ou cobalto

Numa forma de concretizacso oreferida da presente invenção cul Y-64, 3621C a cerca de 26 a 6,4 a 6,6. Após cerca de 4C fermentação obtêm-se o máximo tendido. A fermentação efec iva-se a espécie Str. sp, 28°c e a um pH de cerca de a 45 horas de duração da rendimento no composto preuada é de preferência uma fermentação submersa. O decurso da fermentação e a forma ção do novo complexo antibiótico podem ser seguidos por determinação da actividade antibacteriana do meio de cultu ra e do micélio contra o Staphylococcus aureus 290 p em meio de agar contendo cloreto de cálcio 30 mM.

Eventualmente é possível adicionar ao meio de cultura durante a fermentação um anti-espumante como por exemplo Desmophen (polióis da sociedade

Bayer AG, Leverkusen).

A. camunocina pode ser obtida a partir do caldo de cultura por exemplo por absorção directa num agente de adsorção apropriado ou por extracção por sol ventes seguida de adsorção. Os solventes prererioos são, por exemplo, misturas de acetato de etilo ou de clorofór mio com n-propanol; é especialmente preferida uma mistura de acetato de etilo/n-propanol (2;1). É por exemplo possível tratar o filtrado da cultura ou o extracto em sol vente do filtrado da cultura contenao o composto da presen te invenção por adsorção em carvão activo, em agentes de b

Diaion( adorsão poliméricos como por exemplo ts ubishi

HP-2C (fii(A)

XAv (agente de poliestireno são de diâmetro dos de amina ,ζ-ic cora m, uma dimen

Rohrn &

ríaas C o . ,

EUA) extracto num solvente ae preferência concentrado para eliminação do subraetico a cromatografia numa substância adsorver.te

C composto da presente vente utili ando fases invenção pode ser móveis adequadas eluíclo do acsorcomo por exemplo clorofórmio, acetona ou ainaa por de misturas destes solventes sequencialmente ou com agua e os eluídos podem a secura

C eluente usado de

A camunocina poce também ser iso lada a partir do filtrado da cultura por cromatografia de permuta iónica. São resinas apropriadas, por exemplo, resinas permutadoras de aniões fracamente básicas do tipo de poliestireno, poliamina ou de aminoalcoolpolicrilato t g) reticulado, como por exemplo Dower ‘ (Dow Chemical Compa (R) ny, EUA) ou Amberlite' IRA btí (Ronm & Haas Co., EUA). 0 permutador iónico preferido é a Amberlite IRA b8 (tipo acrílico, funcionalidade de amina terciária). Nes te processo o filtrado da cultura é de preferência submetido a uma cromatografia em coluna, utilizando-se para es (R) ta operação a resina permutadora de aniões Amberlite'

IRA 68 (Cl ) . O composto da presente invenção é em pri^ meiro lugar adsorvido pelo permutados iónico e em seguida é eluído por meio de fases móveis adequadas, como por ex emplo soluções de cloreto de sódio ou de cloreto de potás sio aquoso ou metanólicas clorídrico ou de hidróxido rência uma solução de NaCl ou soluções diluídas de ácido de sódio, usando-se de prefe-

M. Os eluíaos activos podem ser puriticados e os sais podem ser eliminados por meio do processo de cromatografia de adsorção. Os eluídos act ivos e isentos de sais assim obt idos são seleccio9

nados e concentrados camunocina referidos anteriormente podem ser purificados de diferentes modos. Por exemplo podem combinar-se para purificação mais completa técnicas de readsorção e eluição com carvão activo ou com adsorventes poliméricos, como por exemplo Amberleite^{k 7} XaD-4 (constituída por uma matriz de poliestireno com uma dimensão de diâmetro dos poros de 40 x 10 m) e 7 (constituída por uma matriz de acrilato com uma dimensão de diâmetro dos poros de 90 x 10 ·*·° m, Rohm & Haas Co., EUA) ou Diaison^ttk’ HP-20 (i-Ii— tsubisni Chemical Industries, Japão), filtração em gel com material de filtração em gel hipófilo, como por exem( 1) t pio Sephadex LH-20 e géis da serie G (Pharmacia Fine

Chemicals AB, Suécia) e produtos semelhantes bem como fil. tração em gel de permuta iónica com géis com funcionalida de de diaminoetil-(DEAE), como por exemplo géis de DEAE (R)

Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals AB, Suécia) e cro matografia de adsorção em óxido de alumínio e gel de síli_ Para o mesmo fim podem também utilizar-se técnicas de cromatografia em camada fina, cromatografia líquida de média pressão e de alta pressão com adsorventes apropriados, como por exemplo gel de sílica e gel de dílica C-_ o modificado (obtenível por exemplo por reacção de gel de sílica com octadedí1triclorosilano) e agentes apropriados Para além disso pode usar-se para o mesmo objectivo croma tograíia em contra-corrente com um determinado sistema de

A camunocina é um pó amorfo e inco, metanol, etanol, propilenoglico1 e á pouco solúvel ou insolúvel em aceto acetato de etilo, clorofórmio, hexano (40 a b0°) na, diclorometano, e éter de petróleo va no ensaio de coloração com minidrina

Apresenta reacção negati

Nos sistemas de crcr..a tograf ia em ca mada fina (CCF) seg;: idamente dados a Ccúunocina apresenta os seguintes valores:

Placas de CCF

Placas preparadas con gel de sílica,

Artigo n? 5554 de E. ilercR, Darmstadt

Rf

EtOAC

MeOH : H₂0

Butanol : AcOH : H„C z

4:4 : 1

C amunocina

0,47

0,39

A Figura 2 mostra a cromatografia lí quida de alta pressão (HPLC) analítica.

A HPLC foi realizada como se segue:

Enchimento da coluna (σ)

Hypersi 1-ODS ^k ' (10 yum, 4 x 120 mm) (meterial de HPLC com grupos octadeciItriclorosilano da s oc ie dade Shancon, EUA)

C audal detecção solvente

O,5 ml/minuto a 234 nm

MeOH: ácido acético aquoso a 1% (55 : 45)

A camunocina funde a 27O°C com decom posição.

Os dados espectroscópicos para a camunocina são determinados como se segue:

1. Os máximos de absorção de UV em metanol situam-se a cerca de 224, 280 e 345 nm - ver Figura 3. Estes máximos de aborção de UV da camunocina foram determinados numa concentração de 0,2 g por litro. 0 espectro de absorção foi obtido com um espectrómetro Uvikon 810 na gama de 200 a 800 nm.

. 0 espectro de IV (pastilhas de Kbr) foi determinado com um espectrómetro Perkin

Elmer P.E. 521 - ver Figu espectroscópicos anterior análises químicas e espectroscópicas referidas no Exemplo VI mostram que a camunocina é plexo de antibióticos mente referidos e as cina reside em que só

Os dados um com peptídicos aparentados.

Uma característica única da c amuno exerce a sua acção antibiótica conit ivas na iões c álcio

Outros iões metálicos, como por exemplo socuo, potassi bário, rubídio e magnésio não apresentam a mesma acção Em consequência a camunocina foi experimentada num meio de agar contendo pelo menos uma concentração 10 mlí de cio reto de cálcio

No meio de agar referido enriqueci, do dt>'m 'cáTcTo a camunocina apresenta ir. vitro uma actividade contra estirpes sensíveis e resistentes de St aphylococcijs aureus e de Streptomyces faecalis bem como contra Bacillus subtilis, Sarcina lutea, Streptococcus pyogenes e Micrococcus lutens. A concentração inibitória mínima (CIH) da camunocina contra diferentes microorganis mos foi determinada. Os resultados são apresentados no L-uadro 1 seguinte:

ÕUADRO 1

CxM da camunocina

Meio de ensaio: agar de Mtlll -r-Hinton (ver Eanual Cxcic) com adição de diferentes concentrações de Ca^⁺.

Organismo de ensaio:

