JP2925118B2 - ペプチド - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、合成ヒトライノウイルス(HRV)ペプチ
ド、その製造方法およびそのワクチンとしての使用に関
する。
ド、その製造方法およびそのワクチンとしての使用に関
する。
HRV粒子は、1分子の一本鎖RNAと、構造タンパク質VP
1およびVP3の60コピー、VP2およびVP4の58コピー、なら
びにそれらのプレカーサーVP0の2コピーからなる(Med
appaほか:1971;Rueckert,1976)。HRV14型(HRV14)の
原子構造に関する最近の報告(Rossmannほか:1985)に
は、無傷のウイルス粒子の表面上に表れる場合のVP1,VP
2およびVP3の位置と構造について詳細な情報が与えられ
ている。
1およびVP3の60コピー、VP2およびVP4の58コピー、なら
びにそれらのプレカーサーVP0の2コピーからなる(Med
appaほか:1971;Rueckert,1976)。HRV14型(HRV14)の
原子構造に関する最近の報告(Rossmannほか:1985)に
は、無傷のウイルス粒子の表面上に表れる場合のVP1,VP
2およびVP3の位置と構造について詳細な情報が与えられ
ている。
多数のモノクローナル抗体によつて選択された中和抵
抗性変異体に見出されるアミノ酸置換の位置が、HRV14
粒子上の4種の抗原部位の同定に用いられてきた(Sher
ry & Rueckert:1985;Sherryほか:1986)。それらが主
として位置するウイルスタンパク質により、これらの部
位は、NIm−I A,NIm−I B,NIm−IIおよびNIm−IIIと呼
ばれている。モノクローナル抗体を用いて、HRV2のVP2
上の中和エピトープの地図も作成されている。このエピ
トープには、153〜164のアミノ酸残基が包含される(Sk
ernほか:1987)。この12個の残基は一文字記号を用いて
以下のように示される。
抗性変異体に見出されるアミノ酸置換の位置が、HRV14
粒子上の4種の抗原部位の同定に用いられてきた(Sher
ry & Rueckert:1985;Sherryほか:1986)。それらが主
として位置するウイルスタンパク質により、これらの部
位は、NIm−I A,NIm−I B,NIm−IIおよびNIm−IIIと呼
ばれている。モノクローナル抗体を用いて、HRV2のVP2
上の中和エピトープの地図も作成されている。このエピ
トープには、153〜164のアミノ酸残基が包含される(Sk
ernほか:1987)。この12個の残基は一文字記号を用いて
以下のように示される。
Skernらによれば、VP2のトランスケーシヨン遺伝子を
含むプラスミドから発現させたタンパク質の結合性の解
析では、アミノ酸164を越えないカルボキシ末端からの
欠失ではモノクローナル抗体の結合部位は維持されてい
たことが明らかにされている。欠失がアミノ酸153に及
ぶと結合が認められなくなつた。しかしながら、VP2の
N末端と問題のVP2の領域の間の配列には適当な制限部
位がなく、モノクローナル抗体の結合部位のN末端側境
界の決定は妨げられていた。
含むプラスミドから発現させたタンパク質の結合性の解
析では、アミノ酸164を越えないカルボキシ末端からの
欠失ではモノクローナル抗体の結合部位は維持されてい
たことが明らかにされている。欠失がアミノ酸153に及
ぶと結合が認められなくなつた。しかしながら、VP2の
N末端と問題のVP2の領域の間の配列には適当な制限部
位がなく、モノクローナル抗体の結合部位のN末端側境
界の決定は妨げられていた。
HRVに関してこれまでに同定された抗原部位はすべ
て、ウイルス粒子上の研究から予測されたものである。
合成ペプチドを使つた研究は報告されていない。しかし
ながら、他のピコルナウイルスたとえば口蹄疫ウイルス
およびポリオウイルスに対するワクチンとして使用する
ための合成ペプチドの開発への興味が高まつてきた。
て、ウイルス粒子上の研究から予測されたものである。
合成ペプチドを使つた研究は報告されていない。しかし
ながら、他のピコルナウイルスたとえば口蹄疫ウイルス
およびポリオウイルスに対するワクチンとして使用する
ための合成ペプチドの開発への興味が高まつてきた。
本発明者らは、HRV2上の6個の予想免疫原決定基に対
する合成ペプチドを製造した。これらのペプチドのうち
の4個はウサギ抗−HRV2血清と反応することが明らかに
された。これらの4個のうち3個はウイルス粒子と間接
ELISAおよびウエスタンブロツト法でよく反応する抗血
清を産生した。しかしながら、ペプチドのひとつに対す
る抗血清はサンドイツチELISAおよび免疫沈降試験にお
いてウイルスと反応し、in vitroでその感染性が中和さ
れた。このペプチドは、 である。
する合成ペプチドを製造した。これらのペプチドのうち
の4個はウサギ抗−HRV2血清と反応することが明らかに
された。これらの4個のうち3個はウイルス粒子と間接
ELISAおよびウエスタンブロツト法でよく反応する抗血
清を産生した。しかしながら、ペプチドのひとつに対す
る抗血清はサンドイツチELISAおよび免疫沈降試験にお
いてウイルスと反応し、in vitroでその感染性が中和さ
れた。このペプチドは、 である。
換言すれば、このペプチドはHRV2のVP2のアミノ酸残
基56〜170に相当する。これも、非天然カルボキシ末端
システイン残基を有する。Skernらによつて提案されたN
Im−IIのアミノ酸残基のわずか9個が、このペプチド中
に存在するにすぎない。すなわち、このノナペプチドの
配列からなる合成ペプチドはHRV2に対する中和抗体を産
生できる。
基56〜170に相当する。これも、非天然カルボキシ末端
システイン残基を有する。Skernらによつて提案されたN
Im−IIのアミノ酸残基のわずか9個が、このペプチド中
に存在するにすぎない。すなわち、このノナペプチドの
配列からなる合成ペプチドはHRV2に対する中和抗体を産
生できる。
したがつて、本発明は、HRV2のVP2のアミノ酸残基156
〜165または他のHRVの同等のアミノ酸残基からなるエピ
トープを提供するペプチドであって50個までのアミノ酸
残基からなるペプチドであり、ワクチンとして使用する
のに適したペプチドを提供するものである。これらのア
ミノ酸残基は、そのペプチドの抗原性に影響しない他の
アミノ酸に置換されてもよい。これらのペプチドは、生
理的に許容される担体に結合した抱合体として与えられ
てもよい。また、このペプチドは担体配列に結合してな
る融合タンパク質の形態として提供されることもでき
る。
〜165または他のHRVの同等のアミノ酸残基からなるエピ
トープを提供するペプチドであって50個までのアミノ酸
