PT87239B - Processo para a preparacao de peptideos - Google Patents
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA
A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de peptídeos sintéticos do rinovirus humano (HRV), bem como à preparação de vacinas que contêm estes peptídeos.
A partícula HRV é constituída por uma molécula de ARN de cadeia simples mais 60 cópias das proteínas estruturais VP1 e VP3, 5θ cópias das proteínas VP2 e VP4 e 2 cópias do seu precursor VPO (Medappa et al., 1971; Rueckert, 1976). A recente publicação da estrutura atómica do HRV tipo 14 (HRV14) (Rossmann et al., 1985) forneceu uma infor mação pormenorizada sobre a localização e a estrutura das proteínas VP1, VP2 e VP3 tal como ocorrem na superfície do virião intacto.
As posições das substituições de áci dos aminados encontrados em mutantes resistentes à neutralização seleccionados por vários anticorpos monoclonais foram usa
PA
Λ r
ι identificação de quatro locais antigénicos na parti (Sherry e Rueckert, 1985; Sherry et al., 1986). Esforam designados por Elm-IA, NIm-IB, Nim-II e ITIm' _ „2.__1 ___ --das para a cuia HRV14 tes locais
-III, de acordo com a proteína virai na qual estes locais estão fundamentalmente situados. Mediante o uso de um anticorpo monoclonal foi também efectuado o mapeamento de um epítopo de neutralização na proteína Vp2 de HRV2. Este epítopo inclui os resíduos de ácidos aminados de 155 a 164 (Skern Estes doze resíduos são, usando o código de uma GREVKAETRLNP.
De acordo com Skern et propriedades de ligação das plasmídeos contendo um gene et al., 1987).
letras ai., verificou proteínas extruncado da
-se por análise das pressas a partir de teína VP2 que o local de ligação do anticorpo monoclonal se tinha desde que as supressões da extremidade carboxi não se tendessem para além do ácido aminado 164· Não foi observada qualquer ligação logo que a supressão alcançou o ácido aminado 153. No entanto, a falta de um local de restrição adequado na sequência entre a extremidade N-terminal da proteína VP2 e a região VP2 de interesse impede uma definição da fronteira N-terminal do local de ligação do anticorpo monoclonal.
Os locais antigénicos que até agora foram identificados para HRV foram todos previstos a partir de trabalho sobre a partícula vírica. Não foi relatado qualquer trabalho usando peptídeos sintéticos. No entanto tem havido um interesse crescente no desenvolvimento de peptídeos sintéticos para uso em vacinas contra outros picornavírus, tais como o vírus da doença pro man es· de pés-e-booa e o vírus de polio.
agora peptídeos de seis HRV2. Verificou-se que de coelho anti-HRV2.
que reagia bem com parNos produzimos imunogénicos previstos de peptídeos reagem com soro determinantes quatro destes
Destes quatro, três produziam anti-soro tículas viricas em análises por ELISA indirecta e por técnica de mancha de Western. No entanto, o anti-soro contra um destes peptídeos reagia com vírus numa análise por ELISA de sanduíche e num ensaio de imunoprecipitaçao e neutralisava in vitro a infectividade deste. Este peptídeo éí
VKAETRLNPDLQPTEC.
Por outras palavras, o peptídeo corresponde aos resíduos de ácidos aminados 156 a 170 da proteína VP2 de HRV2. Este peptídeo possui também um resíduo de cisteína carboxi-terminal não natural. Apenas nove dos resíduos de ácidos aminados do epítopo Klm-II propostos por Skern et al. estão presentes no peptídeo. Os peptídeos sintéticos que contêm esta sequência nonapeptídica são deste modo capazes de sus citar um anticorpo neutralisante contra HRV2,
Por conseguinte, a presente invenção proporciona peptídeos adequados para serem usados como vacinas, peptídeos estes que apresentam um epítopo que contém os resíduos de ácidos aminados 156 a 164 da proteína VP2 de HRV2 ou residuos de ácidos aminados equivalentes de outro HRV. Estes ácidos podem ser substituídos por outros ácidos aminados que não afectem a antigenicidade do peptídeo. Os peptídeos podem ser preparados sob a forma de um conjugado ligado a um suporte fisiologicamente aceitável. Em alternativa, os peptídeos podem eonter um sequência suporte.