Concentrações de Ca^⁺ óC,OmM

O, OmM , 5mM

10, mil

30,OmM

S.aureus 2o9 P	>100,0	2 5,0	6, 3	1,6	<0, 1
S.aureus 20464 Mak^^R^	>100,0	100, 0	2 5,0	1,6	1, 6
S.aureus 3066 Met^^R^ S.aureus R 85, Ξ^ι''	>100,0	50, 0	6,3	6,3	0,8
>100,0	>100,0	> 50,0	2 5,0	6, 3
S.aureus R 8 5/Μ,Ξπ/^	>100,0	>100,0	>50,0	2,5	1,6
S.aureus 712 Ket^^R^ ( Σ> ) S.aureus 7 89 .'-'.et	>100,0	100,0	6,3	6,3	0,4
>100, 0	100,0	6,3	1,6	C, 8
Str.faecalis UD66	>100,0	100,0	2 5,0	6, 3	0,8
Str.faecalis Eder Mak	>100,0	100,0	25,0	6, 3	1,6
S.aureus MLS 11	>100,0	>100,0	12 , 5	3,2	1,6
S . aureus rtbS—i4	>100,0	50, 0	2 5,0	12 , 5	1,6
s.aureus MLS 16	>100,0	100,0	2 5,0	2 5,0	1,6
S.aureus 011UC5	>100,0	100,0	>50,0	12, 5	1,6
S.aureus 011GR5	>100,0	100,0	>50,0	>50,0	MT
Str.faecalis 02	>100,0	100,0	2 5,0	6,3	1,6
Micrococcus luteus	>100,0	3,2	0, 8	0,2	<0,1
Sarcina lutea	>100,0	25,0	6, 3	1,6	0, 8
Bacillus subtilis	>100,0	100,0	6, 3	3,2	0,8
E. coli 9632	>100,0	>100,0	>100,0'	>ico,o	>100,0
E. coli 2231	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0
Candida albicans	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0
Aspergillus niger	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0	>100,0

	- resistente	a	antibióticos macrolidos
_Met ^(R>	= resistente	X a	meticilina
EK^(S)	- resistente	X a	eritromicina

Actividade de imunomodulação

A actividade de imunomodulação da camunocina foi verifi cada como se segue:

Ensaio na placa de hemólise (PFC):

Sensibilazaram-se ratos suíços fêmeas com um peso de 16 a 18 g (6 por grupo) por injecção

Q intraperitoneal de eritrócitos de carneiro (5 x 1C células). Após 5 dias mtam-se os ratos por fractura do pescoço, ^etira-se o baço e conservam-se em solução de Dulbe cco gelada. Cs esplenócitos são obtidos por desagregação cuidadosa do baço efectuada através de uma rede de arame de malha fina. Determinou-se a viabilidade e ajustou-se a concentração a cerca de 6 χ 10⁶ células/ml. Em seguida fizeram-se reagir os esplenócitos com eritrócitos de carneiro na presença de complemento numa câmara de Cunr.igham a 37°c numa atmosfera com C0₂ a 5 %. As placa s JIç r mg.da-s foram contadas após 2 horas.

A car.iunocina foi injectada por via intraperitoneal ou subcutânea a partir do dia da sensibilização diariamente em dosagens de 5, 10 e 2C mg/Kg ou 10 mg/Kg. A última dose de composto foi administrada no 52 dia uma hora antes da morte dos animais. Os resultados são apresentados no Quadro 2.

QUADRO 2

Dose mg/Kg, x 5

Via de aplicação inibição percentual das PFC

5,0	i.p.	31,2.0
10,0	i. p.	40,66 - 4,67
20, 0	i.p.	41,4 -4,89
10, O	s. c.	38,4

- 14 I

Os resultados mostram que a caniunoci na tem uma actividade imunossupressora e por conseguinte pode ser utilizada como agente imunossupressor, por exemplo em transplantações.

As propriedades farmacológicas qualificam os compostos da presente invenção para a sua utiliza ção terapêutica. Por conseguinte, constitui também um objectivo da presente invenção um processo para a preoara ção de uma composição farmacêutica dotada de actividade antibiótica e/ou imunossupressora segundo a qual se incor pora como princípio activo camunocina em conjunto com adjuvantes e/ou substâncias veiculares conhecidas.

Seguidamente a presente invenção é elucidada mais completamente por meio de alguns exemplos que correspondem a formas de concretização preferidas, não devendo no entanto ser considerado que os exemplos apresen tados constituem qualquer limitação ao âmbito da invenção.

Exemplo 1 Isolamento de Streptomyces sp. Y-84, 36210 a partir de um solo (a) Preparação do meio de cultura para isolamento

: Glucose	1,0	g
Glicerina	1,0	g
L-arginina	0,3	g
k₂hpo₄	0, 3	g
MgSO₄ . 7H₂O₄	C, 2	g
NaCl	0, 3	g
Extrato de levedura	0, 2	g
^Fe2(^S04 3	10,0	g
CuSO₄ . 5H₂O	1	mg
ZnS0₄ . 7H₂O	1	mg
MnS0₄ . 7H₂O	1	mg
Ag ar	15,C	g

Água destilada pH	1 o, 5	L
Glucose	2,0	g
L-asparagina	1,0	g
k₂hpo₄	0, 5	g
MgS0₄ . 7H₂O	C, 5	g
Extrato de terra	200	ml
Agar	15,0	g
Água destilada	800	ml
pH	8,0
Amido	10,0	g
Caseína	o, 3	g
κ:!°₃	2,0	g
N aC 1	2,0	g
k₂hpo₄	2,0	g
I-lgSO . 7H₂O	0,0	5g
C aC O	0,02 g
FeS0₄	0, Olg
Agar	15,0	g
Água destilada	1	1
pH	7,2	a

Os meios foram a 121

C durante 30 minutos. Para cada um dos meios, deixou-se arrefecer a 45°C após esterilização, distribuiram-se por cápsulas de Petri e deixaram-se solidificar.