残基からなるペプチドであり、ワクチンとして使用する
のに適したペプチドを提供するものである。これらのア
ミノ酸残基は、そのペプチドの抗原性に影響しない他の
アミノ酸に置換されてもよい。これらのペプチドは、生
理的に許容される担体に結合した抱合体として与えられ
てもよい。また、このペプチドは担体配列に結合してな
る融合タンパク質の形態として提供されることもでき
る。
本発明のペプチドは、抗原として有効な一定の配列か
ら構成される。この配列を本明細書においては、NIm−I
I配列と呼ぶことにする。HRV2については、この配列
は、 である。
ら構成される。この配列を本明細書においては、NIm−I
I配列と呼ぶことにする。HRV2については、この配列
は、 である。
他のHRVの同等なアミノ酸残基は、HRV2のVP2アミノ酸
残基156〜165に相当する。換言すれば、それらは、他の
HRV血清型のVP2残基対応配列である。これらは、他のHR
VのVP2配列をHRV2のVP2配列と揃うように並べれば容易
に決定できる。これはHRVの別種のVP2配列の間のホモロ
ジーにより、簡単な事柄である。添付した第1図にこれ
を例示する。すなわち、HRV2とHRV14のVP2配列を並べて
ある。HRV14の残基156〜162がHRV2の残基156〜165に相
当することがわかる。これらのHRV14は、 であり、図中に下線を施した。
残基156〜165に相当する。換言すれば、それらは、他の
HRV血清型のVP2残基対応配列である。これらは、他のHR
VのVP2配列をHRV2のVP2配列と揃うように並べれば容易
に決定できる。これはHRVの別種のVP2配列の間のホモロ
ジーにより、簡単な事柄である。添付した第1図にこれ
を例示する。すなわち、HRV2とHRV14のVP2配列を並べて
ある。HRV14の残基156〜162がHRV2の残基156〜165に相
当することがわかる。これらのHRV14は、 であり、図中に下線を施した。
定義されたNIm−II配列のアミノ酸の1個または2個
以上が、そのエピトープの抗原性に影響しない1個また
は2個以上の他のアミノ酸によつて置換されてもよい。
すなわち、あるアミノ酸を、最初のエピトープの物理化
学的性質たとえば電荷密度、親水性/疎水性、大きさお
よびコンフイギユレーシヨンを保持でき、したがつて免
疫学的構造を保持できる他のアミノ酸に置換してもよ
い。たとえば、AはGで置換でき、その逆も可能であ
る。EはDで置換でき、その逆も可能である。QはNで
置換でき、その逆も可能である。上述のように、この変
化はエピトープの抗原性に影響しない。
以上が、そのエピトープの抗原性に影響しない1個また
は2個以上の他のアミノ酸によつて置換されてもよい。
すなわち、あるアミノ酸を、最初のエピトープの物理化
学的性質たとえば電荷密度、親水性/疎水性、大きさお
よびコンフイギユレーシヨンを保持でき、したがつて免
疫学的構造を保持できる他のアミノ酸に置換してもよ
い。たとえば、AはGで置換でき、その逆も可能であ
る。EはDで置換でき、その逆も可能である。QはNで
置換でき、その逆も可能である。上述のように、この変
化はエピトープの抗原性に影響しない。
最も簡単な形では、ペプチドはHRV2のVP2のアミノ酸
残基156〜165または他のHRVの相当するアミノ酸残基か
らなる。HRV2およびHRV14の場合、これらはそれぞれ、
ペプチド である。
残基156〜165または他のHRVの相当するアミノ酸残基か
らなる。HRV2およびHRV14の場合、これらはそれぞれ、
ペプチド である。
また、NIm−IIエピトープを提供するもつと長いペプ
チドであつてもよい。NIm−II配列の一端もしくは両端
に、さらにアミノ酸残基が付加されてもよい。すなわち
50個までのアミノ酸残基、たとえば20個までのアミノ酸
残基からなるペプチドを構築してもよい。1個、2個、
3個またはそれ以上のアミノ酸残基をいずれかの末端に
付加させてもよい。一態様においては、余分のアミノ酸
残基をカルボキシ末端のみに付加する。30個まで、たと
えば15個までまたは6個までのアミノ酸残基をさらに独
立に、NIm−IIエピトープの一方または両方の末端を付
加させてもよい。
チドであつてもよい。NIm−II配列の一端もしくは両端
に、さらにアミノ酸残基が付加されてもよい。すなわち
50個までのアミノ酸残基、たとえば20個までのアミノ酸
残基からなるペプチドを構築してもよい。1個、2個、
3個またはそれ以上のアミノ酸残基をいずれかの末端に
付加させてもよい。一態様においては、余分のアミノ酸
残基をカルボキシ末端のみに付加する。30個まで、たと
えば15個までまたは6個までのアミノ酸残基をさらに独
立に、NIm−IIエピトープの一方または両方の末端を付
加させてもよい。
とくにHRVから誘導できるNIm−II配列に付加されるア
ミノ酸残基は、HRVのVP2配列中の相当する位置に存在す
る配列とすることができる。この方法でHRV2およびHRV1
4のVP2配列から構築される好ましいペプチドは、それぞ
れ である。
ミノ酸残基は、HRVのVP2配列中の相当する位置に存在す
る配列とすることができる。この方法でHRV2およびHRV1
4のVP2配列から構築される好ましいペプチドは、それぞ
れ である。
さらに長いペプチドとして、NIm−IIエピトープまた
はこのエピトープを含有する先に定義したような配列の
多重コピーからなるペプチドも使用できる。また、シス
テイン(C)残基を、本ペプチドの一方または両方の末
端に付加させてもよい。とくに、C残基はカルボキシ末
端のみに付加させることができる。これは、担体カツプ
リングを容易にするためおよび/またはペプチドの免疫
原性を増大させるために付加される。
はこのエピトープを含有する先に定義したような配列の
多重コピーからなるペプチドも使用できる。また、シス
テイン(C)残基を、本ペプチドの一方または両方の末
端に付加させてもよい。とくに、C残基はカルボキシ末
端のみに付加させることができる。これは、担体カツプ
リングを容易にするためおよび/またはペプチドの免疫
原性を増大させるために付加される。
ペプチドを担体に結合させて、免疫学的に活性な抱合
体を創成することもできる。任意の適当な、生理学的に
許容される担体が使用できる。担体としては、たとえ
ば、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、オバルブ
ミンまたはキーホールリンペツトのヘモシアニン等を挙
げることができる。ペプチドは、テタヌストキソイドお
よび/またはデイプセリアトキソイドに連結し、免疫原
と同時に多価ワクチンを提供することもできる。
体を創成することもできる。任意の適当な、生理学的に
許容される担体が使用できる。担体としては、たとえ