Os peptídeos da presente invenção contêm uma sequência eficaz antigenicamente. Esta sequência se rá designada como sequência rara HRV2, esta sequência z e:
VKAETRLITO.
São resíduos de ácidos aminados equi valentes de outros HRV os resíduos de ácidos aminados de VP2 correspondentes aos resíduos de ácidos aminados de VP2 156 a 164 de HRV2. Por outras palavras, estes resíduos podem ser cor respondentes aos resíduos de VP2 de outro serótipo de HRV. Estes resíduos podem ser fácilmente determinados através do alinhamento da sequência VP2 de outro HRV com a sequência VP2 de HRV2. Esta determinação é possível devido à homologia entre as sequências VP2 de diferentes tipos de HRV. A Rigura 1 anexa ilustra este facto. Resta figura, foram alinhadas as sequências VP2 de HR.V2 e de HRV14· É possível verificar-se que os re síduos 156 a 161 de HRV14 correspondem aos resíduos 156 a 164 de HRV2. Estes resíduos de HRV14, sublinhados na figura, são:
LSSANE.
É possível substituir um ou vários
ácidos aminados das sequências NIm-II definidas por um ou vários outros ácidos aminados que não afectem a antigenicidade do epítopo. Em consequência, um ácido aminado pode ser substituído por outro que conserve o carácter fisicoquímico do epítopo original, isto é, em termos de densidade de carga, hidrofilici dade/hidrofobocidade, dimensão e configuração, e deste modo conserve a estrutura imunológica. Por exemplo A pode ser substituído por G ou vice-versa; V por A, 1 ou G; K por R; S por 2 ou vice-versa; E por D ou vice-versa; e Q por N ou vice-versa. Tal como mencionado anteriormente, estas substituições são pos síveis desde que não seja afectada a antigenicidade do epítopo.
Na sua forma mais simples, um peptídeo pode ser constituído pelos resíduos de ácidos aminados 156 a 164 da proteína VP2 de HRV2 ou pelos resíduos de ácidos aminados correspondentes de outro HRV. Para HRV2 e HRV14 estes peptídeos são, respectivamente:
VKAETRINP e LASSANE.
Em alternativa, podem ser previstos peptídeos mais compridos apresentando o epítopo NIm-II. Podem ser adicionados outros resíduos de ácidos aminados adicionais numa qu a ambas as extremidades da sequência NIm-II. Deste modo, é possível construir um peptídeo com até 50 ou por exemplo com até 20 resíduos de ácidos aminados. Podem ser adicionados a qualquer das extremidades um, dois, três ou mais ácidos aminados. De acordo com uma forma de concretização da presente invenção, apenas se adicionam resíduos de ácidos aminados extra à extremidade carboxi-terminal. É possível adicionar até 30, por exemplo até 15 ou até 6 resíduos de ácidos aminados adicio. nais independentemente a cada extremidade do epítopo NIm-II.
Os resíduos de ácidos aminados que são adicionados à sequência NIm-II deriváveis de um HRV particular podem ser os existentes nas posições correspondentes da sequência VP2 para esse HRV. Por exemplo, o resíduo de ácido aminado na posição 165 da proteína VP2 de HRV2 é D. De preferência, por conseguinte, este é o primeiro resíduo na extremidade de carboxi-terminal do epítopo básico de HRV2. Os peptídeos preferidos construídos deste modo a partir de sequências de VP2 de HRV2 e de ERY14 são, respectivamente;
VKAETRLIÍPDLQPTE e LSSANEVGGPVK.
Para além disso, os peptídeos mais compridos podem conter também cópias múltiplas do epítopo ITIm-II ou de sequências tal como as definidas anteriormente englo badas naquele epítopo. Também pode ser adicionado um resíduo de císteina (C) a qualtuer das extremidades ou a ambas as extremidades dos peptídeos presentes. Em particular, pode adicio. nar-se um resíduo de C apenas à extremidade carboxi-terminal. Este resíduo ê adicionado a fim de facilitar o acoplamento ao suporte e/ou a fim de aumentar a imunogenicidade de um peptídeo 0 peptídeo pode ser ligado a um supor te a fim de criar um conjugado que é imunogenicamente aotivo. pode ser utilizado qualquer suporte apropriado fisiologicamente aceitável. Por exemplo, o suporte pode ser albumina de soro de bovino, tiroglobulina, ovalbumina ou hemooianina de Megathu ra crenulata (keyhole limpet hemocyanin). 0 peptídeo pode ser ligado a toxoide de tétano e/ou a toxoide de difeteria, proporcionando simultaneamente tanto um imunogénio como uma va cina multivalente.