(b) Preparação da suspensão de terra

Aqueceu-se a 110°C 1 g de terra quente durante 1 hora numa estufa de ar. Após arrefecimento suspendeu-se a terra em água destilada e agitou-se bem. Deixou-se sedimentar a terra e utilizou-se o sobre nadante para a inoculação de cada um dos meios de isolamento anteriormente referidos.

(c) Inoculação do meio de isolamento

Inocularam-se cápsulas de Petri con tendo cada uma 50 mL de um dos meios de isolamento anteriormente referidos com 1 mL e cada uma da suspensão de terra.

(d) Isolamento de Streptomyces sp. Y-84, 36210

Incubaram-se as placas de Petri ino culadas durante 10 dias a 37°c e isolou-se a partir dos microorganismos que cresceram a estirpe Streptomyces sp. Y-84, 36210.

Exemplo 2

Cultura de Streptomyces sp. Y-84, 36210 para a preparação fermentativa de camunocina

Cultivou-se Strptomyces sp. Y-84, 36210 em agar de levedura-malte com a seguinte composição :

Extracto de malte	10,0	g
Extracto de levedura	4,0	g
Glucose	4,0	g
Agar	15,0	g
Água destilada	1	L
pH	7,0

Distribuiu-se o meio por tubos de ensaio e esterilizou-se durante 30 minutos a 121°c. Arrefeceram-se os frascos de reagente nos tubos inclinados a fim de preparar cunhas de agar.

As cunhas de agar foram inoculadas com a cultura e incubadas durante dias a 28°c, observando-se um bom crescimento e a 15 a formação de esporos. Utilizou-se uma suspensão dos esporos de uma cunha de agar em água destilada para inocular 5 ba

Iões de Frlenmeyer de 500 ml de capacidade contendo cada um 100 ml de meio de inoculação ou 1 balão de aspiração de 5 L de capacidade contendo 1 L do mesmo meio de ino cuia ção.

Composição do meio de inoculação

Glucose	15,0	g
Farinha de semente de soja	15,0	g
Água de maceração de milho	5,0	g
CaC0₃	2,0	g
NaCl	5,0	g
Água destilada	1	L
pH	6, 5

O meio anteriormente descrito foi distribuído por balões de Srlenmeyer de 50C mL de capaci dade em porções de 100 mL ou por frascos de aspiração de 5 L de capacidade em porções de 1 L em cada um e foi esterilizado durante 30 minutos a 120°c. Arrefeceram-se os balões ou os frascos, inocularam-se com a suspensão de vidro de 15 porção de 8 a deixaram-se em agitação durante 72 horas a e a 240 r.p.m. num agitador orbital com de 3,8 cm (1,5 polegadas)· 0 produto desutilizado para inocular dois fermentadores L com 10 L de um meio de inoculação numa vol.% para a realização da 2§ fase da cu) fura de inoculação. A fermentação foi 27°c (- 1°C) com agitação entre 180 e de arejamento de 6 a 7 L/min.

A cultura de inoculação da obtida foi utilizada para inocular o levada a efeito a um da caudal horas assim

200 r.p.m. e com período de bem cresci por um

2â fase meio de preparação

Composição do meio de preparação.

Glucose

Amido solúvel

15,0 g

0,0 g

Farinha de soja	3,0	g
Peptona	3,0	g
CaCO^	2,0	g
aC 1	2,0	g
Água de maceração de milho	2 , G	g
(nh₄)₂so₄	0, 5	g
Água destilada	1	L
pH	b, 5
Adicionou-se	ao conteúdo ι	do fermen-

tador 0,025 % de Desmophen como anti-espumante.