ば、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、オバルブ
ミンまたはキーホールリンペツトのヘモシアニン等を挙
げることができる。ペプチドは、テタヌストキソイドお
よび/またはデイプセリアトキソイドに連結し、免疫原
と同時に多価ワクチンを提供することもできる。
担体配列をこのようにしてペプチドと連結させるより
も、それ自体がVP2エピトープに対する担体配列を含有
するペプチドを製造することもできる。NIm−II配列ま
たはNIm−II配列を含有する長いペプチドの配列を担体
配列に連結させるかまたは担体内に与えることができ
る。異種担体配列が与えられる。これは、ペプチド、た
とえばNIm−II配列と担体配列からなる融合タンパク質
は、特定のVP2の全部または部分に相当するものではな
いことを意味する。担体配列は、全くHRV配列ではなく
てよい。担体タンパク質は、得られた生成物が生理学的
に許容されるものであるように選択される。
も、それ自体がVP2エピトープに対する担体配列を含有
するペプチドを製造することもできる。NIm−II配列ま
たはNIm−II配列を含有する長いペプチドの配列を担体
配列に連結させるかまたは担体内に与えることができ
る。異種担体配列が与えられる。これは、ペプチド、た
とえばNIm−II配列と担体配列からなる融合タンパク質
は、特定のVP2の全部または部分に相当するものではな
いことを意味する。担体配列は、全くHRV配列ではなく
てよい。担体タンパク質は、得られた生成物が生理学的
に許容されるものであるように選択される。
本発明のペプチドは合成ペプチドである。それは、単
体のアミノ酸および/または予め形成させた2個もしく
は3個以上のアミノ酸残基のペプチドから、化学的合成
によつて製造できる。固相法または溶液法を採用でき
る。別法として、ペプチドは組換えDNA技術によつて製
造することもできる。すなわち、NIm−II配列またはNIm
−II配列を含有する長い配列をコードするDNA配列を準
備する。このDNA配列を包含し、適当な宿主中でペプチ
ドを発現できる発現ペプチドを調製する。このDNA配列
は、ベクター中の翻訳開始および停止シグナルの間に位
置させる。適当な転写制御要素、とくにDNA配列に対す
るプロモーターおよび転写終結部位も設置される。DNA
配列は、ベクターに適合性を有する宿主中でペプチドの
発現が起こるように正しい読み取り枠で挿入される。
体のアミノ酸および/または予め形成させた2個もしく
は3個以上のアミノ酸残基のペプチドから、化学的合成
によつて製造できる。固相法または溶液法を採用でき
る。別法として、ペプチドは組換えDNA技術によつて製
造することもできる。すなわち、NIm−II配列またはNIm
−II配列を含有する長い配列をコードするDNA配列を準
備する。このDNA配列を包含し、適当な宿主中でペプチ
ドを発現できる発現ペプチドを調製する。このDNA配列
は、ベクター中の翻訳開始および停止シグナルの間に位
置させる。適当な転写制御要素、とくにDNA配列に対す
るプロモーターおよび転写終結部位も設置される。DNA
配列は、ベクターに適合性を有する宿主中でペプチドの
発現が起こるように正しい読み取り枠で挿入される。
適当な任意の宿主−ベクター系が採用できる。ベクタ
ーはプラスミドであつてよい。この場合、細菌または酵
母を宿主として使用できる。また、ベクターはウイルス
ベクターであつてもよい。これを用いて、ペプチドの発
現を起こすために、哺乳動物細菌系の細胞をトランスフ
エクシヨンする。
ーはプラスミドであつてよい。この場合、細菌または酵
母を宿主として使用できる。また、ベクターはウイルス
ベクターであつてもよい。これを用いて、ペプチドの発
現を起こすために、哺乳動物細菌系の細胞をトランスフ
エクシヨンする。
ウイルスベクターとしては、組換えワクシニアウイル
スを使用できる。たとえば、NIm−II配列またはNIm−II
配列を含有する長い配列をコードするDNA配列を、プラ
スミドベクター中、ワクシニアウイルスプロモーターの
下流、ワクシニアチミジンキナーゼ(TK)配列に隣接さ
せて挿入する。得られた組換えベクターをワクシニアウ
イルスで感染させた細胞中に導入する。同種組換えの結
果、TK-組換えワクシニアウイルスが発生し、ペプチド
を発現する。
スを使用できる。たとえば、NIm−II配列またはNIm−II
配列を含有する長い配列をコードするDNA配列を、プラ
スミドベクター中、ワクシニアウイルスプロモーターの
下流、ワクシニアチミジンキナーゼ(TK)配列に隣接さ
せて挿入する。得られた組換えベクターをワクシニアウ
イルスで感染させた細胞中に導入する。同種組換えの結
果、TK-組換えワクシニアウイルスが発生し、ペプチド
を発現する。
融合タンパク質の部分としてNIm−IIエピトープを提
供するための組換えDNA技術の使用の一例を示せば、次
のとおりである。インフルエンザウイルスヘマグルチニ
ン(HA)からなり、通常はその天然抗原エピトープによ
つて占められている位置にNIm−IIエピトープが存在す
る融合タンパク質をコードするDNA配列を調製する。換
言すれば、HAの天然抗原エピトープの全部または部分
を、NIm−IIエピトープまたはNIm−II配列を含有する長
い配列で置換する。
供するための組換えDNA技術の使用の一例を示せば、次
のとおりである。インフルエンザウイルスヘマグルチニ
ン(HA)からなり、通常はその天然抗原エピトープによ
つて占められている位置にNIm−IIエピトープが存在す
る融合タンパク質をコードするDNA配列を調製する。換
言すれば、HAの天然抗原エピトープの全部または部分
を、NIm−IIエピトープまたはNIm−II配列を含有する長
い配列で置換する。
融合タンパク質の発現には、このDNA配列を発現ベク
ター中に挿入する。DNA配列は、真核宿主中に与えた場
合、融合タンパク質を発現できるようなベクター中に導
入する。真核宿主であることは、H Aの正しいグリコシ
ル化のために必要である。ベクターは、融合タンパク質
がそのベクターで感染させた細胞中で発現するようにDN
A配列を導入したウイルスベクターであつてもよい。ワ
クチンはこのようなウイルスベクターと生理学的に許容
される担体または希釈剤からなるものであつてよい。こ
の場合、好ましいウイルスベクターは、そのDNA配列が
導入された組換えワクシニアウイルスである。また、ワ
クチンは、融合タンパク質と生理学的に許容される担体
または希釈剤からなるものであつてもよい。
ター中に挿入する。DNA配列は、真核宿主中に与えた場
合、融合タンパク質を発現できるようなベクター中に導
入する。真核宿主であることは、H Aの正しいグリコシ
ル化のために必要である。ベクターは、融合タンパク質
がそのベクターで感染させた細胞中で発現するようにDN