Para além deste procedimento em que uma sequência suporte é ligada a um peptídeo, é possível prepa rar um peptídeo que incorpora em si mesmo um sequência suporte para o epítopo de VP2. A sequência Nlm-II ou a sequência de um peptídeo mais comprido podem ser ligadas a uma sequência supor te ou conter em si essa sequência suporte. Proporciona-se uma sequência suporte heterologa. Por sequência suporte heterologa entende-se que a sequência total do peptídeo, por exemplo uma proteína de fusão contendo a sequência HIm-II e a sequência su porte não correspondem à totalidade ou a parte da sequência da proteina VP2 de um iíRV particular. A sequência suporte pode nem ser uma sequência de HRV. A proteina suporte é escolhida de tal modo que o produto resultante seja fisiologicamente aceitável.
Os peptídeos da presente invenção são peptídeos sintéticos. Podem ser preparados por síntese químioa a partir de ácidos aminados isolados e/ou de peptídeos já formados contendo dois ou mais resíduos de ácidos aminados. Podem ser utilizados métodos de síntese em fase solida ou em solu-
ção. Em alternativa, os peptídeos podem ser preparados por metodologias de ADN recombinante. Para este fim, prepara-se uma sequência de ADN que codifica para uma sequência NIm-II ou para uma sequência mais comprida que englobe a sequência ETIm-II. Prepara-se um vector de expressão contendo a sequência de ADN que tem a capacidade de expressão do peptídeo quando fornecido a um hospedeiro adequado. A sequência de ADN está localizada entre os sinais de início e de fim de tradução. Também se proporcionam elementos de regulação de transcrição adequados, em particular um promotor para a sequência de ADI? e um local de terminação de transcrição. Á sequência de ADN é proporcionada no quadro correcto de modo a permitir a ocorrência da expressãc do peptídeo num hospedeiro compatível com o vector.
Pode ser utilizado qualquer sistema hospedeiro-vector apropriado. 0 vector pode ser um plasmideo. Nesse caso pode utilizar-se um hospedeiro bacteriano ou uma le vedura. Em alternativa, o vector pode ser um vector virai. Este pode ser usado para transfectar células ou uma linha de células de mamífero a fim de causar a expressão de peptídeos.
vector virai pode ser um vírus de varíola bovina recombinante. Normalmente, insere-se urna sequência de ADN que codifique para uma sequência NIm-IT ou para uma sequência mais longa que inclua a sequência NIm-II num vector plasmídico a juzante de um promotor do vírus de varíola bovina e flanqueado por sequências de quinase de timidina (TE) de varíola bovina. 0 vector de recombinação resultante é introduzido em células infectadas pelo vírus de varíola bovina. Como resultado de recombinação homóloga, gera-se uri vírus de varíola bovina recombinante TE~ que expressa o peptídeo.
Um exemplo da utilização de tecnologia de ADN recombinante para tornar o epítopo de NIm-II parte duma proteína de fusão é o seguinte. É o possível proporcionar uma sequência de ADN que codifique para uma proteína de fusão contendo hemaglutinina (HA) do vírus da gripe num local do qual se proporciona o epítopo NIm-II normalmente ocupado por um epítopo antigénico natural. Por outras palavras, a totalida. de ou parte de um epítopo antigénico natural de HA podem ser - substituídas por um elemento epítopo NIm-II ou por uma sequên-
cia mais comprida contendo a sequência NIm-II.