Transferiram-se 280 L do meio anteriormente referido para um fermentador de 390 L meio foi esterilizado por cto durante 28 minutos a meio de

121°C.

vapor indirecto ou dire

Arrefeceu-se o ferrnentador e inoculou-se com a

2½ fase da cultura de inocu1ação (7 ' â 2 7 C

120 r.ό

A fermentação foi levada a efeito

Quando % em volume) (- 1°C) com agitação a uma velocidade de 100 a

‘.m.. o caudal de arejamento foi de 170 L/minuto tos os a fermentação diâmetros das foi feita parar após 40 a 45 minulocucus aureus 209 P zonas de inibição contra os St aphyeram de 20 mm na análise do filtrado de cultura de acordo com o método das cápsulas de agar ( 6 mm de diâmetro ) com utilização de agar supleme tado com cálcio (30 mM) a um valor de pH do meio de cult ra entre e 6,9

O volume celular sedimentado foi de 2 0 %.

O caldo de fermentação concentrado contendo o complexo antibiótico foi centrifugado para separação do micélio do líquido e foi processado conforme descrito no Exemplo 4.

Exemplo 3

Cultura de Streptomyces sp. Y-84, 3e21O para a preparação fermentativa de camunocina

Repetiu-se o processo descrito no

Exemplo 2 sob as condições seguintes:

Cultivou-se Str. sp. Y-84, 3b21C num meio de agar com a seguinte composição:

Amido (solúvel)	10,0	g
k₂hpo₄	1,0	g
Mgso . 7H₂O	1,0	g
NaCl	1,0	g
(NH₂)₂so₄	2 , O	g
C cíC 0	2,0	g
FeSO_d . 7H₂O	0, 1	g
MoC1₂ . 4H₂O	C, 1	g
ZnS0₄ . 7H₂O	0, 1	g
Agar	15,0	g
Água destilada	1	L
PH	7, 2	g
	A composição do meio de inoculaç
era igual à descrita no Exemplo 2.
Composição do meio	de produção
Glucose	20,0	g
Farinha de semente	de soja 10,0	g
CaC0₃	0, 2	g
CoCl₂ . 6H₂O	1,0	mg
Água destilada	1	L
pH	7,0
	Carregaram-se 100 L do meie	' ante
ormente descrito num fermentador de 15C L de capacidad
Esterilizou-se o meio durante 28 minutos a 121°c	por v

ao

Γιε apor

indirecto e directo. Arrefeceu-se o fermentador ade do caldo de cultura de

Staphylococcus aureus 209 P era de filtrado da cultura de acordo com o inibição contra mm na análise do método das cápsulas de agar (6 mm de diâmetro) utilizando agar suplementado com cálcio (30 ml-í) . 0 volume celular sedimentado era de % em volume. O caldo de fermentação foi tratado conforme se descreve no Exemplo 5.

Exemplo 4

Fizeram-se passar 250 ml do filtrado da cultura obtido de acordo com o Exemplo 2 através de uma coluna contendo 6 L de resina permutadora aniónica Amberlite ira 68 (Cl ) (resina permutadora com funcionalidade de poliestireno-poliamina). Após lavagem com 40 L de água desmineralizada eluiu-se a coluna com solução de NaCl 2,0 eluídos activos

M a pH 8,5 (ajustado com amónia). obtidos (30 L) foram extraídos 3 vezes

Os com uma mistura acetato de etilo: n-propanol 2:1 depois de se ter ajustado o pH com HC1 até ao tractos foram concentrados sob vácuo e valor 4,0.

Os ex o concentrado obti do deste modo (6,1 g) luna de gel de sílica através de uma comm (230 a 400 malhas, te de clorofórmio até foi feito passar (dimensão de partícula 0,062 a 0,O3'^z600 g) e foi eluído com um gradien clorofórmio: metanol (1:1). as ntradas reunidas (3 g) foram extraí em seguida efectuando

1,8 g do composto, e em seguida foi feito passar através

de uma coluna de cromatografia de gel de sílica (dimensão da partícula C,C62 a 0,037 mm (230 a 400 malnas), 360 g).

A eluição foi efectuada com um gradiente de acetato de etilo até uma proporção acetato de etilo: metanol (1:1), obtencio-se 860 mg de material activo por concentração. Este material foi dividido em 6 porções e foi separado (R) numa coluna contendo 50 g de Sephadex LH.2G (material de filtração em gel hipofílico) em metanol; como agente de eluição utilizou-se metanol. Deste modo foram obtidos 360 mg de camunocina.