A配列を導入したウイルスベクターであつてもよい。ワ
クチンはこのようなウイルスベクターと生理学的に許容
される担体または希釈剤からなるものであつてよい。こ
の場合、好ましいウイルスベクターは、そのDNA配列が
導入された組換えワクシニアウイルスである。また、ワ
クチンは、融合タンパク質と生理学的に許容される担体
または希釈剤からなるものであつてもよい。
インフルエンザウイルスH Aは、膜内在性タンパク質
である。組換えワクシニアウイルス感染細胞中で発現さ
せた場合、H A融合タンパク質は通常グリコシル化さ
れ、細胞表面に輸送され、それを通して突出される。し
たがつて、NIm−IIエピトープは細胞表面の外側に提供
される。通常、NIm−IIエピトープはH Aの抗原部位Aに
提供される。
である。組換えワクシニアウイルス感染細胞中で発現さ
せた場合、H A融合タンパク質は通常グリコシル化さ
れ、細胞表面に輸送され、それを通して突出される。し
たがつて、NIm−IIエピトープは細胞表面の外側に提供
される。通常、NIm−IIエピトープはH Aの抗原部位Aに
提供される。
NIm−IIエピトープを免疫系に提供するための融合タ
ンパク質の製造に組換えDNA技術を使用する他の例に
は、HBcAgのアミノ末端に、NIm−IIエピトープまたはNI
m−IIエピトープを含有する長い配列が連結してなる融
合タンパク質の製造がある。この融合タンパク質は、真
核宿主系のみでなく任意の適合宿主システムを使用でき
るほかは、H A融合タンパク質の場合と同様にして発現
できる。また、HBcAgの表面タンパク質ではないので、
ワクチンとして使用できる唯一の融合タンパク質であ
る。NIm−IIエピトープは、HBcAgに直接融合させること
ができる。また、エピトープを介在リンカーを介してHB
cAgに融合させることもできる。このようなリンカーは
1個または2個以上、たとえば10個までのアミノ酸残基
で構成される。
ンパク質の製造に組換えDNA技術を使用する他の例に
は、HBcAgのアミノ末端に、NIm−IIエピトープまたはNI
m−IIエピトープを含有する長い配列が連結してなる融
合タンパク質の製造がある。この融合タンパク質は、真
核宿主系のみでなく任意の適合宿主システムを使用でき
るほかは、H A融合タンパク質の場合と同様にして発現
できる。また、HBcAgの表面タンパク質ではないので、
ワクチンとして使用できる唯一の融合タンパク質であ
る。NIm−IIエピトープは、HBcAgに直接融合させること
ができる。また、エピトープを介在リンカーを介してHB
cAgに融合させることもできる。このようなリンカーは
1個または2個以上、たとえば10個までのアミノ酸残基
で構成される。
本発明のペプチドは中和抗体を産生させることができ
る。したがつて、ヒトのワクチンとして使用できる。予
防接種は、ペプチドの有効量を患者に投与することによ
つて行われる。経口投与経路または非経口投与経路たと
えば、皮下、静脈内もしくは筋肉内投与を採用できる。
通常ペプチドは、経口および非経口投与経路のいずれで
も、1回1〜1,000μg、さらに好ましくは1回に10〜1
00μg投与される。H A融合タンパク質を発現できるウ
イルスベクターをワクチンとして使用する場合も、与え
られたウイルスの投与経路および量は同じである。組換
えワクシニアウイルスの場合は、皮内投与が行われる。
る。したがつて、ヒトのワクチンとして使用できる。予
防接種は、ペプチドの有効量を患者に投与することによ
つて行われる。経口投与経路または非経口投与経路たと
えば、皮下、静脈内もしくは筋肉内投与を採用できる。
通常ペプチドは、経口および非経口投与経路のいずれで
も、1回1〜1,000μg、さらに好ましくは1回に10〜1
00μg投与される。H A融合タンパク質を発現できるウ
イルスベクターをワクチンとして使用する場合も、与え
られたウイルスの投与経路および量は同じである。組換
えワクシニアウイルスの場合は、皮内投与が行われる。
予防接種の目的には、通常、ペプチドは医薬的に許容
される担体または希釈剤と処方される。慣用の処方、担
体、補助剤および希釈剤を使用できる。これらが投与経
路によつて決定されるのは当然である。
される担体または希釈剤と処方される。慣用の処方、担
体、補助剤および希釈剤を使用できる。これらが投与経
路によつて決定されるのは当然である。
患者に投与されるワクチンは、NIm−IIエピトープが
導入された1種のペプチドのみでなく、他の抗原も含有
させることが好ましい。これらは、別種のHRVのNIm−II
エピトープおよび/またはHRVの他のエピトープを含む
ペプチドの形であつてもよい。
導入された1種のペプチドのみでなく、他の抗原も含有
させることが好ましい。これらは、別種のHRVのNIm−II
エピトープおよび/またはHRVの他のエピトープを含む
ペプチドの形であつてもよい。
本発明においては、ペプチドとしてはヒトライノウイ
ルス(HRV)2型のVP2のアミノ酸残基156〜165またはHR
Vの14型のVP2のアミノ酸残基156〜162からなるエピトー
プを提供するペプチドであり、該エピトーブのカルボキ
シ末端には14個までのアミノ酸残基が付加されていても
よく、該ペプチドのアミノ酸残基のうちでそれぞれ1個
のアミノ酸残基は該ペプチドの抗原性に影響しない他の
1個のアミノ酸残基によって置換されていてもよいヒト
ライノウイルスに対するワクチンに使用するのに適した
合成ペプチドが好ましい対象である。
ルス(HRV)2型のVP2のアミノ酸残基156〜165またはHR
Vの14型のVP2のアミノ酸残基156〜162からなるエピトー
プを提供するペプチドであり、該エピトーブのカルボキ
シ末端には14個までのアミノ酸残基が付加されていても
よく、該ペプチドのアミノ酸残基のうちでそれぞれ1個
のアミノ酸残基は該ペプチドの抗原性に影響しない他の
1個のアミノ酸残基によって置換されていてもよいヒト
ライノウイルスに対するワクチンに使用するのに適した
合成ペプチドが好ましい対象である。
また、本発明においては、上記の合成ペプチドにB型
肝炎コア抗原(HBcAg)のアミノ末端に該ペプチドが結
合した融合ペプチドが、融合ペプチドとして好ましい対
象である。
肝炎コア抗原(HBcAg)のアミノ末端に該ペプチドが結
合した融合ペプチドが、融合ペプチドとして好ましい対
象である。
また、本発明においては、単体のアミノ酸および/ま
たは2個もしくはそれ以上のアミノ酸残基を有する予め
形成したペプチドからペプチドを合成することによる上
記合成ペプチドの製造方法が合成ペプチドの製造方法と
して、好ましい対象である。
たは2個もしくはそれ以上のアミノ酸残基を有する予め
形成したペプチドからペプチドを合成することによる上
記合成ペプチドの製造方法が合成ペプチドの製造方法と