Para a expressão da proteína de fusão, integra-se a sequência de AD17 num vector de expressão. A sequência de ADN é integrada num vector de tal modo que o vector, quando fornecido a uma célula procariótica, tenha a capacidade de expressar a proteína de fusão. Torna-se necessária uma célula hospedeira para a glicosilação correcta de HA. 0 vector pode ser um vector virai que integra uma sequência de ADN de tal modo que a proteína de fusão seja expressa pelas cé lulas infectadas pelo vector. Uma vacina pode conter um vector virai como estes e uma substância veicular ou um diluente fisiologicamente aceitável. Neste caso, o vector virai é de preferência um vírus da varíola bovina recombinante que contém a sequência de ADN. Em alternatina, uma vacina pode conter uma proteína de fusão e uma substância veicular ou um diluente fisiologicamente aceitável.
A HA do vírus da gripe é uma proteína de membrana integral. Quando expressa em células infectadas por vírus recombinantes de varíola bovina, a proteína HA de fusão está normalmente glicosilada e é transportada para a superfície da célula através da qual fica saliente. Aqui apresen ta o epítopo ITIm-II do lado de fora da superfície celular. ITor malmente, prevê-se o epítopo llm-II no local antigénioo A de HA.
Outro exemplo do uso da tecnologia de ADN recombinante para preparar uma proteína de fusão para apresentar o epitopo NIm-II ao sistema imune consiste na produ ção de uma proteína de fusão contendo HBcAg a cuja extremidade amino-terrninal está ligado um epítopo NUm-ll. Esta proteína de fusão pode ser expressa do mesmo modo que a proteína de fusão HA excepto em que se pode empregar qualquer sistema hospedeiro compatível e não apenas um hospedeiro eucariótico. Também apenas a proteína de fusão que pode ser usada para vacina como HBcAg não é uma proteína de superfície. 0 epítopo ITIm-II pode ser fundido directamente à proteína HBcAg. Em alternativa, o epítopo pode ser fundido à proteína HBcAg por meio da interven Ção dum adaptador. Este adaptador pode ser constituído por um ou mais, por exemplo até dez, resíduos de ácidos aminados.
Os peptídeos da presente invenção po dem aumentar o nível de anticorpos de neutralização. Estes pep tídeos podem portanto ser usados em seres humanos como vacinas. A vacinação é efectuada por administração a um paciente de unia quantidade eficaz de um peptídeo. Pode ser adoptada uma via oral ou via parenteral, como seja a via sub-cutânea, intravenosa ou intramuscular. ITormalmente, administra-se um peptídeo numa quantidade de 1 a 1000 ug por dose, de preferência 10 a 100 ug por dose, quer por via oral ou por via parenteral. Ho caso de se utilizar um vector virai capaz de expressar uma pro teína de fusão HA como vacina, as vias de administração e a quantidade de vírus dada são as mesmas. Para um vírus recombinante da varíola bovina, este pode ser administrado por via dermal.
Para finalidade de vacinação, formula-se normalmente um peptídeo com uma substância veicular ou com um diluente farmaceuticamente aceitável. Podem ser usadas formulações, substâncias veiculares, adjuvantes e diluentes normais. Estes serão evidentemente determinados pela via de administração.
As vacinas administradas a pacientes incluirão de preferência não apenas um peptídeo contendo um epítopo NIm-II mas também outros antigenes. Estes podem estar sob a forma de peptídeos contendo um epítopo ITIm-II ou um tipo diferente de HRV e/ou outros epítopos de HRV.
0s seguintes exemplos ilustram a invenção .
Hos desenhos anexos:
A Pigura 1 mostra as sequências VP2 para HRV2 e para HR.V14;
A Figura 2 é o Espectro de Massa de Bombardeamento por Átomos Rápidos (PARES) da região do ião molecular do peptídeo 4 (Exernplo 1);
A Figura 3 mostra os resultados da imunoprecipitação de HRV2 purificado por soros anti-peptídeo para a sequência NIm-II (Exemplo 2); e
A Figura 4 mostra os resultados da analise de mancha de Western de soros anti-peptídeo de i-iRV2.