Exemplo 5

Os filtrados das culturas de duas c argas n idos, de fermentação de acordo com o Exemplo 3 foram reu

Este volume foi obtendo-se um volume de 185 L feito passar através lite^(R) IRA-68 (Cl“);

de uma coluna contendo 4 L de Ambera coluna foi lavada com 20 L de água e foi eluída com solução aquosa de cloreto

8,5 com

Os

M cujo pH tinha sido ajustado a eluídos activos obtidos num volume de 47 L

L de Diaion foram feitos

HP-20

Mitsubishi Chemical Industries, Japão);

a coluna foi lava da com Ί L de água desmineralizada e foi elúida com met anol

O pH foi ajustado a 3,0 com HC1 e a solução foi feita passar através de uma coluna contendo 2 L de Diaion A coluna foi lavada com água desmineralizada até iões cloreto na água de lavacom metanol; os eluídos de

HP-20 se verificar a ausência de gem

A camunocina foi eluída metanol foram concentrados sob vácuo e foram liofilizados

Obtiveram-se deste modo g do complexo antibiótico bruto.

O complexo antibiótico bruto foi dissolvido em água bidestilada, com amónia, o pH foi ajustado a 1,7 a solução foi dividida em duas partes de igual volume e foi feita passar através de duas colunas de

Este complexo antibiótico de pureza intermédia foi dissolvido em 200 ml de água bidestilada e foi feito passar através de uma coluna (6,2 x 26 cm) (R) contendo DEAE-Sephadex' ⁷ A-25 (permutador iónico com funcionalidade de dietilamimetil) em água bidestilada. A coluna foi enxaguada com água e em seguida eluída com uma solução aquosa de NaCl, cuja molaridade era gradualincrementos de 5 %. 0 complexo anfoi eluído em 6 L de uma solução de NaCl 1,5 M uma solução de NaCl 2 M. Os eluídos combinapH foi ajustado a 2,0 com HC1, foram em seguida mente aumentada por t ibiót ico e 5 L de dos, cujo feitos passar através de uma coluna contendo 2 L de Diaion HP-zO; a coluna foi enxaguada com agua ate que a água não apresentasse à saída iões cloreto detectáveis e em seguida foi eluída com metanol nado por destilação sob vácuo e foi liofilizada, obtendo-se 700

O metanol toi elimia soluç:ão aquosa restante g de camunocina pura.

Exemplo 6

A análise por HPLC do comolexo ant biótico da camunocina puro numa coluna contendo DDS-Hype f Q ) sil (10 yum) de dimensão 4 x 120 mm usando como elu ente uma mistura constituída por MeOH e ácido acético aq oso a 1 % (55:45) com um caudal de 0,5 ml por minuto e d tecção a 234 nm mostra que a camunocina é uma mistura mi- 23 H| U| I Ol 0)|

I

cro-heterogénea, isto é, um complexo formado por distintos compostos antibióticos, conforme mostra a Figura 2.

Por meio desta análise verificou-se a presença dos seguintes ácidos aminados:

Componentes principais: ácido o<-aminoadípico ácido aspártico glic ina

4-hidroxifenilglicina serina

Componentes secundários:

ácido glutãmico ácido 3-hidroxiaspártico leucina

N-metilfenilglicina prolina treonina

A partir dos dados anteriores chega-se à conclusão que a camunocina é um complexo antibióti. co peptídico.

Claims

- lâ -

Processo para a preparação de camunocina caracterizado por se cultivar Streptomyces species Y-84, 3621C (DSM 4329) ou um seu variante ou mutante sob condições aeróbicas num meio nutriente contendo fontes de carbono e de azoto e sais nutritivos bem como even tualmente elementos vestigiais, por se isolar a camunocina a partir do caldo de cultura e se purificar.

Processo de acordo com a reivinci cação a uma cerca

1 caracterizado por a cultura temperatura entre cerca de 18 de õ a 9.

ser levada _ _o e 37 c e a a efeito um pH de

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou
2 caracterizado por a cultura ser levada a efeito a uma temperatura entre cerca de 26 e 2S°

6,4 a 6,6.

C e a um pH de cerca de

Processo de acordo com qualquer das

1 ou
3 caracterizado por a cultura ser levada a efeito durante cerca de 40 a 45 horas.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou a uma cultura submersa.

3 caracterizado por se proceder

- 6â Processo para a preparação de uma composição farmacêutica dotada de actividade antibiótica e/ou imunosupressora caracterizado por se incorporar como princípio activo camunocina quando preparada de acordo com uma ou várias das reivindicações anteriores juntamente com adjuvantes e/ou substâncias veiculares habituais numa forma de apresentação apropriada.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 5 de Fevereiro de 1988, sob o n2 p 38 03 383.6.