して、好ましい対象である。
また、本発明においては、上記合成ペプチドまたは融
合ペプチドの遺伝子工学的製造法としては、上記ペプチ
ドまたは融合タンパク質をコードするDNA配列が挿入さ
れ、適当な宿主中で上記ペプチドまたは融合タンパク質
を発現できる発現ベクターを製造し、上記発現ベクター
をそのペプチドまたは融合タンパク質の発現が起こるよ
うに宿主中に提供する工程からなる方法が好ましい対象
である。
合ペプチドの遺伝子工学的製造法としては、上記ペプチ
ドまたは融合タンパク質をコードするDNA配列が挿入さ
れ、適当な宿主中で上記ペプチドまたは融合タンパク質
を発現できる発現ベクターを製造し、上記発現ベクター
をそのペプチドまたは融合タンパク質の発現が起こるよ
うに宿主中に提供する工程からなる方法が好ましい対象
である。
また、本発明では、上記合成ペプチドが生理学的に許
容される担体に結合した、HRVに対するワクチンとして
の使用に適した複合体が好ましい対象である。
容される担体に結合した、HRVに対するワクチンとして
の使用に適した複合体が好ましい対象である。
また、本発明では上記合成ペプチドを医薬的に許容さ
れる担体または希釈剤として処方してなるHRVに対して
使用するに適したワクチンが好ましい対象である。
れる担体または希釈剤として処方してなるHRVに対して
使用するに適したワクチンが好ましい対象である。
次に、本発明を、図面を参照しながら、実施例によつ
てさらに詳細に例示する。
てさらに詳細に例示する。
第1図は、HRV2およびHRV14のVP2配列を示す。
第2図は、ペプチド4(例1)の分子イオンの領域の
フアストアトムボンバードメントマススペクトル(FABM
S)である。
フアストアトムボンバードメントマススペクトル(FABM
S)である。
第3図は、精製HRV2の、NIm−II配列に対する抗−ペ
プチド血清による免疫沈降の結果である(例2)。
プチド血清による免疫沈降の結果である(例2)。
第4図は、抗−HRV2ペプチド血清におけるウエスタン
ブロツト解析の結果を示す(例2)。
ブロツト解析の結果を示す(例2)。
例 1 ペプチドの製造 HRV14のコンピユーターグラフイツクモデル(英国、O
xford大学分子物理学教室のD.Stuart博士により、M.G.R
ossmann博士の協力を得て発生)を参照に、また、HRV14
をHRV2およびこのウイルスの他の血清型と並べて配列を
比較して(Stanwayほか:1984;Skernほか:1985;Callahan
ほか:1985)、本発明者らは、合成ペプチドを用いての
評価のために、HRV2上にいくつかの重要と思われる免疫
原部位を選択した(VP1から3個、VP2から1個、VP3か
ら2個)。製造したHRV2ペプチドの配列および位置は第
1表に示す。合成はMerrifield(1963)の技術を改変し
たHoughten(1985)の記載に従つて実施した。各ペプチ
ドには、キーホールリンペツトヘモシアニン(KLH)へ
のカツプリングを容易にするため、そのC末端に非天然
システイン残基を付加してある。
xford大学分子物理学教室のD.Stuart博士により、M.G.R
ossmann博士の協力を得て発生)を参照に、また、HRV14
をHRV2およびこのウイルスの他の血清型と並べて配列を
比較して(Stanwayほか:1984;Skernほか:1985;Callahan
ほか:1985)、本発明者らは、合成ペプチドを用いての
評価のために、HRV2上にいくつかの重要と思われる免疫
原部位を選択した(VP1から3個、VP2から1個、VP3か
ら2個)。製造したHRV2ペプチドの配列および位置は第
1表に示す。合成はMerrifield(1963)の技術を改変し
たHoughten(1985)の記載に従つて実施した。各ペプチ
ドには、キーホールリンペツトヘモシアニン(KLH)へ
のカツプリングを容易にするため、そのC末端に非天然
システイン残基を付加してある。
ペプチド4(分子量1811,922)の分子イオン領域のフ
アストアトムボンバードメントマススペクトルを第2図
に示す。FABスペクトルは、期待された化合物の(M+
H)+イオンをM/Z 1913に示し、提案された分子量が確
認された。
アストアトムボンバードメントマススペクトルを第2図
に示す。FABスペクトルは、期待された化合物の(M+
H)+イオンをM/Z 1913に示し、提案された分子量が確
認された。
例 2 ペプチドの試験 ペプチドは最初、ウサギ抗−HRV2血清との反応性につ
いて、間接ELISAを用いてin vitroで試験した。固相に
結合したペプチド濃度の範囲を過剰の抗血清によりスク
リーニングした。この方法により、4個の反応性ペプチ
ドが同定された。VP1から2個、VP2から1個、VP3から
1個である(第1表)。
いて、間接ELISAを用いてin vitroで試験した。固相に
結合したペプチド濃度の範囲を過剰の抗血清によりスク
リーニングした。この方法により、4個の反応性ペプチ
ドが同定された。VP1から2個、VP2から1個、VP3から
1個である(第1表)。
したがつて、この4個のペプチドを選んで、MBS法(L
iuほか:1979)でKLHにカツプリングさせたのち、免疫処
置を行つた。
iuほか:1979)でKLHにカツプリングさせたのち、免疫処
置を行つた。
対のウサギに、フロインドの完全アジユバントで乳化
して各ペプチド500μgを筋肉内に接種し、45日後同用
量をフロインドの不完全アジユバンドで乳化して皮下に
再接種した。14日間隔で、抗ペプチド活性を、血清サン
プルについてモニタリングした。すべてのウサギが抗ペ
プチド抗体を産生し、これは最初の接種から14日以内に
検出可能となり、再接種から28日後に集めた最終血液で
は、間接ELISAによつて測定した抗−ペプチド活性は3.7
log10〜4.7log10の範囲であつた(第2表) 抗−ペプチド血清を、次に、数種の異なる定量系、す
なわち間接ELISA,サンドイツチELISA,免疫沈降および中
和を用いて、抗−HRV2活性について試験した(第2
表)。間接ELISAにおいては全抗血清がHRV2と反応した
が、ペプチド3,4および6に対する抗血清の力価(3.1〜
5.2log10)は、ペプチド2に対する抗血清の力価(1.5
〜1.8log10)に比して有意に高かつた。しかしながら、
VP2からのペプチド4を接種したNo.5のウサギからの抗
血清のみが、サンドイツチELISAにおいてよく反応し
た。
して各ペプチド500μgを筋肉内に接種し、45日後同用
量をフロインドの不完全アジユバンドで乳化して皮下に
再接種した。14日間隔で、抗ペプチド活性を、血清サン
プルについてモニタリングした。すべてのウサギが抗ペ
プチド抗体を産生し、これは最初の接種から14日以内に