Exemplo 1; Preparação de peptídeos
Por referência a um modelo gráfico de computador de HRV14 (gerado por Dr. D. Stuart, Departamento de Biofísica Molecular, Universidade de Oxford, GB usando coordena das fornecidas por Dr. M.G. Rossmann) e por alinhamento de sequências de HRV14 com HRV2, outro serótipo do vírus (Stanway et al., 1984; Skern et al., 1985; Callahan et al., 1985), nós sele cionámoa um certo número de locais imunogénicos potencialmente importantes de HRV2 (três de VP1, um de VP2 e dois de VP5) para avaliação usando peptídeos sintéticos. As sequências e as localizações dos peptídeos de HP.P2 produzidos são dados no Quadro 1. Realizou-se a síntese usando uma adaptação da técnica de Lãrrifield (1963) descrita por Houghten (1985). Cada peptídeo tinha um resíduo adicional de cisteína não natural na extremidade C-terminal a fim de facilitar o acoplamento da hemocianina de Megathura crenulata (Keyhole limpet haemohyanin = KLH).
Ra figura 2 apresenta-se um Espectro de Massa de Bombardeamento por Átomos Rápidos (FABMS) da região do ião molecular do peptídeo 4 (peso molecular 1811, 922). 0 espectro de FAB mostra um ião (M + H)+ para o composto esperado a M/Z 1815, confirmando deste modo o peso molecular proposto. Exemplo 2; Ensaios dos peptídeos
Os peptídeos foram inicialmente ensaiados in vitro a fim de determinar a respectiva reactividade com soro de coelho anti-IIRV2 usando uma análise por ELISA indirecta na qual se escrutinou uma gama de concentrações de peptídeos ligados à fase sólida com um excesso de anti-soro. Esta técnica identificou quatro peptídeos reactivos, dois de VP1, um de VP2 e um de VP5 (Quadro 1).
Estes quatro peptídeos foram portanto seleccionados para imunização após acoplamento a KLH pelo método de MBS (Liu et al., 1979). Inocularam-se pares de coelhos in tramuscularmente com 500 ug de cada peptídeo emulsionado com adjuvante de Freund completo e reinoculou-se por via subèutânea 42 dias mais tarde com a mesma dose emulsionada com adjuvante de Freund incompleto. Monitorizaram-se amostras de soro a inter valos de 14 dias para verificação de actividade anti-peptídeo.
n
Todos os coelhos produziram anticorpos anti-peptídeo que podiam ser detectados 14 dias após a primeira inoculação e nas amostras de sangue final colhidas 28 dias após a revacinação a acti vidade anti-peptídica ia de 3,7 logio a 4,7 logio âe acordo com determinações por ELISA indirecta (Quadro 2).
Os soros anti-peptídeo foram sub-sequentemente analisados para detecçao de actividade anti-IIRV2 usando vários sistemas diferentes de análise, nomeadamente ELISA indirecta, ELISA de sandwich, imunoprecipitação e neutrali zação (Quadro 2). Todos os anti-soros reagiam com HRV2 numa aná lise por ELISA indirecta, dando os anti-soros relativos aos pepúideos 3, 4 θ 6 títulos significativamente mais elevados (3,1 a 5,2 log. ) do que os anti-soros relativos ao peptídeo 2 (1,5 a 1,8 log. ). No entanto, apenas o anti-soro de coelho número 5 inoculado com o peptídeo 4 de VP2 reagiu bem numa análise por ELISA de sandwich.
A diferença nos resultados com as duas análises está provavelmente relacionada com o grau de distorção das partículas víricas induzida pelo método de ligação à fase sólida (McCullough et al., 1985). A ligação directa a uma superfície plástica, como na ELISA indirecta, causa uma distorção de outro picornavírus, o vírus da doença de pés-e-boca, por exposição de locais antigénicos não normalmente acessíveis a anticorpos peptídicos. A análise por ELISA de sandwich impõe uma menor alteração física das partículas víricas uma vez que estas estão aprisionadas pelo anticorpo imobilizado.
Uma vez que ambas as técnicas de ELISA podem distorcer o virus, em maior ou menor grau, deixou-se também que os soros reagissem em solução com partículas de ^2 HRV2 purificadas marcadas com ' S-metionina e precipitou-se usando espectros de estafilococos A. Apenas os soros relativos ao peptideo 4 mostraram qualquer precipitação significativa do vírus (Quadro 2). No entanto, o grau de precipitação observado era significativamente diferente entre os dois soros de coelho ensaiados (Fig. 1). 0 anti-soro do coelho número 5 (·—·) Precipitou >90 / do vírus marcado, enquanto que o do coelho núme ro 6 (o—o) precipitou apenas 58 % (na mesma análise (*—t) re presenta anti-soro de coelho normal). Este resultado é prova velmente devido a uma diferença nas afinidades funcionais globais dos dois anti-soros para com partículas nativas de rinoví rus. 0 anti-soro que era mais activo na precipitação do vírus era também o que reagia na ELISA de sandwich.
Todos os anti-soros de peptídeos foram também experimentados para avaliação da respectiva capacidade de neutralizar o vírus. Incubaram-se os anti-soros sem di luição e com uma diluição de 1:4 cada um com una série de diluições de vírus e obteve-se a diferença de título em log^ θ com vírus mais soro de coelho normal, tomando-se o vírus mais soro anti-peptídeo como índice de neutralização. Usando esta técnica apenas o anti-soro relativo ao peptideo 4 revelou acti vidade de neutralização, detectando-se uma actividade significativamente mais elevada com o anti-soro do coelho número 5 em relação ao do coelho número 6 (Quadro 2). Era este anti-soro que reagia melhor nas análises por ELISA de sandwich e de imunoprecipitaçao. Uma vez que ambos os soros tinham níveis se melhantes de actividade anti-peptídica, a diferença observada na análise de neutralização de anticorpos deve ser devida a di ferenças qualitativas nas populações de anticorpos com respeito à conformação do epítopo que reconhecem.
Finalmente, levou-se a efeito uma análise de mancha de 'western a fim de determinar se os anti-soros de peptídeos reconheciam proteínas virais isoladas de modo especifico. Em contraste com o soro anti-H?.V2 policlonal (pista 1), que não reagiu, todos os anti-peptídeo reagiram com a proteína virai correspondente, tendo os anti-soros relativos aos peptídeos 3 (pista 3), 4 (pista 4) e 6 (pista 5) a reactividade mais alta (Figura 4; pista 2 é o anti-soro relativo ao peptideo 2). Estas observações confirmam os resultados da ELISA indirecta. Para além disso o anticorpo monoclonal descrito por Skern et al., (1987) que cobre o local do nosso peptideo 4 também reagiu em análise de mancha de Western. Em geral as reacções eram específicas para cada proteína, se bem que o anti-soro relativo ao peptideo p apresentasse reaoção cruzada com VP2 e VP3 θ o anti-soro relativo ao peptideo 4 apresentasse reacção cruzada num grau limitado com VP1. Ho entanto o ní vel da reactividade cruzada é tão baixo que os anti-soros t
eínas constituirão reagentes de marcação úteis para as prot viais.
Exemplo 3: peptídeo de HRV 14
Foi sintetizado um peptídeo para a sequência LSSANEVGGPVKC usando uma adaptação da técnica de Líer rifield (1963) descrita por Houghten (1985). Na extremidade 0-terminal do peptídeo colocou-se um resíduo de cisteína não natural. 0 peptídeo foi acoplado a KLH (5 mg de peptídeo/3,2 mg de KLH).
A actividade do peptídeo foi analisa por via intramuscular (i.m.) 500 ug . em dois coelhos usando adjuvantes , 42 inocularam-se i.m. outros 500 ug ; em cada coelho usando adjuvante de
Lie— HRV14 por ELISA resultados são apresentados no Quadro 3 abaixo.
da. No dia 0 inocularam-se do peptídeo acoplado a KLH de do peptídeo acoplado a IkLH
Freund incompleto. Sangraram-se os dois coelhos no dia 84 diram-se as actividades anti-peptídeo e anti indirecta.
Freund completo. No dia
Os
QUADRO 3
| ELISA indirecta Peptídeo | (50$ de DO máx. HRV14 | índice de neutralização | |
| Coelho n2. 1 | 3,7* | 3,8 | 0,7 |
| Coelho n2. 2 * 1OSio | 4,1 | >4,0 | 1,7 |
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Quadro 1 - PEPTÍDEOS DO RINOVÍRUS HUMANO TIPO 2: LOCALIZAÇÃO,
SEQUÊNCIA E REACTIVILAPE COM SORO ANTI-HRV2.