検出可能となり、再接種から28日後に集めた最終血液で
は、間接ELISAによつて測定した抗−ペプチド活性は3.7
log10〜4.7log10の範囲であつた(第2表) 抗−ペプチド血清を、次に、数種の異なる定量系、す
なわち間接ELISA,サンドイツチELISA,免疫沈降および中
和を用いて、抗−HRV2活性について試験した(第2
表)。間接ELISAにおいては全抗血清がHRV2と反応した
が、ペプチド3,4および6に対する抗血清の力価(3.1〜
5.2log10)は、ペプチド2に対する抗血清の力価(1.5
〜1.8log10)に比して有意に高かつた。しかしながら、
VP2からのペプチド4を接種したNo.5のウサギからの抗
血清のみが、サンドイツチELISAにおいてよく反応し
た。
2種の定量法における結果の相違は、固相に対する結
合方法によつて誘発されるウイルス粒子のゆがみの程度
(McCulloughほか:1985)に関連するものと思われる。
間接ELISAの場合のようにプラスチツク表面へ直接結合
すると、他のピコルナウイルス、口蹄疫ウイルスにゆが
みを生じ、通常ペプチド抗体に近づきにくい抗原部位が
露出される。サンドイツチELISAでは、ウイルス粒子は
固定化抗体によつて捕捉されるので、その物理学的変化
はそれほど大きくない。
合方法によつて誘発されるウイルス粒子のゆがみの程度
(McCulloughほか:1985)に関連するものと思われる。
間接ELISAの場合のようにプラスチツク表面へ直接結合
すると、他のピコルナウイルス、口蹄疫ウイルスにゆが
みを生じ、通常ペプチド抗体に近づきにくい抗原部位が
露出される。サンドイツチELISAでは、ウイルス粒子は
固定化抗体によつて捕捉されるので、その物理学的変化
はそれほど大きくない。
多かれ少なかれ両ELISA法ともウイルスとゆがめるの
で、血清は、溶液中で精製35Sメチオニン標識HRV2粒子
と反応し、スタフイロコツカスAゴーストを用いて沈殿
を生じることも可能であつた。ペプチド4に対する血清
のみが、ウイルスの有意な沈殿を示した(第2表)。し
かしながら、観察された沈殿の程度は、試験した2種の
ウサギ血清間で著しく異なつていた(第1図)。ウサギ
No.5からの抗血清 は標識ウイルスの90%以上を沈殿させたが、同じ定量法
でNo.6のウサギからの抗血清 はわずか58%を沈殿させたにすぎなかつた( は正常ウサギ抗血清)。この結果は多分、天然ライノウ
イルス粒子に対する2種の抗血清の全体的な機能的親和
性の差によるものと考えられる。ウイルスの沈殿におい
て高い活性を示した抗血清は、サンドイツチELISAにお
いても反応を示した抗血清であつた。
で、血清は、溶液中で精製35Sメチオニン標識HRV2粒子
と反応し、スタフイロコツカスAゴーストを用いて沈殿
を生じることも可能であつた。ペプチド4に対する血清
のみが、ウイルスの有意な沈殿を示した(第2表)。し
かしながら、観察された沈殿の程度は、試験した2種の
ウサギ血清間で著しく異なつていた(第1図)。ウサギ
No.5からの抗血清 は標識ウイルスの90%以上を沈殿させたが、同じ定量法
でNo.6のウサギからの抗血清 はわずか58%を沈殿させたにすぎなかつた( は正常ウサギ抗血清)。この結果は多分、天然ライノウ
イルス粒子に対する2種の抗血清の全体的な機能的親和
性の差によるものと考えられる。ウイルスの沈殿におい
て高い活性を示した抗血清は、サンドイツチELISAにお
いても反応を示した抗血清であつた。
すべてのペプチド抗血清について、ウイルスの中和能
も試験した。各抗血清の非希釈および1:4希釈サンプル
を、ある範囲の希釈ウイルスとインキユベーシヨンし、
ウイルス+正常ウサギ血清およびウイルス+抗ペプチド
血清で得られたlog10力価における差を中和指数として
用いた。この方法を用いると、ペプチド4に対する抗血
清のみが中和活性を示し、No.5のウサギの抗血清はNo.6
のウサギの抗血清よりも有意に高い活性を示した(第2
表)。サンドイツチELISAおよび免疫沈降試験において
最もよく反応したのもこの血清であつた。両血清とも類
似のレベルの抗ペプチド活性を有し、中和抗体定量法に
認められた差は、エピトープのコンフオーメーシヨンを
認識する抗体集団の質的差によるものと考えられる。
も試験した。各抗血清の非希釈および1:4希釈サンプル
を、ある範囲の希釈ウイルスとインキユベーシヨンし、
ウイルス+正常ウサギ血清およびウイルス+抗ペプチド
血清で得られたlog10力価における差を中和指数として
用いた。この方法を用いると、ペプチド4に対する抗血
清のみが中和活性を示し、No.5のウサギの抗血清はNo.6
のウサギの抗血清よりも有意に高い活性を示した(第2
表)。サンドイツチELISAおよび免疫沈降試験において
最もよく反応したのもこの血清であつた。両血清とも類
似のレベルの抗ペプチド活性を有し、中和抗体定量法に
認められた差は、エピトープのコンフオーメーシヨンを
認識する抗体集団の質的差によるものと考えられる。
最後に、ペプチド抗−血清が、特異的な方法で、単離
ウイルスタンパク質を認識するかどうかを決定するため
に、ウエスタンブロツテイングを実施した。反応しない
ポリクローナル抗−HRV2血清(レーン1)と対照的に、
各抗−ペプチド血清は相当するウイルスタンパク質と反
応した。ペプチド3(レーン3)ペプチド4(レーン
4)およびペプチド6(レーン5)に対する抗血清は最
も高い反応性を示した(第4図、レーン2はペプチド2
に対する抗血清である)。これらの観察は間接ELISAの
結果を支持する。さらに、Skernら(1987)によつて記
載された、本発明のペプチド4をカバーするモノクロー
ナル抗体もウエスタンブロツトで反応した。ペプチド3
抗血清はVP2およびVP3と交差反応し、ペプチド4抗血清
はVP1とある程度の交差反応を示したが、一般に、この
反応はタンパク質特異的である。しかしながら、交差反
応性のレベルはきわめて低いので、抗血清はウイルスタ
ンパク質の有用なマーカー試薬を提供する。
ウイルスタンパク質を認識するかどうかを決定するため
に、ウエスタンブロツテイングを実施した。反応しない
ポリクローナル抗−HRV2血清(レーン1)と対照的に、
各抗−ペプチド血清は相当するウイルスタンパク質と反
応した。ペプチド3(レーン3)ペプチド4(レーン
4)およびペプチド6(レーン5)に対する抗血清は最
も高い反応性を示した(第4図、レーン2はペプチド2
に対する抗血清である)。これらの観察は間接ELISAの
結果を支持する。さらに、Skernら(1987)によつて記
載された、本発明のペプチド4をカバーするモノクロー
ナル抗体もウエスタンブロツトで反応した。ペプチド3
抗血清はVP2およびVP3と交差反応し、ペプチド4抗血清
はVP1とある程度の交差反応を示したが、一般に、この
反応はタンパク質特異的である。しかしながら、交差反
応性のレベルはきわめて低いので、抗血清はウイルスタ
ンパク質の有用なマーカー試薬を提供する。
例 3 HRV14ペプチド 配列LSSANEVGGPVKCのペプチドはMerrifield(1963)
の技術のHoughten(1985)による改良法を用いて合成し
た。このペプチドのC末端に非天然システイン残基を付
加した。ペプチドはKLHにカツプリングさせた(5mgペプ
チド/3.2mg KLH)。
の技術のHoughten(1985)による改良法を用いて合成し
た。このペプチドのC末端に非天然システイン残基を付
加した。ペプチドはKLHにカツプリングさせた(5mgペプ
チド/3.2mg KLH)。
ペプチドの活性を調べた。0日に、KLHにカツプリン
グしたペプチド500μgを2匹のウサギに、フロインド
の完全アジユバントを用いて筋肉内(i.m.)接種した。
第42日に、KLHにカツプリングしたペプチド、さらに500
μgを、フロインドの不完全アジユバントを用いて各ウ
サギにi.m.接種した。両ウサギとも第84日に採血した。
抗−ペプチドおよび抗−HRV14活性を、間接ELISAによつ
て測定した。結果は第3表に示す。
グしたペプチド500μgを2匹のウサギに、フロインド
の完全アジユバントを用いて筋肉内(i.m.)接種した。
第42日に、KLHにカツプリングしたペプチド、さらに500
μgを、フロインドの不完全アジユバントを用いて各ウ
サギにi.m.接種した。両ウサギとも第84日に採血した。
抗−ペプチドおよび抗−HRV14活性を、間接ELISAによつ
て測定した。結果は第3表に示す。
第1図は、HRV2およびHRV14のVP2配列を示す。 第2図は、ペプチド4の分子イオン領域のフアストアト
ムボンバードメントマススペクトル(FABMS)である。 第3図は、精製HRV2のNIm−II配列に対する抗ペプチド
血清による免疫沈降の結果である。 第4図は、抗−HRV2ペプチド血清におけるウエスタンブ
ロツト解析を示す写真である。
ムボンバードメントマススペクトル(FABMS)である。 第3図は、精製HRV2のNIm−II配列に対する抗ペプチド
血清による免疫沈降の結果である。 第4図は、抗−HRV2ペプチド血清におけるウエスタンブ
ロツト解析を示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (72)発明者 バーウィン エワート クラーケ イギリス国 ビーアール3 3ビーエス ケント,ベッケンハム,ラングリィ コート(番地なし) (56)参考文献 特開 昭62−279(JP,A) 特開 昭61−47191(JP,A) 特表 昭60−500684(JP,A) J.GEN.VIR,Vol.68, (1987)P.315〜323
Claims (9)
- 【請求項1】ヒトライノウイルス(HRV)2型のVP2のア
ミノ酸残基156〜165またはHRVの14型のVP2のアミノ酸残
基156〜162からなるエピトープを提供するペプチドであ
り、該エピトープのカルボキシ末端には14個までのアミ
ノ酸残基が付加されていてもよく、該ペプチドのアミノ
酸残基のうちでそれぞれ1個のアミノ酸残基は該ペプチ
ドの抗原性に影響しない他の1個のアミノ酸残基によっ
て置換されていてもよいヒトライノウイルスに対するワ
クチンに使用するのに適した合成ペプチド。 - 【請求項2】以下の配列 からなる特許請求の範囲第1項に記載のペプチド。
- 【請求項3】さらにいずれかの末端または両末端に非天
然システイン残基を有する特許請求の範囲第1項または
第2項に記載のペプチド。 - 【請求項4】特許請求の範囲第1項から第3項までのい
ずれかに記載のペプチドが異種担体配列に結合してなる
融合タンパク質。 - 【請求項5】B型肝炎コア抗原(HBcAg)のアミノ末端
に該ペプチドが結合した特許請求の範囲第4項に記載の
融合タンパク質。 - 【請求項6】単体のアミノ酸および/または2個もしく
はそれ以上のアミノ酸残基を有する予め形成したペプチ
ドからペプチドを合成することを特徴とする特許請求の
範囲第1項から第3項までのいずれかに記載の合成ペプ
チドの製造方法。 - 【請求項7】特許請求の範囲第1項から第3項までのい
ずれかに記載の合成ペプチドまたは特許請求の範囲第4
項または第5項に記載の融合タンパク質を製造するにあ
たり、 (i)上記ペプチドまたは融合タンパク質をコードする
DNA配列が挿入され、適当な宿主中で上記ペプチドまた
は融合タンパク質を発現できる発現ベクターを製造し、
(ii)上記発現ベクターをそのペプチドまたは融合タン
パク質の発現が起こるように宿主中に提供する工程から
なる方法。 - 【請求項8】特許請求の範囲第1項から第3項までのい
ずれかに記載のペプチドが生理学的に許容される担体に
結合した、HRVに対するワクチンとしての使用に適した
複合体。 - 【請求項9】特許請求の範囲第1項から第3項までのい
ずれかに記載のペプチドを医薬的に許容される担体また
は希釈剤と処方してなるHRVに対して使用するのに適し
たワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8709274 | 1987-04-16 | ||
GB878709274A GB8709274D0 (en) | 1987-04-16 | 1987-04-16 | Peptides |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6456695A JPS6456695A (en) | 1989-03-03 |
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Family
ID=10616016
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63093288A Expired - Lifetime JP2925118B2 (ja) | 1987-04-16 | 1988-04-15 | ペプチド |
Country Status (14)
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---|---|
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JP (1) | JP2925118B2 (ja) |
AT (1) | ATE98962T1 (ja) |
AU (1) | AU605574B2 (ja) |
CA (1) | CA1340926C (ja) |
DE (1) | DE3886443T2 (ja) |
DK (1) | DK204588A (ja) |