| Numero do peptídeo | Proteína^ virai | Localização | Sequência de ácidos aminados. | Reactividade com soros anti-HRV2» £lisa INLIRECTA) |
| 1 | VP1 | NIm-IA/ NIm-IB | KLEVTLANYIIKEWTC | - |
| 2 | VP1 | duas partes de Nlm-II | £ KHIHKDIGHC^ | |
| 3 | VP1 | Extremidade carboxi-terminal Parte de NIm-II | IQTAlVTEíEIITTASmEC | |
| 4 | VP2 | NIm-II | VKAETRLNPDIQRTEC | +++ |
| 5 | VP3 | NIm-III | VLQSSIITAPMC | - |
| 6 | VP3 | Extremidade carboxi-ter minai Edge of canyon* | KLH;WCmiW3AIAQC | +4r |
_ i % -
Concentração de peptídeo reactivo com anti-soro:
++++ 0,01 ug/ml, +++ 0,1 ug/ml, ++ 1 ug/ml, + 10 ug/ml e - 100 ug/ml.
Rossmann et al., 1985.
Esta sequência não é contígua na estrutura primária de VP1.
Ί Λ
Quadro 2 - Análise de soros de peptídeos anti-HRV2 de coelho
- IS -
Claims (1)
- Processo para a preparação de um pep tídeo sintético adequado para utilização como vacina contra um rinovírus humano (HRV) e que apresenta um epítopo que compreen de os resíduos dos ácidos aminados 156 a 164 de VP2 ou de HRV tipo 2 ou resíduos de ácidos aminados equivalentes de outro HRV, sendo opcionalmente um ou mais destes resíduos substituídos por um ou mais resíduos de outros ácidos aminados de modo a que a antigenicidade do peptídeo não seja afectada, caracterizado por compreender as fases de sintetizar por via química o referido peptídeo a partir de ácidos aminados isolados e/ou de peptídeos de dois ou de mais resíduos de ácidos aminados previamente preparados.Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido peptídeo ser composto de um máximo de 20 resíduos de ácidos aminados.- _Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido peptídeo conter um máximo de 15 resíduos de ácidos aminados depois da extremidade carboxi-terminal do referido epítopo.- 4& Processo de acordo com qualquer dasΊ £ reivindicações 1 a 5 caracterizado por o referido peptídeo Gonter adicionalmente um resíduo de cisterna não natural numa das extremidades ou em ambas.Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por o referido peptídeo ter incorporado uma sequência suporte heteróloga em relação ao referido epítopo.- 6â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 caracterizado por compreender adicionalmente uma fase de ligação do peptídeo protegido a um suporte fisiológicamente aceitável.- 7â Processo para a preparação de um peptídeo sintético adequado para utilização como vacina contra um rinovírus humano (HRV) e que apresenta um epítopo que compreende os resíduos dos ácidos aminados 156 a 164 de VP2 ou de HRV tipo 2 ou resíduos de ácidos aminados equivalentes de outro HRV sendoopcionalmente um ou mais destes resíduos substituídos por um ou mais resíduos de outros ácidos aminados de modo a que a antigenicidade do peptídeo não seja afectada; ou uma proteína de fusão na qual o referido peptídeo se encontra ligado a uma sequência de suporte heteróloga adequada para esse fim; caracterizado por compreender as fases de:(i) preparação de um vector de expressão incorporando uma sequência de ADN que codifica para o referido peptídeo cu pr£ teína de fusão e que possui a capacidade de expressar o referido peptídeo ou proteína de fusão quando presente num hospedeiro apropriado e ^ii) integrar o referido vector de expressão no referido hospedeiro de modo a possibilitar a ocorrência da expressão do peptídeo ou proteína de fusão.- 8& Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido peptídeo ser composto de um máximo de 20 resíduos de ácidos aminados._ Cja _Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido peptídeo conter um máximo de 15 resíduos de ácidos aminados depois de extremidade car boxi-terminal do referido epítopo.- 105 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9 caracterizado por a sequência suporte referida ser HBcAg.- llê Processo para a preparação de uma vacina caracterizado por se incorporar numa formulação um peptídeo quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9 em conjunto com uma substância veicular ou um diluente farmaceuticamente aceitáveis.Ί OA requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado no Reino Unido em 16 de Abril de 1987, sob o n^. 8709274.Lisboa, 14 de Abril de 1988.
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