ES (1) | ES2060650T3 (ja) |
GB (1) | GB8709274D0 (ja) |
IE (1) | IE62382B1 (ja) |
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NZ (1) | NZ224251A (ja) |
PT (1) | PT87239B (ja) |
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US8318423B2 (en) | 2004-07-06 | 2012-11-27 | Focus Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for detecting rhinoviruses |
DE102009053588A1 (de) | 2009-11-17 | 2011-05-19 | Teijin Monofilament Germany Gmbh | Abriebbeständige Monofilamente |
DE202012001985U1 (de) | 2012-02-25 | 2012-03-30 | Nextrusion Gmbh | Abriebbeständige Monofilamente für Papiermaschinenbespannungen |
WO2023005805A1 (zh) * | 2021-07-26 | 2023-02-02 | 北京万泰生物药业股份有限公司 | 人鼻病毒的通用亲和表位多肽、抗体及其用途 |
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JPS6147191A (ja) * | 1984-07-20 | 1986-03-07 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | ヒト・ライノウイルスrnaおよびたんぱく |
DE3505148A1 (de) * | 1985-02-15 | 1986-10-30 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Polypeptide des rhinovirusstammes hrv2 sowie die hierfuer codierenden dna-molekuele |
GB8821077D0 (en) * | 1988-09-08 | 1988-10-05 | Wellcome Found | Peptides |
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1987
- 1987-04-16 GB GB878709274A patent/GB8709274D0/en active Pending
-
1988
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- 1988-04-14 NZ NZ224251A patent/NZ224251A/xx unknown
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- 1988-04-14 PT PT87239A patent/PT87239B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-04-14 ZA ZA882641A patent/ZA882641B/xx unknown
- 1988-04-15 DE DE3886443T patent/DE3886443T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-15 ES ES88303432T patent/ES2060650T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-15 NO NO881661A patent/NO881661L/no unknown
- 1988-04-15 IE IE114088A patent/IE62382B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 JP JP63093288A patent/JP2925118B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-15 AT AT88303432T patent/ATE98962T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 EP EP88303432A patent/EP0287395B1/en not_active Expired - Lifetime
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Title |
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J.GEN.VIR,Vol.68,(1987)P.315〜323 |
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ES2060650T3 (es) | 1994-12-01 |
PT87239B (pt) | 1992-08-31 |
PT87239A (pt) | 1988-05-01 |
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DE3886443D1 (de) | 1994-02-03 |
JPS6456695A (en) | 1989-03-03 |
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ZA882641B (en) | 1988-09-30 |
NO881661D0 (no) | 1988-04-15 |
IE62382B1 (en) | 1995-01-25 |
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NZ224251A (en) | 1991-09-25 |
ATE98962T1 (de) | 1994-01-15 |
EP0287395A1 (en) | 1988-10-19 |
GB8709274D0 (en) | 1987-05-20 |
CA1340926C (en) | 2000-03-14 |
DK204588A (da) | 1988-10-17 |
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